---
title: "Chromatine en epigenetica"
book: "Universitaire biologie — jaar 3"
subject: biology
language: nl
chapter: 1
exercises: 12
source: https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica
---

# Hoofdstuk 1 — Chromatine en epigenetica

Twee muizen uit hetzelfde nest, genetisch identiek tot aan de laatste base, zitten naast elkaar: de ene is slank en bruin, de andere dik en geel, en zij zal diabetes krijgen. Een lapjeskat draagt oranje en zwarte vlekken hoewel elke cel van haar huid dezelfde twee X-chromosomen bevat. Een kind erft hetzelfde ontbrekende stuk van chromosoom 15 als een ander kind, en de een heeft het syndroom van Prader–Willi terwijl de ander het syndroom van Angelman heeft — het verschil is alleen van welke ouder de deletie kwam. Niets hiervan staat in de DNA-sequentie geschreven. Het staat er *op* geschreven: in de manier waarop twee meter DNA in een kern van tien micrometer doorsnede wordt gepakt, in de kleine chemische groepen aan de pakkingseiwitten en aan de cytosines zelf, en in de machinerie die die merktekens van een cel naar haar dochters kopieert. Dit hoofdstuk gaat over die tweede informatielaag, haar moleculaire dragers en de eerlijke grenzen aan wat zij kan onthouden.

## 1.1 Chromatine: DNA op een klos

**Definitie 1.1 (Nucleosoom en chromatine).**

*Chromatine* is het complex van DNA met eiwitten waarin het genoom in een eukaryote kern bestaat. De herhalende eenheid is het *nucleosoom*: $147\,\mathrm{bp}$ DNA gewonden in $1.65$ linksdraaiende slagen om een octameer van *histonen* — van elk van de kleine, zeer basische eiwitten H2A, H2B, H3 en H4 twee kopieën — gevolgd door een *linker* van $20\text{ tot }60\,\mathrm{bp}$ naar het volgende nucleosoom. Een vijfde histon, H1, bindt de linker waar die de kern binnengaat en verlaat en helpt de kralen tegen elkaar aan te pakken. Elk kernhiston draagt een ongestructureerde aminoterminale *staart* van zo’n $20\text{ tot }40$ residuen die uit het deeltje steekt. Chromatine dat licht kleurt, los gepakt is en wordt getranscribeerd heet *euchromatine*; dicht gepakt, laat replicerend en grotendeels zwijgend chromatine, bij centromeren, telomeren en herhaalde sequenties, heet *heterochromatine*.

**Bewijsmateriaal.** Hewish en Burgoyne (1973) verteerden rattenleverkernen met een endogeen nuclease en vonden dat het DNA er niet als een veeg uit kwam maar als een ladder van fragmenten met lengtes die veelvouden waren van ongeveer $200\,\mathrm{bp}$: het DNA was op regelmatige afstanden beschermd en werd alleen ertussen geknipt. Kornberg (1974) toonde aan dat de beschermde eenheid een deeltje van acht [histonen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) met ongeveer $200\,\mathrm{bp}$ was, en elektronenmicroscopische opnamen van voorzichtig uitgespreid [chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) lieten de “kralen aan een snoer” zien. Luger en collega’s (1997) losten de kristalstructuur van het kerndeeltje op bij $2.8\,\text{Å}$: $147\,\mathrm{bp}$, een octameer met de staarten tussen de DNA-windingen door naar buiten. ∎

![De 10\, nm-vezel: nucleosoomkernen (blauw) op één doorlopend DNA (rood), elke kraal een histonoctameer met zijn staarten (oranje) naar buiten, linkerhiston H1 (groen) op het in- en uittredepunt. Ongeveer zes nucleosomen beslaan de lengte die 1200\, bp naakt DNA zou innemen.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-0b2397e56d41.svg)

*De $10\,\mathrm{nm}$-vezel: nucleosoomkernen (blauw) op één doorlopend DNA (rood), elke kraal een histonoctameer met zijn staarten (oranje) naar buiten, linkerhiston H1 (groen) op het in- en uittredepunt. Ongeveer zes [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) beslaan de lengte die $1200\,\mathrm{bp}$ naakt DNA zou innemen.*

![Chromatine op moleculaire schaal: de dubbele helix gewonden om opeenvolgende histonkernen, de “kralen aan een snoer” die de nucleaseladder aan het licht bracht.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-4a3089c69564.jpg)

*[Chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) op moleculaire schaal: de dubbele helix gewonden om opeenvolgende histonkernen, de “kralen aan een snoer” die de nucleaseladder aan het licht bracht.*

**Propositie 1.2 (Niveaus van compactie).**

De *[pakkingsgraad](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction)* van een chromatinestructuur is de lengte van het DNA dat zij bevat gedeeld door de lengte van de structuur. Het opwinden tot de $10\,\mathrm{nm}$-vezel geeft een graad van ongeveer $6$: de $68\,\mathrm{nm}$ van een herhaling van $200\,\mathrm{bp}$ wordt samengeperst tot één kraal van $11\,\mathrm{nm}$. In de interfasekern is de vezel niet opgewonden tot een regelmatige dikkere vezel, zoals leerboeken haar lang tekenden, maar gevouwen tot *lussen* van tientallen tot honderden kilobasen die aan hun voet worden vastgehouden door ringvormige cohesinecomplexen en door het DNA-bindende eiwit CTCF; de lussen groeperen zich tot *topologisch associërende domeinen* (TAD’s) van ongeveer een megabase, waarbinnen een gen zijn regulatoren veel vaker ontmoet dan wat dan ook daarbuiten. Een mitotisch chromosoom, de meest compacte toestand, heeft een [pakkingsgraad](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) van bijna $10\,000$: de $4\,\mathrm{cm}$ DNA van een gemiddeld menselijk chromosoom is gevouwen tot een staafje van $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ lang.

**Voorbeeld 1.3 (Twee meter in tien micrometer).**

Een menselijke diploïde kern bevat $6.4\times 10^{9}$ basenparen. Bij $0.34\,\mathrm{nm}$ per basenpaar is dat $2.2\,\mathrm{m}$ dubbele helix, in een kern van ongeveer $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ doorsnede. Zij wordt gepakt in $6.4\times 10^{9}/200 \approx 3.2\times 10^{7}$ [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), die elk ongeveer $108\,\mathrm{kDa}$ [histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) dragen tegenover $96\,\mathrm{kDa}$ DNA ($147\,\mathrm{bp}$ à $650\,\mathrm{Da}$ per paar): de kern bevat naar massa ruwweg evenveel [histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) als DNA. Het DNA zelf, opgevat als een cilinder van $2\,\mathrm{nm}$ doorsnede, heeft een volume van slechts ongeveer $7\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$, zo’n $1\,\%$ van een bolvormige kern met straal $5\,\text{µ}\mathrm{m}$; het pakkingsprobleem is er een van verknoping en toegang, niet van ruimte.

## 1.2 De histoncode

**Definitie 1.4 (Histonmodificaties).**

De residuen van de histonstaarten worden covalent gemodificeerd: *acetylering* van lysines (die hun positieve lading neutraliseert en de greep op het DNA losser maakt), *methylering* van lysines en arginines (één, twee of drie methylgroepen, zonder verandering van lading), fosforylering van serines, ubiquitinering van lysines. Een modificatie wordt genoemd naar [histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), residu en groep: H3K4me3 is [histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) H3, lysine 4, getrimethyleerd; H3K27ac is H3 lysine 27 geacetyleerd. De *histoncode* is het verband tussen combinaties van merktekens en de toestand van het onderliggende gen: H3K4me3 en H3K27ac op actieve promotoren en enhancers, H3K36me3 langs getranscribeerde genlichamen, H3K9me3 op constitutief [heterochromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), H3K27me3 op genen die tijdens de ontwikkeling zijn uitgeschakeld. Enzymen die een merkteken aanbrengen zijn *schrijvers* (histonacetyltransferasen, HAT’s; methyltransferasen), enzymen die het verwijderen zijn *wissers* (histondeacetylasen, HDAC’s; demethylasen), en eiwitten die een merkteken binden en erop reageren zijn *lezers*: een *bromodomein* bindt acetyllysine, een *chromodomein* methyllysine.

**Propositie 1.5 (Merktekens worden gelezen, niet slechts gevoeld).**

[Acetylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) werkt deels langs elektrostatische weg — een geacetyleerde staart houdt zijn DNA minder stevig vast en de vezel opent zich — maar de meeste merktekens werken door [lezers](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) aan te trekken. H3K9me3 wordt gebonden door het chromodomein van het *heterochromatine-eiwit HP1*, dat dimeriseert, naburige [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) overbrugt en juist het methyltransferase (SUV39H) aantrekt dat H3K9me3 op het volgende [nucleosoom](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) schrijft: het merkteken breidt zich langs de vezel uit tot het een grens bereikt, en comprimeert wat het bedekt. H3K27me3 wordt geschreven door *Polycomb repressive complex 2* (PRC2, katalytische subeenheid EZH2), gelezen door PRC1, dat H2A ubiquitineert en de vezel comprimeert, en het complex wordt zelf gestimuleerd door het merkteken dat het maakt; de *Trithorax*-groep van eiwitten schrijft het tegengestelde H3K4me3 en houdt de ontwikkelingsgenen van een bepaald celtype aan. Elke zulke lus — een [lezer](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) trekt een [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) aan — is een positieve terugkoppeling die een toestand zichzelf laat handhaven zodra hij gevestigd is, en dat is wat een erfelijk merkteken nodig heeft.

![De logica van schrijver, lezer en wisser. Een lezer die op een merkteken van het ene nucleosoom zit, trekt de schrijver aan die hetzelfde merkteken op het volgende zet, zodat de toestand zich uitbreidt en zichzelf kopieert; wissers werken ertegen. Acetylgroepen (groen) openen de vezel; H3K9me3 (rood) sluit haar.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-956f146ed698.svg)

*De logica van [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code), [lezer](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) en [wisser](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code). Een [lezer](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) die op een merkteken van het ene [nucleosoom](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) zit, trekt de [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) aan die hetzelfde merkteken op het volgende zet, zodat de toestand zich uitbreidt en zichzelf kopieert; [wissers](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) werken ertegen. Acetylgroepen (groen) openen de vezel; H3K9me3 (rood) sluit haar.*

**Methode 1.6 (Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)).**

Om in kaart te brengen waar een merkteken of een eiwit op het genoom zit: (1) verknoop eiwitten en DNA in levende cellen met formaldehyde; (2) breek het [chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) in fragmenten van enkele honderden basenparen; (3) sla de fragmenten neer met een aan kralen gebonden antilichaam tegen het merkteken (bijvoorbeeld H3K27me3); (4) maak de verknopingen ongedaan en zuiver het DNA; (5) sequenceer het (ChIP-seq) en tel de reads langs het genoom: de pieken zijn de plaatsen waar het merkteken zat. Een controle van ingangs-DNA zonder antilichaam bepaalt de achtergrond. De resolutie is die van de fragmenten, ongeveer één [nucleosoom](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome).

**Opmerking 1.7 (Code of correlatie).**

Het woord “code” zegt te veel. Veel merktekens zijn eerder gevolgen van transcriptie dan oorzaken ervan (H3K36me3 wordt neergelegd door een methyltransferase dat met het polymerase meerijdt), en het weghalen van een [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) verandert de expressie vaak veel minder dan de verdeling van het merkteken doet vermoeden. Wat wel vaststaat, is dat enkele merktekens — H3K9me3, H3K27me3 en de [DNA-methylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) hieronder — een zelfvoortplantende uitschakeling dragen die het signaal overleeft dat haar heeft ingesteld.

## 1.3 DNA-methylering en het kopiëren van een merkteken

**Definitie 1.8 (DNA-methylering).**

Bij gewervelden wordt vrijwel alleen in het dinucleotide *CpG* (een C gevolgd door een G op dezelfde streng) een methylgroep aan koolstof 5 van cytosine gehangen, een sequentie die haar eigen complement is, zodat een gemethyleerd CpG normaal op beide strengen gemethyleerd is. Zo’n $70\text{ tot }80\,\%$ van de CpG’s van een menselijke cel is gemethyleerd, en gemethyleerde promotoren zwijgen: de methylgroepen worden gelezen door methyl-CpG-bindende eiwitten (MeCP2, MBD1–4) die HDAC’s en H3K9-methylasen aantrekken, en zij blokkeren verscheidene transcriptiefactoren rechtstreeks. De uitzonderingen zijn de *CpG-eilanden*, stukken van ongeveer een kilobase, rijk aan G en C en aan CpG, die bij de promotoren van de meeste huishoudgenen liggen en in normale cellen ongemethyleerd blijven. De methylgroep wordt geschreven door *DNA-methyltransferasen*: DNMT3A en DNMT3B verzorgen de *de-novomethylering* van ongemethyleerde plaatsen, en *DNMT1*, dat een hemigemethyleerd CpG verkiest — de ene streng gemethyleerd, de andere niet — verzorgt de *onderhoudsmethylering* achter de replicatievork. Verwijdering is passief, door replicatie zonder onderhoud, of actief, door de TET-enzymen, die 5-methylcytosine oxideren tot 5-hydroxymethylcytosine en verder, tot base-excisieherstel het door een gewoon cytosine vervangt.

**Voorbeeld 1.9 (Waarom het genoom arm is aan CpG).**

Het menselijk genoom is voor $42\,\%$ G$+$C, dus als de basen onafhankelijk waren zou een [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) voorkomen met frequentie $0.21\times 0.21 \approx 0.044$, ongeveer $2.8\times 10^{8}$ keer in het diploïde genoom. Het waargenomen aantal is ongeveer $5.6\times 10^{7}$, een vijfde daarvan. De oorzaak is het merkteken zelf: een gemethyleerd cytosine dat zijn aminogroep verliest wordt thymine, een normale base die het herstel niet als fout kan herkennen, terwijl een ongemethyleerd cytosine tot uracil deamineert, dat wordt uitgesneden. In de loop van de evolutie zijn gemethyleerde [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s tot TpG en CpA gemuteerd, en alleen de ongemethyleerde eilanden hebben hun [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s behouden. Het merkteken heeft zijn handtekening in de sequentie achtergelaten.

**Stelling 1.10 (Behoud van een methyleringstoestand door de delingen heen).**

Beschouw één CpG-plaats, gevolgd langs een lijn van cellen. Bij elke deling wordt het cytosine van de nieuwe streng gemethyleerd met kans $\mu$ als het cytosine van de matrijsstreng gemethyleerd is (onderhoudsefficiëntie) en met kans $\delta$ als dat niet zo is (de-novosnelheid). Zij $p_{n}$ de kans dat de plaats na $n$ delingen gemethyleerd is. Dan geldt

$$
p_{n+1} = \mu\, p_{n} + \delta\,(1 - p_{n}),
\qquad
p_{n} = p^{*} + (p_{0} - p^{*})\,(\mu - \delta)^{n},
\qquad
p^{*} = \frac{\delta}{1 - \mu + \delta}.
$$

Elke plaats drijft naar hetzelfde evenwicht $p^{*}$, wat haar begintoestand ook is, en het geheugen van de begintoestand vervalt meetkundig met verhouding $\mu - \delta$. Een merkteken wordt ongeveer $1/(1 - \mu + \delta)$ delingen lang onthouden; trouw geheugen van een *verschil* tussen plaatsen vereist daarom dat $\mu$ zeer dicht bij $1$ ligt en $\delta$ zeer dicht bij $0$, of een terugkoppeling die $\mu$ en $\delta$ van de toestand van de omgeving laat afhangen.

**Bewijs.** De recursie is de wet van de totale kans over de twee toestanden van de matrijs. Het vaste punt lost $p^{*} = \mu p^{*} + \delta(1 -
p^{*})$ op, wat $p^{*}(1 - \mu + \delta) = \delta$ geeft. Trekt men de vergelijking van het vaste punt van de recursie af, dan is $p_{n+1} - p^{*} = (\mu -
\delta)(p_{n} - p^{*})$, wat itereert tot de gesloten vorm. Omdat $0 \le \delta \le \mu \le 1$ ligt de verhouding $\mu - \delta$ in $[0,1]$ en krimpt de afwijking; zij halveert elke $\ln 2 / (-\ln(\mu -
\delta)) \approx \ln 2/(1 - \mu + \delta)$ delingen wanneer $\mu -
\delta$ dicht bij $1$ ligt. ∎

**Voorbeeld 1.11 (Getallen).**

Gemeten waarden voor zoogdiercellen zijn $\mu \approx 0.99$ en $\delta \approx 0.02$ per deling op een gewoon [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation). Dan is $p^{*} =
0.02/0.03 \approx 0.67$, dicht bij de genoombrede gemethyleerde fractie, en $\mu - \delta = 0.97$: een volledig gemethyleerde plaats die alleen aan de machinerie wordt overgelaten zou na $\ln 2 /
0.03 \approx 23$ delingen halverwege terug zijn naar het gemiddelde. Een uitgeschakelde promotor die de honderden delingen van een leven lang blijft zwijgen heeft daarom meer nodig dan [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation): de methyl-CpG-lezers trekken H3K9-methylering aan en de H3K9-lezers trekken DNMT3 aan, zodat een dicht eiland van merktekens zijn eigen $\mu$ naar $1$ opdrijft en de naburige $\delta$ naar $0$ verlaagt. Omgekeerd verliest een cel die [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) kwijtraakt het merkteken passief: met $\mu = \delta = 0$ halveert de fractie gemethyleerde strengen bij elke deling.

![Links: onderhoudsmethylering. Na replicatie is elk CpG hemigemethyleerd; DNMT1 kopieert het merkteken met kans per plaats naar de nieuwe streng. Rechts: het lot van een plaats over de delingen voor = 0.99, = 0.02 (blauw vanuit gemethyleerd, rood vanuit ongemethyleerd) — beide convergeren naar p* = 0.67 — en voor een plaats waarvan de terugkoppeling in de omgeving tot 0.999 verhoogt (groen).](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-042e208743bb.svg)

*Links: [onderhoudsmethylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation). Na replicatie is elk [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) hemigemethyleerd; [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) kopieert het merkteken met kans $\mu$ per plaats naar de nieuwe streng. Rechts: het lot van een plaats over de delingen voor $\mu = 0.99$, $\delta = 0.02$ (blauw vanuit gemethyleerd, rood vanuit ongemethyleerd) — beide convergeren naar $p^{*} = 0.67$ — en voor een plaats waarvan de terugkoppeling in de omgeving $\mu$ tot $0.999$ verhoogt (groen).*

**Methode 1.12 (Methylering lezen: bisulfietsequencing).**

Sequencen alleen kan een methylgroep niet zien. Behandel gedenatureerd DNA met natriumbisulfiet: ongemethyleerd cytosine wordt gedeamineerd tot uracil, dat na PCR als T wordt gelezen, terwijl 5-methylcytosine beschermd is en nog steeds als C wordt gelezen. Sequenceer het omgezette DNA en vergelijk het met de referentie: elke C die C is gebleven was gemethyleerd, elke C die T is geworden niet. Genoombreed uitgevoerd ([bisulfietsequencing](#met-b3-chromatin-epigenetics-bisulfite) van het hele genoom) geeft dit de methyleringstoestand van elk van de $2.8\times 10^{7}$ [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s van een haploïd genoom met een resolutie van één base, als fractie van de cellen in het monster.

## 1.4 X-inactivatie en genomische imprinting

**Definitie 1.13 (Inactivatie van het X-chromosoom).**

Bij vrouwelijke zoogdieren wordt in elke somatische cel een van de twee X-chromosomen vroeg in de ontwikkeling transcriptioneel uitgeschakeld, een vorm van *dosiscompensatie* die de expressie van X-gebonden genen tussen XX-vrouwtjes en XY-mannetjes gelijktrekt. Het uitgeschakelde chromosoom wordt samengepakt tot een dicht lichaampje tegen het kernmembraan, het *Barr-lichaampje*. Welke X zwijgt, wordt in het eigenlijke embryo willekeurig bepaald en wordt, eenmaal gekozen, klonaal door alle afstammelingen van de cel geërfd. De inactivatie wordt op gang gebracht door *Xist*, een niet-coderend RNA van $17\,\mathrm{kb}$ dat wordt afgeschreven van het X-inactivatiecentrum van het chromosoom dat zal zwijgen: het bekleedt dat chromosoom in cis, trekt Polycomb (H3K27me3), de histonvariant macroH2A en ten slotte [DNA-methylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) van de promotoren aan, en de stilte wordt daarna zonder Xist per deling in stand gehouden. Ongeveer $15\,\%$ van de menselijke X-gebonden genen ontsnapt geheel of gedeeltelijk aan de inactivatie.

**Bewijsmateriaal.** Barr en Bertram (1949) merkten een dicht lichaampje op in de kernen van vrouwelijke maar niet van mannelijke kattenneuronen. Ohno (1959) toonde aan dat het één heel X-chromosoom was, gecondenseerd. Lyon (1961) legde de stukken bij elkaar: vrouwelijke muizen die heterozygoot zijn voor X-gebonden vachtkleurgenen hebben een mozaïekvacht met plekken die het ene of het andere allel tot expressie brengen, zodat elke plek een kloon is waarin één X, altijd dezelfde, zwijgt; hetzelfde geldt voor de oranje en zwarte plekken van een schildpad- of lapjeskat, waarvan het oranjegen X-gebonden is, en voor de mozaïekzweetklieren van vrouwen die een mutant allel van een X-gebonden gen dragen. Een mannelijke lapjeskat is bijna altijd XXY. ∎

![Links: een vrouwelijke kern gekleurd voor DNA, met de compacte inactieve X — het Barr-lichaampje — tegen de kernrand gedrukt. Rechts: een lapjeskat. Elke oranje of zwarte plek is een kloon van huidcellen die hetzelfde X-chromosoom hebben uitgeschakeld; het wit is een apart, autosomaal, vlekkengen.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-3f3811e47dc3.jpg)

![Links: een vrouwelijke kern gekleurd voor DNA, met de compacte inactieve X — het Barr-lichaampje — tegen de kernrand gedrukt. Rechts: een lapjeskat. Elke oranje of zwarte plek is een kloon van huidcellen die hetzelfde X-chromosoom hebben uitgeschakeld; het wit is een apart, autosomaal, vlekkengen.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-f88c4a5d803d.jpg)

*Links: een vrouwelijke kern gekleurd voor DNA, met de compacte inactieve X — het [Barr-lichaampje](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) — tegen de kernrand gedrukt. Rechts: een lapjeskat. Elke oranje of zwarte plek is een kloon van huidcellen die hetzelfde X-chromosoom hebben uitgeschakeld; het wit is een apart, autosomaal, vlekkengen.*

**Definitie 1.14 (Genomische imprinting).**

Een gen is *geïmprint* wanneer maar één van zijn twee allelen tot expressie komt, en welk allel dat is hangt af van de ouder waarvan het komt: sommige genen komen alleen van de vaderlijke kopie tot expressie, andere alleen van de moederlijke. Zoogdieren hebben zo’n $100\text{ tot }200$ geïmprinte genen, in clusters, en elk cluster wordt bestuurd door een *imprintingcontroleregio* (ICR) die op het ene ouderlijke allel gemethyleerd is en op het andere niet. De methylering wordt in de kiembaan ingesteld — één patroon in zaadcellen, een ander in eicellen — in de kiemcellen van de volgende generatie gewist en opnieuw ingesteld naar het geslacht van dat individu. Een kind dat beide kopieën van een chromosoom van dezelfde ouder krijgt (*uniparentale disomie*) heeft daarom de verkeerde dosis van de geïmprinte genen erop, hoewel zijn sequentie volkomen normaal is.

**Bewijsmateriaal.** McGrath en Solter, en onafhankelijk Surani, Barton en Norris (1984), maakten muizenzygoten met twee moederlijke voorkernen, of twee vaderlijke, door voorkernen tussen bevruchte eicellen over te brengen. Geen van beide soorten kwam tot ontwikkeling, hoewel elk twee volledige chromosoomsets had: de gynogenetische embryo’s vormden een redelijk embryo met een slechte placenta, de androgenetische een grote placenta en vrijwel geen embryo. De twee ouderlijke genomen zijn niet gelijkwaardig en beide zijn nodig. Cattanach en Kirk (1985) toonden met chromosoomspecifieke uniparentale disomieën aan dat de ongelijkwaardigheid beperkt is tot bepaalde gebieden van bepaalde chromosomen, en daar zijn de geïmprinte clusters later gevonden. ∎

**Voorbeeld 1.15 (Het cluster Igf2–H19).**

*Igf2*, een foetale groeifactor, komt tot expressie vanaf het vaderlijke allel; zijn buurman *H19*, een niet-coderend RNA, vanaf het moederlijke. Daartussen ligt de ICR en, voorbij *H19*, een gedeelde reeks enhancers. Op het moederlijke chromosoom is de ICR ongemethyleerd en bindt zij CTCF, dat als isolator werkt: de enhancers kunnen *H19* bereiken maar *Igf2* niet. Op het vaderlijke chromosoom is de ICR gemethyleerd (ingesteld in de zaadcel), kan CTCF niet binden en reiken de enhancers over naar *Igf2*; de methylering breidt zich ook uit en legt de *H19*-promotor stil. Eén merkteken, ingesteld in één kiembaan, beslist over beide genen.

![Imprinting bij Igf2–H19. Moederlijk allel: de ongemethyleerde ICR bindt CTCF, een isolator, zodat de stroomafwaartse enhancers alleen H19 activeren. Vaderlijk allel: de ICR werd in de zaadcel gemethyleerd, CTCF kan niet binden, de enhancers bereiken Igf2, en de methylering legt H19 stil.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-6b1d6366cce4.svg)

*Imprinting bij *Igf2*–*H19*. Moederlijk allel: de ongemethyleerde ICR bindt CTCF, een isolator, zodat de stroomafwaartse enhancers alleen *H19* activeren. Vaderlijk allel: de ICR werd in de zaadcel gemethyleerd, CTCF kan niet binden, de enhancers bereiken *Igf2*, en de methylering legt *H19* stil.*

**Voorbeeld 1.16 (Prader–Willi en Angelman).**

Dezelfde deletie van ongeveer $5\,\mathrm{Mb}$ in chromosoom 15 (regio 15q11–q13) veroorzaakt het *syndroom van Prader–Willi* — slappe spieren bij de geboorte, daarna onverzadigbare eetlust en obesitas — wanneer zij op het vaderlijke chromosoom ligt, en het *syndroom van Angelman* — ernstige verstandelijke beperking, afwezige spraak, een vrolijk voorkomen en epilepsie — wanneer zij op het moederlijke ligt. De regio draagt vaderlijk tot expressie komende genen (*SNRPN* en een cluster kleine RNA’s) waarvan in het eerste geval de enige actieve kopie verloren gaat, en het moederlijk tot expressie komende *UBE3A*, dat in het tweede geval verloren gaat. Moederlijke [uniparentale disomie](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) van 15, zonder enige deletie, geeft eveneens Prader–Willi: twee moederlijke kopieën, zwijgend voor de vaderlijke genen.

**Opmerking 1.17 (Waarom eigenlijk imprinten).**

Geïmprinte genen zijn verrijkt voor de sturing van de foetale groei en van het transport van voedingsstoffen door de placenta, waarbij vaderlijk tot expressie komende genen (*Igf2*, *Peg3*) eerder groei bevorderen en moederlijk tot expressie komende (*H19*, *Igf2r*, *Cdkn1c*) haar eerder beteugelen. De *verwantschapstheorie* leest hierin een conflict: de genen van een vader winnen bij het onttrekken van meer aan een moeder die later nakomelingen van andere mannetjes kan dragen, terwijl de genen van de moeder winnen bij het rantsoeneren over al haar worpen. Imprinting komt voor bij placentadieren en bij bloemplanten, waarvan het endosperm eveneens door de moeder wordt gevoed, en niet bij vogels of reptielen, en dat is wat de theorie voorspelt.

## 1.5 Epigenetische overerving en haar grenzen

**Definitie 1.18 (Epigenetica).**

*Epigenetica* is de studie van erfelijke veranderingen in genactiviteit die geen veranderingen in de DNA-sequentie zijn: toestanden gedragen door [DNA-methylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation), histonmerktekens of zelfonderhoudende circuits van transcriptiefactoren, en gekopieerd door de celdeling heen. Twee allelen van identieke sequentie maar met een verschillende stabiele epigenetische toestand zijn *epiallelen*. Overerving door mitose is de regel en is wat een gedifferentieerde cel gedifferentieerd houdt. Overerving door meiose, van ouder op nakomeling, is bij zoogdieren de uitzondering, omdat de merktekens in twee golven van *herprogrammering* worden gewist: in de primordiale kiemcellen, waar de imprints en het grootste deel van de methylering worden uitgevlakt en daarna naar geslacht opnieuw gezet, en nogmaals in de zygote en het vroege embryo, waar het vaderlijke genoom actief door TET3 wordt gedemethyleerd en het moederlijke passief, voordat de eigen patronen van het embryo door DNMT3 worden aangelegd.

**Voorbeeld 1.19 (De levensvatbare gele agoutimuis).**

In het $A^{vy}$-allel is een retrotransposon stroomopwaarts van het vachtkleurgen *agouti* ingevoegd. Waar de promotor van het transposon ongemethyleerd is, drijft hij *agouti* in elke cel onophoudelijk aan; de muis is geel, zwaarlijvig en vatbaar voor diabetes. Waar hij gemethyleerd is, volgt het gen zijn normale regeling en is de muis bruin (“pseudoagouti”). Genetisch identieke nestgenoten spreiden zich over het hele spectrum, en een gele moeder krijgt meer gele jongen dan een bruine: het [epiallel](#def-b3-chromatin-epigenetics-epigenetics) wordt door de moederlijke kiembaan onvolledig gewist. Waterland en Jirtle (2003) gaven drachtige $A^{vy}$-moeders een voeding rijk aan methyldonoren (foliumzuur, vitamine B12, choline, betaïne) en verschoven de vacht van de jongen naar bruin. Het milieu van de ene generatie had een merkteken gezet dat de volgende generatie meedroeg.

![Twee Avy-nestgenoten met identiek genotype: een gele, zwaarlijvige muis waarin het transposon stroomopwaarts van agouti ongemethyleerd is, en een bruine pseudoagouti waarin het gemethyleerd is.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-f80cae50b46a.jpg)

*Twee $A^{vy}$-nestgenoten met identiek genotype: een gele, zwaarlijvige muis waarin het transposon stroomopwaarts van *agouti* ongemethyleerd is, en een bruine pseudoagouti waarin het gemethyleerd is.*

**Propositie 1.20 (Waar erfelijke epigenetische toestanden voorkomen).**

Drie goed onderzochte systemen illustreren de bovenstaande mechanismen. *[Positie-effectvariegatie](#prop-b3-chromatin-epigenetics-examples)* bij *Drosophila*: een gen dat door een chromosoomherschikking naast [heterochromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) is beland, wordt in sommige cellen uitgeschakeld en in andere niet, wat een gevlamd oog geeft; elke plek is een kloon, de uitschakeling breidt zich vanuit het [heterochromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) uit via de HP1-lus, en de genen waarvan mutatie de variegatie onderdrukt (de *Su(var)*-genen) zijn HP1 en het H3K9-methyltransferase. *Vernalisatie* bij *Arabidopsis*: weken winterkou leggen de bloeirepressor *FLC* stil met door Polycomb neergelegd H3K27me3, de stilte houdt maanden voorjaarsgroei en duizenden celdelingen stand, en zij wordt in elke generatie teruggezet, zodat elke plant haar eigen winter moet meemaken. *Paramutatie* bij mais: één allel van het pigmentgen *b1* zet, wanneer het in een heterozygoot een bepaald ander allel ontmoet, dat allel om naar zijn eigen zwijgende toestand, en het omgezette allel geeft die toestand generaties lang aan zijn nakomelingen door, via een door klein RNA gestuurde methylering die in [Hoofdstuk 2](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/2-niet-coderende-rnas-en-posttranscriptionele-regulatie#ch-b3-rna-regulation) aan bod komt. In alle drie de gevallen is de overerving mitotisch en robuust; de overdracht tussen generaties wordt ofwel actief teruggezet (planten) ofwel is lek en onvolledig (muizen).

**Opmerking 1.21 (De grenzen van transgenerationele claims).**

Beweringen dat de hongersnood of de stress van een grootouder “epigenetisch geërfd” wordt door menselijke kleinkinderen zijn gangbaar en meestal onbewezen. Tussen een somatisch merkteken en een kleinkind staan twee golven van uitwissing, de geïmprinte genen en enkele transposons zijn bij zoogdieren de enige gedocumenteerde overlevenden van die uitwissing, en in menselijke cohorten zijn de effecten van een gedeeld milieu, van het milieu in de baarmoeder en van genetische verschillen moeilijk te scheiden van een merkteken dat in de kiembaan wordt meegedragen. De aangetoonde gevallen — $A^{vy}$, enkele aan transposons gekoppelde [epiallelen](#def-b3-chromatin-epigenetics-epigenetics), door RNA bemiddelde toestanden bij wormen en planten — zijn echt, moleculair begrepen en beperkt. De stelling van dit hoofdstuk zegt waarom: zonder een terugkoppeling die $\mu$ naar $1$ duwt, vergeet een merkteken zichzelf in enkele tientallen delingen, en de kiembaan legt daar nog een actieve terugzetting bovenop.

## 1.6 Opgaven

**Oefening 1.1 ★.**

Geef de samenstelling van een nucleosoomkerndeeltje, de lengte van het DNA dat het bindt en de gebruikelijke linkerlengte. Waarom gaf nucleasevertering van [chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) een ladder van fragmenten en geen veeg?

**Oplossing van Oefening 1.1.**

Van elk van H2A, H2B, H3 en H4 twee kopieën (een octameer) met $147\,\mathrm{bp}$ DNA in $1.65$ slagen; linkers van $20\text{ tot }60\,\mathrm{bp}$, wat een herhaling van bijna $200\,\mathrm{bp}$ geeft. Het nuclease knipt alleen het blootliggende linker-DNA, nooit binnen een kerndeeltje, zodat elk fragment een geheel aantal herhalingen is: een ladder van $200$, $400$, $600\,\mathrm{bp}$, geen veeg.

**Oefening 1.2 ★.**

Een kikkergenoom heeft $3.0\times 10^{9}$ basenparen per haploïde set. Hoeveel [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) bevat een diploïde kern, uitgaande van een herhaling van $190\,\mathrm{bp}$, en hoe lang is haar DNA?

**Oplossing van Oefening 1.2.**

Diploïd: $6.0\times 10^{9}$ bp; $6.0\times 10^{9}/190 \approx
3.2\times 10^{7}$ [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome); lengte $6.0\times 10^{9}\times
0.34\,\mathrm{nm} = 2.0\,\mathrm{m}$.

**Oefening 1.3 ★.**

Ontcijfer H3K27me3, H4K16ac en H3S10ph. Zeg bij elk of het met actief dan wel met zwijgend [chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) samengaat, en noem een [lezer](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) voor het eerste.

**Oplossing van Oefening 1.3.**

H3K27me3: [histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) H3, lysine 27, getrimethyleerd — zwijgend [chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) van onderdrukte ontwikkelingsgenen, geschreven door PRC2 en gelezen door de chromodomein-eiwitten van PRC1. H4K16ac: H4, lysine 16, geacetyleerd — actief, open [chromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (het verbreekt een contact tussen twee [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome)). H3S10ph: H3, serine 10, gefosforyleerd — een mitotisch merkteken dat samengaat met de condensatie van chromosomen (en, kortstondig, met genactivatie door sommige signalen); geen stabiel uitschakelend of activerend merkteken.

**Oefening 1.4 ★.**

Leg uit waarom een lapjeskat vrijwel altijd vrouwelijk is, en wat een mannelijke lapjeskat wel moet zijn.

**Oplossing van Oefening 1.4.**

Het oranjegen is X-gebonden met een oranje en een zwart allel; een gevlekte vacht vereist van elk één, op twee verschillende X-chromosomen, waarvan er per cel één zwijgt. Een kater heeft één X en is helemaal oranje of helemaal zwart. Een mannelijke lapjeskat draagt twee X-chromosomen en een Y (XXY), en is steriel.

**Oefening 1.5 ★★.**

Bereken de [pakkingsgraad](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) van de $10\,\mathrm{nm}$-vezel uit de getallen van [Definitie 1.1](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (herhaling $200\,\mathrm{bp}$, kraal $11\,\mathrm{nm}$), en de graad die nodig is om de $4\,\mathrm{cm}$ DNA van een gemiddeld menselijk chromosoom in een mitotisch chromatide van $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ te persen. Met welke extra factor moet de vezel worden gevouwen?

**Oplossing van Oefening 1.5.**

$200\,\mathrm{bp}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 68\,\mathrm{nm}$ per kraal van $11\,\mathrm{nm}$: graad $6.2$. Vereist: $4\,\mathrm{cm}/4\,\text{µ}\mathrm{m} =
10^{4}$. Verdere vouwing met een factor $10^{4}/6.2 \approx 1600$.

**Oefening 1.6 ★★.**

Bepaal in het model van [Stelling 1.10](#thm-b3-chromatin-epigenetics-maintenance) met $\mu = 0.98$ en $\delta = 0.01$ de waarde van $p^{*}$ en het aantal delingen waarna een plaats die gemethyleerd begon de helft van haar overschot boven $p^{*}$ kwijt is. Herhaal dit voor $\mu = 0.999$, $\delta = 0.001$.

**Oplossing van Oefening 1.6.**

$\mu = 0.98$, $\delta = 0.01$: $p^{*} = 0.01/0.03 = 0.33$; verhouding $\mu -
\delta = 0.97$; halveringstijd $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ delingen. $\mu = 0.999$, $\delta = 0.001$: $p^{*} = 0.5$; verhouding $0.998$; halveringstijd $\ln 2 / 0.002 \approx 350$ delingen.

**Oefening 1.7 ★★.**

Een ChIP-seq-experiment op levercellen geeft een H3K4me3-piek en een H3K27ac-piek bij de promotor van gen $A$, een breed H3K27me3-domein over gen $B$ en H3K9me3 over gen $C$. Voorspel de transcriptionele toestand van elk, en zeg welke van $B$ en $C$ in een ander celtype eerder aangezet zal worden, en waarom.

**Oplossing van Oefening 1.7.**

$A$: actief (promotor met H3K4me3 en [acetylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code)). $B$: zwijgend, door Polycomb onderdrukt — facultatief [heterochromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), de toestand van een ontwikkelingsgen dat in deze lijn is uitgezet maar in andere wordt gebruikt, zodat $B$ het gen is dat in een ander celtype actief kan zijn. $C$: zwijgend, constitutief [heterochromatine](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (de HP1-route), meestal herhalingen of genen die in elk celtype zwijgen.

**Oefening 1.8 ★★.**

Een vrouw draagt op één chromosoom 15 een deletie van de *UBE3A*-regio maar is gezond. Haar vader droeg dezelfde deletie en was eveneens gezond. Op welk syndroom loopt elk van haar kinderen risico, en met welke kans? En als de deletie van haar moeder was gekomen?

**Oplossing van Oefening 1.8.**

*UBE3A* komt in neuronen alleen vanaf het moederlijke allel tot expressie. Haar deletie kwam van haar vader, op het allel dat toch al zwijgt, dus is zij gezond; geeft zij hem door, dan wordt het een moederlijke deletie: elk kind heeft kans $1/2$ hem te erven en heeft dan het syndroom van Angelman. Was de deletie van haar moeder gekomen, dan zou zij zelf het syndroom van Angelman hebben; een gezonde draagster kan hem alleen van vaderskant hebben geërfd. (Een vaderlijke deletie van de hele regio zou Prader–Willi geven; *UBE3A* alleen is daarvoor niet genoeg.)

**Oefening 1.9 ★★.**

Voorspel wat er in een vrouwelijk muizenembryo gebeurt als het *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*-gen van één X-chromosoom wordt verwijderd; en van beide. Voorspel wat een *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*-transgen dat in een autosoom is ingebouwd met dat autosoom doet.

**Oplossing van Oefening 1.9.**

Een X zonder *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* kan niet worden geïnactiveerd, dus zwijgt de andere X in elke cel: de inactivatie is volledig maar niet langer willekeurig (scheef), en het embryo is levensvatbaar. Beide X zonder *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*: geen inactivatie, twee actieve X-chromosomen, tweevoudige X-gebonden expressie, en het vrouwelijke embryo sterft vroeg. Een *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*-transgen op een autosoom bekleedt dat autosoom in cis en legt zijn genen stil, wat functieverlies van één autosomale kopie geeft — het experiment dat liet zien dat *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* voldoende is voor uitschakeling in cis.

**Oefening 1.10 ★★★.**

Leg met [Voorbeeld 1.9](#ex-b3-chromatin-epigenetics-cpg-deficit) uit waarom [CpG-eilanden](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) hun [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s hebben behouden terwijl de rest van het genoom er vier vijfde van heeft verloren, en wat dit zegt over de methyleringstoestand van de eilanden in de kiembaan op evolutionaire tijdschaal. Waarom gaat het argument niet op voor een gen dat alleen in de lever gemethyleerd is?

**Oplossing van Oefening 1.10.**

Gemethyleerde cytosines deamineren tot thymine, dat het herstel niet herkent, zodat een gemethyleerd [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) met hoge snelheid tot TpG of CpA muteert. Alleen sequenties die generatie na generatie in de *kiembaan* ongemethyleerd blijven behouden hun [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s; de eilanden hebben de hunne behouden, dus zijn zij het grootste deel van de geschiedenis van de gewervelden in de kiembaan ongemethyleerd geweest. Een gen dat alleen in de lever gemethyleerd is, is in zaadcel en eicel ongemethyleerd; mutaties die in levercellen ontstaan worden niet geërfd, dus laat somatische methylering geen spoor in de sequentie na.

**Oefening 1.11 ★★★.**

Laat met de lus van [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) en [lezer](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) uit [Propositie 1.5](#prop-b3-chromatin-epigenetics-readers) zien hoe een domein van H3K9me3 stabiel kan blijven door de replicatie heen, hoewel elke deling de gemerkte [histonen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) tweevoudig verdunt met nieuwe ongemerkte. Wat bepaalt waar het domein ophoudt zich uit te breiden? Stel een experiment voor om die verklaring te toetsen.

**Oplossing van Oefening 1.11.**

Bij de replicatie worden de oude, gemerkte [histonen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) over de twee dochterduplexen verdeeld en afgewisseld met nieuwe, ongemerkte, zodat elk dochterdomein ongeveer half gemerkt is. HP1 dat aan een behouden gemerkt [nucleosoom](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) bindt trekt SUV39H aan, dat de ongemerkte buren methyleert; zolang de gemerkte [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) dicht genoeg staan om bij elk gat een [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) te brengen, is het domein vóór de volgende deling weer gevuld — dezelfde terugkoppeling als de hoge $\mu$ van de stelling. De uitbreiding stopt bij grenzen: isolatoreiwitten (CTCF), sterk getranscribeerde genen en tRNA-genen, [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) met onverenigbare actieve merktekens (H3K4me3, [acetylering](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code)) die de [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) niet kan gebruiken, en het punt waar de [wissers](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) (demethylasen, verloop van HDAC’s) de [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) voorbijstreven. Toets: trek HP1 kortstondig naar een reportergen (een fusie met een DNA-bindend domein waarvan de binding met een geneesmiddel wordt geregeld), laat het weer los, en volg de stilte van het reportergen en H3K9me3 over de delingen; verwacht een voortduren dat van de [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) afhangt, en verlies wanneer de [schrijver](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) of de dimerisatie van de [lezer](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) gemuteerd is, of wanneer een isolator binnen het domein wordt geplaatst.

**Oefening 1.12 ★★★.**

Een studie meldt dat de kleinkinderen van mensen die een hongersnood hebben meegemaakt een afwijkende methylering bij een groeigen en een hogere lichaamsmassa hebben. Noem de alternatieve verklaringen die moeten worden uitgesloten voordat men mag besluiten dat een methyleringsmerkteken via de kiembaan is doorgegeven, en zeg welk experiment bij muizen de vraag zou beslechten.

**Oplossing van Oefening 1.12.**

Sluit uit: een gedeeld milieu (de eigen voeding en armoede van de kleinkinderen); een baarmoedereffect — de dochter van de aan de hongersnood blootgestelde moeder was een foetus met haar kiemcellen al aanwezig, zodat de kiembaan van het kleinkind rechtstreeks werd blootgesteld en het effect niet transgenerationeel is; genetische verschillen tussen families die het overleefden en families die dat niet deden; omgekeerde oorzakelijkheid (lichaamsmassa verandert zelf de methylering in bloed); verschillen in de samenstelling van de bloedcellen; en meervoudig toetsen over vele [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s. Muizenexperiment: stel ingeteelde F$_0$-*mannetjes* bloot (geen route via de baarmoeder), paar ze met niet-blootgestelde vrouwtjes of gebruik in-vitrofertilisatie met embryotransfer, en volg F$_2$ en F$_3$ langs de vaderlijke lijn, met meting van de methylering in de zaadcellen van elke generatie; een merkteken dat in de zaadcellen en het fenotype van F$_3$ blijft, in een stam zonder genetische variatie, is overdracht via de kiembaan.

## 1.7 Vraagstuk: het geheugen van een uitgeschakeld gen

**Probleem 1.1.**

Weekendvraagstuk — een menselijk genoom gepakt in zijn kern, een methyleringsmerkteken gevolgd door de delingen heen, een lapjeskat gelezen als een klonale kaart en de ziekten van een geïmprinte regio geteld, met als besluit het aantal delingen dat een merkteken zonder terugkoppeling overleeft en de grootte van de celpopulatie die haar X koos

Gegevens: een menselijke diploïde kern bevat $6.4\times 10^{9}$ basenparen, à $0.34\,\mathrm{nm}$ en $650\,\mathrm{Da}$ per paar; de nucleosoomherhaling is $200\,\mathrm{bp}$, een histonoctameer weegt $108\,\mathrm{kDa}$, en een kerndeeltje is een schijf van $11\,\mathrm{nm}$ doorsnede en $5.5\,\mathrm{nm}$ dik. De kern is een bol met diameter $10\,\text{µ}\mathrm{m}$. Het genoom is voor $42\,\%$ G$+$C. Methylering op een gewoon [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation): $\mu = 0.99$, $\delta = 0.02$ per deling.

**Deel I — Pakking.**

1. Bereken de totale lengte van het DNA in de kern en het aantal [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) .
2. Bereken de totale massa aan [histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (alleen octameren) en aan DNA, in picogram ( $1\,\mathrm{Da} = 1.66 \times 10^{-24}\,\mathrm{g}$ ).
3. Bereken het volume van de kern en het totale volume van de kerndeeltjes, opgevat als cilinders. Welk deel van de kern vullen zij?
4. Als de [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) als een $10\,\mathrm{nm}$ -vezel achter elkaar zouden liggen, hoe lang zou die vezel dan zijn, en wat is de [pakkingsgraad](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) ten opzichte van naakt DNA?
5. De vezel is gevouwen tot lussen van $200\,\mathrm{kb}$ verankerd door cohesine. Hoeveel lussen, en hoeveel [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) per lus?
6. Hoeveel CpG-dinucleotiden zou het diploïde genoom onder de aanname van onafhankelijkheid bevatten? Het waargenomen aantal is $5.6\times 10^{7}$ . Welk deel is verloren gegaan, en door welk mutatiemechanisme?

**Deel II — Een merkteken door de delingen heen.**

7. Schrijf de recursie voor $p_{n}$ op en bereken $p^{*}$ .
8. Een [promotor-CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) is bij $n = 0$ volledig gemethyleerd. Bereken $p_{n}$ na $10$ , $50$ en $200$ delingen.
9. Na hoeveel delingen is het overschot $p_{n} - p^{*}$ gehalveerd? Een weefselstamcel deelt ongeveer eens per week: hoeveel jaar is dat?
10. Een geneesmiddel remt [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) volledig ( $\mu = 0$ ) en DNMT3 eveneens ( $\delta = 0$ ). Laat zien dat de fractie gemethyleerde strengen in de populatie bij elke deling halveert, en bepaal het aantal delingen om $80\,\%$ methylering onder $5\,\%$ te brengen.
11. In een uitgeschakeld eiland trekken de methyl-CpG-lezers H3K9-methylering aan, die DNMT3 aantrekt, zodat binnen het eiland $\mu = 0.9995$ en $\delta = 0.0005$ . Herbereken de halveringstijd van het overschot, in delingen en in jaren bij één deling per week.
12. Leg in één zin uit waarom de uitkomst van vraag 11 en niet die van vraag 9 is wat een levenslang uitgeschakeld gen vereist, en welke moleculaire opstelling haar voortbrengt.

**Deel III — De kaart van de lapjeskat.**

13. Een kat is heterozygoot voor het X-gebonden oranjegen. Leg uit waarom haar vacht oranje en zwarte plekken heeft en wat één plek voorstelt.
14. De [X-inactivatie](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) vond plaats toen de cellen die de huid zouden vormen met $N$ waren. Elk koos willekeurig een X. Wat is de kans dat alle $N$ dezelfde kozen, wat een eenkleurige kat zou geven?
15. Onder misschien een miljard katten is zo’n eenkleurige heterozygoot nooit beschreven; neem de kans op $10^{-9}$ en schat $N$ .
16. Het huidoppervlak van de kat is ongeveer $0.3\,\mathrm{m}^{2}$ en haar plekken zijn gemiddeld $15\,\mathrm{cm}^{2}$ . Schat het aantal plekken, en leg uit waarom het groter is dan $N$ .
17. Een XXY-kater is ook een lapjeskat. Hoeveel [Barr-lichaampjes](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) tonen zijn cellen? Hoeveel bij een XXX-vrouwtje en bij een XY-mannetje?
18. Een gen dat aan de inactivatie ontsnapt is bij vrouwtjes in twee actieve kopieën aanwezig en bij mannetjes in één. Geef één reden waarom zulke ontsnapping verdragen kan worden en één situatie waarin zij ertoe doet.

**Deel IV — Chromosoom 15.**

19. Het syndroom van Prader–Willi treft ongeveer één geboorte op $15\,000$ ; $70\,\%$ van de gevallen is een de-novodeletie van het vaderlijke 15q11–q13 en $25\,\%$ een moederlijke [uniparentale disomie](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) . Bereken de geboortefrequentie van elke oorzaak.
20. Het syndroom van Angelman heeft ongeveer dezelfde frequentie; $70\,\%$ zijn moederlijke deleties, $5\,\%$ vaderlijke disomieën en $10\,\%$ puntmutaties van *UBE3A* . Waarom zijn puntmutaties wel een oorzaak van Angelman maar vrijwel nooit van Prader–Willi?
21. Een vader draagt een gebalanceerde translocatie die $20\,\%$ van zijn zaadcellen een deletie van 15q11–q13 geeft. Welk deel van zijn kinderen krijgt Prader–Willi, en welk deel Angelman?
22. [Uniparentale disomie](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) ontstaat wanneer een trisome zygote één chromosoom verliest. Als een trisomie-15-zygote willekeurig een van haar drie chromosomen verliest, en de trisomie van de moeder kwam (twee moederlijke kopieën), wat is dan de kans dat de overlevende moederlijke disomie heeft? Welk syndroom?
23. De Prader–Willi-genen komen vaderlijk tot expressie en het Angelman-gen moederlijk. Zeg met de verwantschapstheorie welke van de symptomen van de twee syndromen (voedingsproblemen bij de geboorte tegenover vraatzucht) bij de theorie passen en welke moeilijker te plaatsen zijn.
24. Er wordt een methode voorgesteld om Angelman te behandelen door het zwijgende vaderlijke *UBE3A* weer aan te zetten. Zijn stilte komt door een vaderlijk tot expressie komend antisense-RNA. Stel het moleculaire doelwit voor en zeg waarom de therapie de andere geïmprinte genen niet zou verstoren.
25. Vat samen: de halveringstijd van een merkteken zonder terugkoppeling (vraag 9) en met terugkoppeling (vraag 11), in delingen; en de stichterspopulatie $N$ van de lapjesvacht (vraag 15).

**Oplossing van Probleem 1.1.**

**1.** $6.4\times 10^{9}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 2.2\,\mathrm{m}$; $6.4\times 10^{9}/200 = 3.2\times 10^{7}$ [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome). **2.** [Histon](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome): $3.2\times 10^{7}\times 1.08\times 10^{5} =
3.5\times 10^{12}$ Da $= 5.7\,\mathrm{pg}$. DNA: $6.4\times 10^{9}\times
650 = 4.2\times 10^{12}$ Da $= 6.9\,\mathrm{pg}$. Vergelijkbare massa’s. **3.** Kern: $\tfrac{4}{3}\pi\,(5\,\text{µ}\mathrm{m})^{3} =
520\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$. Kerndeeltje: $\pi\,(5.5)^{2}\times 5.5 =
520\,\mathrm{nm}^{3} = 5.2\times 10^{-7}\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$; totaal $3.2\times 10^{7}\times 5.2\times 10^{-7} = 17\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$: ongeveer $3\,\%$ van de kern. **4.** $3.2\times 10^{7}\times 11\,\mathrm{nm} = 0.35\,\mathrm{m}$; [pakkingsgraad](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) $2.2/0.35 \approx 6$. **5.** $6.4\times 10^{9}/2\times 10^{5} = 32\,000$ lussen van elk $1000$ [nucleosomen](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome). **6.** $0.21^{2}\times 6.4\times 10^{9} = 2.8\times 10^{8}$; waargenomen $5.6\times 10^{7}$, dus $80\,\%$ verloren, door deaminering van 5-methylcytosine tot thymine (niet-herstelde C$\to$T-transities op gemethyleerde [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation)’s). **7.** $p_{n+1} = 0.99\,p_{n} + 0.02\,(1 - p_{n}) = 0.97\,p_{n} +
0.02$; $p^{*} = 0.02/0.03 = 0.67$. **8.** $p_{n} = 0.67 + 0.33\times 0.97^{n}$: $n = 10$: $0.91$; $n = 50$: $0.74$; $n = 200$: $0.67$ (het overschot is $7\times 10^{-4}$). **9.** $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ delingen; bij één per week ongeveer $23$ weken — vijf maanden. **10.** Elke replicatie koppelt één oude streng, nog gemethyleerd, aan één nieuwe streng die geen enzym methyleert; er komen geen oude strengen bij en er gaan er geen verloren, het aantal strengen verdubbelt, dus halveert de gemethyleerde fractie. $0.80/2^{n} < 0.05$ vereist $2^{n} > 16$: vijf delingen ($0.025$; vier geven precies $5\,\%$). **11.** Verhouding $0.9995 - 0.0005 = 0.999$; halveringstijd $\ln
2/(-\ln 0.999) \approx 690$ delingen, ongeveer $13$ jaar bij één per week. **12.** Een gen dat een leven lang van zo’n $4000$ wekelijkse delingen zwijgt heeft een halveringstijd van honderden delingen nodig, en die geeft alleen de terugkoppeling van vraag 11: [lezers](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) van het merkteken (MeCP2, HP1) trekken zijn [schrijvers](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) aan (H3K9-methylase, DNMT3), zodat een dicht domein van merktekens zichzelf kopieert met een efficiëntie die geen enkel enzym alleen haalt. **13.** De ene X draagt het oranje allel, de andere het zwarte; elke huidcel heeft één X uitgeschakeld en brengt alleen de andere tot expressie; de afstammelingen van een cel houden haar keuze, dus is een plek een kloon (of een groep aangrenzende klonen) die dezelfde keuze maakte. **14.** Alle $N$ kiezen de X met oranje, of alle kiezen de andere: $2\times (1/2)^{N} = 2^{1-N}$. **15.** $2^{1-N} = 10^{-9}$: $N - 1 = \log_{2} 10^{9} = 29.9$, $N \approx 30$ cellen. **16.** $3000\,\mathrm{cm}^{2}/15\,\mathrm{cm}^{2} = 200$ plekken, veel meer dan $30$ stichters: tijdens de groei worden de afstammelingen van een stichter door celmenging en migratie verspreid, zodat één kloon verscheidene eilanden vormt (en buren met dezelfde keuze versmelten, wat de andere kant op werkt maar minder). **17.** Eén [Barr-lichaampje](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) per X boven de eerste: XXY één, XXX twee, XY geen. **18.** Verdragen wanneer het gen een werkzame Y-homoloog heeft, zodat mannetjes ook twee kopieën hebben (de pseudoautosomale genen en paren als *KDM5C*/*KDM5D*); het doet ertoe bij aneuploïdieën van X — bij het syndroom van Turner (XO) zijn de ontsnapte genen in enkelvoud aanwezig, en daarom is een XO-individu niet eenvoudig een normaal vrouwtje (haplo-insufficiëntie van *SHOX* en kleine gestalte), en bij XXY zijn de ontsnappers overgedoseerd. **19.** $1/15\,000 = 6.7\times 10^{-5}$; deleties $0.70\times
6.7\times 10^{-5} = 4.7\times 10^{-5}$ (één op $21\,000$); moederlijke disomie $1.7\times 10^{-5}$ (één op $60\,000$). **20.** Angelman is het verlies van één gen, *UBE3A*, dus volstaat één puntmutatie in het moederlijke allel. Prader–Willi is het verlies van verscheidene vaderlijk tot expressie komende genen tegelijk (*SNRPN*, het cluster kleine RNA’s); een puntmutatie schakelt er één van uit en geeft hoogstens een gedeeltelijk fenotype, nooit het hele syndroom. **21.** $20\,\%$ van de kinderen krijgt een vaderlijke deletie en heeft Prader–Willi; geen enkel kind heeft Angelman, waarvoor een moederlijke deletie nodig is. **22.** Drie chromosomen, twee moederlijke en één vaderlijke, waarvan er willekeurig één verloren gaat: het vaderlijke gaat verloren met kans $1/3$, wat moederlijke disomie en Prader–Willi oplevert; met kans $2/3$ gaat een moederlijke kopie verloren en is het kind normaal. **23.** Vaderlijke genen zouden de vraag aan de moeder moeten opdrijven; hun verlies (Prader–Willi) zou de vraag moeten verlagen — wat past bij het slechte zuigen en het niet gedijen van de pasgeborene — terwijl de latere onverzadigbare eetlust het tegenovergestelde is en moeilijker te plaatsen (een voorgestelde lezing is dat de vaderlijke genen het kind normaal naar het spenen toe sturen). Angelman, het verlies van een moederlijk gen, zou de vraag moeten verhogen; het langdurige zuigen en het veelvuldig wakker worden van Angelman-kinderen passen daarbij, de epilepsie en het verlies van spraak gaan helemaal niet over hulpbronnen. **24.** Neem als doelwit het vaderlijke antisense-transcript (*UBE3A-ATS*) met een antisense-oligonucleotide dat het afbreekt of zijn verlenging blokkeert: het vaderlijke *UBE3A* is intact en wordt alleen in cis door dat RNA uitgeschakeld, dus herstelt het weghalen van het RNA zijn expressie. De methylering van de [imprintingcontroleregio](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) blijft onaangeroerd, zodat *SNRPN* en de andere geïmprinte genen hun normale ouderlijke patroon houden. **25.** Halveringstijd van een merkteken: ongeveer $23$ delingen zonder terugkoppeling, ongeveer $690$ met terugkoppeling; de lapjesvacht werd beslist door een stichterspopulatie van ongeveer $30$ cellen.