--- title: "Niet-coderende RNA’s en posttranscriptionele regulatie" book: "Universitaire biologie — jaar 3" subject: biology language: nl chapter: 2 exercises: 12 source: https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/2-niet-coderende-rnas-en-posttranscriptionele-regulatie --- # Hoofdstuk 2 — Niet-coderende RNA’s en posttranscriptionele regulatie In 1990 probeerden twee plantenbiologen petunia’s dieper paars te maken door ze extra kopieën van het gen voor het pigmentenzym te geven. Bijna de helft van de transgene planten kwam er wit uit, of paars met witte sectoren: het toegevoegde gen had de eigen kopie van de plant samen met zichzelf uitgeschakeld. Acht jaar later vonden twee wormgenetici die RNA in *Caenorhabditis elegans* injecteerden dat een dubbelstrengs RNA dat bij een spiergen paste dat gen uitschakelde, in de geïnjecteerde worm en in haar nageslacht, veel krachtiger dan elk van beide strengen afzonderlijk. De twee raadsels hadden één antwoord: cellen bezitten een machinerie die met korte RNA’s RNA’s met een passende sequentie opspoort en uitschakelt. Die machinerie, en de bredere wereld van regulatie die een boodschapper-RNA ondergaat nadat het is afgeschreven — hoe het wordt gesplitst, waarheen het wordt gestuurd, hoe lang het leeft, of het wordt vertaald — is het onderwerp van dit hoofdstuk. Het boek van jaar 1 behandelde het gen als een eenheid die aan of uit staat bij haar promotor; hier wordt het transcript zelf het voorwerp van sturing. ## 2.1 De RNA-telling van een cel **Definitie 2.1 (Niet-coderend RNA).** Een *niet-coderend RNA* (ncRNA) is een transcript dat als RNA werkt en niet als matrijs voor een eiwit. Behalve de ribosomale en transfer-RNA’s van de translatie en de *kleine nucleaire RNA’s* (snRNA’s) van het spliceosoom bevat een eukaryote cel: *microRNA’s* (miRNA’s), $21\text{ tot }23$ nucleotiden, geknipt uit haarspelden in de eigen transcripten van de cel en sturend bij de onderdrukking van deels complementaire boodschappers; *kleine interfererende RNA’s* (siRNA’s), even lang, geknipt uit lang dubbelstrengs RNA en sturend bij de knip van volmaakt passende doelwitten; *Piwi-interagerende RNA’s* ([piRNA’s](#def-b3-rna-regulation-pirna)), $26\text{ tot }31$ nucleotiden, werkzaam in de kiembaan tegen transposons; kleine nucleolaire RNA’s die de modificatie van rRNA sturen; en *lange niet-coderende RNA’s* (lncRNA’s), transcripten langer dan $200\,\mathrm{nt}$ zonder open leesraam van betekenis, waarvan *[Xist](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* uit [Hoofdstuk 1](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#ch-b3-chromatin-epigenetics) het best begrepen is. Eiwitcoderende exons beslaan ongeveer $1.5\,\%$ van het menselijk genoom; een groot deel van de rest wordt ooit in een of andere cel afgeschreven, maar hoeveel van die transcriptie functioneel is, is een open vraag. **Opmerking 2.2 (Overvloed is geen functie).** Een transcript kan aantoonbaar zijn omdat het polymerase lekt, niet omdat het RNA iets doet; de meeste lncRNA’s komen in minder dan één kopie per cel voor, zijn slecht geconserveerd en zijn bij deletie misbaar. De toets op functie is genetisch: een fenotype wanneer het RNA, en niet enkel zijn DNA, wordt weggehaald. *[Xist](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*, de miRNA’s en de [piRNA’s](#def-b3-rna-regulation-pirna) doorstaan haar overtuigend; van de tienduizenden geannoteerde lncRNA’s hebben er tot nu toe enkele honderden dat gedaan. ## 2.2 RNA-interferentie en de microRNA’s **Definitie 2.3 (RNA-interferentie).** *RNA-interferentie* (RNAi) is de sequentiespecifieke uitschakeling van een gen door een klein RNA dat van dubbelstrengs RNA afkomstig is. Het enzym *Dicer*, een RNase III, knipt lang dubbelstrengs RNA in duplexen van $21\text{ tot }23$ nucleotiden met 3$'$-overhangen van twee nucleotiden; van elke duplex wordt één streng, de gids, in een *Argonaute*-eiwit geladen, waarmee het *RNA-geïnduceerde uitschakelingscomplex* (RISC) ontstaat. De gids paart met een complementair doel-RNA, en het endonucleasedomein van Argonaute knipt het doelwit tegenover de nucleotiden 10 en 11 van de gids; het geknipte RNA wordt daarna afgebroken en het RISC komt vrij om een volgend te zoeken. Bij planten, wormen en schimmels kopieert een RNA-afhankelijk RNA-polymerase het doelwit tot nieuw dubbelstrengs RNA, zodat het signaal wordt versterkt en zich verspreidt; zoogdieren missen die stap. **Bewijsmateriaal.** Napoli, Lemieux en Jorgensen (1990) brachten een extra gen voor chalconsynthase in petunia om de bloemkleur te versterken; $42\,\%$ van de transformanten was wit of bont, met zowel het transgen als het endogene gen uitgeschakeld — “cosuppressie”. Guo en Kemphues (1995) vonden dat antisense-RNA tegen een gen van *C. elegans* dat gen uitschakelde, maar de sensecontrole deed dat ook. Fire, Mello en collega’s (1998) losten de tegenspraak op: hun preparaten van enkele strengen waren verontreinigd met dubbele strengen, en gezuiverd dubbelstrengs RNA van *unc-22* dat in een worm werd gespoten gaf het trillende *unc-22*-fenotype bij concentraties van enkele moleculen per cel, terwijl zuiver sense- of antisense-RNA vrijwel niets gaf; de uitschakeling drong door tot in weefsels ver van de injectieplaats en tot in het nageslacht. Hamilton en Baulcombe (1999) toonden de RNA’s van $25\,\mathrm{nt}$ aan in uitgeschakelde planten, en Zamore en collega’s (2000) lieten in een vliegenextract zien dat het dubbelstrengs RNA daarin wordt geknipt en dat het doelwit om de $21\,\mathrm{nt}$ wordt gesneden. ∎ ![Links: petunia’s met een extra pigmentgen, met de witte sectoren van cosuppressie. Rechts: de nematode Caenorhabditis elegans, ongeveer een millimeter lang en doorzichtig, waarin geïnjecteerd dubbelstrengs RNA het passende gen in het hele dier en in zijn nageslacht uitschakelde.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-rna-regulation/img-bfed7e5dd10c.jpg) ![Links: petunia’s met een extra pigmentgen, met de witte sectoren van cosuppressie. Rechts: de nematode Caenorhabditis elegans, ongeveer een millimeter lang en doorzichtig, waarin geïnjecteerd dubbelstrengs RNA het passende gen in het hele dier en in zijn nageslacht uitschakelde.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-rna-regulation/img-4f3c5b185165.jpg) *Links: petunia’s met een extra pigmentgen, met de witte sectoren van cosuppressie. Rechts: de nematode *Caenorhabditis elegans*, ongeveer een millimeter lang en doorzichtig, waarin geïnjecteerd dubbelstrengs RNA het passende gen in het hele dier en in zijn nageslacht uitschakelde.* **Definitie 2.4 (MicroRNA’s).** Een *[microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna)* is in het genoom gecodeerd — in een eigen gen of in een intron van een eiwitcoderend gen — en wordt door RNA-polymerase II afgeschreven als een lang primair transcript (pri-miRNA) met een haarspeld van ongeveer $70\,\mathrm{nt}$. In de kern knipt het RNase III *Drosha*, met zijn partner DGCR8, de haarspeld eruit (het pre-miRNA); exportine-5 brengt haar naar het cytoplasma, waar [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai) de lus verwijdert en een duplex van $22\,\mathrm{nt}$ overblijft. Eén streng wordt in [Argonaute](#def-b3-rna-regulation-rnai) geladen. Het rijpe miRNA herkent zijn doelwitten vooral via zijn *seed*, de nucleotiden 2 tot 8, die paart met plaatsen die meestal in de 3$'$-niet-vertaalde regio van een boodschapper liggen; de rest van het miRNA paart onvolledig, zodat het doelwit niet wordt geknipt maar onderdrukt: het [RISC](#def-b3-rna-regulation-rnai) trekt eiwitten aan die de poly(A)-staart inkorten, de kap verwijderen en de translatie remmen, en de boodschapper wordt sneller afgebroken. Omdat een seed maar zeven nucleotiden telt, heeft één miRNA honderden doelwitten, en meer dan de helft van de menselijke eiwitcoderende genen draagt geconserveerde plaatsen voor minstens één van de enkele honderden zeker geïdentificeerde menselijke miRNA’s. **Bewijsmateriaal.** *lin-4*, een gen dat de worm nodig heeft om van zijn eerste larvale stadium naar het tweede te gaan, bleek bij Lee, Feinbaum en Ambros (1993) niet voor een eiwit te coderen maar voor een RNA van $22\,\mathrm{nt}$, complementair aan zeven plaatsen in de 3$'$-niet-vertaalde regio van de boodschapper van *lin-14*, het gen waarvan bekend was dat het het onderdrukte. Wanneer de larve het tweede stadium ingaat verdwijnt het LIN-14-eiwit terwijl zijn mRNA blijft: de onderdrukking is posttranscriptioneel. Reinhart en collega’s (2000) vonden een tweede zo’n RNA, *let-7*, dat de latere larvale overgangen stuurt; Pasquinelli (2000) vond *let-7* bij vliegen en mensen, met dezelfde sequentie, en dat maakte van een wormcuriositeit een algemeen mechanisme. ∎ ![Biogenese van een microRNA. De haarspeld wordt in de kern door Drosha uit het primaire transcript geknipt, geëxporteerd, door Dicer bijgesneden tot een duplex van 22\, nt, en één streng wordt in Argonaute geladen. De seed paart met een plaats in de 3'-niet-vertaalde regio van een boodschapper, en de boodschapper wordt gedeadenyleerd, afgebroken en minder vertaald.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-rna-regulation/fig-1ac6b213c8c0.svg) *Biogenese van een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna). De haarspeld wordt in de kern door [Drosha](#def-b3-rna-regulation-mirna) uit het primaire transcript geknipt, geëxporteerd, door [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai) bijgesneden tot een duplex van $22\,\mathrm{nt}$, en één streng wordt in [Argonaute](#def-b3-rna-regulation-rnai) geladen. De seed paart met een plaats in de 3$'$-niet-vertaalde regio van een boodschapper, en de boodschapper wordt gedeadenyleerd, afgebroken en minder vertaald.* **Stelling 2.5 (Wat een microRNA doet met het niveau en de snelheid van een boodschapper).** Een boodschapper wordt met constante snelheid $k$ gemaakt en met eerste-ordesnelheid $\gamma$ afgebroken; een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) op niveau $R$ voegt een afbraakterm $\gamma' R\, m$ toe. Dan voldoet het mRNA-niveau $m(t)$ aan $$ \frac{\mathrm{d}m}{\mathrm{d}t} = k - (\gamma + \gamma' R)\, m, \qquad m^{*} = \frac{k}{\gamma + \gamma' R}, \qquad m(t) = m^{*} + (m_{0} - m^{*})\,e^{-(\gamma + \gamma' R)t}. $$ Het [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) verlaagt de evenwichtstoestand met de factor $1 + \gamma' R/ \gamma$ en verkort de tijdconstante van elke verandering in $m$ met diezelfde factor, van $1/\gamma$ tot $1/(\gamma + \gamma' R)$. Een gen onder microRNA-sturing is daarom zowel stiller als sneller: het bereikt na een verandering van zijn promotor eerder een nieuwe evenwichtstoestand, en schommelingen in zijn transcriptie worden gedempt. **Bewijs.** De vergelijking is lineair met constante coëfficiënten; haar vaste punt is $m^{*}$, waar het rechterlid verdwijnt, en met $u = m - m^{*}$ komt er $\mathrm{d}u/\mathrm{d}t = -(\gamma + \gamma' R)\,u$, vanwaar de exponentiële vorm. De halveringstijd van de nadering is $\ln 2/(\gamma + \gamma' R)$, en $\gamma = \ln 2 / t_{1/2}$ met $t_{1/2}$ de natuurlijke halveringstijd van de boodschapper. ∎ **Voorbeeld 2.6 (Een viervoudige onderdrukking).** Een boodschapper met een natuurlijke halveringstijd van $30\,\mathrm{min}$ ($\gamma = 0.023\,\mathrm{min}^{-1}$), afgeschreven met $k = 2$ moleculen per minuut, staat op $m^{*} = 2/0.023 \approx 87$ kopieën per cel en heeft $30\,\mathrm{min}$ nodig om na een verandering van zijn promotor halverwege een nieuw niveau te komen. Een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) dat zijn afbraaksnelheid verdrievoudigt ($\gamma' R = 3\gamma$) brengt hem op $22$ kopieën en snijdt de halveringstijd terug tot $7.5\,\mathrm{min}$. Dezelfde getallen, achterstevoren gelezen, laten zien waarom uitschakeling van een miRNA vaak milde fenotypen geeft: een viervoudige verandering in een boodschapper die stroomafwaarts zelf gebufferd is kan het organisme bijna normaal laten, en het effect komt onder stress of in de timing naar voren. ![Stijging van een boodschapper nadat zijn promotor is aangezet, met de getallen van . Het microRNA verlaagt het plateau viervoudig en bereikt het vier keer zo snel.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-rna-regulation/fig-2d3b11567884.svg) *Stijging van een boodschapper nadat zijn promotor is aangezet, met de getallen van [Voorbeeld 2.6](#ex-b3-rna-regulation-fourfold). Het [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) verlaagt het plateau viervoudig en bereikt het vier keer zo snel.* **Methode 2.7 (Een gen uitschakelen met RNAi).** Om een gen uit te schakelen zonder zijn DNA aan te raken: (1) kies een sequentie van $21\,\mathrm{nt}$ die uniek is voor zijn boodschapper en vermijd seedovereenkomsten met andere genen; (2) lever haar aan als synthetische siRNA-duplex (tijdelijk, enkele dagen) of als een kort haarspeld-RNA (shRNA) dat vanuit een vector tot expressie komt en dat [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai) doorlopend verwerkt; voeder wormen bacteriën die het dubbelstrengs RNA tot expressie brengen; (3) meet de boodschapper met kwantitatieve PCR en het eiwit met een immunoblot, en verwacht $70\text{ tot }95\,\%$ verlies in plaats van de volledige afwezigheid van een knockout; (4) controleer op effecten buiten het doelwit met een tweede, niet-overlappend [siRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) en met een redding door een RNAi-bestendige versie van het gen. Een knockdown is een gedeeltelijk, omkeerbaar functieverlies; de gentherapieën die op dit beginsel zijn goedgekeurd leveren [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) tegen boodschappers van de lever (transthyretine, PCSK9), gekoppeld aan een suiker die de hepatocyt opneemt. ## 2.3 Kleine RNA’s die het genoom bewaken **Definitie 2.8 (piRNA’s en het uitschakelen van transposons).** *piRNA’s* zijn RNA’s van $26\text{ tot }31$ nucleotiden, gemaakt zonder [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai) uit lange enkelstrengs transcripten van genomische *piRNA-clusters* — kerkhoven van defecte transposonkopieën — en geladen in de PIWI-onderfamilie van de Argonaute-eiwitten in de kiembaan. Een piRNA dat antisense is aan een transposon stuurt de knip van de transcripten van dat transposon; het geknipte fragment wordt een nieuw sense-piRNA, dat op zijn beurt clustertranscripten knipt om meer antisense-piRNA’s te maken — de *ping-pongcyclus*, een versterking die zich richt op het transposon dat op dat moment actief is. Nucleaire PIWI-eiwitten sturen ook H3K9-methylering en [DNA-methylering](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) naar de genomische kopieën van het transposon, wat het RNA verbindt met de chromatinemerktekens van [Hoofdstuk 1](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#ch-b3-chromatin-epigenetics). Een moeder legt haar piRNA’s in de eicel; een vrouwtje uit een lijn die nooit een bepaald transposon heeft ontmoet heeft er geen piRNA’s tegen, en haar nakomelingen van een mannetje dat het draagt zijn steriel — *hybride dysgenese*, voor het eerst gezien bij kruisingen van *Drosophila* tussen laboratorium- en wilde stammen. **Propositie 2.9 (RNA-gestuurde uitschakeling via chromatine).** Bij planten methyleert een eigen route — RNA-polymerase IV schrijft een locus af, een RNA-afhankelijk RNA-polymerase maakt het transcript dubbelstrengs, een [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai) knipt [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) van $24\,\mathrm{nt}$, [Argonaute](#def-b3-rna-regulation-rnai) 4 brengt ze terug naar de ontluikende transcripten van polymerase V op dezelfde locus en trekt het methyltransferase DRM2 aan — het DNA van transposons en herhaalde sequenties; zij is het mechanisme van de paramutatie. Bij splijtgist trekken [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) uit de centromere herhalingen het H3K9-methyltransferase aan en bouwen zij het [heterochromatine](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) dat het centromeer nodig heeft. In beide gevallen vindt een RNA door complementariteit een plaats in het genoom en wordt daar een chromatinemerkteken geschreven: sequentiespecifiek, zichzelf versterkend en erfelijk door de delingen heen. ## 2.4 Het leven van een boodschapper **Definitie 2.10 (Gereguleerde splicing).** Alternatieve splicing maakt uit één gen verschillende boodschappers door het *overslaan van een exon*, de keuze tussen elkaar uitsluitende exons, het behoud van een intron, of het gebruik van andere 5$'$- of 3$'$-splitsplaatsen. Zij wordt gereguleerd door RNA-bindende eiwitten die sequentie-elementen binden in de exons en introns bij een splitsplaats: *SR-eiwitten* gebonden aan exonische enhancers trekken het spliceosoom aan en bevorderen de opname van het exon, *hnRNP*-eiwitten gebonden aan silencers blokkeren haar, en de uitkomst in een gegeven cel wordt bepaald door de verhouding tussen beide soorten. Meer dan $90\,\%$ van de menselijke genen met meerdere exons wordt alternatief gesplitst; het *Dscam*-gen van *Drosophila*, met vier blokken elkaar uitsluitende exons (12, 48, 33 en 2 alternatieven), kan $38\,016$ verschillende eiwitten maken, waarbij elk neuron een andere set tot expressie brengt die zijn takken elkaar laat herkennen en ontwijken. **Bewijsmateriaal.** Het geslacht van een fruitvlieg wordt beslist door een splicingcascade. Bij vrouwtjes maakt het gen *Sex-lethal* (*Sxl*) een werkzaam eiwit; SXL is een RNA-bindend eiwit dat een splitsplaats blokkeert in zijn eigen transcript (zodat een exon met een stopcodon wordt overgeslagen en het eiwit gemaakt blijft worden) en in het transcript van *transformer*, wat de vrouwelijke splitsing afdwingt; TRA bindt daarna, met TRA-2, een exonische enhancer in het *doublesex*-transcript en stuurt de vrouwelijke vorm van de transcriptiefactor DSX. Bij mannetjes, zonder SXL, neemt elk van deze transcripten de standaardsplitsing, bevat *transformer* een stopcodon en komt DSX in de mannelijke vorm uit. Elk geslachtelijk dimorf kenmerk van de vlieg volgt uit welk DSX wordt gemaakt; een vrouwtje met een mutatie in *tra* ontwikkelt zich als mannetje. ∎ **Definitie 2.11 (Stabiliteit en lokalisatie van mRNA).** De *halveringstijd* van een boodschapper loopt van minuten tot dagen en wordt bepaald door elementen in zijn 3$'$-niet-vertaalde regio. *AU-rijke elementen* (AUUUA-herhalingen) in de boodschappers van cytokinen, groeifactoren en proto-oncogenen worden gebonden door eiwitten die deadenylasen aantrekken en halveringstijden van $10\text{ tot }30\,\mathrm{min}$ geven, zodat een uitbarsting van transcriptie een uitbarsting van eiwit oplevert en niet meer dan dat; mutaties die ze weghalen veroorzaken overexpressie en, voor sommige proto-oncogenen, kanker. *Lokalisatie-elementen*, vaak met een structuur, worden gebonden door adaptoren die de boodschapper aan een motor koppelen: de boodschappers van *bicoid* en *oskar* worden door dyneïne en kinesine over microtubuli naar de twee polen van het vliegenei gebracht, de boodschapper van $\beta$-actine naar de voorrand van een fibroblast, en de boodschappers van synaptische eiwitten tot in de dendrieten, waar ze op verzoek worden vertaald. Het *ijzerresponsieve element* (IRE), een steellus die door de ijzerregulerende eiwitten IRP1 en IRP2 wordt gebonden wanneer ijzer schaars is, doet vanuit twee posities twee tegengestelde dingen: in de 5$'$-niet-vertaalde regio van de ferritineboodschapper blokkeert gebonden IRP het ribosoom; in de 3$'$-niet-vertaalde regio van de boodschapper van de transferrinereceptor beschermt gebonden IRP het transcript tegen een nuclease. **Voorbeeld 2.12 (IJzer, gelezen door één haarspeld).** Bij weinig ijzer bindt IRP beide boodschappers: ferritine, het opslageiwit, wordt niet vertaald, en de transferrinereceptor, die ijzer invoert, wordt gestabiliseerd en overvloedig — de cel slaat minder op en voert meer in. Bij veel ijzer wordt IRP1 omgezet in een aconitase (het krijgt een ijzer-zwavelcluster en verliest zijn affiniteit voor RNA) en wordt de afbraak van IRP2 in gang gezet: ferritine wordt vertaald, de boodschapper van de receptor vergaat binnen minuten, en de cel slaat meer op en voert minder in. Er is geen verandering van transcriptie voor nodig. Een puntmutatie in het IRE van ferritine die de binding van IRP verhindert veroorzaakt onophoudelijke ferritinesynthese en het erfelijke hyperferritinemie-cataractsyndroom. ![Het ijzerresponsieve element. Bij weinig ijzer bindt het ijzerregulerende eiwit de IRE-haarspelden: aan het 5'-uiteinde van de ferritineboodschapper blokkeert het de translatie, aan het 3'-uiteinde van de boodschapper van de transferrinereceptor blokkeert het een nuclease. Bij veel ijzer laat het eiwit beide los: ferritine wordt gemaakt, de boodschapper van de receptor vergaat.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-rna-regulation/fig-e2b2dd7f9894.svg) *Het ijzerresponsieve element. Bij weinig ijzer bindt het ijzerregulerende eiwit de IRE-haarspelden: aan het 5$'$-uiteinde van de ferritineboodschapper blokkeert het de translatie, aan het 3$'$-uiteinde van de boodschapper van de transferrinereceptor blokkeert het een nuclease. Bij veel ijzer laat het eiwit beide los: ferritine wordt gemaakt, de boodschapper van de receptor vergaat.* **Propositie 2.13 (Sturing van de translatie).** De initiatiestap is het gebruikelijke aangrijpingspunt van de [sturing van de translatie](#prop-b3-rna-regulation-translation). Fosforylering van de initiatiefactor *eIF2* door kinasen die aminozuurgebrek, ongevouwen eiwitten, viraal dubbelstrengs RNA of haemtekort waarnemen legt de algemene initiatie binnen minuten stil, met uitzondering van enkele boodschappers met bijzondere kenmerken — vooral die met *stroomopwaartse open leesramen*, korte leesramen in de 5$'$-niet-vertaalde regio die normaal ribosomen vangen en die onder stress worden overgeslagen, zodat de stressresponsfactoren (GCN4 bij gist, ATF4 bij zoogdieren) juist worden gemaakt wanneer al het overige dat niet wordt. De kapbindende factor eIF4E wordt inactief gehouden door 4E-bindende eiwitten totdat het groeisignaalkinase mTOR ze fosforyleert: een cel vertaalt pas op volle snelheid wanneer voedingsstoffen en groeifactoren dat zeggen. Bij bacteriën doen *riboswitches* het zonder enig eiwit: een gestructureerde 5$'$-regio bindt een metaboliet (thiaminepyrofosfaat, S-adenosylmethionine, een purine) en vouwt zich bij die binding om, waardoor de ribosoombindingsplaats wordt begraven of een transcriptieterminator ontstaat, zodat een biosynthetisch operon uitgaat wanneer zijn product overvloedig is. ![Een lang niet-coderend RNA aan het werk: het Xist-transcript (rood), aangetoond met fluorescente hybridisatie, bekleedt het territorium van één X-chromosoom in een vrouwelijke kern (DNA in blauw).](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-rna-regulation/img-9de825628d1d.jpg) *Een [lang niet-coderend RNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) aan het werk: het *[Xist](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*-transcript (rood), aangetoond met fluorescente hybridisatie, bekleedt het territorium van één X-chromosoom in een vrouwelijke kern (DNA in blauw).* **Opmerking 2.14 (Wat posttranscriptionele sturing oplevert).** Transcriptionele sturing werkt via de kern, met een vertraging van minuten tot uren voordat een nieuwe boodschapper is gemaakt, uitgevoerd en vertaald. Sturing van de boodschapper zelf werkt daar waar het eiwit nodig is, in seconden tot minuten, en kan plaatselijk zijn: één dendriet die één boodschapper bij één synaps vertaalt, de voorrand van een fibroblast die actine maakt waar hij kruipt. Zij maakt van één gen ook vele eiwitten, en laat één signaal — ijzer, een aminozuur, een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) — honderden boodschappers tegelijk afstemmen zonder ook maar één promotor aan te raken. ## 2.5 Opgaven **Oefening 2.1 ★.** Onderscheid miRNA, [siRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) en [piRNA](#def-b3-rna-regulation-pirna) naar herkomst, lengte, afhankelijkheid van [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai), en wat zij met hun doelwitten doen. **Oplossing van Oefening 2.1.** miRNA: in het genoom gecodeerd als een haarspeld, $22\,\mathrm{nt}$, geknipt door [Drosha](#def-b3-rna-regulation-mirna) en daarna [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai), paart onvolledig via zijn seed en onderdrukt translatie en stabiliteit van vele boodschappers. [siRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna): uit lang dubbelstrengs RNA (viraal, transgeen, experimenteel), $21\,\mathrm{nt}$, Dicer-afhankelijk, paart volmaakt en stuurt [Argonaute](#def-b3-rna-regulation-rnai) aan om het doelwit te knippen. [piRNA](#def-b3-rna-regulation-pirna): uit enkelstrengs transcripten van piRNA-clusters, $26\text{ tot }31\,\mathrm{nt}$, onafhankelijk van [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai), geladen op PIWI-eiwitten in de kiembaan, knipt transposontranscripten (ping-pong) en stuurt de uitschakeling van transposon-DNA via [chromatine](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome). **Oefening 2.2 ★.** Volg de biogenese van een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) van zijn gen tot een onderdrukte boodschapper, en noem bij elke knip het enzym. **Oplossing van Oefening 2.2.** Pol II schrijft het pri-miRNA af; [Drosha](#def-b3-rna-regulation-mirna) (met DGCR8) knipt de haarspeld eruit in de kern; exportine-5 voert het pre-miRNA uit; [Dicer](#def-b3-rna-regulation-rnai) knipt de lus eraf en laat een duplex van $22\,\mathrm{nt}$ achter; één streng wordt in [Argonaute](#def-b3-rna-regulation-rnai) geladen; de seed (nucleotiden 2–8) paart met een plaats in de 3$'$ UTR; [Argonaute](#def-b3-rna-regulation-rnai) trekt de deadenylase- en ontkappingsmachinerie aan en blokkeert de initiatie — de boodschapper wordt minder vertaald en vergaat sneller. **Oefening 2.3 ★.** Waarom schakelde het injecteren van sense-RNA van *unc-22* in wormen het gen uit in de vroege experimenten, en wat veranderden Fire en Mello daaraan? **Oplossing van Oefening 2.3.** RNA dat in vitro door een faagpolymerase is gemaakt bevatte dubbelstrengs verontreinigingen (het polymerase kopieert ook de andere streng van de matrijs en loopt over de uiteinden door), zodat de “sense”-preparaten de echte trekker bevatten. Fire en Mello zuiverden elke streng, toonden aan dat elk afzonderlijk weinig deed en lieten ze daarna opzettelijk paren: het dubbelstrengs RNA was minstens honderd keer krachtiger, waarbij enkele moleculen per cel volstonden. **Oefening 2.4 ★.** Wat gebeurt er met ferritine en met de transferrinereceptor wanneer een cel van ijzer wordt beroofd? Welke stap van de expressie wordt in elk van beide gevallen gestuurd? **Oplossing van Oefening 2.4.** IJzergebrek: IRP bindt de IRE’s. Ferritine: de initiatie van de translatie wordt geblokkeerd en er wordt geen opslageiwit gemaakt ([sturing van de translatie](#prop-b3-rna-regulation-translation)). Transferrinereceptor: de boodschapper is beschermd tegen zijn nuclease en hoopt zich op, zodat er meer receptor wordt gemaakt en meer ijzer wordt ingevoerd (sturing van de stabiliteit van de boodschapper). **Oefening 2.5 ★★.** Een boodschapper heeft een halveringstijd van $2\,\mathrm{h}$ en wordt met $5$ moleculen per minuut gemaakt. Bereken zijn evenwichtsniveau, en daarna het niveau en de halveringstijd wanneer een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) zijn afbraaksnelheid verdubbelt. **Oplossing van Oefening 2.5.** $\gamma = \ln 2/120\,\mathrm{min} = 0.0058\,\mathrm{min}^{-1}$; $m^{*} = 5/0.0058 \approx 870$ moleculen. Afbraak verdubbeld: $m^{*} \approx 430$, halveringstijd $120\,\mathrm{min}/2 = 60\,\mathrm{min}$. **Oefening 2.6 ★★.** Een seed van zeven nucleotiden past met kans $4^{-7}$ op een willekeurige sequentie. Hoeveel plaatsen treft één miRNA-seed bij toeval in een verzameling van $20\,000$ boodschappers met 3$'$-niet-vertaalde regio’s van gemiddeld $1000\,\mathrm{nt}$? Wat onderscheidt dan een echt doelwit? **Oplossing van Oefening 2.6.** Totale 3$'$ UTR-sequentie $2\times 10^{7}$ nt; toevallige treffers $2\times 10^{7}/4^{7} = 2\times 10^{7}/16\,384 \approx 1200$ plaatsen. Een echt doelwit onderscheidt zich door conservering van de plaats over soorten heen, een gunstige omgeving (een AU-rijke buurt, een plaats ver van het stopcodon, extra paring aan het 3$'$-uiteinde van het miRNA), door gelijktijdige expressie van miRNA en doelwit in dezelfde cel, en door het experiment: de boodschapper daalt wanneer het miRNA aanwezig is en doet dat niet meer wanneer de plaats is gemuteerd. **Oefening 2.7 ★★.** Voorspel het geslacht van een vlieg (a) met een functieverliesmutatie in *tra* en twee X-chromosomen; (b) die TRA tot expressie brengt vanaf een constitutief transgen, met één X; (c) die *dsx* geheel mist. **Oplossing van Oefening 2.7.** (a) XX, *tra*-nul: SXL wordt gemaakt maar TRA niet, *dsx* neemt de mannelijke standaardsplitsing — een somatisch mannetje (steriel). (b) XY met constitutief TRA: TRA-2 is bij beide geslachten aanwezig, dus wordt DSX in de vrouwelijke vorm gemaakt — vrouwelijke somatische ontwikkeling (een steriel “pseudovrouwtje”, waarbij de kiembaan andere aanwijzingen volgt). (c) Geen *dsx*: geen van beide DSX-vormen, dus wordt geen van beide programma’s van eindedifferentiatie opgelegd — een intersekse dier met gemengde of onvolledige kenmerken. **Oefening 2.8 ★★.** De boodschapper van een proto-oncogen heeft door een [AU-rijk element](#def-b3-rna-regulation-stability) normaal een halveringstijd van $15\,\mathrm{min}$. Een chromosomale translocatie haalt het element weg en de halveringstijd wordt $3\,\mathrm{h}$. Met welke factor stijgt het eiwitniveau, als translatie en eiwitafbraak onveranderd blijven? Waarom is dit oncogeen hoewel het eiwit normaal is? **Oplossing van Oefening 2.8.** In evenwicht is de boodschapper, en daarmee het eiwit, evenredig met de halveringstijd van de boodschapper: $180\,\mathrm{min}/15\,\mathrm{min} = 12$ keer meer eiwit. Het eiwit is een normaal groeisignaal dat kortstondig bedoeld is, een puls na elke prikkel; twaalfvoudig en doorlopend gemaakt drijft het de deling aan zonder prikkel. Dosis en timing, niet de sequentie, maken het oncogeen. **Oefening 2.9 ★★.** Een laboratoriumstam van *Drosophila* mist P-elementen; een wilde stam draagt ze. Voorspel de vruchtbaarheid van het nageslacht van (a) laboratoriumvrouwtjes $\times$ wilde mannetjes, (b) wilde vrouwtjes $\times$ laboratoriummannetjes, en verklaar de asymmetrie met [piRNA’s](#def-b3-rna-regulation-pirna). **Oplossing van Oefening 2.9.** (a) Laboratoriummoeder, wilde vader: de eicellen dragen geen [piRNA’s](#def-b3-rna-regulation-pirna) tegen P-elementen (de lijn van de moeder heeft ze nooit ontmoet), de vaderlijke P-elementen transponeren vrijelijk in de kiembaan van het nageslacht — steriel (dysgeen). (b) Wilde moeder: haar eicellen bevatten [piRNA’s](#def-b3-rna-regulation-pirna) tegen P-elementen, die de elementen in het nageslacht uitschakelen — vruchtbaar. De asymmetrie is de moederlijke meegave van [piRNA’s](#def-b3-rna-regulation-pirna), een overerving van RNA en niet van genen. **Oefening 2.10 ★★★.** Beredeneer met [Stelling 2.5](#thm-b3-rna-regulation-mirna-kinetics) dat het eiwit dat uit een boodschapper wordt gemaakt relatief minder schommelt wanneer de boodschapper onder microRNA-sturing staat, bij een gelijk gemiddeld boodschapperniveau. (Het eiwit middelt de boodschapper over zijn eigen levensduur, en de boodschapper vernieuwt zichzelf sneller.) Waarom zou een cel voor een [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) en een hogere transcriptiesnelheid betalen om hetzelfde gemiddelde te krijgen? **Oplossing van Oefening 2.10.** Het eiwit integreert zijn boodschapper over zijn eigen levensduur $\tau_{p}$. Boodschappers leven $\tau_{m} = 1/(\gamma + \gamma' R)$; gedurende $\tau_{p}$ ziet het eiwit dus ongeveer $\tau_{p}/\tau_{m}$ onafhankelijke levensduren van boodschappers, elk een toevallige geboorte-en-sterftegebeurtenis. De relatieve schommeling van een gemiddelde over $N$ onafhankelijke gebeurtenissen daalt als $1/\sqrt{N}$, dus geeft de kortere $\tau_{m}$ onder microRNA-sturing — bij hetzelfde gemiddelde aantal boodschappers, wat een evenredig hogere $k$ vergt — een gladder eiwitverloop. De cel betaalt het [microRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) en de extra transcriptie om precisie en snelheid te kopen: een niveau dat wordt bepaald door een evenwicht van snelle synthese en snelle afbraak is zowel minder ruizig als sneller bij te stellen dan hetzelfde niveau bij trage synthese en trage afbraak. **Oefening 2.11 ★★★.** Bij wormen maakt een RNA-afhankelijk RNA-polymerase secundaire [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) uit de doelboodschapper; bij zoogdieren bestaat zo’n polymerase niet. Voorspel voor elk of uitschakeling door één injectie van dubbelstrengs RNA vele celdelingen lang standhoudt en of zij zich naar andere weefsels verspreidt, en verklaar het medische gevolg voor siRNA-geneesmiddelen. **Oplossing van Oefening 2.11.** Worm: het RNA-afhankelijke RNA-polymerase maakt nieuwe [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) uit de doelboodschapper zelf, zodat het signaal wordt vernieuwd zolang het doelwit wordt afgeschreven, de verdunning door de delingen overleeft en zich, via een kanaal voor dubbelstrengs RNA tussen de cellen, verspreidt naar andere weefsels en enkele generaties lang in de kiembaan. Zoogdier: geen versterking, dus worden de [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) verbruikt en bij elke deling verdund, werken zij alleen in de cellen die ze hebben ontvangen en doven zij in delende cellen binnen dagen uit. Gevolg: een siRNA-geneesmiddel moet in elke doelcel worden gebracht, werkt het best in cellen die niet delen (hepatocyten, vandaar de levermiddelen) en vergt herhaalde toediening. **Oefening 2.12 ★★★.** Een nieuw geannoteerd lncRNA komt in het hart tot expressie. Ontwerp de experimenten die onderscheid maken tussen (a) een functioneel RNA, (b) een functionele daad van transcriptie waarvan het RNA er niet toe doet, en (c) ruis, en zeg welke uitkomst elk daarvan voorspelt. **Oplossing van Oefening 2.12.** (a) Functioneel RNA: het transcript vernietigen nadat het is gemaakt ([siRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna), of een antisense-oligonucleotide) geeft een fenotype, en het RNA elders in het genoom vanaf een transgen tot expressie brengen redt het. (b) Functionele transcriptie: het invoegen van een vroeg polyadenyleringssignaal dat de transcriptie stopt (of het weghalen van de promotor) geeft het fenotype, terwijl het RNA posttranscriptioneel vernietigen dat niet doet en een ectopisch transgen niet redt — de daad van transcriptie (of het DNA-element) doet ertoe, zoals bij vele RNA’s die bij enhancers horen. (c) Ruis: geen van beide ingrepen verandert iets, het RNA komt in minder dan één kopie per cel voor, en zijn sequentie en expressie zijn niet geconserveerd. ## 2.6 Vraagstuk: de tijdklok van een worm **Probleem 2.1.** Weekendvraagstuk — de schakelaar *lin-4*/*lin-14* van de worm getimed met de kinetiek van de boodschapper, een geïnjecteerd RNA verdund door de delingen van een embryo en gered door versterking, het ijzerregulon gekwantificeerd en een telling van splitsvormen, met als besluit de onderdrukkingsfactor, de halveringstijd van de schakelaar en het aantal delingen dat een onversterkt signaal overleeft Gegevens: de boodschapper van *lin-14* wordt met $k = 3$ moleculen per minuut per cel gemaakt en heeft een halveringstijd van $40\,\mathrm{min}$. Het LIN-14-eiwit wordt met $\beta = 2$ per boodschapper per minuut gemaakt en heeft een halveringstijd van $3\,\mathrm{h}$. Vanaf het begin van het tweede larvale stadium hoopt het RNA van *lin-4* zich op en voegt het een afbraakterm $\gamma' R = 3\gamma$ aan de boodschapper toe en halveert het, door de initiatie te blokkeren, $\beta$. Een wormembryo ontwikkelt zich van één cel tot ongeveer $550$ cellen bij het uitkomen; een volwassen dier heeft $959$ somatische cellen. **Deel I — De boodschapper.** 1. Bereken $\gamma$ en het evenwichtsniveau van de boodschapper van *lin-14* voordat *lin-4* verschijnt. 2. Bereken de afbraaksnelheid van het eiwit en het evenwichtsniveau van het LIN-14-eiwit. 3. Bereken, zodra *lin-4* aanwezig is, het nieuwe niveau van de boodschapper en de nieuwe tijdconstante van de boodschapper. 4. Bereken de nieuwe evenwichtstoestand van het eiwit en de onderdrukkingsfactor op het eiwit in het geheel. 5. Hoe lang na het verschijnen van *lin-4* komt de boodschapper halverwege zijn nieuwe niveau? En het eiwit — welke stap begrenst de snelheid van de schakelaar? 6. De oorspronkelijke experimenten vonden het eiwit verdwenen terwijl het mRNA nog aantoonbaar was. Strookt dat met deze getallen? Welk deel van de boodschapper blijft over? **Deel II — Verdunning en versterking.** 7. In de gonade van een worm worden $10^{6}$ moleculen dubbelstrengs RNA gespoten, die gelijkelijk over $250$ eicellen worden verdeeld. Hoeveel moleculen per eicel? 8. Als de moleculen bij elke deling eenvoudig zouden worden verdeeld, hoeveel zou elke cel van de uitgekomen larve van $550$ cellen er dan bevatten? Na hoeveel verdere delingen zou het gemiddelde onder één per cel zakken? 9. Fire en Mello zagen uitschakeling in het hele dier en in zijn nageslacht, bij enkele moleculen per cel. Leg uit wat een RNA-afhankelijk RNA-polymerase aan de verklaring toevoegt, en waarom het effect toch na enkele generaties uitdooft. 10. In een zoogdiercel zonder zo’n polymerase brengt een siRNA-transfectie $5000$ duplexen in een cel die zich dagelijks deelt; het [RISC](#def-b3-rna-regulation-rnai) is stabiel maar wordt door de deling verdund. Na hoeveel dagen zakt het aantal onder $100$ , ruwweg het aantal dat voor doeltreffende uitschakeling nodig is? 11. Een therapeutisch [siRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) tegen een boodschapper van de lever wordt eenmaal gegeven en werkt zes maanden. Hepatocyten delen zelden. Leg uit waarom het mechanisme van vraag 10 het niet begrenst, en wat dat wel doet. 12. Een seed van zeven nucleotiden past bij toeval eens per $4^{7}$ nucleotiden. Het transcriptoom van de worm telt ongeveer $20\,\mathrm{Mb}$ aan 3 $'$ -niet-vertaalde sequentie. Hoeveel toevallige seedovereenkomsten heeft *lin-4* , en hoe wisten de genetici welk doelwit ertoe deed? **Deel III — Het ijzerregulon.** 13. In ijzerrijke cellen heeft de boodschapper van de transferrinereceptor een halveringstijd van $10\,\mathrm{min}$ ; met IRP gebonden $50\,\mathrm{min}$ . Met welke factor stijgt de boodschapper bij onveranderde transcriptie wanneer ijzer schaars wordt? 14. Het niveau van de ferritineboodschapper verandert niet, maar haar translatie daalt van $1$ naar $0.05$ eiwitten per boodschapper per minuut wanneer IRP bindt. Met welke factor daalt de ferritinesynthese? 15. Combineer beide: met welke factor verandert de verhouding tussen invoercapaciteit en opslagcapaciteit tussen de ijzerrijke en de ijzerarme toestand? 16. Het IRP1-eiwit is ofwel een RNA-bindend eiwit ofwel een aconitase, afhankelijk van de vraag of het een ijzer-zwavelcluster draagt. Leg uit waarom het daardoor een sensor van ijzer zelf is en niet van een hormoon. 17. Een patiënt draagt een IRE-mutatie in ferritine die de binding van IRP opheft. Voorspel het ferritineniveau, het serumijzer, en waarom de ooglens is aangedaan. 18. Leg in één zin uit waarom dezelfde haarspeld op de ene positie kan activeren en op de andere kan onderdrukken. 19. IRP2 heeft geen ijzer-zwavelcluster; bij veel ijzer wordt het vernietigd door een ubiquitineligase waarvan de eigen stabiliteit ijzer en zuurstof vereist. Waarom zou een cel twee sensoren met zo verschillende chemie aanhouden? **Deel IV — Splitsvormen tellen.** 20. *Dscam* heeft exonblokken met 12, 48, 33 en 2 elkaar uitsluitende alternatieven. Hoeveel splitsvormen? Als elk neuron er ongeveer $50$ willekeurig tot expressie brengt, wat is dan de kans dat twee gegeven neuronen er minstens één delen? (Gebruik $1 - (1 - 50/N)^{50}$ .) 21. Waarom heeft een neuron er baat bij splitsvormen te hebben die zijn buren vrijwel zeker missen? 22. Hoeveel boodschappers geeft een gen met $n$ cassette-exons die elk onafhankelijk worden opgenomen of overgeslagen? Hoeveel voor $n = 10$ ? Waarom is het werkelijke aantal in een gegeven celtype meestal veel kleiner? 23. Waarom sterft bij de vlieg een vrouwtje met twee X-chromosomen maar een nulallel van *Sxl* , in plaats van zich eenvoudig als mannetje te ontwikkelen? (Bedenk wat het X-telsysteem nog meer stuurt: de [dosiscompensatie](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) van X-gebonden genen.) 24. SXL bevordert de productieve splitsing van zijn eigen transcript. Leg uit waarom de geslachtsbeslissing daardoor een geheugen wordt dat standhoudt nadat het X-telsignaal, dat alleen in het vroege embryo aanwezig is, is verdwenen, en verbind dit met de zichzelf onderhoudende schakelaars van [Hoofdstuk 1](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#ch-b3-chromatin-epigenetics) . 25. Vat de tijdklok samen: de onderdrukkingsfactor op het LIN-14-eiwit (vraag 4), de halveringstijd van de schakelaar van de boodschapper (vraag 5) en het aantal delingen dat een onversterkt signaal overleeft voordat het onder één molecuul per cel zakt (vraag 8). **Oplossing van Probleem 2.1.** **1.** $\gamma = \ln 2/40 = 0.0173\,\mathrm{min}^{-1}$; $m^{*} = 3/0.0173 \approx 170$ boodschappers. **2.** $\delta_{p} = \ln 2/180 = 0.003\,85\,\mathrm{min}^{-1}$; $P^{*} = \beta m^{*}/\delta_{p} = 2\times 173/0.00385 \approx 9.0\times 10^{4}$ eiwitten. **3.** Afbraak $4\gamma = 0.069\,\mathrm{min}^{-1}$; $m^{*} = 3/0.069 \approx 43$; tijdconstante $1/0.069 = 14\,\mathrm{min}$. **4.** $\beta = 1$: $P^{*} = 43/0.00385 \approx 1.1\times 10^{4}$; onderdrukking met een factor $8$ ($4$ uit de afbraak, $2$ uit de translatie). **5.** Halveringstijd van de boodschapper $\ln 2/(4\gamma) = 10\,\mathrm{min}$. Het eiwit vervalt daarna met zijn eigen halveringstijd, $3\,\mathrm{h}$: de afbraak van het eiwit begrenst de schakelaar. **6.** Ja: de boodschapper zakt maar tot $1/4$ (nog gemakkelijk aantoonbaar) terwijl het eiwit tot $1/8$ zakt en verder blijft dalen naarmate het oude eiwit wordt omgezet; de vroege waarneming dat het eiwit verdween “terwijl het mRNA bleef” weerspiegelde vooral de translationele helft van de onderdrukking. **7.** $10^{6}/250 = 4000$ moleculen per eicel. **8.** $4000/550 \approx 7$ per cel bij het uitkomen. $4000/2^{n} < 1$ voor $n \ge 12$ delingen vanaf de zygote — ongeveer drie delingen na het uitkomen. **9.** Het polymerase kopieert de doelboodschapper tot nieuw dubbelstrengs RNA, dat tot secundaire [siRNA’s](#def-b3-rna-regulation-ncrna) wordt geknipt: de trekker wordt uit het doelwit zelf hergemaakt, zodat hij de verdunning overleeft en zich verspreidt (een kanaal geeft dubbelstrengs RNA door tussen cellen en naar de kiembaan). Hij dooft uit omdat de versterking zowel het doelwit als een primaire trekker nodig heeft; zodra het geïnjecteerde RNA op is, wordt de secundaire voorraad generatie na generatie verdund en zet de kiembaan zich terug. **10.** $5000/2^{n} < 100$: $2^{n} > 50$, $n = 6$ dagen ($78$ kopieën over). **11.** Cellen die niet delen verdunnen het [RISC](#def-b3-rna-regulation-rnai) niet; de grens is de chemische levensduur van het [siRNA](#def-b3-rna-regulation-ncrna) (afbraak door nucleasen, vertraagd door chemische modificatie van de strengen) en het trage weglekken uit het endosomale voorraadje dat het cytoplasma voedt. **12.** $2\times 10^{7}/16\,384 \approx 1200$ toevallige treffers. De genetica gaf de doorslag: verlies van *lin-14* geeft het tegenovergestelde fenotype van verlies van *lin-4*, functiewinstallelen van *lin-14* bleken deleties van precies de plaatsen in de 3$'$ UTR, en de zeven plaatsen waren geconserveerd. **13.** Niveau $\propto$ halveringstijd: $50/10 = 5$ keer hoger. **14.** $1/0.05 = 20$ keer lagere ferritinesynthese. **15.** Invoer/opslag stijgt $5\times 20 = 100$-voudig van ijzerrijk naar ijzerarm. **16.** Het cluster wordt alleen samengesteld wanneer er cytosolisch ijzer beschikbaar is, zodat de conformatie van het eiwit een rechtstreekse aflezing van de ijzerconcentratie is, zonder receptor, hormoon of transcriptie — als een riboswitch, een metaboliet waargenomen door het molecuul dat hij stuurt. **17.** Ferritine wordt ongeacht het ijzer vertaald: het serumferritine is zeer hoog, het serumijzer en de voorraden zijn normaal (geen overbelasting). In de lens, die geen omzet kent, hoopt ferritine zich jarenlang op en kristalliseert het — een vroege staar. **18.** De haarspeld is alleen een landingsplaats; het effect is wat het gebonden eiwit fysiek in de weg zit — scannende ribosomen aan het 5$'$-uiteinde, een nuclease aan het 3$'$-uiteinde. **19.** Twee soorten chemie dekken twee omstandigheden: het ijzer-zwavelcluster van IRP1 wordt ook vernield door oxidanten en door weinig zuurstof, zodat IRP1 op de redoxtoestand reageert, terwijl de ijzerafhankelijke afbraak van IRP2 over het hele fysiologische zuurstofbereik op ijzer zelf reageert; de overtolligheid maakt het regulon robuust, en de twee melden verschillende dingen. **20.** $12\times 48\times 33\times 2 = 38\,016$. $1 - (1 - 50/38\,016)^{50} = 1 - 0.99868^{50} \approx 1 - e^{-0.066} = 0.064$: ongeveer $6\,\%$. **21.** Gelijke splitsvormen binden homofiel en stoten af: de takken van één neuron mijden elkaar en spreiden zich, terwijl takken van verschillende neuronen, die vrijwel geen splitsvorm delen, elkaar mogen kruisen — een eigen identiteit per cel. **22.** $2^{n}$; $1024$ voor $n = 10$. In werkelijkheid minder: de opname wordt beslist door celtypespecifieke factoren en over de exons heen afgestemd, vele combinaties verschuiven het leesraam en worden door nonsense-gemedieerde afbraak vernietigd, en de exons zijn niet onafhankelijk. **23.** *Sxl* stuurt ook de [dosiscompensatie](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation): bij vrouwtjes blokkeert SXL de translatie van *msl-2*, zodat de twee X-chromosomen niet extra worden afgeschreven; zonder SXL bouwt een XX-embryo het MSL-complex op beide X-chromosomen en verdubbelt het hun opbrengst — een dodelijke overdosis van elk X-gebonden gen, nog voordat het geslacht aan de orde is. **24.** De vroege promotor vuurt alleen zolang het X:A-signaal aanwezig is; het SXL dat hij maakt dwingt de productieve splitsing af van het transcript van de onderhoudspromotor, die bij beide geslachten actief is, zodat SXL zodra het bestaat zichzelf blijft maken en het signaal niet langer nodig is — dezelfde zichzelf onderhoudende logica van [lezer](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) trekt [schrijver](https://one-course.com/books/biology/5/nl/chapter/1-chromatine-en-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) aan als bij de chromatinemerktekens, hier met een eiwit en een splitsing. **25.** LIN-14-eiwit $8$-voudig onderdrukt; halveringstijd van de schakelaar van de boodschapper $10\,\mathrm{min}$; een onversterkt RNA zakt na $12$ delingen onder één molecuul per cel.