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title: "Cromatina e epigenética"
book: "Biologia universitária — 3.º ano"
subject: biology
language: pt
chapter: 1
exercises: 12
source: https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/1-cromatina-e-epigenetica
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# Capítulo 1 — Cromatina e epigenética

Dois camundongos da mesma ninhada, geneticamente idênticos até a última base, estão lado a lado: um é magro e pardo, o outro é gordo e amarelo, e ficará diabético. Uma gata de pelagem tricolor exibe manchas alaranjadas e pretas embora cada célula de sua pele carregue os mesmos dois cromossomos X. Uma criança herda o mesmo trecho deletado do cromossomo 15 que outra criança, e uma tem a síndrome de Prader–Willi enquanto a outra tem a síndrome de Angelman — a diferença está apenas em de qual dos pais veio a deleção. Nada disso está escrito na sequência do DNA. Está escrito *sobre* ela: no modo como dois metros de DNA são acondicionados num núcleo de dez micrômetros, nos pequenos grupos químicos ligados às proteínas de empacotamento e às próprias citosinas, e na maquinaria que copia essas marcas de uma célula para suas filhas. Este capítulo trata dessa segunda camada de informação, de seus portadores moleculares e dos limites honestos daquilo que ela consegue lembrar.

## 1.1 Cromatina: o DNA num carretel

**Definição 1.1 (Nucleossomo e cromatina).**

A *cromatina* é o complexo do DNA com proteínas sob a forma do qual o genoma existe num núcleo eucarionte. Sua unidade de repetição é o *nucleossomo*: $147\,\mathrm{bp}$ de DNA enrolados em $1.65$ voltas levógiras em torno de um octâmero de *histonas* — duas cópias de cada uma das proteínas pequenas e muito básicas H2A, H2B, H3 e H4 — seguidos de um *ligante* de $20\text{ a }60\,\mathrm{bp}$ até o nucleossomo seguinte. Uma quinta histona, a H1, liga-se ao ligante onde ele entra e sai do cerne e ajuda as contas a se empacotarem umas contra as outras. Cada histona do cerne tem uma *cauda* amino-terminal não estruturada, de umas $20\text{ a }40$ resíduos, que se projeta para fora da partícula. A cromatina que se cora fracamente, é frouxamente empacotada e é transcrita é a *eucromatina*; a cromatina densamente empacotada, de replicação tardia e em larga medida silenciosa, nos centrômeros, nos telômeros e nas sequências repetidas, é a *heterocromatina*.

**Evidência.** Hewish e Burgoyne (1973) digeriram núcleos de fígado de rato com uma nuclease endógena e constataram que o DNA saía não como um rastro contínuo, mas como uma escada de fragmentos cujos comprimentos eram múltiplos de cerca de $200\,\mathrm{bp}$: o DNA estava protegido em intervalos regulares e era cortado apenas entre eles. Kornberg (1974) mostrou que a unidade protegida era uma partícula de oito [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) com cerca de $200\,\mathrm{bp}$, e micrografias eletrônicas de [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) delicadamente espalhada mostraram as “contas num colar”. Luger e colaboradores (1997) resolveram a estrutura cristalográfica da partícula do cerne a $2.8\,\text{Å}$: $147\,\mathrm{bp}$, um octâmero com as caudas passando por entre os giros do DNA. ∎

![A fibra de 10\, nm: cernes de nucleossomo (azul) sobre um DNA contínuo (vermelho), cada conta um octâmero de histonas com suas caudas (laranja) projetadas para fora, a histona ligante H1 (verde) no ponto de entrada e saída. Cerca de seis nucleossomos ocupam o comprimento que 1200\, bp de DNA nu ocupariam.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-1cd946a44896.svg)

*A fibra de $10\,\mathrm{nm}$: cernes de [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (azul) sobre um DNA contínuo (vermelho), cada conta um octâmero de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) com suas caudas (laranja) projetadas para fora, a [histona](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) ligante H1 (verde) no ponto de entrada e saída. Cerca de seis [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) ocupam o comprimento que $1200\,\mathrm{bp}$ de DNA nu ocupariam.*

![A cromatina na escala molecular: a dupla-hélice enrolada em torno de cernes sucessivos de histonas, as “contas num colar” que a escada da nuclease revelou.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-4a3089c69564.jpg)

*A [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) na escala molecular: a dupla-hélice enrolada em torno de cernes sucessivos de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), as “contas num colar” que a escada da nuclease revelou.*

**Proposição 1.2 (Níveis de compactação).**

A *[razão de empacotamento](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction)* de uma estrutura de [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) é o comprimento do DNA que ela contém dividido pelo comprimento da estrutura. O enrolamento na fibra de $10\,\mathrm{nm}$ dá uma razão de cerca de $6$: os $68\,\mathrm{nm}$ de uma repetição de $200\,\mathrm{bp}$ são comprimidos numa única conta de $11\,\mathrm{nm}$. No núcleo interfásico a fibra não se enrola numa fibra regular mais grossa, como os livros por muito tempo a desenharam, mas se dobra em *alças* de dezenas a centenas de quilobases mantidas em suas bases por complexos de coesina em forma de anel e pela proteína ligadora de DNA CTCF; as alças se agrupam em *[domínios de associação topológica](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction)* (TADs) de cerca de uma megabase, dentro dos quais um gene encontra seus reguladores muito mais vezes do que encontra qualquer coisa de fora. Um cromossomo mitótico, o estado mais compacto, tem uma [razão de empacotamento](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) próxima de $10\,000$: os $4\,\mathrm{cm}$ de DNA de um cromossomo humano médio são dobrados num bastão de $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ de comprimento.

**Exemplo 1.3 (Dois metros em dez micrômetros).**

Um núcleo diploide humano contém $6.4\times 10^{9}$ pares de bases. A $0.34\,\mathrm{nm}$ por par de bases isso dá $2.2\,\mathrm{m}$ de dupla-hélice, num núcleo de cerca de $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ de diâmetro. Tudo isso é acondicionado em $6.4\times 10^{9}/200 \approx 3.2\times 10^{7}$ [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), cada um carregando cerca de $108\,\mathrm{kDa}$ de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) contra $96\,\mathrm{kDa}$ de DNA ($147\,\mathrm{bp}$ a $650\,\mathrm{Da}$ por par): o núcleo contém, em massa, aproximadamente tanta [histona](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) quanto DNA. O próprio DNA, tratado como um cilindro de $2\,\mathrm{nm}$ de diâmetro, tem um volume de apenas cerca de $7\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$, uns $1\,\%$ de um núcleo esférico de raio $5\,\text{µ}\mathrm{m}$; o problema do empacotamento é de emaranhamento e de acesso, não de espaço.

## 1.2 O código das histonas

**Definição 1.4 (Modificações das histonas).**

Os resíduos das caudas das [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) sofrem modificações covalentes: *acetilação* de lisinas (que neutraliza sua carga positiva e afrouxa o aperto sobre o DNA), *metilação* de lisinas e argininas (um, dois ou três grupos metila, sem mudança de carga), fosforilação de serinas, ubiquitinação de lisinas. Uma modificação é nomeada pela [histona](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), pelo resíduo e pelo grupo: H3K4me3 é a [histona](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) H3, lisina 4, trimetilada; H3K27ac é a H3 com a lisina 27 acetilada. O *código das [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome)* é a correlação entre combinações de marcas e o estado do gene subjacente: H3K4me3 e H3K27ac em promotores e intensificadores ativos, H3K36me3 ao longo dos corpos dos genes transcritos, H3K9me3 na [heterocromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) constitutiva, H3K27me3 em genes silenciados durante o desenvolvimento. As enzimas que acrescentam uma marca são *escritores* (acetiltransferases de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), HATs; metiltransferases), as que a removem são *apagadores* (desacetilases de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), HDACs; desmetilases), e as proteínas que se ligam a uma marca e agem sobre ela são *leitores*: um *bromodomínio* liga acetil-lisina, um *cromodomínio* metil-lisina.

**Proposição 1.5 (As marcas são lidas, não apenas sentidas).**

A [acetilação](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) age em parte por eletrostática — uma cauda acetilada segura seu DNA com menos força e a fibra se abre — mas a maioria das marcas age recrutando [leitores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code). A H3K9me3 é ligada pelo cromodomínio da *proteína de [heterocromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) HP1*, que dimeriza, faz ponte entre [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) vizinhos e recruta a própria metiltransferase (SUV39H) que escreve H3K9me3 no [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) seguinte: a marca se propaga ao longo da fibra até encontrar uma fronteira, e compacta o que cobre. A H3K27me3 é escrita pelo *complexo repressor Polycomb 2* (PRC2, subunidade catalítica EZH2), lida pelo PRC1, que ubiquitina a H2A e compacta a fibra, e o complexo é ele próprio estimulado pela marca que produz; o grupo de proteínas *Trithorax* escreve a H3K4me3 oposta e mantém ligados os genes do desenvolvimento de um dado tipo celular. Cada uma dessas alças — o [leitor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) recruta o [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) — é uma retroalimentação positiva que permite a um estado manter-se depois de estabelecido, que é do que uma marca hereditária precisa.

![A lógica escritor–leitor–apagador. Um leitor ligado a uma marca num nucleossomo recruta o escritor que põe a mesma marca no seguinte, de modo que o estado se propaga e se copia; os apagadores se opõem a isso. Os grupos acetila (verde) abrem a fibra; a H3K9me3 (vermelho) a fecha.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-25079d8419e6.svg)

*A lógica escritor–leitor–apagador. Um [leitor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) ligado a uma marca num [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) recruta o [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) que põe a mesma marca no seguinte, de modo que o estado se propaga e se copia; os [apagadores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) se opõem a isso. Os grupos acetila (verde) abrem a fibra; a H3K9me3 (vermelho) a fecha.*

**Método 1.6 (Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)).**

Para mapear onde uma marca ou uma proteína se assenta no genoma: (1) faça a ligação cruzada das proteínas ao DNA em células vivas com formaldeído; (2) fragmente a [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) em pedaços de algumas centenas de pares de bases; (3) precipite os fragmentos com um anticorpo contra a marca (digamos H3K27me3) preso a esferas; (4) desfaça as ligações cruzadas e purifique o DNA; (5) sequencie-o (ChIP-seq) e conte as leituras ao longo do genoma: os picos são os lugares onde a marca estava. Um controle de DNA de entrada sem anticorpo fixa o ruído de fundo. A resolução é a dos fragmentos, cerca de um [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome).

**Observação 1.7 (Código ou correlação).**

A palavra “código” exagera o caso. Muitas marcas são consequências da transcrição, e não causas dela (a H3K36me3 é depositada por uma metiltransferase que viaja com a polimerase), e retirar um [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) muitas vezes muda a expressão bem menos do que a distribuição da marca sugere. O que está bem estabelecido é que algumas poucas marcas — H3K9me3, H3K27me3 e a [metilação do DNA](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation), adiante — carregam um silenciamento autopropagante que sobrevive ao sinal que o instaurou.

## 1.3 A metilação do DNA e a cópia de uma marca

**Definição 1.8 (Metilação do DNA).**

Nos vertebrados um grupo metila é acrescentado ao carbono 5 da citosina quase somente no dinucleotídeo *CpG* (um C seguido de um G na mesma fita), uma sequência que é seu próprio complemento, de modo que um CpG metilado costuma estar metilado nas duas fitas. Cerca de $70\text{ a }80\,\%$ dos CpGs de uma célula humana estão metilados, e promotores metilados são silenciosos: os grupos metila são lidos por proteínas ligadoras de metil-CpG (MeCP2, MBD1–4) que recrutam HDACs e metilases da H3K9, e bloqueiam diretamente vários fatores de transcrição. As exceções são as *ilhas CpG*, trechos de cerca de uma quilobase, ricos em G e C e em CpG, que se situam nos promotores da maioria dos genes de manutenção e permanecem não metilados em células normais. O grupo metila é escrito pelas *DNA metiltransferases*: a DNMT3A e a DNMT3B realizam a *metilação de novo* de sítios não metilados, e a *DNMT1*, que prefere um CpG hemimetilado — uma fita metilada, a outra não —, realiza a *metilação de manutenção* atrás da forquilha de replicação. A remoção é passiva, por replicação sem manutenção, ou ativa, pelas enzimas TET, que oxidam a 5-metilcitosina a 5-hidroximetilcitosina e além, até que o reparo por excisão de bases a troque por uma citosina comum.

**Exemplo 1.9 (Por que o genoma é pobre em CpG).**

O genoma humano tem $42\,\%$ de G$+$C, de modo que, se as bases fossem independentes, um [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) ocorreria com a frequência $0.21\times 0.21 \approx 0.044$, cerca de $2.8\times 10^{8}$ vezes no genoma diploide. O número observado é de cerca de $5.6\times 10^{7}$, um quinto disso. A razão é a própria marca: uma citosina metilada que perde seu grupo amino torna-se timina, uma base normal que o reparo não consegue reconhecer como errada, ao passo que uma citosina não metilada se desamina a uracila, que é excisada. Ao longo do tempo evolutivo os [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) metilados mutaram em TpG e CpA, e só as ilhas não metiladas conservaram seus [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation). A marca deixou sua assinatura na sequência.

**Teorema 1.10 (Manutenção de um estado de metilação ao longo das divisões).**

Considere um único sítio [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation), acompanhado ao longo de uma linhagem de células. A cada divisão a citosina da fita nova é metilada com probabilidade $\mu$ se a citosina da fita-molde está metilada (eficiência de manutenção) e com probabilidade $\delta$ se não está (taxa de novo). Seja $p_{n}$ a probabilidade de o sítio estar metilado após $n$ divisões. Então

$$
p_{n+1} = \mu\, p_{n} + \delta\,(1 - p_{n}),
\qquad
p_{n} = p^{*} + (p_{0} - p^{*})\,(\mu - \delta)^{n},
\qquad
p^{*} = \frac{\delta}{1 - \mu + \delta}.
$$

Todo sítio deriva rumo ao mesmo equilíbrio $p^{*}$, qualquer que seja seu estado inicial, e a memória do estado inicial decai geometricamente com razão $\mu - \delta$. Uma marca é lembrada durante cerca de $1/(1 - \mu + \delta)$ divisões; a memória fiel de uma *diferença* entre sítios exige, portanto, um $\mu$ muito próximo de $1$ e um $\delta$ muito próximo de $0$, ou uma retroalimentação que faça $\mu$ e $\delta$ dependerem do estado da vizinhança.

**Demonstração.** A recorrência é a lei da probabilidade total sobre os dois estados da fita-molde. Seu ponto fixo resolve $p^{*} = \mu p^{*} + \delta(1 -
p^{*})$, o que dá $p^{*}(1 - \mu + \delta) = \delta$. Subtraindo a equação do ponto fixo da recorrência, $p_{n+1} - p^{*} = (\mu -
\delta)(p_{n} - p^{*})$, que iterada dá a forma fechada. Como $0 \le \delta \le \mu \le 1$, a razão $\mu - \delta$ está em $[0,1]$ e o desvio encolhe; ele cai pela metade a cada $\ln 2 / (-\ln(\mu -
\delta)) \approx \ln 2/(1 - \mu + \delta)$ divisões quando $\mu -
\delta$ está perto de $1$. ∎

**Exemplo 1.11 (Números).**

Os valores medidos em células de mamífero são $\mu \approx 0.99$ e $\delta \approx 0.02$ por divisão num [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) típico. Então $p^{*} =
0.02/0.03 \approx 0.67$, próximo da fração metilada de todo o genoma, e $\mu - \delta = 0.97$: um sítio totalmente metilado entregue apenas à maquinaria estaria a meio caminho de volta à média após $\ln 2 /
0.03 \approx 23$ divisões. Um promotor silenciado que permanece silencioso durante as centenas de divisões de uma vida precisa, portanto, de mais do que a [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation): os [leitores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) de [metil-CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) recrutam a metilação da H3K9 e os [leitores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) da H3K9 recrutam a DNMT3, de modo que uma ilha densa de marcas eleva seu próprio $\mu$ rumo a $1$ e abaixa o $\delta$ vizinho rumo a $0$. Inversamente, uma célula que perde a [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) perde a marca passivamente: com $\mu = \delta = 0$ a fração de fitas metiladas cai pela metade a cada divisão.

![À esquerda: a metilação de manutenção. Após a replicação todo CpG está hemimetilado; a DNMT1 copia a marca para a fita nova com probabilidade por sítio. À direita: o destino de um sítio ao longo das divisões para = 0.99, = 0.02 (azul a partir do estado metilado, vermelho a partir do não metilado) — ambos convergem para p* = 0.67 — e para um sítio cuja retroalimentação de vizinhança eleva a 0.999 (verde).](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-d0e8ffdd37a4.svg)

*À esquerda: a [metilação de manutenção](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation). Após a replicação todo [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) está hemimetilado; a [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) copia a marca para a fita nova com probabilidade $\mu$ por sítio. À direita: o destino de um sítio ao longo das divisões para $\mu = 0.99$, $\delta = 0.02$ (azul a partir do estado metilado, vermelho a partir do não metilado) — ambos convergem para $p^{*} = 0.67$ — e para um sítio cuja retroalimentação de vizinhança eleva $\mu$ a $0.999$ (verde).*

**Método 1.12 (Ler a metilação: sequenciamento por bissulfito).**

O sequenciamento sozinho não enxerga um grupo metila. Trate o DNA desnaturado com bissulfito de sódio: a citosina não metilada é desaminada a uracila, que é lida como T depois da PCR, ao passo que a 5-metilcitosina fica protegida e continua sendo lida como C. Sequencie o DNA convertido e compare-o com a referência: todo C que continuou C estava metilado, todo C que virou T não estava. Feito para todo o genoma ([sequenciamento por bissulfito](#met-b3-chromatin-epigenetics-bisulfite) do genoma inteiro), isso dá o estado de metilação de cada um dos $2.8\times 10^{7}$ [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) de um genoma haploide com resolução de uma base, como fração das células da amostra.

## 1.4 Inativação do X e imprinting genômico

**Definição 1.13 (Inativação do cromossomo X).**

Nas fêmeas de mamífero um dos dois cromossomos X de cada célula somática é silenciado transcricionalmente cedo no desenvolvimento, uma forma de *compensação de dose* que iguala a expressão dos genes ligados ao X entre fêmeas XX e machos XY. O cromossomo silenciado é compactado num corpo denso encostado no envoltório nuclear, o *corpúsculo de Barr*. A escolha de qual X silenciar é aleatória no embrião propriamente dito e, uma vez feita, é herdada clonalmente por todos os descendentes da célula. A inativação é iniciada pelo *Xist*, um RNA não codificante de $17\,\mathrm{kb}$ transcrito a partir do centro de inativação do X do cromossomo que será silenciado: ele recobre esse cromossomo em cis, recruta o Polycomb (H3K27me3), a variante de [histona](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) macroH2A e, por fim, a [metilação do DNA](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) dos promotores, e daí em diante o silêncio é mantido sem que o Xist seja necessário a cada divisão. Cerca de $15\,\%$ dos genes humanos ligados ao X escapam da inativação, em parte ou por inteiro.

**Evidência.** Barr e Bertram (1949) notaram um corpo denso nos núcleos de neurônios de gatas, mas não de gatos. Ohno (1959) mostrou que ele era um cromossomo X inteiro, condensado. Lyon (1961) juntou as peças: as fêmeas de camundongo heterozigóticas para genes de cor de pelagem ligados ao X têm uma pelagem em mosaico, com manchas que expressam um alelo ou o outro, de modo que cada mancha é um clone no qual um X, sempre o mesmo, está silencioso; o mesmo vale para as manchas alaranjadas e pretas de uma gata tartaruga ou tricolor, cujo gene alaranjado é ligado ao X, e para as glândulas sudoríparas em mosaico das mulheres portadoras de um alelo mutante de um gene ligado ao X. Um gato tricolor macho é quase sempre XXY. ∎

![À esquerda: um núcleo feminino corado para DNA, com o X inativo compacto — o corpúsculo de Barr — comprimido contra a borda nuclear. À direita: uma gata tricolor. Cada mancha alaranjada ou preta é um clone de células da pele que silenciaram o mesmo cromossomo X; o branco é um gene de manchamento à parte, autossômico.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-3f3811e47dc3.jpg)

![À esquerda: um núcleo feminino corado para DNA, com o X inativo compacto — o corpúsculo de Barr — comprimido contra a borda nuclear. À direita: uma gata tricolor. Cada mancha alaranjada ou preta é um clone de células da pele que silenciaram o mesmo cromossomo X; o branco é um gene de manchamento à parte, autossômico.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-f88c4a5d803d.jpg)

*À esquerda: um núcleo feminino corado para DNA, com o X inativo compacto — o [corpúsculo de Barr](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) — comprimido contra a borda nuclear. À direita: uma gata tricolor. Cada mancha alaranjada ou preta é um clone de células da pele que silenciaram o mesmo cromossomo X; o branco é um gene de manchamento à parte, autossômico.*

**Definição 1.14 (Imprinting genômico).**

Um gene está *sob imprinting* quando apenas um de seus dois alelos é expresso, e qual deles depende do genitor de que veio: alguns genes são expressos só a partir da cópia paterna, outros só a partir da materna. Os mamíferos têm uns $100\text{ a }200$ genes sob imprinting, agrupados, cada agrupamento governado por uma *região controladora do imprinting* (ICR) que está metilada num dos alelos parentais e não no outro. A metilação é fixada na linhagem germinativa — um padrão nos espermatozoides, outro nos óvulos —, apagada nas células germinativas da geração seguinte e fixada de novo conforme o sexo daquele indivíduo. Uma criança que recebe as duas cópias de um cromossomo do mesmo genitor (*dissomia uniparental*) tem, portanto, a dose errada dos genes sob imprinting nele, embora sua sequência seja inteiramente normal.

**Evidência.** McGrath e Solter e, independentemente, Surani, Barton e Norris (1984) produziram zigotos de camundongo com dois pronúcleos maternos, ou dois paternos, transferindo pronúcleos entre óvulos fecundados. Nenhum dos dois tipos chegou a termo, embora cada um tivesse dois conjuntos completos de cromossomos: os embriões ginogenéticos formavam um embrião razoável com uma placenta ruim, e os androgenéticos, uma placenta grande e quase nenhum embrião. Os dois genomas parentais não são equivalentes e ambos são necessários. Cattanach e Kirk (1985) mostraram, com dissomias uniparentais específicas de cromossomo, que a não equivalência se restringe a regiões particulares de cromossomos particulares, que são onde os agrupamentos sob imprinting foram encontrados mais tarde. ∎

**Exemplo 1.15 (O agrupamento Igf2–H19).**

O *Igf2*, um fator de crescimento fetal, é expresso a partir do alelo paterno; seu vizinho *H19*, um RNA não codificante, a partir do materno. Entre os dois está a ICR e, depois do *H19*, um conjunto compartilhado de intensificadores. No cromossomo materno a ICR está não metilada e liga o CTCF, que age como isolante: os intensificadores conseguem alcançar o *H19*, mas não o *Igf2*. No cromossomo paterno a ICR está metilada (fixada no espermatozoide), o CTCF não consegue se ligar, e os intensificadores alcançam o *Igf2*; a metilação também se propaga e silencia o promotor do *H19*. Uma marca, fixada numa linhagem germinativa, decide os dois genes.

![O imprinting em Igf2–H19. Alelo materno: a ICR não metilada liga o CTCF, um isolante, de modo que os intensificadores a jusante ativam apenas o H19. Alelo paterno: a ICR foi metilada no espermatozoide, o CTCF não consegue se ligar, os intensificadores alcançam o Igf2, e a metilação silencia o H19.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/fig-d8b271503b36.svg)

*O imprinting em *Igf2*–*H19*. Alelo materno: a ICR não metilada liga o CTCF, um isolante, de modo que os intensificadores a jusante ativam apenas o *H19*. Alelo paterno: a ICR foi metilada no espermatozoide, o CTCF não consegue se ligar, os intensificadores alcançam o *Igf2*, e a metilação silencia o *H19*.*

**Exemplo 1.16 (Prader–Willi e Angelman).**

A mesma deleção de cerca de $5\,\mathrm{Mb}$ no cromossomo 15 (região 15q11–q13) causa a *síndrome de Prader–Willi* — tônus muscular fraco ao nascer, depois apetite insaciável e obesidade — quando está no cromossomo paterno, e a *síndrome de Angelman* — deficiência intelectual grave, ausência de fala, um temperamento alegre e convulsões — quando está no materno. A região carrega genes de expressão paterna (o *SNRPN* e um agrupamento de RNAs pequenos), cuja única cópia ativa se perde no primeiro caso, e o *UBE3A*, de expressão materna, perdido no segundo. A [dissomia uniparental](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) materna do 15, sem deleção alguma, também dá Prader–Willi: duas cópias maternas, silenciosas para os genes paternos.

**Observação 1.17 (Por que fazer imprinting).**

Os genes sob imprinting são enriquecidos no controle do crescimento fetal e da transferência placentária de nutrientes, com os genes de expressão paterna (*Igf2*, *Peg3*) tendendo a promover o crescimento e os de expressão materna (*H19*, *Igf2r*, *Cdkn1c*) a contê-lo. A *teoria do parentesco* lê nisso um conflito: os genes de um pai ganham em extrair mais de uma mãe que poderá carregar depois a prole de outros machos, ao passo que os genes da mãe ganham em racionar entre todas as suas ninhadas. O imprinting ocorre nos mamíferos placentários e nas plantas com flor, cujo endosperma também é alimentado pela mãe, e não em aves ou répteis, que é o que a teoria prevê.

## 1.5 A herança epigenética e seus limites

**Definição 1.18 (Epigenética).**

A *epigenética* é o estudo das mudanças hereditárias na atividade dos genes que não são mudanças na sequência do DNA: estados carregados pela [metilação do DNA](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation), pelas marcas das [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) ou por circuitos autossustentados de fatores de transcrição, e copiados através da divisão celular. Dois alelos de sequência idêntica, mas com estado epigenético estável diferente, são *epialelos*. A herança através da mitose é a regra e é o que faz uma célula diferenciada continuar diferenciada. A herança através da meiose, de genitor para descendente, é a exceção nos mamíferos, porque as marcas são apagadas em duas ondas de *reprogramação*: nas células germinativas primordiais, onde os imprintings e a maior parte da metilação são varridos e depois fixados de novo conforme o sexo, e outra vez no zigoto e no embrião inicial, onde o genoma paterno é ativamente desmetilado pela TET3 e o materno passivamente, antes que os padrões próprios do embrião sejam estabelecidos pelas DNMT3.

**Exemplo 1.19 (O camundongo agouti viável amarelo).**

No alelo $A^{vy}$ um retrotranspóson se inseriu a montante do gene de cor de pelagem *agouti*. Onde o promotor do transpóson está não metilado, ele aciona o *agouti* constantemente em todas as células; o camundongo é amarelo, obeso e propenso ao diabetes. Onde está metilado, o gene segue seu controle normal e o camundongo é pardo (“pseudoagouti”). Irmãos de ninhada geneticamente idênticos se distribuem por todo o espectro, e uma mãe amarela tem mais filhotes amarelos do que uma parda: o [epialelo](#def-b3-chromatin-epigenetics-epigenetics) é apagado de forma incompleta através da linhagem germinativa materna. Waterland e Jirtle (2003) alimentaram mães $A^{vy}$ prenhes com uma dieta rica em doadores de metila (folato, vitamina B12, colina, betaína) e deslocaram a pelagem dos filhotes rumo ao pardo. O ambiente de uma geração fixara uma marca que a geração seguinte carregou.

![Dois irmãos de ninhada Avy de genótipo idêntico: um camundongo amarelo e obeso, no qual o transpóson a montante do agouti está não metilado, e um pardo pseudoagouti, no qual ele está metilado.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-chromatin-epigenetics/img-f80cae50b46a.jpg)

*Dois irmãos de ninhada $A^{vy}$ de genótipo idêntico: um camundongo amarelo e obeso, no qual o transpóson a montante do *agouti* está não metilado, e um pardo pseudoagouti, no qual ele está metilado.*

**Proposição 1.20 (Onde se encontram estados epigenéticos hereditários).**

Três sistemas bem analisados ilustram os mecanismos acima. A *[variegação por efeito de posição](#prop-b3-chromatin-epigenetics-examples)* em *Drosophila*: um gene deslocado por um rearranjo cromossômico para junto da [heterocromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) é silenciado em algumas células e não em outras, o que dá um olho mosqueado; cada mancha é um clone, o silenciamento se propaga a partir da [heterocromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) pela alça da HP1, e os genes cuja mutação suprime a variegação (genes *Su(var)*) são a HP1 e a metiltransferase da H3K9. A *vernalização* em *Arabidopsis*: semanas de frio de inverno silenciam o repressor do florescimento *FLC* pela H3K27me3 depositada pelo Polycomb, o silêncio se mantém ao longo de meses de crescimento primaveril e de milhares de divisões celulares, e é reiniciado a cada geração, de modo que cada planta precisa passar pelo seu próprio inverno. A *paramutação* no milho: um alelo do gene de pigmento *b1*, quando encontra um outro alelo particular num heterozigoto, converte-o ao seu próprio estado silencioso, e o alelo convertido passa o estado a seus descendentes por gerações, através de uma metilação dirigida por RNA pequeno retomada no [Capítulo 2](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/2-rnas-nao-codificantes-e-regulacao-pos-transcricional#ch-b3-rna-regulation). Em cada caso a herança é mitótica e robusta; a transmissão entre gerações é ou ativamente reiniciada (plantas) ou parcial e imperfeita (camundongos).

**Observação 1.21 (Os limites das alegações transgeracionais).**

Alegações de que a fome ou o estresse de um avô é “herdado epigeneticamente” pelos netos humanos são comuns e em sua maioria não comprovadas. Duas ondas de apagamento se interpõem entre uma marca somática e um neto, os genes sob imprinting e alguns poucos transpósons são os únicos sobreviventes documentados do apagamento em mamíferos, e em coortes humanas os efeitos de um ambiente compartilhado, do ambiente uterino e de diferenças genéticas são difíceis de separar de uma marca carregada na linhagem germinativa. Os casos demonstrados — o $A^{vy}$, alguns [epialelos](#def-b3-chromatin-epigenetics-epigenetics) ligados a transpósons, estados mediados por RNA em vermes e plantas — são reais, molecularmente compreendidos e restritos. O teorema deste capítulo diz por quê: sem uma retroalimentação que empurre $\mu$ para $1$, uma marca esquece a si mesma em poucas dezenas de divisões, e a linhagem germinativa ainda acrescenta um reinício ativo.

## 1.6 Exercícios

**Exercício 1.1 ★.**

Dê a composição de uma partícula do cerne do [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome), o comprimento de DNA que ela liga e o comprimento típico do ligante. Por que a digestão da [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) por nuclease deu uma escada de fragmentos em vez de um rastro contínuo?

**Solução de Exercício 1.1.**

Duas cópias de cada uma das [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) H2A, H2B, H3 e H4 (um octâmero) com $147\,\mathrm{bp}$ de DNA em $1.65$ voltas; ligantes de $20\text{ a }60\,\mathrm{bp}$, o que dá uma repetição próxima de $200\,\mathrm{bp}$. A nuclease corta apenas o DNA ligante exposto, nunca dentro de um cerne, de modo que todo fragmento é um número inteiro de repetições: uma escada de $200$, $400$, $600\,\mathrm{bp}$, e não um rastro.

**Exercício 1.2 ★.**

O genoma de um sapo tem $3.0\times 10^{9}$ pares de bases por conjunto haploide. Quantos [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) contém um núcleo diploide, tomando uma repetição de $190\,\mathrm{bp}$, e qual é o comprimento de seu DNA?

**Solução de Exercício 1.2.**

Diploide: $6.0\times 10^{9}$ bp; $6.0\times 10^{9}/190 \approx
3.2\times 10^{7}$ [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome); comprimento $6.0\times 10^{9}\times
0.34\,\mathrm{nm} = 2.0\,\mathrm{m}$.

**Exercício 1.3 ★.**

Decifre H3K27me3, H4K16ac e H3S10ph. Para cada um, diga se está associado a [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) ativa ou silenciosa, e nomeie um [leitor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) do primeiro.

**Solução de Exercício 1.3.**

H3K27me3: [histona](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) H3, lisina 27, trimetilada — [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) silenciosa de genes reprimidos no desenvolvimento, escrita pelo PRC2 e lida pelas proteínas com cromodomínio do PRC1. H4K16ac: H4, lisina 16, acetilada — [cromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) ativa e aberta (rompe um contato nucleossomo–nucleossomo). H3S10ph: H3, serina 10, fosforilada — uma marca mitótica associada à condensação cromossômica (e, transitoriamente, à ativação gênica por alguns sinais); não é uma marca estável de silenciamento nem de ativação.

**Exercício 1.4 ★.**

Explique por que uma gata tricolor é quase sempre fêmea, e o que um tricolor macho tem de ser.

**Solução de Exercício 1.4.**

O gene alaranjado é ligado ao X e tem um alelo alaranjado e um preto; uma pelagem malhada exige um de cada, em dois cromossomos X diferentes, um dos quais é silenciado por célula. Um macho tem um só X e é inteiramente alaranjado ou inteiramente preto. Um macho tricolor carrega dois cromossomos X e um Y (XXY), e é estéril.

**Exercício 1.5 ★★.**

Calcule a [razão de empacotamento](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) da fibra de $10\,\mathrm{nm}$ a partir dos números da [Definição 1.1](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (repetição $200\,\mathrm{bp}$, conta $11\,\mathrm{nm}$), e a razão necessária para caber os $4\,\mathrm{cm}$ de DNA de um cromossomo humano médio numa cromátide mitótica de $4\,\text{µ}\mathrm{m}$. Por qual fator adicional a fibra deve ser dobrada?

**Solução de Exercício 1.5.**

$200\,\mathrm{bp}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 68\,\mathrm{nm}$ por conta de $11\,\mathrm{nm}$: razão $6.2$. Necessária: $4\,\mathrm{cm}/4\,\text{µ}\mathrm{m} =
10^{4}$. Dobramento adicional de $10^{4}/6.2 \approx 1600$.

**Exercício 1.6 ★★.**

No modelo do [Teorema 1.10](#thm-b3-chromatin-epigenetics-maintenance) com $\mu = 0.98$ e $\delta = 0.01$, determine $p^{*}$ e o número de divisões após o qual um sítio que começou metilado perdeu metade de seu excesso sobre $p^{*}$. Repita para $\mu = 0.999$, $\delta = 0.001$.

**Solução de Exercício 1.6.**

$\mu = 0.98$, $\delta = 0.01$: $p^{*} = 0.01/0.03 = 0.33$; razão $\mu -
\delta = 0.97$; meia-vida $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ divisões. $\mu = 0.999$, $\delta = 0.001$: $p^{*} = 0.5$; razão $0.998$; meia-vida $\ln 2 / 0.002 \approx 350$ divisões.

**Exercício 1.7 ★★.**

Um experimento de ChIP-seq em células de fígado dá um pico de H3K4me3 e um pico de H3K27ac no promotor do gene $A$, um amplo domínio de H3K27me3 sobre o gene $B$ e H3K9me3 sobre o gene $C$. Preveja o estado transcricional de cada um, e diga qual entre $B$ e $C$ tem mais chance de ser ligado em outro tipo celular, e por quê.

**Solução de Exercício 1.7.**

$A$: ativo (promotor com H3K4me3 e [acetilação](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code)). $B$: silencioso, reprimido pelo Polycomb — [heterocromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) facultativa, o estado de um gene do desenvolvimento desligado nesta linhagem mas usado em outras, de modo que $B$ é o que tem mais chance de estar ativo em outro tipo celular. $C$: silencioso, [heterocromatina](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) constitutiva (via da HP1), tipicamente repetições ou genes silenciados em todos os tipos celulares.

**Exercício 1.8 ★★.**

Uma mulher é portadora de uma deleção da região *UBE3A* num dos cromossomos 15, mas é saudável. Seu pai era portador da mesma deleção e também era saudável. De qual síndrome, se alguma, cada um de seus filhos corre risco, e com que probabilidade? E se a deleção tivesse vindo da mãe dela?

**Solução de Exercício 1.8.**

O *UBE3A* é expresso apenas a partir do alelo materno nos neurônios. A deleção dela veio do pai, no alelo que já está silencioso de qualquer modo, e por isso ela é saudável; quando ela a transmite, a deleção passa a ser materna: cada filho tem probabilidade $1/2$ de herdá-la e então tem a síndrome de Angelman. Se a deleção tivesse vindo da mãe dela, ela própria teria a síndrome de Angelman; uma portadora saudável só pode tê-la herdado por via paterna. (Uma deleção paterna de toda a região daria Prader–Willi; o *UBE3A* sozinho não basta para isso.)

**Exercício 1.9 ★★.**

Preveja a consequência, num embrião de camundongo fêmea, de deletar o gene *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* de um dos cromossomos X; dos dois. Preveja o que um transgene *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* inserido num autossomo faz a esse autossomo.

**Solução de Exercício 1.9.**

Um X sem *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* não pode ser inativado, de modo que o outro X é silenciado em todas as células: a inativação é completa, mas deixa de ser aleatória (é enviesada), e o embrião é viável. Os dois X sem *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)*: nenhuma inativação, dois cromossomos X ativos, expressão dobrada dos genes ligados ao X, e o embrião fêmea morre cedo. Um transgene *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* num autossomo recobre esse autossomo em cis e silencia seus genes, causando perda de função de uma cópia autossômica — o experimento que mostrou que o *[Xist](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation)* basta para silenciar em cis.

**Exercício 1.10 ★★★.**

Explique, com o [Exemplo 1.9](#ex-b3-chromatin-epigenetics-cpg-deficit), por que as [ilhas CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) conservaram seus [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) enquanto o resto do genoma perdeu quatro quintos deles, e o que isso implica sobre o estado de metilação das ilhas na linhagem germinativa ao longo do tempo evolutivo. Por que o argumento falha para um gene metilado apenas no fígado?

**Solução de Exercício 1.10.**

As citosinas metiladas se desaminam a timina, que o reparo não reconhece, de modo que um [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) metilado muta para TpG ou CpA a uma taxa alta. Só as sequências não metiladas na *linhagem germinativa*, geração após geração, conservam seus [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation); as ilhas conservaram os seus, e portanto estiveram não metiladas na linhagem germinativa durante a maior parte da história dos vertebrados. Um gene metilado apenas no fígado está não metilado no espermatozoide e no óvulo; as mutações que surgem nas células do fígado não são herdadas, de modo que a metilação somática não deixa pegada na sequência.

**Exercício 1.11 ★★★.**

Mostre, usando a alça escritor–leitor da [Proposição 1.5](#prop-b3-chromatin-epigenetics-readers), como um domínio de H3K9me3 pode ser estável através da replicação embora cada divisão dilua as [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) marcadas pela metade com [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) novas sem marca. O que determina onde o domínio para de se propagar? Proponha um experimento para testar sua explicação.

**Solução de Exercício 1.11.**

Na replicação as [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) antigas, marcadas, são repartidas entre os dois dúplexes-filhos e intercaladas com [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) novas sem marca, de modo que cada domínio-filho fica cerca de metade marcado. A HP1 ligada a um [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) marcado retido recruta a SUV39H, que metila os vizinhos sem marca; enquanto os [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) marcados forem densos o bastante para levar um [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) a cada lacuna, o domínio é recomposto antes da divisão seguinte — a mesma retroalimentação do $\mu$ alto do teorema. A propagação para nas fronteiras: proteínas isolantes (CTCF), genes muito transcritos e genes de tRNA, [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) com marcas ativas incompatíveis (H3K4me3, [acetilação](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code)) que o [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) não consegue usar, e o ponto em que os [apagadores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) (desmetilases, renovação das HDAC) superam o [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code). Teste: recrute a HP1 transitoriamente para um gene repórter (uma fusão com um domínio de ligação ao DNA cuja ligação seja controlada por fármaco), solte-a e acompanhe o silêncio do repórter e a H3K9me3 ao longo das divisões; preveja uma persistência que depende do [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code), e a perda se o [escritor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) ou a dimerização do [leitor](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) estiverem mutados, ou se um isolante for colocado dentro do domínio.

**Exercício 1.12 ★★★.**

Um estudo relata que os netos de pessoas que passaram por uma fome têm metilação alterada num gene de crescimento e maior massa corporal. Liste as explicações alternativas que precisam ser excluídas antes de concluir que uma marca de metilação foi transmitida pela linhagem germinativa, e diga que experimento em camundongos resolveria a questão.

**Solução de Exercício 1.12.**

Excluir: um ambiente compartilhado (a dieta e a pobreza dos próprios netos); um efeito uterino — a filha da mãe exposta à fome era um feto, com suas células germinativas já presentes, de modo que a linhagem germinativa do neto foi exposta diretamente e o efeito não é transgeracional; diferenças genéticas entre as famílias que sobreviveram e as que não; causalidade reversa (a própria massa corporal altera a metilação no sangue); diferenças na composição das células do sangue; e testes múltiplos ao longo de muitos [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation). Experimento em camundongos: exponha *machos* F$_0$ de linhagem isogênica (sem via uterina), cruze-os com fêmeas não expostas ou use fecundação in vitro e transferência de embriões, e acompanhe F$_2$ e F$_3$ pela linha paterna, medindo a metilação no esperma de cada geração; uma marca que persiste no esperma e no fenótipo da F$_3$, numa linhagem sem variação genética, é transmissão germinativa.

## 1.7 Problema: a memória de um gene silenciado

**Problema 1.1.**

Problema de fim de semana — um genoma humano acondicionado em seu núcleo, uma marca de metilação acompanhada ao longo das divisões, uma gata tricolor lida como mapa clonal e as doenças de uma região sob imprinting contadas, terminando no número de divisões que uma marca sobrevive sem retroalimentação e no tamanho da população de células que escolheu seu X

Dados: um núcleo diploide humano contém $6.4\times 10^{9}$ pares de bases, a $0.34\,\mathrm{nm}$ e $650\,\mathrm{Da}$ por par; a repetição do [nucleossomo](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) é de $200\,\mathrm{bp}$, um octâmero de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) pesa $108\,\mathrm{kDa}$ e uma partícula do cerne é um disco de $11\,\mathrm{nm}$ de diâmetro e $5.5\,\mathrm{nm}$ de espessura. O núcleo é uma esfera de $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ de diâmetro. O genoma tem $42\,\%$ de G$+$C. Metilação num [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) comum: $\mu = 0.99$, $\delta = 0.02$ por divisão.

**Parte I — O empacotamento.**

1. Calcule o comprimento total de DNA no núcleo e o número de [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) .
2. Calcule a massa total de [histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) (apenas os octâmeros) e a de DNA, em picogramas ( $1\,\mathrm{Da} = 1.66 \times 10^{-24}\,\mathrm{g}$ ).
3. Calcule o volume do núcleo e o volume total das partículas do cerne, tratadas como cilindros. Que fração do núcleo elas preenchem?
4. Se os [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) fossem dispostos ponta a ponta como uma fibra de $10\,\mathrm{nm}$ , qual seria o comprimento da fibra e qual a [razão de empacotamento](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) em relação ao DNA nu?
5. A fibra é dobrada em alças de $200\,\mathrm{kb}$ ancoradas pela coesina. Quantas alças, e quantos [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) por alça?
6. Sob a hipótese de independência, quantos dinucleotídeos [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) o genoma diploide conteria? O número observado é $5.6\times 10^{7}$ . Que fração se perdeu, e por qual mecanismo mutacional?

**Parte II — Uma marca ao longo das divisões.**

7. Escreva a recorrência de $p_{n}$ e calcule $p^{*}$ .
8. Um [CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) de promotor está totalmente metilado em $n = 0$ . Calcule $p_{n}$ após $10$ , $50$ e $200$ divisões.
9. Após quantas divisões o excesso $p_{n} - p^{*}$ cai pela metade? Uma célula-tronco tecidual se divide cerca de uma vez por semana: quantos anos são esses?
10. Um fármaco inibe completamente a [DNMT1](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) ( $\mu = 0$ ) e também a DNMT3 ( $\delta = 0$ ). Mostre que a fração de fitas metiladas na população cai pela metade a cada divisão, e determine o número de divisões para levar $80\,\%$ de metilação a menos de $5\,\%$ .
11. Numa ilha silenciada os [leitores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) de [metil-CpG](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) recrutam a metilação da H3K9, que recruta a DNMT3, de modo que dentro da ilha $\mu = 0.9995$ e $\delta = 0.0005$ . Recalcule a meia-vida do excesso, em divisões e em anos a uma divisão por semana.
12. Explique numa frase por que é o resultado da questão 11, e não o da questão 9, o que um gene silenciado por toda a vida exige, e que tipo de arranjo molecular o produz.

**Parte III — O mapa da gata tricolor.**

13. Uma gata é heterozigótica para o gene alaranjado ligado ao X. Explique por que sua pelagem tem manchas alaranjadas e pretas e o que representa uma mancha.
14. A [inativação do X](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) ocorreu quando as células destinadas a formar a pele eram $N$ . Cada uma escolheu um X ao acaso. Qual é a probabilidade de todas as $N$ terem escolhido o mesmo, o que daria uma gata de cor única?
15. Nenhuma heterozigota de cor única foi documentada entre talvez um bilhão de gatas; tome a probabilidade como $10^{-9}$ e estime $N$ .
16. A superfície da pele da gata é de cerca de $0.3\,\mathrm{m}^{2}$ e suas manchas têm em média $15\,\mathrm{cm}^{2}$ . Estime o número de manchas e explique por que ele é maior que $N$ .
17. Um gato XXY também é tricolor. Quantos [corpúsculos de Barr](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) exibem suas células? Quantos numa fêmea XXX e num macho XY?
18. Um gene que escapa da inativação está presente em duas cópias ativas nas fêmeas e em uma nos machos. Dê uma razão pela qual esse escape pode ser tolerado e uma situação em que ele importa.

**Parte IV — O cromossomo 15.**

19. A síndrome de Prader–Willi afeta cerca de um nascimento em $15\,000$ ; $70\,\%$ dos casos são uma deleção de novo do 15q11–q13 paterno e $25\,\%$ uma [dissomia uniparental](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) materna. Calcule a frequência de nascimento de cada causa.
20. A síndrome de Angelman tem mais ou menos a mesma frequência; $70\,\%$ são deleções maternas, $5\,\%$ dissomias paternas e $10\,\%$ mutações pontuais do *UBE3A* . Por que as mutações pontuais são uma causa de Angelman, mas quase nunca de Prader–Willi?
21. Um pai é portador de uma translocação balanceada que dá a $20\,\%$ de seus espermatozoides uma deleção 15q11–q13. Que fração de seus filhos tem Prader–Willi, e que fração Angelman?
22. A [dissomia uniparental](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) surge quando um zigoto trissômico perde um cromossomo. Se um zigoto com trissomia do 15 perde ao acaso um de seus três cromossomos, e a trissomia veio da mãe (duas cópias maternas), qual é a probabilidade de o sobrevivente ter dissomia materna? Qual síndrome?
23. Os genes de Prader–Willi são de expressão paterna e o gene de Angelman, de expressão materna. Usando a teoria do parentesco, diga quais dos sintomas das duas síndromes (dificuldade de alimentação ao nascer contra apetite voraz) se encaixam na teoria e quais são mais difíceis de encaixar.
24. Propõe-se um método de tratar a síndrome de Angelman reativando o *UBE3A* paterno silencioso. Seu silêncio se deve a um RNA antissenso de expressão paterna. Proponha o alvo molecular e diga por que a terapia não perturbaria os outros genes sob imprinting.
25. Resuma: a meia-vida de uma marca sem retroalimentação (questão 9) e com ela (questão 11), em divisões; e a população fundadora $N$ da pelagem tricolor (questão 15).

**Solução de Problema 1.1.**

**1.** $6.4\times 10^{9}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 2.2\,\mathrm{m}$; $6.4\times 10^{9}/200 = 3.2\times 10^{7}$ [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome). **2.** [Histonas](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome): $3.2\times 10^{7}\times 1.08\times 10^{5} =
3.5\times 10^{12}$ Da $= 5.7\,\mathrm{pg}$. DNA: $6.4\times 10^{9}\times
650 = 4.2\times 10^{12}$ Da $= 6.9\,\mathrm{pg}$. Massas comparáveis. **3.** Núcleo: $\tfrac{4}{3}\pi\,(5\,\text{µ}\mathrm{m})^{3} =
520\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$. Cerne: $\pi\,(5.5)^{2}\times 5.5 =
520\,\mathrm{nm}^{3} = 5.2\times 10^{-7}\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$; total $3.2\times 10^{7}\times 5.2\times 10^{-7} = 17\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$: cerca de $3\,\%$ do núcleo. **4.** $3.2\times 10^{7}\times 11\,\mathrm{nm} = 0.35\,\mathrm{m}$; [razão de empacotamento](#prop-b3-chromatin-epigenetics-compaction) $2.2/0.35 \approx 6$. **5.** $6.4\times 10^{9}/2\times 10^{5} = 32\,000$ alças de $1000$ [nucleossomos](#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) cada. **6.** $0.21^{2}\times 6.4\times 10^{9} = 2.8\times 10^{8}$; observados $5.6\times 10^{7}$, ou seja $80\,\%$ perdidos, por desaminação da 5-metilcitosina a timina (transições C$\to$T não reparadas nos [CpGs](#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) metilados). **7.** $p_{n+1} = 0.99\,p_{n} + 0.02\,(1 - p_{n}) = 0.97\,p_{n} +
0.02$; $p^{*} = 0.02/0.03 = 0.67$. **8.** $p_{n} = 0.67 + 0.33\times 0.97^{n}$: $n = 10$: $0.91$; $n = 50$: $0.74$; $n = 200$: $0.67$ (o excesso é $7\times 10^{-4}$). **9.** $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ divisões; a uma por semana, cerca de $23$ semanas — cinco meses. **10.** Cada replicação emparelha uma fita antiga, ainda metilada, com uma fita nova que enzima nenhuma metila; as fitas antigas não são nem ganhas nem perdidas, o número de fitas dobra, e portanto a fração metilada cai pela metade. $0.80/2^{n} < 0.05$ exige $2^{n} > 16$: cinco divisões ($0.025$; quatro dão exatamente $5\,\%$). **11.** Razão $0.9995 - 0.0005 = 0.999$; meia-vida $\ln
2/(-\ln 0.999) \approx 690$ divisões, cerca de $13$ anos a uma por semana. **12.** Um gene silencioso por uma vida inteira de umas $4000$ divisões semanais precisa de uma meia-vida de centenas de divisões, que só a retroalimentação da questão 11 dá: os [leitores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) da marca (MeCP2, HP1) recrutam seus [escritores](#def-b3-chromatin-epigenetics-histone-code) (metilase da H3K9, DNMT3), de modo que um domínio denso de marcas se copia com uma eficiência que enzima nenhuma tem sozinha. **13.** Um X carrega o alelo alaranjado, o outro o preto; toda célula da pele silenciou um X e expressa apenas o outro; os descendentes de uma célula mantêm sua escolha, de modo que uma mancha é um clone (ou um grupo de clones vizinhos) que fez a mesma escolha. **14.** Todas as $N$ escolhem o X que carrega o alaranjado, ou todas escolhem o outro: $2\times (1/2)^{N} = 2^{1-N}$. **15.** $2^{1-N} = 10^{-9}$: $N - 1 = \log_{2} 10^{9} = 29.9$, $N \approx 30$ células. **16.** $3000\,\mathrm{cm}^{2}/15\,\mathrm{cm}^{2} = 200$ manchas, bem mais que $30$ fundadoras: durante o crescimento os descendentes de uma fundadora são dispersados pela mistura e pela migração celular, de modo que um clone forma várias ilhas (e vizinhas com a mesma escolha se fundem, o que puxa no sentido contrário, mas menos). **17.** Um [corpúsculo de Barr](#def-b3-chromatin-epigenetics-x-inactivation) por X além do primeiro: XXY um, XXX dois, XY nenhum. **18.** Tolerado quando o gene tem um homólogo funcional no Y, de modo que os machos também têm duas cópias (os genes pseudoautossômicos e pares como *KDM5C*/*KDM5D*); importa nas aneuploidias do X — na síndrome de Turner (XO) os genes que escapam estão presentes em cópia única, que é por que um indivíduo XO não é simplesmente uma fêmea normal (haploinsuficiência do *SHOX* e baixa estatura), e no XXY os que escapam ficam em dose excessiva. **19.** $1/15\,000 = 6.7\times 10^{-5}$; deleções $0.70\times
6.7\times 10^{-5} = 4.7\times 10^{-5}$ (uma em $21\,000$); dissomia materna $1.7\times 10^{-5}$ (uma em $60\,000$). **20.** A síndrome de Angelman é a perda de um só gene, o *UBE3A*, de modo que uma única mutação pontual no alelo materno basta. Prader–Willi é a perda de vários genes de expressão paterna ao mesmo tempo (*SNRPN*, o agrupamento de RNAs pequenos); uma mutação pontual inativa um deles e dá no máximo um fenótipo parcial, nunca a síndrome inteira. **21.** $20\,\%$ dos filhos recebem uma deleção paterna e têm Prader–Willi; nenhum tem Angelman, que exige uma deleção materna. **22.** Três cromossomos, dois maternos e um paterno, um perdido ao acaso: o paterno se perde com probabilidade $1/3$, o que deixa dissomia materna e Prader–Willi; com probabilidade $2/3$ perde-se uma cópia materna e a criança é normal. **23.** Os genes paternos deveriam promover a demanda sobre a mãe; sua perda (Prader–Willi) deveria reduzir a demanda — o que se encaixa na sucção fraca e no baixo ganho de peso do recém-nascido —, ao passo que o apetite insaciável posterior é o oposto e é mais difícil de encaixar (uma leitura proposta é que os genes paternos normalmente empurram a criança rumo ao desmame). Angelman, a perda de um gene materno, deveria aumentar a demanda; a sucção prolongada e os despertares noturnos frequentes das crianças com Angelman se encaixam, as convulsões e a perda da fala não têm nada a ver com recursos. **24.** Ter como alvo o transcrito antissenso paterno (*UBE3A-ATS*) com um oligonucleotídeo antissenso que o degrade ou bloqueie sua elongação: o *UBE3A* paterno está intacto e é silenciado apenas em cis por esse RNA, de modo que retirar o RNA restabelece sua expressão. A metilação da [região controladora do imprinting](#def-b3-chromatin-epigenetics-imprinting) fica intocada, e portanto o *SNRPN* e os demais genes sob imprinting conservam seu padrão parental normal. **25.** Meia-vida de uma marca: cerca de $23$ divisões sem retroalimentação, cerca de $690$ com ela; a pelagem tricolor foi decidida por uma população fundadora de cerca de $30$ células.