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title: "Estabilidade do genoma: dano, reparo e recombinação do DNA"
book: "Biologia universitária — 3.º ano"
subject: biology
language: pt
chapter: 3
exercises: 12
source: https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/3-estabilidade-do-genoma-dano-reparo-e-recombinacao-do-dna
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# Capítulo 3 — Estabilidade do genoma: dano, reparo e recombinação do DNA

Uma tarde de praia deposita umas cem mil lesões químicas no DNA de cada célula da pele exposta ao sol: timinas adjacentes soldadas em dímeros pela luz ultravioleta, bases oxidadas, fitas cortadas. Sem sol algum, a água morna da célula arranca cerca de dez mil purinas de seus açúcares por dia e converte centenas de citosinas em uracila. Ainda assim, a taxa de mutação de uma célula humana é de cerca de uma mudança em dez bilhões de pares de bases por divisão — num genoma de seis bilhões, menos de uma mutação nova por divisão. A distância entre o dano que um genoma sofre e o dano que ele conserva é fechada pelo reparo: uma dúzia de sistemas enzimáticos que patrulham a dupla-hélice, reconhecem o que não deveria estar ali, recortam-no e reconstroem a partir da fita intacta e, quando as duas fitas estão quebradas, as reúnem ou copiam o pedaço que falta de uma irmã. As crianças que não têm um desses sistemas — que se queimam ao primeiro toque de sol, ou que desenvolvem câncer de cólon aos trinta anos — mostram quanto os sistemas valem. Este capítulo trata do dano, das vias de reparo, da maquinaria de recombinação que repara as piores quebras e que a meiose toma emprestada, e da decisão da célula, quando o reparo falha, de parar de se dividir ou de morrer.

## 3.1 O que dá errado no DNA

**Definição 3.1 (Lesões do DNA).**

Uma *lesão* é qualquer alteração química do DNA que o afaste das quatro bases normais corretamente pareadas sobre um esqueleto intacto. As lesões espontâneas vêm da química da água e do oxigênio: a *depurinação*, hidrólise da ligação entre uma purina e seu açúcar, que deixa um sítio abásico (cerca de $10^{4}$ por célula por dia); a *desaminação*, que converte a citosina em uracila, a 5-metilcitosina em timina e a adenina em hipoxantina (algumas centenas por dia); a *oxidação* por espécies reativas de oxigênio, sobretudo a *8-oxoguanina*, que pareia com a adenina tão prontamente quanto com a citosina; e os *erros de replicação*, uma base mal incorporada ou deslizada. Entre as lesões ambientais estão o *dímero ciclobutânico de pirimidina* e o fotoproduto 6-4 feitos pela luz ultravioleta entre duas pirimidinas adjacentes; as bases alquiladas por agentes alquilantes (a O$^{6}$-metil-guanina pareia com a timina); os adutos volumosos de hidrocarbonetos aromáticos e da aflatoxina; as ligações cruzadas entre fitas da cisplatina e das mostardas nitrogenadas; e as quebras de fita simples e de *fita dupla* feitas pela radiação ionizante, cerca de $1000$ quebras de fita simples e $30\text{ a }40$ de fita dupla por célula por gray.

**Proposição 3.2 (A escada da fidelidade).**

A replicação alcança sua taxa de erro de cerca de $10^{-10}$ por par de bases em três etapas multiplicativas. A seleção da base pela polimerase, pela geometria e pelas pontes de hidrogênio, erra cerca de uma vez em $10^{5}$; a *revisão* pela exonuclease 3$'\to$5$'$ da polimerase, que excisa uma base terminal mal pareada antes da extensão, remove $99\,\%$ desses erros; o *[reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity)*, agindo atrás da forquilha sobre a fita recém-feita, remove $99.9\,\%$ do que resta. O produto $10^{-5}\times 10^{-2}\times 10^{-3} = 10^{-10}$ é a taxa observada, e um defeito em qualquer das etapas de correção a eleva cem ou mil vezes: tais células são *mutadoras*.

**Exemplo 3.3 (Lesões contra mutações).**

Uma célula humana de $6.4\times 10^{9}$ pares de bases que se divide uma vez por dia acumula da ordem de $10^{4}$–$10^{5}$ lesões por dia e cerca de $6.4\times 10^{9}\times 10^{-10} \approx 0.6$ mutações novas por divisão: menos de uma [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) em dez mil sobrevive para se tornar uma mudança permanente. As demais são reparadas antes que a replicação as leia, e é a taxa de sobrevivência até a mutação — e não a taxa de dano — que a seleção minimizou. A mesma aritmética mostra por que o número de mutações num tumor ou no esperma de um pai mais velho conta divisões: as mutações que uma célula carrega são, em primeira ordem, as divisões que ela sofreu vezes o erro por divisão.

## 3.2 Reparo de uma fita danificada

**Definição 3.4 (Reparo por excisão).**

A maioria das lesões afeta uma só fita e é reparada recortando o pedaço danificado e copiando a outra fita. O *reparo por excisão de bases* (BER) cuida de lesões pequenas que não distorcem a hélice: uma *DNA-glicosilase* específica para um tipo de base errada (uracila-DNA-glicosilase, glicosilase da 8-oxoG e várias outras) vira a base para fora da hélice e a corta de seu açúcar; uma AP-endonuclease corta o esqueleto no sítio abásico; uma polimerase (a Pol $\beta$) remove o açúcar e insere um nucleotídeo; uma ligase sela. O *reparo por excisão de nucleotídeos* (NER) cuida de lesões volumosas que distorcem a hélice — [dímeros de pirimidina](#def-b3-dna-repair-lesions), adutos químicos — sem reconhecer a química da [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) em si: a distorção é detectada (pela XPC que varre o genoma, ou por uma RNA-polimerase parada, no ramo acoplado à transcrição), a hélice é aberta pelas subunidades helicase do TFIIH, o dano é verificado (XPA), duas endonucleases (XPF, XPG) cortam a fita danificada a $24\text{ a }32$ nucleotídeos de distância, o oligonucleotídeo é liberado, e a polimerase e a ligase preenchem a lacuna. A perda de qualquer uma das sete proteínas XP causa o *xeroderma pigmentoso*: sensibilidade extrema à luz do sol, sardas e uma taxa mil vezes maior de câncer de pele.

**Evidência.** Cleaver (1968) cultivou fibroblastos de pele de pacientes com [xeroderma pigmentoso](#def-b3-dna-repair-excision), irradiou-os com luz ultravioleta e lhes deu timidina radioativa fora da fase S. As células normais incorporaram a marcação em muitos sítios pequenos — a “síntese de DNA não programada” dos remendos de reparo —, ao passo que as células dos pacientes quase nada incorporaram e morreram em doses que as normais sobreviviam: a doença é uma falha em excisar os dímeros. Fundir células de dois pacientes muitas vezes restaurava o reparo no híbrido, cada célula fornecendo o que faltava à outra; por esse teste os pacientes foram separados em grupos de complementação, de A a G, um por gene da via, anos antes de os genes serem clonados. ∎

![Duas vias de excisão. A excisão de bases (à esquerda) reconhece uma base errada específica com uma glicosilase dedicada e troca um nucleotídeo. A excisão de nucleotídeos (à direita) reconhece a distorção que qualquer lesão volumosa causa, corta a fita dos dois lados e troca um remendo de uns trinta nucleotídeos (verde).](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/fig-fd9ab719c7ea.svg)

*Duas vias de excisão. A excisão de bases (à esquerda) reconhece uma base errada específica com uma [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) dedicada e troca um nucleotídeo. A excisão de nucleotídeos (à direita) reconhece a distorção que qualquer [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) volumosa causa, corta a fita dos dois lados e troca um remendo de uns trinta nucleotídeos (verde).*

**Definição 3.5 (Reparo de mau pareamento).**

O *[reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity)* (MMR) corrige os pareamentos errados e as pequenas alças de inserção–deleção que escapam da revisão. A proteína MutS (MSH2–MSH6 nos humanos) reconhece a distorção de um mau pareamento e, com a MutL (MLH1–PMS2), autoriza uma exonuclease a degradar a fita recém-sintetizada desde um corte próximo até passar do mau pareamento; a lacuna é preenchida pela polimerase. A dificuldade é a *discriminação de fitas*: um mau pareamento tem duas bases e só uma está errada. Em *Escherichia coli* a fita nova é identificada porque ainda não está metilada nos sítios GATC, que a metilase Dam marca alguns minutos depois da síntese; a MutH corta a fita não metilada. Nos eucariontes a fita nova é identificada pelos cortes entre os fragmentos de Okazaki e pela extremidade 3$'$ livre da fita contínua. A perda do MMR eleva a taxa de mutação cem a mil vezes, o que é mais visível nos *microssatélites* — séries de uma repetição curta em que a polimerase desliza — cujos comprimentos mudam de célula para célula: a *instabilidade de microssatélites*. A perda herdada de um alelo de MMR é a *síndrome de Lynch*, com câncer colorretal em uns $70\,\%$ dos portadores, muitas vezes antes dos cinquenta.

![A discriminação de fitas no reparo de mau pareamento bacteriano. A fita-molde carrega grupos metila em seus sítios GATC; a fita nova ainda não, e a MutH a corta ali. A base errada é, portanto, sempre removida da fita nova.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/fig-d8c4e98a9ede.svg)

*A discriminação de fitas no [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) bacteriano. A fita-molde carrega grupos metila em seus sítios GATC; a fita nova ainda não, e a MutH a corta ali. A base errada é, portanto, sempre removida da fita nova.*

**Método 3.6 (Separar uma doença de reparo em genes).**

Para descobrir quantos genes um fenótipo recessivo envolve, antes que qualquer gene seja conhecido: (1) tome linhagens celulares de pacientes não aparentados, cada uma mutante em algum gene da via; (2) funda pares de linhagens em células híbridas; (3) teste o híbrido quanto à função (aqui, a síntese de DNA não programada depois da luz ultravioleta); (4) se o híbrido repara, os dois pacientes têm mutações em genes *diferentes* (cada um fornece a proteína que falta ao outro: eles se *complementam*); se não, no mesmo gene; (5) agrupe os pacientes em grupos de complementação — um por gene. A contagem de grupos é um limite inferior do número de genes.

## 3.3 Reparo de um cromossomo quebrado

**Definição 3.7 (Reparo de quebras de fita dupla).**

Uma *[quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions)* secciona o cromossomo e não deixa fita intacta a copiar. Duas vias a reparam. A *junção de extremidades não homólogas* (NHEJ): o anel Ku70–Ku80 liga cada extremidade, recruta a cinase DNA-PKcs, nucleases aparam as pontas salientes e a ligase IV une as extremidades; funciona em qualquer etapa do ciclo e em minutos, mas perde ou acrescenta alguns nucleotídeos na junção e pode unir as extremidades erradas. A *recombinação homóloga* (HR): o complexo MRN e nucleases ressecam as fitas 5$'$ para deixar longas caudas 3$'$ de fita simples, que são recobertas pela RPA e depois, com a ajuda da BRCA2, pela recombinase *Rad51*; o filamento de Rad51 procura um dúplex homólogo — a cromátide irmã, em S e G2 —, invade-o, e a extremidade 3$'$ invasora inicia a síntese sobre a cópia intacta. As moléculas conjuntas podem ser dissolvidas após uma síntese curta (a maior parte do reparo mitótico, sem troca do DNA flanqueador) ou amadurecer em duas *junções de Holliday* de quatro braços, cuja resolução por endonucleases dá ou um produto com permuta ou um sem ela. A HR é acurada porque copia uma irmã, mas só está disponível quando existe uma irmã.

![Os dois destinos de uma quebra de fita dupla. À esquerda: a junção de extremidades, rápida e sempre disponível, ao custo de uma pequena mudança na junção. À direita: a recombinação homóloga, que resseca as extremidades, invade a cromátide irmã com um filamento de Rad51 e copia o que se perdeu.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/fig-df38c5ff87e6.svg)

*Os dois destinos de uma [quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions). À esquerda: a junção de extremidades, rápida e sempre disponível, ao custo de uma pequena mudança na junção. À direita: a [recombinação homóloga](#def-b3-dna-repair-dsb), que resseca as extremidades, invade a cromátide irmã com um filamento de [Rad51](#def-b3-dna-repair-dsb) e copia o que se perdeu.*

**Teorema 3.8 (Carga de dano, taxa de reparo e a forquilha).**

Sejam lesões de um mesmo tipo que surgem a uma taxa constante $D$ por célula por hora e são removidas por um reparo de primeira ordem com constante de taxa $k$ (meia-vida $t_{1/2} = \ln 2/k$). O número de lesões $L(t)$ obedece a $\mathrm{d}L/\mathrm{d}t = D - kL$, de modo que, no estado estacionário,

$$
L^{*} = \frac{D}{k},
$$

e um pulso de $N$ lesões entregue em $t = 0$ deixa $N e^{-kT}$ lesões quando uma forquilha de replicação chega no instante $T$. Se duas vias concorrem pela mesma [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) com constantes de taxa $k_{1}$ e $k_{2}$, cada [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) é reparada pela primeira com probabilidade $k_{1}/(k_{1} +
k_{2})$ e a meia-vida global é $\ln 2/(k_{1} + k_{2})$. O número de lesões que chegam à forquilha segue uma distribuição de Poisson de média $N e^{-kT}$, e portanto a probabilidade de nenhuma chegar é $\exp(-N e^{-kT})$.

**Demonstração.** O estado estacionário é onde $D = kL$. Para o pulso, $D = 0$ e a equação se integra em $L = N e^{-kt}$. Com duas vias a taxa de perda é $(k_{1} + k_{2})L$; em qualquer intervalo curto uma dada [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) é removida pela via 1 com probabilidade $k_{1}\,\mathrm{d}t$ e pela via 2 com $k_{2}\,\mathrm{d}t$, de modo que a probabilidade condicional de sua remoção, quando ocorre, ser pela via 1 é $k_{1}/(k_{1} +
k_{2})$. Lesões independentes, cada uma sobrevivendo com probabilidade $e^{-kT}$, dão uma contagem binomial, Poisson no limite de muitas lesões e sobrevivência pequena, e a probabilidade de zero na Poisson é $e^{-\text{média}}$. ∎

**Exemplo 3.9 (Por que o xeroderma é uma doença da forquilha).**

Uma dose de sol deixa $N = 10^{5}$ [dímeros de pirimidina](#def-b3-dna-repair-lesions) num queratinócito. Com uma meia-vida de excisão de nucleotídeos de $2\,\mathrm{h}$ ($k =
0.35\,\mathrm{h}^{-1}$) e uma forquilha que chega após $8\,\mathrm{h}$, $N e^{-kT} =
10^{5}\times e^{-2.8} \approx 6000$ dímeros ainda estão lá para ser copiados; com o reparo quase ausente de uma célula XP ($k \approx
0.01\,\mathrm{h}^{-1}$), são $92\,000$. Cada dímero encontrado pela forquilha é contornado pela [síntese translesão](#def-b3-dna-repair-tls) (adiante), que é propensa a erro: a carga de mutação do paciente por divisão é quinze vezes a normal, e os cânceres de pele vêm na infância. A cura que funciona é manter $N$ pequeno — a evitação total da luz ultravioleta.

![Dímeros remanescentes após um pulso de 105, em escala logarítmica, para uma célula normal e para uma deficiente em excisão de nucleotídeos. A forquilha às 8\, h encontra quinze vezes mais lesões na célula do paciente.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/fig-fbc59fbd03fc.svg)

*Dímeros remanescentes após um pulso de $10^{5}$, em escala logarítmica, para uma célula normal e para uma deficiente em excisão de nucleotídeos. A forquilha às $8\,\mathrm{h}$ encontra quinze vezes mais lesões na célula do paciente.*

**Evidência.** Holliday (1964) propôs a junção de quatro braços para explicar um enigma da genética de fungos: num cruzamento, uma tétrade de esporos às vezes mostrava uma segregação $3{:}1$ de um marcador em vez da mendeliana $2{:}2$, sempre para marcadores próximos de uma permuta. Seu modelo — a troca de fitas simples entre dois dúplexes homólogos, formando um heterodúplex que o [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) depois “corrige” num sentido ou no outro (a *conversão gênica*) — explicava tanto as razões estranhas quanto sua associação com a permuta. A própria junção foi vista mais tarde no microscópio eletrônico em plasmídeos em recombinação e na estrutura da resolvase RuvC ligada a ela. ∎

## 3.4 Tolerância, alarme e a decisão de parar

**Definição 3.10 (Síntese translesão).**

Quando uma forquilha encontra uma [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) que não foi reparada, a polimerase replicativa para. A *síntese translesão* (TLS) chama uma polimerase especializada, de sítio ativo mais folgado e sem revisão — a Pol $\eta$ para os [dímeros de pirimidina](#def-b3-dna-repair-lesions), as Pol $\iota$, $\kappa$, $\zeta$ e a Rev1 para outras lesões —, que insere alguns nucleotídeos em frente à [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) e sai de cena. A Pol $\eta$ põe duas adeninas em frente a um dímero de timina, o que costuma estar certo; as outras erram com frequência. A TLS troca acurácia pela sobrevivência da forquilha e é a fonte da maioria das mutações induzidas por ultravioleta. A forma variante do [xeroderma pigmentoso](#def-b3-dna-repair-excision) (XP-V) tem o reparo por excisão intacto e não tem a Pol $\eta$: os dímeros que escapam da excisão são contornados pelas polimerases mais propensas a erro, e os cânceres vêm em seguida.

**Proposição 3.11 (A resposta SOS bacteriana).**

Em *E. coli* a recombinase RecA, ligada ao DNA de fita simples que se acumula em forquilhas paradas e em quebras ressecadas, torna-se uma coprotease que induz o repressor LexA a se autoclivar. A LexA reprime uns quarenta genes; à medida que ela cai, eles são ligados na ordem da afinidade de seus operadores: primeiro os genes de reparo por excisão *uvrA* e *uvrB*, depois o próprio *recA* e o inibidor da divisão celular *sulA* (as células param de se dividir e crescem em filamentos), e por último as polimerases propensas a erro Pol IV e Pol V, que contornam lesões ao custo de mutações. A resposta graduada tenta primeiro o reparo acurado e só recorre à tolerância mutagênica quando o dano persiste; as mutações que ela induz são a matéria-prima sobre a qual a resistência a antibióticos evolui durante o tratamento.

![À esquerda: E. coli depois da irradiação ultravioleta, crescida em longos filamentos porque a resposta SOS bloqueou a divisão celular enquanto o DNA é reparado. À direita: um ensaio cometa — células isoladas embebidas num gel e submetidas a eletroforese; o DNA fragmentado escorre para fora do núcleo numa cauda cujo comprimento mede o número de quebras.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/img-f4a5af7f8a90.jpg)

![À esquerda: E. coli depois da irradiação ultravioleta, crescida em longos filamentos porque a resposta SOS bloqueou a divisão celular enquanto o DNA é reparado. À direita: um ensaio cometa — células isoladas embebidas num gel e submetidas a eletroforese; o DNA fragmentado escorre para fora do núcleo numa cauda cujo comprimento mede o número de quebras.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/img-889edb3e6fee.jpg)

*À esquerda: *E. coli* depois da irradiação ultravioleta, crescida em longos filamentos porque a [resposta SOS](#prop-b3-dna-repair-sos) bloqueou a divisão celular enquanto o DNA é reparado. À direita: um ensaio cometa — células isoladas embebidas num gel e submetidas a eletroforese; o DNA fragmentado escorre para fora do núcleo numa cauda cujo comprimento mede o número de quebras.*

**Definição 3.12 (A resposta ao dano no DNA).**

Os eucariontes sinalizam o dano por duas cinases: a *ATM*, recrutada pelo complexo MRN às [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions), e a *ATR*, recrutada ao DNA de fita simples das forquilhas paradas. Elas fosforilam centenas de alvos. Em minutos a [histona](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/1-cromatina-e-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-nucleosome) H2AX é fosforilada (*$\gamma$-H2AX*) ao longo de megabases em torno de cada quebra, formando um foco que recruta as proteínas de reparo e pode ser contado ao microscópio, um foco por quebra. As cinases Chk1 e Chk2 detêm o ciclo celular — os *pontos de checagem* do [Capítulo 10](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/10-controle-do-ciclo-celular-e-morte-celular-programada#ch-b3-cell-cycle-apoptosis) — ao inativar as fosfatases que levariam à entrada em S ou em M; e o fator de transcrição *p53*, estabilizado por fosforilação, induz o inibidor de cinase dependente de ciclina p21 (uma parada duradoura em G1), genes de reparo e, se o dano for pesado ou persistir, os genes apoptóticos que matam a célula. A resposta compra tempo para o reparo e, quando o reparo falha, remove a célula em vez de deixá-la dividir-se com um genoma quebrado.

![Focos de -H2AX (verde) em núcleos (azul) uma hora após a irradiação. Cada foco marca uma quebra de fita dupla; contá-los mede o dano e, ao longo das horas seguintes, seu reparo.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-dna-repair/img-ba437a8ebf15.jpg)

*Focos de $\gamma$-H2AX (verde) em núcleos (azul) uma hora após a irradiação. Cada foco marca uma [quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions); contá-los mede o dano e, ao longo das horas seguintes, seu reparo.*

**Exemplo 3.13 (Letalidade sintética: BRCA e PARP).**

As mulheres que herdam uma cópia defeituosa de *BRCA1* ou de *BRCA2* têm um risco de câncer de mama ao longo da vida de $50\text{ a }80\,\%$; os tumores surgem em células que perderam a segunda cópia e já não conseguem fazer [recombinação homóloga](#def-b3-dna-repair-dsb). Tais células reparam suas [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) apenas por junção de extremidades e acumulam rearranjos. Elas também adquirem uma fraqueza específica. As quebras de fita simples, umas $10\,000$ por dia, são reparadas por uma rota que precisa da enzima PARP; quando a PARP é inibida por um fármaco, as quebras de fita simples persistem até a fase S, em que uma forquilha converte cada uma numa [quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) com apenas uma extremidade — reparável só por recombinação. Uma célula normal, com um alelo *[BRCA](#def-b3-dna-repair-dsb)* bom, dá conta; a célula tumoral morre. Dois defeitos, inócuos isoladamente, são letais juntos: o fármaco mata por *letalidade sintética* e poupa as demais células da paciente.

**Proposição 3.14 (A recombinação como ferramenta).**

As recombinases sítio-específicas cortam e reúnem o DNA em sequências curtas definidas, sem busca de homologia nem síntese: a enzima Cre do fago P1 age sobre sítios *loxP* de $34\,\mathrm{bp}$, a enzima Flp da levedura sobre sítios *FRT*. Dois sítios na mesma orientação numa mesma molécula excisam o DNA entre eles como um círculo; em orientações opostas, invertem-no; sítios em duas moléculas trocam seus flancos. Um gene ladeado por sítios *loxP* (“floxeado”) é deletado apenas nas células em que a Cre é expressa, a partir de um promotor à escolha do experimentador, ou no momento que o experimentador escolher se a Cre for ativada por um fármaco: é assim que um gene essencial ao embrião é estudado no fígado adulto, ou no neurônio, isoladamente ([Capítulo 6](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/6-engenharia-genetica-e-biotecnologia#ch-b3-genetic-engineering)). A própria [recombinação homóloga](#def-b3-dna-repair-dsb) da célula é o que o direcionamento gênico e a edição dirigida por CRISPR tomam emprestado para escrever uma sequência escolhida num lugar escolhido.

**Observação 3.15 (Reparo e envelhecimento).**

As células que não conseguem reparar acumulam mutações, entram em senescência ou morrem; os defeitos herdados de reparo (síndrome de Werner, uma helicase; síndrome de Cockayne, o reparo acoplado à transcrição; ataxia-telangiectasia, a [ATM](#def-b3-dna-repair-ddr)) causam traços de envelhecimento precoce, e a contagem de mutações somáticas dos tecidos normais sobe linearmente com a idade, a uma taxa de algumas dezenas de mutações por célula por ano. Se o dano acumulado *causa* o envelhecimento comum, ou apenas o acompanha, não está resolvido; que a capacidade de reparar seja um determinante da longevidade entre as espécies — as espécies mais longevas reparam mais — está bem apoiado.

## 3.5 Exercícios

**Exercício 3.1 ★.**

Classifique estas lesões como espontâneas ou ambientais e nomeie a via de reparo de cada uma: uma uracila no DNA; um dímero de timina; uma [8-oxoguanina](#def-b3-dna-repair-lesions); um mau pareamento G–T atrás da forquilha; uma [quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) em G1.

**Solução de Exercício 3.1.**

Uracila: espontânea ([desaminação](#def-b3-dna-repair-lesions) de C), [reparo por excisão de bases](#def-b3-dna-repair-excision) pela uracila-DNA-glicosilase. Dímero de timina: ambiental (UV), [reparo por excisão de nucleotídeos](#def-b3-dna-repair-excision). [8-oxoguanina](#def-b3-dna-repair-lesions): espontânea (oxidação), [reparo por excisão de bases](#def-b3-dna-repair-excision) pela [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) da 8-oxoG. Mau pareamento G–T atrás da forquilha: erro de replicação, [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity). [Quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) em G1: ambiental (radiação) ou espontânea; [junção de extremidades não homólogas](#def-b3-dna-repair-dsb), já que não há cromátide irmã disponível.

**Exercício 3.2 ★.**

Por que o [reparo por excisão de nucleotídeos](#def-b3-dna-repair-excision) não precisa de uma enzima específica para cada tipo de [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions), ao passo que o [reparo por excisão de bases](#def-b3-dna-repair-excision) precisa de uma [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) para cada uma?

**Solução de Exercício 3.2.**

A excisão de nucleotídeos reconhece uma propriedade física comum a todas as lesões volumosas — a distorção da hélice, ou uma RNA-polimerase parada — e remove um remendo que contém o que quer que a tenha causado. As lesões pequenas (uracila, 8-oxoG, bases alquiladas) quase não distorcem a hélice, e por isso precisam ser reconhecidas por sua química, uma [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) por tipo de base errada.

**Exercício 3.3 ★.**

Enuncie o problema da discriminação de fitas no [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) e como *E. coli* o resolve. O que aconteceria num mutante *dam*, que não metila nenhum sítio GATC?

**Solução de Exercício 3.3.**

Um mau pareamento é feito de duas bases normais, e só a que está na fita nova está errada; o sistema precisa saber qual fita é a nova. *E. coli* marca a fita parental com grupos metila nos GATC, que a fita nova não tem por alguns minutos; a MutH corta a fita não metilada. Num mutante *dam* nenhuma das fitas é metilada: a MutH corta qualquer uma, o reparo remove a base certa tantas vezes quanto a errada — fixando metade dos erros como mutações (uma mutadora) — e cortes nas duas fitas em sítios GATC próximos produzem [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions).

**Exercício 3.4 ★.**

Uma célula recebe $2\,\mathrm{Gy}$ de raios X. Quantas [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) ela sofre, grosso modo, e quantos focos de $\gamma$-H2AX você esperaria contar uma hora depois? Por que menos após seis horas?

**Solução de Exercício 3.4.**

Cerca de $35\times 2 = 70$ [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions). Após uma hora a maioria já foi unida: com meia-vida perto de $30\,\mathrm{min}$, cerca de $70/4 \approx 18$ focos. Após seis horas quase todas foram reparadas ($70/2^{12} < 1$), restando apenas algumas quebras complexas e persistentes.

**Exercício 3.5 ★★.**

Usando a [Proposição 3.2](#prop-b3-dna-repair-fidelity), calcule a taxa de mutação por par de bases e o número de mutações novas por genoma diploide por divisão em (a) uma célula normal, (b) uma célula sem [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity), (c) uma célula cuja polimerase perdeu sua exonuclease. Qual é a mutadora mais perigosa?

**Solução de Exercício 3.5.**

(a) $10^{-5}\times 10^{-2}\times 10^{-3} = 10^{-10}$; $6.4\times
10^{9}\times 10^{-10} = 0.64$ mutações por divisão. (b) Sem [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity), $10^{-7}$; $640$ por divisão. (c) Sem revisão, $10^{-8}$; $64$ por divisão. A mutante de [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) é a mais perigosa, mil vezes acima do normal.

**Exercício 3.6 ★★.**

Sítios abásicos surgem a $10^{4}$ por célula por dia e são reparados com meia-vida de $15\,\mathrm{min}$. Use o [Teorema 3.8](#thm-b3-dna-repair-load) para achar o número estacionário de sítios abásicos numa célula. Se um fármaco desacelera o reparo dez vezes, qual é o novo estado estacionário, e quantos sítios uma forquilha encontraria se copiasse o genoma em $8\,\mathrm{h}$?

**Solução de Exercício 3.6.**

$k = \ln 2/0.25\,\mathrm{h} = 2.8\,\mathrm{h}^{-1}$; $D = 10^{4}/24 =
420\,\mathrm{h}^{-1}$; $L^{*} = 420/2.8 \approx 150$ sítios abásicos presentes a cada momento. Com o reparo dez vezes mais lento: $L^{*} \approx 1500$. A forquilha passa uma vez por cada loco e encontra as lesões presentes ali naquele momento; na média do genoma ela encontra cerca de $L^{*}$ delas — uns $150$ normalmente, $1500$ com o fármaco.

**Exercício 3.7 ★★.**

Em G2 uma quebra pode ser reparada por NHEJ (meia-vida $30\,\mathrm{min}$) ou por HR (meia-vida $4\,\mathrm{h}$), ambas disponíveis. Que fração das quebras vai pela HR? Qual é a meia-vida das quebras? Por que a HR é, ainda assim, a via que importa nas forquilhas de replicação colapsadas?

**Solução de Exercício 3.7.**

$k_{\text{NHEJ}} = \ln 2/0.5 = 1.39\,\mathrm{h}^{-1}$, $k_{\text{HR}} =
\ln 2/4 = 0.17\,\mathrm{h}^{-1}$; fração da HR $0.17/1.56 = 0.11$; meia-vida $\ln 2/1.56 = 27\,\mathrm{min}$. Uma forquilha colapsada dá uma quebra de *uma só extremidade*: não há segunda extremidade para a NHEJ unir, de modo que só a recombinação com a irmã pode restaurar a forquilha — e ela é, de todo modo, a única via acurada.

**Exercício 3.8 ★★.**

Preveja o comportamento dos microssatélites, o espectro de tumores e a sensibilidade à luz do sol de um paciente com (a) [síndrome de Lynch](#def-b3-dna-repair-mmr), (b) [xeroderma pigmentoso](#def-b3-dna-repair-excision) do grupo A, (c) a variante XP-V, sem a Pol $\eta$.

**Solução de Exercício 3.8.**

(a) Lynch: microssatélites instáveis (comprimentos diferentes entre as células do tumor), cânceres colorretal, de endométrio, gástrico e de ovário, resposta normal à luz do sol. (b) XP-A: microssatélites estáveis, queimadura extrema com exposição mínima, cânceres de pele e de olho na infância e, neste grupo, degeneração neurológica progressiva. (c) XP-V: microssatélites estáveis, reparo por excisão normal, de modo que a queimadura é mais branda, mas os dímeros que escapam da excisão são contornados por polimerases propensas a erro — cânceres de pele, de início mais tardio que no grupo A.

**Exercício 3.9 ★★.**

Dois sítios *loxP* na mesma orientação ladeiam o éxon 3 de um gene; a Cre é expressa a partir de um promotor ativo apenas no fígado desde o nascimento. Descreva o genótipo das células hepáticas e o dos neurônios no adulto, e o que acontece se os sítios forem postos em orientações opostas.

**Solução de Exercício 3.9.**

Células hepáticas: a Cre excisou o éxon 3 dos dois alelos (como um círculo que se perde), de modo que o gene está inativo em cada hepatócito desde o nascimento — um nocaute específico do fígado. Neurônios: sem Cre, os alelos floxeados estão intactos e funcionais. Orientações opostas: a Cre inverte o éxon e o desinverte indefinidamente, de modo que a qualquer momento cerca de metade das células carrega o éxon invertido e não funcional — um mosaico, e não uma deleção limpa.

**Exercício 3.10 ★★★.**

Explique por que a [resposta SOS](#prop-b3-dna-repair-sos) liga os genes de reparo antes das polimerases propensas a erro, usando as afinidades da LexA por seus operadores, e por que uma bactéria desprovida das polimerases propensas a erro poderia mesmo assim estar em desvantagem num paciente tratado com antibióticos.

**Solução de Exercício 3.10.**

À medida que a LexA é clivada, sua concentração cai gradualmente. Os operadores que ligam a LexA fracamente ficam vagos já com uma queda pequena — *uvrA*, *uvrB*, *recA* —, e por isso o reparo acurado começa primeiro; os operadores de *sulA* e das polimerases propensas a erro ligam a LexA com força e só ficam vagos quando ela quase desapareceu, isto é, quando o dano persistiu por muito tempo. Uma bactéria sem as polimerases propensas a erro morreria em forquilhas bloqueadas por lesões que não conseguiria contornar e, sem mutagênese induzida, evoluiria resistência ao antibiótico bem mais devagar — uma desvantagem para a bactéria, uma vantagem para o paciente; inibidores da [resposta SOS](#prop-b3-dna-repair-sos) são estudados por essa razão.

**Exercício 3.11 ★★★.**

Um inibidor de PARP mata células tumorais deficientes em *[BRCA](#def-b3-dna-repair-dsb)*, mas não as células normais da paciente. Exponha a cadeia causal e, em seguida, preveja dois modos pelos quais um tumor poderia tornar-se resistente ao fármaco e como você detectaria cada um.

**Solução de Exercício 3.11.**

Cadeia: PARP inibida $\to$ as quebras de fita simples persistem $\to$ uma forquilha de replicação converte cada uma numa [quebra de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) de uma só extremidade $\to$ o reparo exige [recombinação homóloga](#def-b3-dna-repair-dsb) $\to$ a célula tumoral, sem [BRCA](#def-b3-dna-repair-dsb), não consegue $\to$ união errada, perda de cromossomos, morte. As células normais, com um alelo funcional, recombinam e sobrevivem. Resistência: (1) uma segunda mutação em *[BRCA](#def-b3-dna-repair-dsb)* que restaura a fase de leitura e uma proteína funcional — detecte sequenciando o tumor ou o DNA tumoral circulante no sangue, e pelo retorno dos focos de [Rad51](#def-b3-dna-repair-dsb) após a irradiação; (2) a perda das proteínas que bloqueiam a ressecção das extremidades (53BP1–shieldina), que restaura em parte a recombinação sem a BRCA1 — detecte pela ausência delas na coloração e pelos focos de [Rad51](#def-b3-dna-repair-dsb) restaurados; também mutações de PARP1 que impeçam seu aprisionamento no DNA, ou bombas de efluxo de fármacos, detectadas por sequenciamento e por expressão, respectivamente.

**Exercício 3.12 ★★★.**

A conversão gênica numa permuta dá tétrades $3{:}1$. Desenhe (ou descreva) uma [junção de Holliday](#def-b3-dna-repair-dsb) com um heterodúplex que abranja um marcador, e mostre como o [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) do heterodúplex num sentido dá $3{:}1$, no outro dá $1{:}3$, e a ausência de reparo dá um esporo ele próprio heterozigoto (uma segregação pós-meiótica). Por que a conversão se restringe a marcadores próximos da permuta?

**Solução de Exercício 3.12.**

Dois dúplexes homólogos, um carregando $A$ e o outro $a$, trocam fitas simples ao longo do marcador: cada um passa a ter uma fita de cada parental ao longo do trecho — um heterodúplex com um mau pareamento $A/a$. Se o [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) converte o mau pareamento no dúplex invadido para $A$, três cromátides carregam $A$ e uma carrega $a$: $3{:}1$; convertido para $a$: $1{:}3$; deixado sem reparo, a cromátide segrega $A$ e $a$ na primeira mitose depois da meiose, dando dois esporos-filhos diferentes (segregação pós-meiótica, $5{:}3$ num asco de oito esporos). O trecho de heterodúplex tem apenas de algumas centenas a alguns milhares de pares de bases em torno da quebra iniciadora, de modo que só marcadores dentro dele podem ser convertidos, e eles estão, por construção, ao lado da permuta.

## 3.6 Problema: um dia na vida de um genoma

**Problema 3.1.**

Problema de fim de semana — o dano diário de uma célula humana contado, a escada da fidelidade multiplicada, uma dose de sol acompanhada até a forquilha numa célula normal e numa deficiente em reparo, uma dose de raios X repartida entre duas vias de reparo e a fraqueza de um tumor convertida em fármaco, terminando no número de dímeros que a forquilha encontra, na taxa de mutação por base e na fração de quebras que a recombinação repara

Dados: uma célula humana diploide tem $6.4\times 10^{9}$ bp, $1.5\,\%$ deles codificadores de proteína. Dano espontâneo por dia: $10^{4}$ depurinações, $400$ desaminações de citosina, $10^{4}$ quebras de fita simples. Fidelidade: polimerase $10^{-5}$, a revisão deixa $10^{-2}$ dos erros, o [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) $10^{-3}$. Um banho de sol deixa $10^{5}$ [dímeros de pirimidina](#def-b3-dna-repair-lesions) por célula da pele; o reparo por excisão tem meia-vida de $2\,\mathrm{h}$ normalmente e de $70\,\mathrm{h}$ no [xeroderma pigmentoso](#def-b3-dna-repair-excision); uma forquilha chega $8\,\mathrm{h}$ depois; o contorno de um dímero pela translesão causa uma mutação com probabilidade $10^{-3}$. Os raios X produzem $35$ [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) por gray; meia-vida da NHEJ $30\,\mathrm{min}$, da HR $4\,\mathrm{h}$.

**Parte I — Dias comuns.**

1. Quantas lesões espontâneas a célula sofre por dia, e por ano? Compare com o tamanho do genoma.
2. Calcule a taxa de mutação por par de bases por divisão e o número esperado de mutações novas por divisão.
3. Quantas delas caem em sequência codificadora de proteína? Ao longo das cerca de $50$ divisões do zigoto a uma célula de pele adulta, quantas mutações codificadoras uma célula da pele carrega só pela replicação?
4. Uma célula sem [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) : taxa de mutação e mutações por divisão? Um microssatélite desliza uma vez em $10^{4}$ divisões sem [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) e uma vez em $10^{7}$ com ele. Num tumor de $10^{9}$ células derivadas por $40$ divisões, quantas células carregam um alelo deslizado num dado microssatélite em cada caso? (Estime com taxa $\times$ divisões $\times$ células.)
5. A [desaminação](#def-b3-dna-repair-lesions) da citosina dá uracila, a da 5-metilcitosina dá timina. Qual é reparada, por quê, e qual se torna mutação? Relacione com o déficit de [CpG](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/1-cromatina-e-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation) do [Capítulo 1](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/1-cromatina-e-epigenetica#ch-b3-chromatin-epigenetics) .
6. Uma guanina oxidada (8-oxoG) pareia com A durante a replicação. A célula tem uma [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) para a 8-oxoG em frente a C, outra para o A em frente à 8-oxoG e uma hidrolase que destrói o dGTP oxidado. Explique o que cada uma previne e que mutação resulta quando as três falham.

**Parte II — Um dia ao sol.**

7. Calcule as constantes de taxa de excisão $k$ da célula normal e da célula XP.
8. Quantos dímeros restam na forquilha em cada uma?
9. Quantas mutações o banho de sol causa por célula em cada caso, e quantas delas estão em sequência codificadora?
10. Ao longo de uma infância de $500$ exposições dessas, quantas mutações codificadoras por célula da pele em cada caso? Compare com o número devido apenas à replicação da questão 3.
11. Cerca de $20$ genes, somando $40\,\mathrm{kb}$ de sequência codificadora, podem impulsionar um câncer de pele quando mutados. Qual é a probabilidade, por célula, de ao menos uma mutação induzida pelo banho de sol cair num deles, na criança com XP? (Use uma Poisson com a média certa.) Com $10^{9}$ células expostas, quantas são atingidas?
12. Explique por que o problema das células XP é da forquilha, e não da [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) em si, e por que os cânceres aparecem só na pele.

**Parte III — Uma dose de raios X.**

13. Uma dose de $2\,\mathrm{Gy}$ : quantas [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) , e quantos focos de $\gamma$ -H2AX após uma hora se a NHEJ for a única via (célula em G1)?
14. Numa célula em G2 as duas vias operam. Calcule as constantes de taxa e a fração de quebras reparadas pela HR.
15. Qual é a meia-vida das quebras em G2, e quantas restam após uma hora?
16. Cada evento de NHEJ altera alguns pares de bases na junção. Se uma junção cai em sequência codificadora com probabilidade $0.015$ e a alteração então rompe o gene com probabilidade $0.7$ , quantos genes a dose de $2\,\mathrm{Gy}$ rompe por célula em G1?
17. Com $n$ quebras simultâneas, as extremidades podem ser unidas erradas numa translocação. Suponha que cada um dos $n(n-1)/2$ pares de quebras seja unido de modo errado com probabilidade $3\times 10^{-4}$ . Translocações esperadas por célula a $2\,\mathrm{Gy}$ ? E a $0.2\,\mathrm{Gy}$ ? Por que o risco escala com o quadrado da dose enquanto o número de quebras escala linearmente?
18. A mesma dose de $2\,\mathrm{Gy}$ dada ao longo de $10\,\mathrm{h}$ em vez de num instante: quantas quebras estão presentes ao mesmo tempo (estado estacionário, NHEJ)? O que isso implica para as translocações e para a prática de fracionar a radioterapia?
19. Uma célula sobrevive a uma dose $D$ com probabilidade $e^{-D/D_{0}}$ , com $D_{0} = 1.5\,\mathrm{Gy}$ para uma célula de reparo intacto e $0.5\,\mathrm{Gy}$ para uma sem NHEJ. Calcule a sobrevivência de cada uma a $2\,\mathrm{Gy}$ e a $6\,\mathrm{Gy}$ , e interprete $D_{0}$ .

**Parte IV — A fraqueza do tumor.**

20. Uma célula tumoral deficiente em *BRCA2* repara as quebras só por NHEJ. Usando a questão 14, que fração de suas quebras em S/G2 passa a ser reparada de modo inacurado, quando uma célula normal a repararia de modo acurado? O que isso faz a seu genoma ao longo dos anos?
21. A inibição da PARP deixa as $10^{4}$ quebras diárias de fita simples sem reparo; $1\,\%$ delas é convertido pelas forquilhas em [quebras de fita dupla](#def-b3-dna-repair-lesions) com uma só extremidade. Quantas quebras dessas por dia por célula, e por que a NHEJ não consegue reparar corretamente uma quebra de uma só extremidade?
22. Explique por que as células normais da paciente, heterozigotas para *BRCA2* , sobrevivem ao fármaco.
23. Um tumor torna-se resistente por uma segunda mutação que restaura a fase de leitura de *BRCA2* . Explique e diga como você o detectaria.
24. A quimioterapia com um agente alquilante mata as células tumorais por meio do [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) : a enzima tenta reparar as bases alquiladas e dispara a morte celular. Preveja o efeito do fármaco sobre um tumor de [síndrome de Lynch](#def-b3-dna-repair-mmr) , que não tem [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) .
25. Enuncie os três resultados: os dímeros encontrados pela forquilha na célula XP (questão 8), a taxa normal de mutação por par de bases (questão 2) e a fração de quebras em G2 que a HR repara (questão 14).

**Solução de Problema 3.1.**

**1.** $10^{4} + 400 + 10^{4} \approx 2\times 10^{4}$ lesões por dia, $7\times 10^{6}$ por ano — grosso modo uma por quilobase do genoma por ano. **2.** $10^{-5}\times 10^{-2}\times 10^{-3} = 10^{-10}$ por bp; $6.4\times 10^{9}\times 10^{-10} = 0.64$ mutações por divisão. **3.** $0.64\times 0.015 \approx 0.01$ mutações codificadoras por divisão; ao longo de $50$ divisões, cerca de $0.5$. **4.** $10^{-7}$ por bp, $640$ mutações por divisão. Células com deslizamento: sem reparo, $10^{-4}\times 40\times 10^{9} = 4\times 10^{6}$; com ele, $10^{-7}\times 40\times 10^{9} = 4000$ — uma diferença de mil vezes, visível como [instabilidade de microssatélites](#def-b3-dna-repair-mmr). **5.** A uracila é estranha ao DNA, é reconhecida pela uracila-DNA-glicosilase e excisada: reparada. A timina vinda da 5-metilcitosina é uma base normal em frente a um G; nada a assinala como errada fora da replicação, e ela se torna uma mutação C$\to$T — o mecanismo que esvaziou o genoma de [CpG](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/1-cromatina-e-epigenetica#def-b3-chromatin-epigenetics-methylation). **6.** A [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) da 8-oxoG remove a base oxidada enquanto ela ainda está em frente a C (antes da replicação); a segunda [glicosilase](#def-b3-dna-repair-excision) remove um A mal incorporado em frente à 8-oxoG (depois da replicação, restaurando uma chance de reparar o G); a hidrolase destrói o dGTP oxidado para que ele não seja incorporado em frente a A. Quando as três falham, a 8-oxoG pareia com A e a rodada seguinte fixa uma transversão G$\cdot$C$\to$T$\cdot$A. **7.** Normal $k = \ln 2/2 = 0.35\,\mathrm{h}^{-1}$; XP $k = \ln 2/70
= 0.0099\,\mathrm{h}^{-1}$. **8.** Normal $10^{5} e^{-2.77} \approx 6200$; XP $10^{5}
e^{-0.079} \approx 92\,000$. **9.** Mutações $6.2$ e $92$ por célula; codificadoras $0.09$ e $1.4$. **10.** $500$ exposições: $47$ mutações codificadoras (normal) e $690$ (XP), contra $0.5$ vindas da replicação — a luz do sol domina a carga de mutação da pele mesmo numa pessoa normal. **11.** Sequência codificadora $9.6\times 10^{7}$ bp; os genes condutores são $4\times 10^{4}/9.6\times 10^{7} = 4.2\times 10^{-4}$ dela. Média de acertos $690\times 4.2\times 10^{-4} = 0.29$; $P(\ge 1) = 1 - e^{-0.29} =
0.25$. De $10^{9}$ células, $2.5\times 10^{8}$ carregam uma mutação condutora (criança normal: média $0.02$, $2\,\%$). **12.** Um dímero não é uma mutação; ele só se torna uma quando uma forquilha o copia por contorno propenso a erro, e por isso são as células em divisão com muitos dímeros não reparados que mutam. A luz ultravioleta alcança apenas a pele e o olho; os tecidos internos não recebem dímeros e, no XP, estão quase normais. **13.** $70$ quebras; após $1\,\mathrm{h}$ só com NHEJ, $70\times
2^{-2} \approx 18$ focos. **14.** $k_{\text{NHEJ}} = 1.39\,\mathrm{h}^{-1}$, $k_{\text{HR}} =
0.17\,\mathrm{h}^{-1}$; fração da HR $0.17/1.56 = 0.11$. **15.** Meia-vida $\ln 2/1.56 = 27\,\mathrm{min}$; após $1\,\mathrm{h}$, $70\,e^{-1.56} \approx 15$ quebras. **16.** $70\times 0.015\times 0.7 \approx 0.7$ genes rompidos por célula. **17.** $n = 70$: $2415$ pares $\times 3\times 10^{-4} = 0.72$ translocações. $n = 7$: $21\times 3\times 10^{-4} = 0.006$. O número de quebras é $\propto D$, mas o número de *pares* de quebras simultâneas é $\propto n^{2} \propto D^{2}$. **18.** $D = 7\,\mathrm{h}^{-1}$, $L^{*} = 7/1.39 \approx 5$ quebras presentes por vez: $10$ pares, $0.003$ translocações — duzentas vezes menos que a mesma dose num instante. O fracionamento deixa o tecido normal reparar entre as frações e mantém poucas quebras simultâneas. **19.** Reparo intacto: $e^{-2/1.5} = 0.26$ a $2\,\mathrm{Gy}$, $e^{-4} = 0.018$ a $6\,\mathrm{Gy}$. Sem NHEJ: $e^{-4} = 0.018$ e $e^{-12} = 6\times 10^{-6}$. $D_{0}$ é a dose que deixa, em média, uma [lesão](#def-b3-dna-repair-lesions) letal não reparada por célula (sobrevivência $1/e$). **20.** Os $11\,\%$ de quebras de duas extremidades em G2 que a HR teria reparado com acurácia passam agora pela NHEJ, e cada quebra de forquilha de uma só extremidade — que a NHEJ não consegue reparar corretamente de modo algum — é unida errada: ao longo dos anos o genoma acumula deleções, translocações e mudanças de número de cópias, as cicatrizes características dos tumores *[BRCA](#def-b3-dna-repair-dsb)*. **21.** $10^{4}\times 0.01 = 100$ quebras de uma só extremidade por dia. Uma quebra de uma só extremidade não tem extremidade parceira; a NHEJ só pode deixá-la como está ou uni-la a alguma extremidade sem relação, produzindo uma translocação ou uma perda. **22.** Um alelo *BRCA2* funcional produz proteína suficiente para a recombinação: as células normais reparam suas quebras de forquilha e sobrevivem ao inibidor. **23.** Uma segunda mudança de fase a jusante da primeira restaura a fase de leitura e dá uma BRCA2 encurtada, mas em parte funcional, de modo que a recombinação volta e o fármaco deixa de matar. Detecte sequenciando o *BRCA2* no tumor resistente ou no DNA tumoral circulante, e funcionalmente pelo reaparecimento dos focos de [Rad51](#def-b3-dna-repair-dsb) após a irradiação. **24.** A morte celular precisa que o [reparo de mau pareamento](#prop-b3-dna-repair-fidelity) engaje as bases alquiladas; um tumor de Lynch, que não o tem, é tolerante — o fármaco não consegue matá-lo (tais tumores são tratados por outros meios, entre eles a imunoterapia, à qual sua pesada carga de mutações os torna sensíveis). **25.** Cerca de $92\,000$ dímeros na forquilha da célula XP; $10^{-10}$ mutações por par de bases por divisão; a HR repara $11\,\%$ das quebras em G2.