---
title: "Genômica e sequenciamento"
book: "Biologia universitária — 3.º ano"
subject: biology
language: pt
chapter: 4
exercises: 12
source: https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/4-genomica-e-sequenciamento
---

# Capítulo 4 — Genômica e sequenciamento

O primeiro genoma completo de um organismo de vida livre, os $1.8\,\mathrm{Mb}$ de uma bactéria, foi publicado em 1995 depois de um ano de trabalho de uma equipe de quarenta pessoas. O genoma humano, com $3.2$ bilhões de pares de bases, custou treze anos e cerca de três bilhões de dólares a um consórcio internacional e foi declarado concluído em 2003. Hoje uma máquina de bancada lê um genoma humano numa noite por algumas centenas de dólares, um hospital sequencia o tumor de um paciente para escolher um fármaco, e um museu extrai e lê o genoma de um osso de quarenta mil anos. A tecnologia que tornou isso possível, a matemática que converte milhões de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas num genoma e o que os genomas prontos ensinaram sobre o tamanho, o conteúdo e a história de nosso DNA são o assunto deste capítulo. O capítulo seguinte retoma os algoritmos que comparam as sequências depois de obtidas.

## 4.1 Ler o DNA

**Definição 4.1 (Sequenciamento por terminação de cadeia).**

O *sequenciamento de Sanger* copia um molde de fita simples a partir de um iniciador com DNA-polimerase, na presença dos quatro nucleotídeos normais e de uma pequena proporção de *didesoxinucleotídeos*, que não têm a hidroxila 3$'$ e por isso terminam a cadeia onde quer que sejam incorporados. Cada didesoxinucleotídeo carrega um corante fluorescente diferente. O produto é uma mistura de fragmentos, um para cada posição do molde, cada um terminando numa base de identidade conhecida; separados por tamanho num capilar de gel, eles passam por um detector em ordem de comprimento, e a sequência de cores é a sequência do molde. Uma corrida lê $700\text{ a }900\,\mathrm{bp}$ com taxa de erro abaixo de $10^{-3}$; continua sendo o método para verificar uma construção ou um gene isolado.

**Evidência.** Sanger, Nicklen e Coulson publicaram o método em 1977 e o usaram naquele mesmo ano para ler os $5386\,\mathrm{bp}$ do fago $\phi$X174 — o primeiro genoma de DNA completo — e, em 1981, os $16\,569\,\mathrm{bp}$ da mitocôndria humana. Fleischmann e colaboradores (1995) leram os $1.83\,\mathrm{Mb}$ de *Haemophilus influenzae* quebrando o genoma inteiro em fragmentos aleatórios, sequenciando $24\,000$ deles e montando as [leituras](#def-b3-genomics-ngs) por computador — a estratégia de *sequenciamento aleatório do genoma inteiro* que todos os projetos posteriores ampliaram. ∎

![À esquerda: Frederick Sanger, que idealizou os primeiros métodos práticos de leitura de proteínas e de DNA e recebeu um prêmio Nobel por cada um. À direita: uma autorradiografia de um gel de sequenciamento da era pré-capilar, uma raia por base, com a sequência lida de baixo para cima na escada de bandas.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/img-449ad1d73146.jpg)

![À esquerda: Frederick Sanger, que idealizou os primeiros métodos práticos de leitura de proteínas e de DNA e recebeu um prêmio Nobel por cada um. À direita: uma autorradiografia de um gel de sequenciamento da era pré-capilar, uma raia por base, com a sequência lida de baixo para cima na escada de bandas.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/img-874706cdd095.jpg)

*À esquerda: Frederick Sanger, que idealizou os primeiros métodos práticos de [leitura](#def-b3-genomics-ngs) de proteínas e de DNA e recebeu um prêmio Nobel por cada um. À direita: uma autorradiografia de um gel de sequenciamento da era pré-capilar, uma raia por base, com a sequência lida de baixo para cima na escada de bandas.*

![Sequenciamento por terminação de cadeia. Uma base didesoxi encerra a cópia em cada posição onde é incorporada; os fragmentos, um por comprimento, são separados por tamanho e a cor de cada base terminal é lida em ordem.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/fig-898013917dc6.svg)

*Sequenciamento por [terminação de cadeia](#def-b3-genomics-sanger). Uma base didesoxi encerra a cópia em cada posição onde é incorporada; os fragmentos, um por comprimento, são separados por tamanho e a cor de cada base terminal é lida em ordem.*

**Definição 4.2 (Sequenciamento massivamente paralelo).**

Os instrumentos de segunda geração leem de milhões a bilhões de fragmentos ao mesmo tempo. No *sequenciamento por síntese* os fragmentos, com adaptadores ligados às suas extremidades, são fixados numa célula de fluxo de vidro e amplificados no lugar em aglomerados de moléculas idênticas; os aglomerados são então estendidos uma base por ciclo com nucleotídeos fluorescentes reversivelmente bloqueados, fotografados, desbloqueados e estendidos de novo, de modo que cada ciclo acrescenta uma base à *leitura* de cada aglomerado. As leituras têm $100\text{ a }300\,\mathrm{bp}$, em geral vindas das duas pontas de um fragmento (*extremidades pareadas*), com taxa de erro de cerca de $10^{-3}$ por base, e uma corrida dá até $10^{12}$ bases. Os instrumentos de terceira geração, de *leituras longas*, leem moléculas isoladas sem amplificação: observando uma polimerase incorporar nucleotídeos fluorescentes em tempo real, ou passando o DNA por um *nanoporo* proteico e registrando a corrente iônica, que cada sequência de bases modula a seu modo. Leituras de $10\text{ a }100\,\mathrm{kb}$ e mais atravessam as repetições que as leituras curtas não vencem, a uma taxa bruta de erro maior que o consenso reduz.

![À esquerda: uma célula de fluxo, a lâmina de vidro sobre a qual bilhões de aglomerados de DNA são crescidos e lidos uma base por ciclo. À direita: um sequenciador de nanoporo do tamanho de um bolso, lendo moléculas isoladas como variações de uma corrente iônica.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/img-1248e19cab5b.jpg)

![À esquerda: uma célula de fluxo, a lâmina de vidro sobre a qual bilhões de aglomerados de DNA são crescidos e lidos uma base por ciclo. À direita: um sequenciador de nanoporo do tamanho de um bolso, lendo moléculas isoladas como variações de uma corrente iônica.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/img-7e84822a8975.jpg)

*À esquerda: uma célula de fluxo, a lâmina de vidro sobre a qual bilhões de aglomerados de DNA são crescidos e lidos uma base por ciclo. À direita: um sequenciador de [nanoporo](#def-b3-genomics-ngs) do tamanho de um bolso, lendo moléculas isoladas como variações de uma corrente iônica.*

**Teorema 4.3 (Cobertura e lacunas num projeto de sequenciamento aleatório).**

Sejam $N$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) de comprimento $L$ tomadas em posições aleatórias ao longo de um genoma de comprimento $G$, e seja $c = NL/G$ a *cobertura*, o número médio de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) que cobrem uma base. Então uma dada base é coberta por um número de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) que é Poisson de média $c$: a fração do genoma que fica sem sequenciar é

$$
P(\text{descoberto}) = e^{-c},
$$

e, se duas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) só são reconhecidas como sobrepostas quando compartilham ao menos $T$ bases, de modo que $\theta = T/L$, o número esperado de *contigs* (ilhas de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) sobrepostas) é

$$
\text{contigs} = N\,e^{-c(1-\theta)},
$$

e seu comprimento médio é $L\,\bigl(e^{c(1-\theta)} - 1\bigr)/c + L\theta$, aproximadamente.

**Demonstração.** Os pontos de início das [leituras](#def-b3-genomics-ngs) caem ao acaso com densidade $N/G$ por base. Uma base é coberta pelas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) que começam nas $L$ bases anteriores a ela; o número de inícios numa janela de comprimento $L$ é Poisson de média $LN/G
= c$, e a probabilidade de nenhum é $e^{-c}$. Uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) é a mais à direita de seu contig se nenhuma outra [leitura](#def-b3-genomics-ngs) começa nas $L - T = L(1-\theta)$ bases depois de seu próprio início (uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) que começasse mais tarde a sobreporia em menos de $T$ e não seria unida); essa probabilidade é $e^{-c(1-\theta)}$ e, como cada contig tem exatamente uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) mais à direita, o número esperado de contigs é $N e^{-c(1-\theta)}$. O comprimento médio do contig segue de $G$ dividido pelo número de contigs, corrigido pela fração não coberta. ∎

**Exemplo 4.4 (Quanto basta).**

Com $c = 5$ a fração não sequenciada é $e^{-5} = 0.7\,\%$ — para um genoma de $3.2\,\mathrm{Gb}$, vinte milhões de bases em algumas dezenas de milhares de lacunas. Com $c = 10$ ela é $4.5\times 10^{-5}$, $150\,\mathrm{kb}$ no total. Os genomas humanos são sequenciados de rotina a $c = 30$, não por causa das lacunas de cobertura ($e^{-30} \approx 10^{-13}$), mas porque cada base precisa ser lida várias vezes em cada um dos dois cromossomos para que uma variante heterozigota seja chamada com confiança contra uma taxa de erro de $10^{-3}$ por [leitura](#def-b3-genomics-ngs). Os genomas bacterianos são sequenciados a $c = 50$–$100$ pela mesma razão e porque é barato. A fórmula também mostra o que a cobertura não resolve: uma repetição mais longa que uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) é um lugar onde o grafo de sobreposições se ramifica, e nenhuma quantidade de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas a resolve. É para isso que servem as [leituras](#def-b3-genomics-ngs) longas.

![As duas quantidades de Lander–Waterman contra a cobertura: a fração do genoma que nunca é lida cai como e-c, e o número de contigs (aqui escalonado por leitura) tem um pico em cobertura baixa e depois cai à medida que as ilhas se fundem.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/fig-396ca1eeea35.svg)

*As duas quantidades de Lander–Waterman contra a cobertura: a fração do genoma que nunca é lida cai como $e^{-c}$, e o número de contigs (aqui escalonado por [leitura](#def-b3-genomics-ngs)) tem um pico em cobertura baixa e depois cai à medida que as ilhas se fundem.*

## 4.2 Das leituras a um genoma

**Definição 4.5 (Montagem e anotação).**

A *montagem* reconstrói um genoma a partir de suas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) por sobreposição: num *grafo de sobreposições* cada [leitura](#def-b3-genomics-ngs) é um nó unido às [leituras](#def-b3-genomics-ngs) que a sobrepõem; num *grafo de de Bruijn*, usado para bilhões de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas, cada $k$-mero (subsequência de comprimento $k$) é um nó e o genoma é um caminho por eles. Os dois são rompidos por repetições mais longas que a [leitura](#def-b3-genomics-ngs), que dão caminhos ramificados. Os contigs são ordenados e orientados em *scaffolds* por [leituras](#def-b3-genomics-ngs) de extremidades pareadas e por informação de longo alcance ([leituras](#def-b3-genomics-ngs) longas, mapas ópticos, mapas de contato cromossômico), e os scaffolds são colocados nos cromossomos. A qualidade de uma montagem é resumida pelo *N50*: o comprimento de contig tal que metade das bases montadas está em contigs pelo menos tão longos. A *anotação* então localiza os genes: nas bactérias, fases de [leitura](#def-b3-genomics-ngs) abertas mais longas do que o acaso daria; nos eucariontes, combinando sinais de sequência (sítios de splicing, promotores, viés de códons), homologia com proteínas conhecidas e transcritos sequenciados a partir do RNA. O resultado, para uma espécie, é um *genoma de referência* ao qual toda [leitura](#def-b3-genomics-ngs) posterior daquela espécie é alinhada, em vez de montada de novo.

**Método 4.6 (De uma amostra às variantes).**

Para um estudo de ressequenciamento de um indivíduo contra uma referência: (1) extraia o DNA, fragmente-o em $300\text{ a }500\,\mathrm{bp}$ e ligue adaptadores (a *biblioteca*); (2) sequencie até a cobertura necessária (30$\times$ para um genoma humano, 100$\times$ para um exoma, que captura os $1.5\,\%$ do genoma que codificam proteína); (3) alinhe cada [leitura](#def-b3-genomics-ngs) à referência, tolerando discordâncias; (4) em cada posição conte as bases nas [leituras](#def-b3-genomics-ngs): uma posição em que cerca de metade das [leituras](#def-b3-genomics-ngs) discorda da referência é uma *variante* heterozigota, aquela em que quase todas discordam é homozigota, e aquela em que poucas discordam é erro; (5) filtre por profundidade, qualidade de base e equilíbrio entre as fitas; (6) anote cada variante com seu efeito sobre qualquer gene (sinônima, de sentido trocado, sem sentido, de splicing, de mudança de fase) e com sua frequência em bancos populacionais; (7) para um diagnóstico, guarde as variantes raras previstas como danosas em genes compatíveis com o fenótipo, e confirme por [sequenciamento de Sanger](#def-b3-genomics-sanger).

## 4.3 Como são os genomas

**Proposição 4.7 (Tamanho do genoma e número de genes).**

Os tamanhos de genoma abrangem um fator de $10^{5}$ entre os eucariontes — $12\,\mathrm{Mb}$ na levedura, $100\,\mathrm{Mb}$ no verme, $140\,\mathrm{Mb}$ na mosca, $3.2\,\mathrm{Gb}$ num humano, $16\,\mathrm{Gb}$ numa cebola, $130\,\mathrm{Gb}$ num peixe pulmonado, $150\,\mathrm{Gb}$ no lírio *Paris japonica* —, ao passo que os números de genes mal abrangem um fator de $10$: $6000$ na levedura, $20\,000$ no verme, $14\,000$ na mosca, cerca de $20\,000$ genes codificadores de proteína num humano, $40\,000$ no arroz. Este é o *paradoxo do valor C*: o [tamanho do genoma](#prop-b3-genomics-sizes) não mede complexidade, e o número de genes tampouco. O que varia é o conteúdo não codificante — íntrons, elementos transponíveis, repetições satélites — e o número de proteínas que um genoma pode produzir é multiplicado muito além de sua contagem de genes pelo splicing alternativo ([Capítulo 2](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/2-rnas-nao-codificantes-e-regulacao-pos-transcricional#ch-b3-rna-regulation)) e pela regulação, que é onde a complexidade de um organismo está escrita, na maior parte. Os genomas bacterianos, em contraste, são compactos, e seu tamanho de fato acompanha o número de genes: cerca de um gene por quilobase, $88\,\%$ codificante em *E. coli*.

**Exemplo 4.8 (O genoma humano por conteúdo).**

Dos $3.2\,\mathrm{Gb}$: éxons codificadores de proteína, $1.5\,\%$; íntrons e regiões não traduzidas dos genes, cerca de $35\,\%$; elementos transponíveis e seus fósseis, cerca de $45\,\%$ — retrotranspósons LINE-1 $17\,\%$, elementos Alu $10\,\%$ (mais de um milhão de cópias de uma sequência de $300\,\mathrm{bp}$), retrovírus endógenos $8\,\%$; duplicações segmentares $5\,\%$; repetições simples e satélites, entre elas os centrômeros, cerca de $5\,\%$; o resto é sequência não codificante única, onde vivem os elementos regulatórios. Uns $100\text{ a }200$ genes ainda codificam uma maquinaria LINE-1 ativa, e inserções novas ocorrem cerca de uma vez a cada vinte nascimentos. Cerca de $8\,\%$ do genoma está sob seleção purificadora detectável — bem mais que os éxons — e a maior parte disso é regulatória.

![O genoma humano por conteúdo, em escala. Os éxons codificadores de proteína (vermelho) são uma lasca; quase metade do genoma descende de elementos transponíveis.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-genomics/fig-e57f385613eb.svg)

*O genoma humano por conteúdo, em escala. Os éxons codificadores de proteína (vermelho) são uma lasca; quase metade do genoma descende de elementos transponíveis.*

**Definição 4.9 (Genômica comparativa).**

Genes de duas espécies descendentes de um mesmo gene do ancestral comum são *ortólogos*; genes de uma mesma espécie descendentes de uma duplicação são *parálogos*. Blocos de cromossomo em que a ordem dos genes se conserva entre espécies são *sintênicos*; a sintenia permite localizar um gene num genoma a partir de sua posição em outro e revela os rearranjos que separam dois cariótipos (cerca de $1000$ entre humano e camundongo). As sequências conservadas entre espécies distantes que não codificam proteína alguma — os *elementos não codificantes conservados*, alguns ultraconservados base a base ao longo de $200\,\mathrm{bp}$ entre humano e peixe — são em sua maioria intensificadores de genes do desenvolvimento. As *duplicações do genoma inteiro* marcaram a história de várias linhagens: duas rodadas na origem dos vertebrados (os quatro agrupamentos Hox dos mamíferos contra o único dos invertebrados), uma no ancestral dos salmonídeos, uma na linhagem das leveduras, várias nas plantas com flor; os genes duplicados são em sua maioria perdidos ao longo de dezenas de milhões de anos, e os sobreviventes divergem em função.

**Exemplo 4.10 (Humano e chimpanzé).**

A sequência de cópia única alinhada difere entre humano e chimpanzé em $1.2\,\%$ das bases — uns $35$ milhões de substituições — e por inserções e deleções que juntas somam mais $3\,\%$ de cada genoma. Dois humanos diferem em cerca de uma base em mil, uns $4\text{ a }5$ milhões de sítios, além de alguns milhares de variantes estruturais; dois chimpanzés, cuja população foi maior por mais tempo, diferem em bem mais. Uma criança carrega cerca de $70$ mutações novas ausentes nos dois pais, quatro quintos delas vindas do pai, e o número sobe cerca de duas por ano de idade paterna — a aritmética do [Capítulo 3](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/3-estabilidade-do-genoma-dano-reparo-e-recombinacao-do-dna#ch-b3-dna-repair) aplicada às muitas divisões da espermatogênese.

## 4.4 Genomas e características

**Definição 4.11 (Associação genômica ampla).**

Um *polimorfismo de nucleotídeo único* (SNP) é uma posição em que duas bases ocorrem, cada uma em ao menos $1\,\%$ de uma população; cerca de dez milhões são comuns nos humanos. Um *estudo de associação genômica ampla* (GWAS) genotipa centenas de milhares de SNPs em milhares de pessoas com uma doença e em milhares sem ela, e pergunta, em cada SNP, se um alelo é mais frequente nos casos. Como se fazem um milhão de testes, um resultado só conta abaixo de um limiar de significância de cerca de $5\times 10^{-8}$ ($0.05$ dividido pelo milhão de testes efetivamente independentes). Os SNPs associados marcam uma região, e não uma variante causal, já que alelos vizinhos viajam juntos (desequilíbrio de ligação) ao longo de dezenas de quilobases. Para a maioria das doenças comuns, cada alelo associado desloca o risco em poucos por cento e a maior parte deles está em sequência regulatória; seu efeito combinado, somado ao longo de milhares de SNPs como um *escore poligênico*, explica uma fração da herdabilidade e prevê o risco mais ou menos tão bem quanto a história familiar.

**Observação 4.12 (O que a genômica entregou e o que não entregou).**

O sequenciamento foi decisivo onde um único gene tem grande efeito: vários milhares de doenças mendelianas já têm seu gene, e sequenciar o exoma de uma criança com um distúrbio sem diagnóstico dá um diagnóstico em cerca de um terço dos casos. Os genomas de tumores revelam quais condutores um tumor carrega e quais fármacos podem funcionar ([Capítulo 11](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/11-biologia-do-cancer#ch-b3-cancer-biology)); os genomas de patógenos rastreiam surtos linhagem por linhagem ([Capítulo 12](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/12-bacteriologia-crescimento-fisiologia-e-genetica#ch-b3-bacteriology)); os genomas antigos reescreveram a pré-história humana, mostrando que as pessoas de fora da África carregam cerca de $2\,\%$ de DNA neandertal. Para as doenças comuns — diabetes, doença cardíaca, esquizofrenia — a genômica entregou milhares de efeitos pequenos e poucos mecanismos, e a promessa de prever a partir do genoma de uma pessoa saudável continua modesta. O genoma é uma lista de peças; a biologia de como as peças interagem não se lê nele.

## 4.5 Exercícios

**Exercício 4.1 ★.**

Explique por que um [didesoxinucleotídeo](#def-b3-genomics-sanger) termina uma cadeia de DNA em crescimento, e por que uma reação de Sanger precisa conter as formas normal e didesoxi de cada nucleotídeo.

**Solução de Exercício 4.1.**

Um [didesoxinucleotídeo](#def-b3-genomics-sanger) não tem a hidroxila 3$'$, de modo que nenhuma ligação fosfodiéster pode ser feita com o nucleotídeo seguinte e a cadeia para. Só com formas didesoxi, toda cadeia pararia na primeira posição; só com formas normais, nenhuma pararia. A mistura torna a terminação um evento aleatório em cada posição, de modo que os produtos formam uma escada completa, um comprimento para cada base do molde.

**Exercício 4.2 ★.**

Uma corrida produz $4\times 10^{8}$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) pareadas de $2\times 150\,\mathrm{bp}$. Que cobertura isso dá de um genoma humano de $3.2\,\mathrm{Gb}$? E de um genoma bacteriano de $5\,\mathrm{Mb}$?

**Solução de Exercício 4.2.**

$4\times 10^{8}\times 300\,\mathrm{bp} = 1.2\times 10^{11}$ bases. Humano: $1.2\times 10^{11}/3.2\times 10^{9} \approx 38\times$. Bactéria: $1.2\times 10^{11}/5\times 10^{6} = 24\,000\times$.

**Exercício 4.3 ★.**

Defina contig, [scaffold](#def-b3-genomics-assembly) e [N50](#def-b3-genomics-assembly). Uma [montagem](#def-b3-genomics-assembly) de $100\,\mathrm{Mb}$ tem dez contigs de $8\,\mathrm{Mb}$ e $2000$ de $10\,\mathrm{kb}$. Qual é seu [N50](#def-b3-genomics-assembly)?

**Solução de Exercício 4.3.**

Um contig é uma sequência contígua montada a partir de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) sobrepostas; um [scaffold](#def-b3-genomics-assembly) é um conjunto ordenado e orientado de contigs com lacunas de tamanho estimado entre eles; o [N50](#def-b3-genomics-assembly) é o comprimento de contig em que os contigs ordenados alcançam metade das bases montadas. Aqui só os dez contigs de $8\,\mathrm{Mb}$ somam $80\,\mathrm{Mb}$, além do ponto médio de $50\,\mathrm{Mb}$ (o sétimo chega a $56\,\mathrm{Mb}$): [N50](#def-b3-genomics-assembly) $= 8\,\mathrm{Mb}$.

**Exercício 4.4 ★.**

Enuncie o paradoxo do valor C com dois exemplos, e diga o que responde principalmente pelo DNA em excesso dos genomas grandes.

**Solução de Exercício 4.4.**

O [tamanho do genoma](#prop-b3-genomics-sizes) não acompanha a complexidade do organismo: uma cebola tem cinco vezes o DNA de um humano, um peixe pulmonado quarenta vezes; a levedura e o verme diferem dez vezes em DNA com números de genes semelhantes. O excesso é não codificante: elementos transponíveis e seus restos, íntrons, repetições satélites.

**Exercício 4.5 ★★.**

Usando o [Teorema 4.3](#thm-b3-genomics-lander-waterman), determine a cobertura necessária para deixar no máximo uma base em um milhão sem sequenciar, e o número esperado de contigs de um genoma de $5\,\mathrm{Mb}$ lido a $c = 8$ com [leituras](#def-b3-genomics-ngs) de $150\,\mathrm{bp}$ e sobreposição mínima de $30\,\mathrm{bp}$.

**Solução de Exercício 4.5.**

$e^{-c} = 10^{-6}$ dá $c = 6\ln 10 = 13.8$. Para $c = 8$: $N =
cG/L = 8\times 5\times 10^{6}/150 \approx 267\,000$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs), $\theta
= 30/150 = 0.2$, contigs $= N e^{-6.4} = 267\,000\times 0.00166
\approx 440$.

**Exercício 4.6 ★★.**

Uma variante heterozigota é coberta por $30$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs). Supondo que cada [leitura](#def-b3-genomics-ngs) mostre um dos alelos com probabilidade $1/2$, qual é a probabilidade de menos de $8$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) mostrarem o alelo variante (de modo que ele pudesse ser tomado por erro)? Use uma aproximação normal com média $15$ e desvio padrão $\sqrt{7.5}$. Por que $30\times$ é o padrão?

**Solução de Exercício 4.6.**

$P(X < 8) = P(X \le 7) \approx P\bigl(Z < (7.5 - 15)/2.74\bigr) =
P(Z < -2.74) \approx 0.003$. A $30\times$ os dois alelos de um heterozigoto são quase sempre vistos muitas vezes, a cobertura é desigual (regiões ricas em GC recebem menos [leituras](#def-b3-genomics-ngs), de modo que alguns sítios ficam com metade da média) e restam [leituras](#def-b3-genomics-ngs) bastantes para separar um alelo verdadeiro dos erros de $10^{-3}$.

**Exercício 4.7 ★★.**

Um genoma tem uma repetição de $6\,\mathrm{kb}$ presente em $500$ cópias. Explique por que uma [montagem](#def-b3-genomics-assembly) a partir de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) de $150\,\mathrm{bp}$ a colapsa, como fica o grafo resultante e que comprimento de [leitura](#def-b3-genomics-ngs) a resolveria.

**Solução de Exercício 4.7.**

Toda [leitura](#def-b3-genomics-ngs) de $150\,\mathrm{bp}$ vinda de dentro da repetição é idêntica venha da cópia que vier, de modo que o montador constrói um único nó de $6\,\mathrm{kb}$ com $500$ caminhos entrando e $500$ saindo; ele não tem como dizer qual entrada casa com qual saída, e a [montagem](#def-b3-genomics-assembly) se parte em $500$ lacunas, com a repetição presente uma única vez e com cobertura $500$ vezes a média. [Leituras](#def-b3-genomics-ngs) mais longas que a repetição mais flancos únicos dos dois lados — $8\,\mathrm{kb}$ ou mais — atravessam cada cópia e a resolvem.

**Exercício 4.8 ★★.**

Dois humanos diferem em uma base em mil. Quantas diferenças há em seus exomas ($48\,\mathrm{Mb}$ de sequência codificadora)? Se dois terços das diferenças codificadoras são sinônimas ou benignas e o resto altera uma proteína, quantas variantes que alteram proteína uma pessoa carrega em relação a outra?

**Solução de Exercício 4.8.**

$4.8\times 10^{7}/1000 = 48\,000$ diferenças codificadoras; um terço, cerca de $16\,000$, altera a proteína.

**Exercício 4.9 ★★.**

Um GWAS testa $10^{6}$ SNPs com limiar $p < 5\times 10^{-8}$. Quantos falsos positivos se esperam se nenhum SNP estiver de fato associado? Um alelo de SNP eleva o risco de uma doença de frequência $2\,\%$ para $2.3\,\%$. Explique por que um efeito desses é indetectável num estudo de mil pessoas e inútil para um indivíduo, mas pode ainda assim apontar para um mecanismo.

**Solução de Exercício 4.9.**

Falsos positivos esperados $10^{6}\times 5\times 10^{-8} = 0.05$. Um risco relativo de $1.15$ sobre uma doença de $2\,\%$ muda alguns casos por mil; mil pessoas contêm cerca de vinte casos, longe demais do bastante para vê-lo (o poder cresce com o número de casos e com o quadrado do efeito). Para um indivíduo, $0.3$ ponto percentual não significa nada. Mas o alelo marca um gene cuja mudança modesta de atividade altera o risco da doença — o gene, e sua via, podem ser um alvo farmacológico cuja inibição completa tenha grande efeito.

**Exercício 4.10 ★★★.**

Os genomas bacterianos são cerca de $88\,\%$ codificantes; o genoma humano, $1.5\,\%$. Dê três hipóteses — de genética de populações, estrutural e regulatória — para a diferença e, para cada uma, uma observação genômica que a apoie ou a enfraqueça.

**Solução de Exercício 4.10.**

De genética de populações: nas bactérias, com populações enormes, a seleção remove até inserções levemente custosas; nos mamíferos, com populações efetivas pequenas, a deriva deixa acumular DNA não codificante levemente deletério — apoiada pela correlação inversa entre [tamanho do genoma](#prop-b3-genomics-sizes) e tamanho populacional ao longo das linhagens, enfraquecida pelas exceções. Estrutural: os genomas eucariontes são invadidos por transpósons que as bactérias, com um viés a favor da deleção e sem refúgio meiótico para elementos egoístas, expurgam — apoiada pela correlação do [tamanho do genoma](#prop-b3-genomics-sizes) com o conteúdo de transpósons. Regulatória: um desenvolvimento complexo precisa de mais DNA regulatório — apoiada pelos [elementos não codificantes conservados](#def-b3-genomics-comparative) em torno dos genes do desenvolvimento, enfraquecida pelo fato de que só $8\,\%$ do genoma humano mostra alguma seleção, de modo que a maior parte do DNA não codificante não é regulatória.

**Exercício 4.11 ★★★.**

Deduza a contagem de contigs de Lander–Waterman para [leituras](#def-b3-genomics-ngs) de dois comprimentos misturados: $N_{1}$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas de comprimento $L_{1}$ e $N_{2}$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) longas de comprimento $L_{2}$, com as sobreposições contadas com o mesmo mínimo $T$. (Trate cada [leitura](#def-b3-genomics-ngs) como a mais à direita de seu contig se nenhuma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) de qualquer dos tipos começa dentro de seu próprio comprimento menos $T$.) Mostre que algumas poucas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) longas reduzem a contagem de contigs mais do que o mesmo número de bases em [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas.

**Solução de Exercício 4.11.**

Os inícios dos dois tipos caem com densidade total $\rho = (N_{1} +
N_{2})/G$. Uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) de comprimento $L_{i}$ é a mais à direita de seu contig se nenhuma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) de qualquer dos tipos começa nas $L_{i} - T$ bases após ela: probabilidade $e^{-\rho(L_{i} - T)}$. Logo, contigs $= N_{1}
e^{-\rho(L_{1} - T)} + N_{2} e^{-\rho(L_{2} - T)}$. Uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) longa é a mais à direita com probabilidade exponencialmente menor que uma curta, e cada [leitura](#def-b3-genomics-ngs) longa também elimina a chance de uma lacuna ao longo de todo o seu comprimento; o mesmo número de bases em [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas acrescenta muitos pontos de início, mas cada janela protegida é curta, e por isso as [leituras](#def-b3-genomics-ngs) longas vencem.

**Exercício 4.12 ★★★.**

Argumenta-se que os quatro agrupamentos Hox dos mamíferos descendem de um só agrupamento por duas rodadas de [duplicação do genoma inteiro](#def-b3-genomics-comparative) na base dos vertebrados. Diga que padrão de [parálogos](#def-b3-genomics-comparative) pelo genoma, e que padrão nos genomas das lampreias e dos cordados invertebrados, essa hipótese prevê, e como se a distinguiria de duas duplicações independentes só do agrupamento.

**Solução de Exercício 4.12.**

Duas [duplicações do genoma inteiro](#def-b3-genomics-comparative) preveem que o padrão de quatro cópias seja genômico: quartetos de segmentos cromossômicos [parálogos](#def-b3-genomics-comparative) (paralogons) carregando as mesmas famílias gênicas na mesma ordem, com as duplicações datadas do mesmo momento para todas as famílias; um único agrupamento no anfioxo e em *Ciona*, que divergiram antes dos eventos; e nas lampreias, que divergiram por volta deles, um estado intermediário ou derivado de forma independente. Duplicações independentes só do agrupamento Hox preveem paralogons apenas para o Hox, vizinhos com histórias diferentes e datas de duplicação diferentes entre as famílias. Os paralogons genômicos e a datação compartilhada, como se observa, favorecem a [duplicação do genoma inteiro](#def-b3-genomics-comparative).

## 4.6 Problema: dois genomas numa máquina

**Problema 4.1.**

Problema de fim de semana — uma bactéria e um humano sequenciados na mesma corrida: as leituras repartidas, a cobertura e as lacunas calculadas, os contigs contados, as variantes heterozigotas chamadas contra a taxa de erro, o conteúdo do genoma humano pesado e um estudo de associação dimensionado, terminando na contagem de contigs em cobertura baixa, na cobertura que torna segura a chamada de uma variante e no número de mutações novas numa criança

Dados: uma corrida dá $6\times 10^{8}$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) de $150\,\mathrm{bp}$. Um genoma bacteriano tem $4.6\,\mathrm{Mb}$; o genoma humano, $3.2\,\mathrm{Gb}$ (haploide). Sobreposição mínima $T = 30\,\mathrm{bp}$. Taxa de erro $10^{-3}$ por base por [leitura](#def-b3-genomics-ngs). Sequência codificadora humana $48\,\mathrm{Mb}$; o genoma é $45\,\%$ derivado de transpósons, com $1.1$ milhão de cópias Alu de $300\,\mathrm{bp}$. Dois humanos diferem em um sítio em $1000$. Taxa de mutação $1.2\times 10^{-8}$ por base por geração.

**Parte I — A bactéria.**

1. A bactéria recebe $0.2\,\%$ da corrida. Quantas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) , e que cobertura?
2. Que fração de seu genoma fica sem sequenciar? Quantas bases são essas?
3. Calcule $\theta$ e o número esperado de contigs.
4. Um ensaio piloto anterior usou apenas $30\,000$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) . Cobertura, fração não coberta e número de contigs?
5. O genoma contém $7$ cópias de um óperon de rRNA de $5\,\mathrm{kb}$ . Explique o que acontece com elas na [montagem](#def-b3-genomics-assembly) e quantas pontas de contig só isso produz.
6. A bactéria tem cerca de um gene por quilobase. Quantos genes e, se $88\,\%$ do genoma é codificante, qual é o comprimento médio de um gene?

**Parte II — O humano.**

7. O resto da corrida vai para um genoma humano. Qual a cobertura do genoma diploide por cópia haploide (isto é, o total de bases dividido por $3.2\,\mathrm{Gb}$ )?
8. Num sítio heterozigoto cada um dos dois alelos é coberto por cerca de metade das [leituras](#def-b3-genomics-ngs) . Com a cobertura da questão 7, qual é o número esperado de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) que mostram cada alelo?
9. Um erro mostra uma base errada numa [leitura](#def-b3-genomics-ngs) com probabilidade $10^{-3}$ . Num sítio homozigoto coberto por $c$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) , qual é o número esperado de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) que mostram uma base errada qualquer em particular ( $10^{-3}/3$ cada)? Por que uma regra “chame uma variante se ao menos $3$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) e ao menos $20\,\%$ das [leituras](#def-b3-genomics-ngs) a mostrarem” rejeita os erros nessa cobertura?
10. Quantos sítios heterozigotos um humano carrega (metade das diferenças entre dois genomas aleatórios está em cada um, grosso modo: tome um sítio em $1500$ )? Quantos em sequência codificadora?
11. As [leituras](#def-b3-genomics-ngs) são alinhadas a uma referência. Explique por que as [leituras](#def-b3-genomics-ngs) vindas de elementos Alu muitas vezes se alinham à cópia errada e que consequência isso tem para a [chamada de variantes](#met-b3-genomics-pipeline) dentro deles.
12. Uma criança é sequenciada junto com os dois pais. Quantas mutações novas você espera? Quantas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) na criança, nessa cobertura, precisam mostrar uma variante ausente nos *dois* pais para que ela seja aceita, e por que a cobertura dos pais é tão importante quanto a da criança?
13. Um laboratório clínico captura o exoma ( $48\,\mathrm{Mb}$ ) e o sequencia a $100\times$ . Quantas [leituras](#def-b3-genomics-ngs) isso exige, e por que sai mais barato por paciente do que um genoma a $28\times$ , embora sua cobertura seja maior?

**Parte III — O conteúdo de um genoma.**

14. Que fração do genoma humano é Alu, e que fração das [leituras](#def-b3-genomics-ngs) da questão 7 vem de elementos Alu?
15. A referência tem $3.2\,\mathrm{Gb}$ , mas uma célula diploide contém $6.4\,\mathrm{Gb}$ ; e uma cebola de $16\,\mathrm{Gb}$ tem cerca de $60\,000$ genes. Qual é a fração codificante do genoma da cebola, se seus genes têm em média $1.5\,\mathrm{kb}$ de sequência codificadora?
16. Humano e chimpanzé diferem em $1.2\,\%$ das bases alinhadas. Quantas substituições são essas em $2.9\,\mathrm{Gb}$ de sequência alinhável? Repartidas igualmente entre as duas linhagens ao longo de $6.5$ milhões de anos, que taxa de mutação por base por ano isso implica, e por geração de $25$ anos? Compare com a medida direta dada nos dados.
17. Duas duplicações do genoma dos vertebrados deveriam dar até quatro cópias de cada gene ancestral. Os humanos têm cerca de $20\,000$ genes e o cordado invertebrado *Ciona* cerca de $16\,000$ . Que fração das duplicatas se perdeu, sob a hipótese de que o ancestral tinha $16\,000$ ?
18. Explique por que o número de genes é uma medida ruim de complexidade do organismo, usando a contagem de splicing alternativo do [Capítulo 2](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/2-rnas-nao-codificantes-e-regulacao-pos-transcricional#ch-b3-rna-regulation) como um argumento.
19. $8\,\%$ do genoma está sob seleção purificadora, mas apenas $1.5\,\%$ codifica proteína. O que provavelmente é o resto, e como você testaria um elemento candidato?

**Parte IV — Um estudo de associação.**

20. $10^{6}$ SNPs são testados. Enuncie o limiar de Bonferroni para um erro por família de $0.05$ , e o número esperado de falsos positivos a $p < 10^{-5}$ .
21. Uma doença tem prevalência de $1\,\%$ . Um alelo de risco de frequência $0.3$ eleva as chances em $5\,\%$ . Calcule o risco da doença para um portador de duas cópias, de uma cópia e de nenhuma, tomando o risco do não portador como $0.9\,\%$ . (Multiplique as chances.)
22. Duzentos alelos desses são encontrados. Explique o que é um [escore poligênico](#def-b3-genomics-gwas) e por que o escore de uma pessoa no $1\,\%$ mais alto pode corresponder a um risco várias vezes maior, embora cada alelo quase nada faça.
23. Explique por que um SNP que alcança significância em geral não é a variante causal, e que experimento identificaria a causal na região.
24. Um genoma antigo de um osso de $40\,000$ anos é sequenciado a $c = 0.5$ . Que fração dele é lida? Por que isso ainda pode responder a perguntas sobre história populacional que um genoma moderno sozinho não responde?
25. Resuma: o número de contigs da [montagem](#def-b3-genomics-assembly) piloto (questão 4), a cobertura por genoma haploide que dá cerca de $15$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) por alelo (questões 7–8) e o número de mutações novas numa criança (questão 12).

**Solução de Problema 4.1.**

**1.** $0.002\times 6\times 10^{8} = 1.2\times 10^{6}$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs); $c = 1.2\times 10^{6}\times 150/4.6\times 10^{6} \approx 39$. **2.** $e^{-39} \approx 10^{-17}$: na prática, nenhuma base fica descoberta. **3.** $\theta = 0.2$; contigs $= 1.2\times 10^{6} e^{-31} \approx
0$: um contig em teoria, com lacunas apenas nas repetições. **4.** $c = 30\,000\times 150/4.6\times 10^{6} = 0.98$; fração não coberta $e^{-0.98} = 0.38$, cerca de $1.7\,\mathrm{Mb}$; contigs $= 30\,000
\times e^{-0.78} \approx 13\,700$. **5.** Os sete óperons dão [leituras](#def-b3-genomics-ngs) idênticas e colapsam num único contig de $5\,\mathrm{kb}$, ao qual chegam sete flancos esquerdos únicos e do qual saem sete flancos direitos cujo pareamento é desconhecido: $14$ pontas de contig, sete lacunas. **6.** Cerca de $4600$ genes; sequência codificadora $0.88\times 4.6\times 10^{6}
= 4.0\times 10^{6}$ bp, gene médio de $880\,\mathrm{bp}$. **7.** $0.998\times 6\times 10^{8}\times 150/3.2\times 10^{9}
\approx 28\times$. **8.** Cerca de $14$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) por alelo. **9.** $28\times 10^{-3}/3 \approx 0.009$ [leitura](#def-b3-genomics-ngs) mostrando uma dada base errada — a chance de três ou mais é de cerca de $10^{-7}$ — e $20\,\%$ de $28$ são $5.6$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs); um erro não passa em nenhum dos dois testes, ao passo que um alelo heterozigoto verdadeiro é esperado em $14$. **10.** $3.2\times 10^{9}/1500 \approx 2.1\times 10^{6}$ sítios heterozigotos; em sequência codificadora, $4.8\times 10^{7}/1500 \approx
32\,000$. **11.** Uma [leitura](#def-b3-genomics-ngs) de $150\,\mathrm{bp}$ vinda de um Alu casa quase igualmente bem com muitas das $1.1$ milhão de cópias, e por isso é colocada na cópia errada ou recebe baixa confiança de mapeamento. As diferenças entre as cópias passam então a parecer variantes heterozigotas, e as variantes verdadeiras ficam escondidas entre elas: as [chamadas de variantes](#met-b3-genomics-pipeline) dentro de Alu costumam ser filtradas, e os elementos são pontos cegos do sequenciamento de [leituras](#def-b3-genomics-ngs) curtas. **12.** $1.2\times 10^{-8}\times 6.4\times 10^{9} \approx 77$ mutações novas. Cerca de $14$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) deveriam mostrar a variante na criança; mas, se o sítio de um dos pais é coberto por apenas cinco [leituras](#def-b3-genomics-ngs), um alelo heterozigoto passa despercebido com probabilidade $2^{-5} = 3\,\%$ e uma variante herdada é chamada de nova — por isso os pais precisam ser sequenciados tão profundamente quanto a criança. **13.** $4.8\times 10^{7}\times 100/150 = 3.2\times 10^{7}$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs), vinte vezes menos que o genoma: o custo de sequenciamento cai vinte vezes, mais do que o custo da etapa de captura. **14.** $1.1\times 10^{6}\times 300 = 3.3\times 10^{8}$ bp, cerca de $10\,\%$ do genoma; $10\,\%$ das [leituras](#def-b3-genomics-ngs), uns $6\times
10^{7}$. **15.** $60\,000\times 1500 = 9\times 10^{7}$ bp; $9\times
10^{7}/1.6\times 10^{10} = 0.56\,\%$. **16.** $0.012\times 2.9\times 10^{9} = 3.5\times 10^{7}$ substituições, $1.7\times 10^{7}$ por linhagem; taxa $1.7\times
10^{7}/(2.9\times 10^{9}\times 6.5\times 10^{6}) = 9\times 10^{-10}$ por base por ano, $2.3\times 10^{-8}$ por geração de 25 anos — cerca do dobro da taxa medida em genealogias, $1.2\times 10^{-8}$, uma discrepância conhecida que sugere gerações mais longas no passado ou uma separação mais antiga. **17.** Quatro cópias de $16\,000$ dariam $64\,000$; $20\,000$ permanecem, de modo que, das $48\,000$ cópias extras, só $4000$ sobrevivem: $92\,\%$ das duplicatas se perderam. **18.** O verme e o humano têm o mesmo número de genes; a complexidade está em como eles são usados — o splicing alternativo multiplica um gene em milhares de proteínas ($38\,016$ no *Dscam*), a regulação combina fatores de transcrição e intensificadores de maneiras específicas de cada tipo celular, os [RNAs não codificantes](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/2-rnas-nao-codificantes-e-regulacao-pos-transcricional#def-b3-rna-regulation-ncrna) acrescentam camadas, e as proteínas interagem em redes. **19.** Elementos regulatórios (intensificadores, promotores, isolantes), genes de [RNA não codificante](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/2-rnas-nao-codificantes-e-regulacao-pos-transcricional#def-b3-rna-regulation-ncrna), sinais de splicing e de localização, origens e sequências estruturais. Teste um candidato a intensificador colocando-o antes de um gene repórter num embrião transgênico e vendo onde o repórter é expresso, depois deletando o elemento no genoma com CRISPR e medindo os genes vizinhos. **20.** $0.05/10^{6} = 5\times 10^{-8}$; a $p < 10^{-5}$, $10^{6}
\times 10^{-5} = 10$ falsos positivos esperados. **21.** Chances do não portador $0.009/0.991 = 0.00908$; com uma cópia, chances $0.00954$, risco $0.945\,\%$; com duas cópias, chances $0.01001$, risco $0.99\,\%$. **22.** O escore soma, sobre os $200$ alelos, o número de cópias de risco que a pessoa carrega, ponderado pelo logaritmo da razão de chances de cada alelo. A contagem tem média $200\times 2\times 0.3 = 120$ e desvio padrão $\sqrt{200\times 2\times 0.3\times 0.7} \approx 9$; o $1\,\%$ mais alto carrega cerca de $21$ alelos acima da média, e $1.05^{21} \approx
2.8$: quase o triplo das chances de uma pessoa média, a partir de alelos que individualmente mudam o risco em $5\,\%$. **23.** Os alelos dentro de um bloco de dezenas de quilobases são herdados juntos (desequilíbrio de ligação), de modo que qualquer um deles mostra a mesma associação; o SNP genotipado é apenas o que estava no arranjo. Para achar a variante causal: sequencie a região em casos e controles, estreite o conjunto estatisticamente e depois teste cada candidata — ensaios com repórter para a atividade intensificadora de cada alelo, edição de cada alelo em células com medida da expressão dos genes vizinhos, colocalização com sinais de loco de característica quantitativa de expressão. **24.** $1 - e^{-0.5} = 39\,\%$ do genoma é lido. Ele dá uma amostra direta de uma população num momento conhecido do passado — frequências alélicas antes de migrações e mesclas posteriores, o comprimento dos segmentos neandertais (longos, porque poucas gerações de recombinação os haviam quebrado) e daí uma data para a mescla — coisas que os genomas modernos só conseguem inferir por modelos. **25.** Cerca de $13\,700$ contigs no piloto; $28\times$ por genoma haploide, cerca de $14$ [leituras](#def-b3-genomics-ngs) por alelo; umas $77$ mutações novas numa criança.