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title: "Tráfego de membranas e endereçamento de proteínas"
book: "Biologia universitária — 3.º ano"
subject: biology
language: pt
chapter: 8
exercises: 12
source: https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/8-trafego-de-membranas-e-enderecamento-de-proteinas
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# Capítulo 8 — Tráfego de membranas e endereçamento de proteínas

Uma célula do pâncreas produz uns dez milhões de moléculas de enzima digestiva por minuto, empacota-as em grânulos e as libera num ducto a um sinal vindo do intestino — sem jamais deixar solta uma molécula de tripsina no próprio citoplasma. Uma célula do fígado retira colesterol do sangue engolindo inteiras as partículas que o carregam, a uma taxa de milhares por minuto, e devolve cada receptor à superfície para a próxima. Uma proteína recém-feita destinada à mitocôndria, ao núcleo, ao [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis), à membrana ou ao mundo exterior chega a seu endereço entre uma dúzia de compartimentos com uma taxa de erro que envergonharia um serviço postal. Este capítulo trata do endereçamento: os sinais escritos nas proteínas, as máquinas que os leem, as vesículas que levam membrana e carga entre compartimentos, os [revestimentos](#def-b3-membrane-traffic-coats) que moldam as vesículas e as proteínas que as fazem fundir-se com o alvo certo, e o tráfego de mão dupla — secreção para fora, endocitose para dentro — que uma célula eucarionte mantém a cada segundo de sua vida.

## 8.1 Sinais e endereços

**Definição 8.1 (Sinais de endereçamento).**

Um *sinal de endereçamento* é um segmento de uma proteína, ou uma modificação dela, lido por um receptor que entrega a proteína a um compartimento. O *peptídeo-sinal*, um trecho de $15\text{ a }30$ resíduos na extremidade amino com um cerne hidrofóbico, manda a proteína para o retículo endoplasmático enquanto ela está sendo feita; dali a rota padrão leva pelo Golgi até a membrana plasmática ou o exterior, e sinais adicionais desviam para o [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) (um açúcar fosforilado) ou de volta ao retículo (a sequência carboxi-terminal KDEL). Um *sinal de localização nuclear*, um curto trecho básico como PKKKRKV, é ligado por importinas que levam a proteína enovelada pelo poro nuclear; uma *pré-sequência* mitocondrial, uma hélice anfipática de $20\text{ a }50$ resíduos, é reconhecida por receptores da membrana externa e enfiada, desenovelada, pelas translocases das duas membranas; as enzimas peroxissomais terminam em SKL. As proteínas sem nenhum desses sinais ficam no citosol. Todo sinal foi descoberto do mesmo modo: deletá-lo deixa a proteína no citosol, enxertá-lo numa proteína citosólica manda essa proteína ao compartimento.

**Evidência.** Blobel e Dobberstein (1975) traduziram o RNA mensageiro de uma cadeia leve de anticorpo num sistema livre de células. Sem membranas o produto era cerca de vinte resíduos mais longo que a proteína secretada; com fragmentos de retículo endoplasmático acrescentados *durante* a tradução, o produto tinha o tamanho da secretada e ficava protegido da protease acrescentada — estava dentro das vesículas —, ao passo que membranas acrescentadas depois da tradução não faziam nada. O segmento amino-terminal extra, o [peptídeo-sinal](#def-b3-membrane-traffic-signals), é necessário para entrar no retículo, é removido dentro dele e só funciona enquanto a cadeia está sendo feita: a *hipótese do sinal*, confirmada em cada detalhe quando o receptor (a partícula de reconhecimento do sinal, Walter e Blobel, 1981) e o canal (Sec61) foram purificados. ∎

![A hipótese do sinal. Um peptídeo-sinal no início da cadeia nascente é ligado pela partícula de reconhecimento do sinal, que pausa a tradução e acopla o ribossomo ao canal Sec61; a cadeia então atravessa a membrana à medida que é sintetizada, o sinal é cortado no lúmen e açúcares são acrescentados.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/fig-a28b63f22047.svg)

*A hipótese do sinal. Um [peptídeo-sinal](#def-b3-membrane-traffic-signals) no início da cadeia nascente é ligado pela partícula de reconhecimento do sinal, que pausa a tradução e acopla o ribossomo ao canal Sec61; a cadeia então atravessa a membrana à medida que é sintetizada, o sinal é cortado no lúmen e açúcares são acrescentados.*

**Proposição 8.2 (Proteínas de membrana e topologia).**

Um trecho hidrofóbico de cerca de vinte resíduos no meio de uma cadeia em translocação age como *[sequência de parada de transferência](#prop-b3-membrane-traffic-topology)*: o canal se abre lateralmente e a libera na bicamada como hélice transmembrana, com a parte já translocada no lúmen e o resto feito para dentro do citosol. Um segundo trecho desses reinicia a translocação, e uma proteína com $n$ sinais alternados termina com $n$ hélices que atravessam a membrana. A orientação fixada no retículo nunca muda: o que dá para o lúmen do retículo dá para o lúmen do Golgi e de cada vesícula depois dele, e para o *exterior* da célula depois da fusão com a membrana plasmática. Daí que os açúcares, acrescentados apenas no lúmen, estejam sempre na face extracelular de uma proteína de superfície, e que a topologia de um receptor possa ser lida a partir de onde estão seus sítios de glicosilação.

**Método 8.3 (Pulso–caça).**

Para acompanhar uma população de moléculas recém-feitas pela célula: (1) exponha as células brevemente (o *pulso*, alguns minutos) a um precursor radioativo ou marcado de outro modo — leucina tritiada para proteínas; (2) substitua-o por um excesso de precursor não marcado (a *caça*), de modo que nenhuma marcação nova seja incorporada; (3) fixe amostras de células em intervalos e localize a marcação por autorradiografia em micrografias eletrônicas, ou isolando os compartimentos e contando; (4) represente a fração de marcação em cada compartimento contra o tempo. A ordem em que os compartimentos enchem e esvaziam é a rota; os tempos dão o tempo de residência em cada um. O laboratório de Palade (anos 1960) aplicou o método à célula acinar pancreática e encontrou a marcação no retículo rugoso aos $3\,\mathrm{min}$, no Golgi aos $20\,\mathrm{min}$, em vacúolos de condensação e grânulos aos $40\,\mathrm{min}$, e no ducto depois de uma hora e de um sinal: a via secretora, disposta no tempo.

**Teorema 8.4 (Compartimentos em sequência e as curvas de pulso–caça).**

Seja um pulso de proteína marcada que deixa o compartimento $A$ rumo a $B$ com taxa de primeira ordem $k_{1}$ e deixa $B$ rumo a $C$ com taxa $k_{2}$, retendo-a $C$. Com toda a marcação em $A$ em $t = 0$,

$$
A(t) = e^{-k_{1}t},\qquad
B(t) = \frac{k_{1}}{k_{2} - k_{1}}\bigl(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t}\bigr),
\qquad
C(t) = 1 - A - B,
$$

e a marcação em $B$ tem um pico em $t^{*} = \ln(k_{2}/k_{1})/(k_{2} - k_{1})$. O tempo médio de residência em $A$ é $1/k_{1}$ e em $B$ é $1/k_{2}$, seja qual for a ordem das duas taxas.

**Demonstração.** $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = -k_{1}A$ dá a exponencial. Para $B$, $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k_{1}A - k_{2}B = k_{1}e^{-k_{1}t} - k_{2}B$; tente $B = \beta(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t})$: a derivada é $\beta(-k_{1}e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ e $-k_{2}B = \beta(-k_{2}
e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$, de modo que a equação exige $\beta(k_{2}
- k_{1})e^{-k_{1}t} = k_{1}e^{-k_{1}t}$, $\beta = k_{1}/(k_{2} -
k_{1})$, e $B(0) = 0$ como se pedia. Fazendo $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t =
0$: $k_{1}e^{-k_{1}t} = k_{2}e^{-k_{2}t}$, de onde vem $t^{*}$. O tempo médio que uma molécula passa num compartimento do qual sai à taxa $k$ é $\int_{0}^{
\infty} t\,k e^{-kt}\,\mathrm{d}t = 1/k$. ∎

**Exemplo 8.5 (A célula de Palade em números).**

Tome $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ (dez minutos no retículo) e $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ (vinte no Golgi). O Golgi tem seu pico em $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$, e contém então $B = 2(e^{-1.39} -
e^{-0.69}) = 2(0.25 - 0.50)\cdot(-1) = 0.50$: metade da marcação. Aos $40\,\mathrm{min}$, $A = 0.018$, $B = 2(0.018 - 0.135) \to 0.23$, $C = 0.75$: três quartos da proteína chegaram aos grânulos. As curvas observadas no laboratório de Palade têm essa forma, e ajustá-las foi como os tempos de residência foram medidos pela primeira vez.

![Curvas de pulso–caça do modelo de duas taxas com k_1 = 0.1\, min-1 e k_2 = 0.05\, min-1: a marcação deixa o retículo exponencialmente, passa pelo Golgi com um pico aos 14\, min e se acumula nos grânulos.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/fig-a9c09bc5e99b.svg)

*Curvas de pulso–caça do modelo de duas taxas com $k_{1} =
0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ e $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$: a marcação deixa o retículo exponencialmente, passa pelo Golgi com um pico aos $14\,\mathrm{min}$ e se acumula nos grânulos.*

## 8.2 O retículo endoplasmático: enovelamento, açúcares e qualidade

**Definição 8.6 (N-glicosilação e controle de qualidade).**

Quando a cadeia entra no lúmen, um oligossacarídeo pré-montado de catorze açúcares (duas N-acetilglicosaminas, nove manoses, três glicoses) é transferido de um carreador lipídico para asparaginas na sequência Asn-X-Ser/Thr — a *N-glicosilação*. As três glicoses são então aparadas uma a uma, e a aparagem é um relógio do [enovelamento](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/7-biologia-estrutural-das-proteinas#def-b3-structural-biology-levels): uma proteína que ainda carrega uma glicose é retida pela [chaperona](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/7-biologia-estrutural-das-proteinas#def-b3-structural-biology-chaperones) calnexina; uma proteína cuja última glicose foi removida mas que ainda não está enovelada é reglicosilada por uma enzima que reconhece trechos hidrofóbicos expostos, e volta à calnexina — o *ciclo da calnexina*. As proteínas que falham repetidamente são puxadas de volta ao citosol, ubiquitinadas e destruídas pelo proteassomo: a *degradação associada ao RE* (ERAD). Quando as proteínas mal enoveladas se acumulam mais depressa do que podem ser enoveladas ou destruídas, sensores da membrana do retículo disparam a *resposta a proteínas mal enoveladas*: a tradução é retardada, os genes de [chaperonas](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/7-biologia-estrutural-das-proteinas#def-b3-structural-biology-chaperones) são induzidos, o retículo é expandido e, se o estresse persistir, a célula é morta. A mutação mais comum da fibrose cística ($\Delta$F508 no CFTR) produz um canal que funcionaria, mas se enovela devagar demais, é capturado pela ERAD e nunca chega à superfície; fármacos que o ajudam a enovelar-se são hoje um tratamento.

![Uma célula acinar pancreática no microscópio eletrônico: retículo endoplasmático rugoso empilhado e cravejado de ribossomos preenche a base, o Golgi fica acima do núcleo, e grânulos secretores densos de enzima digestiva estão apinhados sob a superfície apical, à espera de um sinal.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/img-0eab95b6ccef.jpg)

*Uma célula acinar pancreática no microscópio eletrônico: retículo endoplasmático rugoso empilhado e cravejado de ribossomos preenche a base, o Golgi fica acima do núcleo, e grânulos secretores densos de enzima digestiva estão apinhados sob a superfície apical, à espera de um sinal.*

## 8.3 Vesículas: brotamento, endereçamento, fusão

**Definição 8.7 (Revestimentos e brotamento de vesículas).**

Uma vesícula de transporte é moldada por um *revestimento* de proteínas montado na face citosólica de uma membrana, que curva a membrana num broto de $60\text{ a }100\,\mathrm{nm}$, recolhe carga por meio de receptores que atravessam a membrana e é descartado depois que a vesícula se destaca. Três revestimentos servem às rotas principais: o *COPII* para as vesículas que deixam o retículo rumo ao Golgi, o *COPI* para o tráfego de volta do Golgi ao retículo e entre as cisternas do Golgi, e a *clatrina* — uma proteína de três pernas que polimeriza numa gaiola de hexágonos e pentágonos — para as vesículas que deixam o Golgi trans rumo aos [endossomos](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) e para a endocitose na membrana plasmática, onde proteínas adaptadoras ligam a gaiola aos receptores que estão sendo internalizados. Cada revestimento é recrutado por uma *GTPase pequena* (Sar1 para o COPII, Arf1 para o COPI e a clatrina) que se insere na membrana em sua forma ligada a GTP e, ao hidrolisar o GTP depois do brotamento, deixa o revestimento cair. Sinais de recuperação mantêm os compartimentos distintos: as proteínas do retículo que escapam carregando KDEL são ligadas no Golgi por um receptor e levadas de volta em vesículas COPI.

![À esquerda: uma gaiola de clatrina, a rede poliédrica de unidades de três pernas que molda uma vesícula endocítica (cortada para mostrar a membrana por dentro). À direita: uma pilha de Golgi no microscópio eletrônico, um monte de cisternas achatadas com vesículas brotando das bordas.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/img-a6c219ca4999.jpg)

![À esquerda: uma gaiola de clatrina, a rede poliédrica de unidades de três pernas que molda uma vesícula endocítica (cortada para mostrar a membrana por dentro). À direita: uma pilha de Golgi no microscópio eletrônico, um monte de cisternas achatadas com vesículas brotando das bordas.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/img-6c4faf2a89dc.jpg)

*À esquerda: uma gaiola de [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats), a rede poliédrica de unidades de três pernas que molda uma vesícula endocítica (cortada para mostrar a membrana por dentro). À direita: uma pilha de Golgi no microscópio eletrônico, um monte de cisternas achatadas com vesículas brotando das bordas.*

**Definição 8.8 (Endereçamento e fusão).**

Uma vesícula encontra seu alvo por duas camadas de reconhecimento. As *GTPases Rab* — umas sessenta numa célula humana, cada uma nas membranas de um compartimento — recrutam longas proteínas de amarra que capturam uma vesícula que chegue carregando a Rab correspondente. Depois agem as *SNAREs*: uma v-SNARE na vesícula e t-SNAREs no alvo, proteínas helicoidais ancoradas em suas membranas, enrolam-se uma na outra das extremidades distais em direção às membranas, e a energia do feixe de quatro hélices que formam puxa as duas bicamadas até que se fundam. Cada pareamento de SNAREs é específico, uma segunda conferência do endereço. Depois da fusão o feixe é desmontado pela ATPase NSF para reúso. A fusão pode ser feita esperar por um sinal: no terminal nervoso as SNAREs são mantidas meio fechadas pela complexina até que a *sinaptotagmina*, ligando o cálcio que entra quando chega um potencial de ação, complete o fechamento em menos de um milissegundo — a liberação de neurotransmissor tratada no volume do 2.º ano. As neurotoxinas do tétano e do botulismo são proteases que clivam SNAREs.

**Evidência.** Novick e Schekman (1980) isolaram mutantes de levedura sensíveis à temperatura que paravam de secretar a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ e acumulavam proteína no compartimento em que seu defeito bloqueava — retículo, Golgi ou vesículas amontoadas sob a superfície; os $23$ genes *sec* definiram as etapas e, uma vez clonados, revelaram-se codificadores dos [revestimentos](#def-b3-membrane-traffic-coats), das GTPases e das [SNAREs](#def-b3-membrane-traffic-fusion). Rothman reconstituiu o transporte entre cisternas do Golgi num tubo de ensaio com membranas purificadas, citosol e ATP, e a partir dele purificou a NSF e as [SNAREs](#def-b3-membrane-traffic-fusion); as duas abordagens convergiram para as mesmas proteínas, e as máquinas de levedura e de mamífero mostraram-se as mesmas. ∎

![A fusão em três etapas. Uma Rab na vesícula e uma amarra no alvo trazem as duas membranas ao alcance uma da outra; as SNAREs da vesícula e do alvo (vermelho e verde) se fecham num feixe de quatro hélices que arrasta as bicamadas uma contra a outra; elas se fundem e a carga entra no compartimento-alvo.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/fig-e76429212e08.svg)

*A fusão em três etapas. Uma Rab na vesícula e uma amarra no alvo trazem as duas membranas ao alcance uma da outra; as [SNAREs](#def-b3-membrane-traffic-fusion) da vesícula e do alvo (vermelho e verde) se fecham num feixe de quatro hélices que arrasta as bicamadas uma contra a outra; elas se fundem e a carga entra no compartimento-alvo.*

**Proposição 8.9 (O Golgi).**

O Golgi é uma pilha de quatro a oito cisternas achatadas, com a face cis voltada para o retículo e a face trans voltada para a membrana plasmática, cada cisterna abrigando um conjunto diferente de enzimas que aparam e reconstroem os açúcares das glicoproteínas que passam e acrescentam açúcares O-ligados, sulfato e fosfato. A carga avança sobretudo por *[maturação das cisternas](#prop-b3-membrane-traffic-golgi)*: uma cisterna nova se forma na face cis a partir das vesículas que chegam, atravessa a pilha como fizeram as anteriores, e amadurece à medida que vesículas [COPI](#def-b3-membrane-traffic-coats) levam as enzimas de cada cisterna para trás, à mais jovem que vem atrás; na face trans ela se desfaz em vesículas rumo a seus destinos. É ali que o endereçamento é decidido: as hidrolases lisossomais, marcadas no Golgi cis com *manose-6-fosfato*, são ligadas por seu receptor e empacotadas em vesículas de [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats) rumo ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis); as proteínas de secreção regulada se agregam no pH levemente ácido em grânulos de condensação; todo o resto sai na corrente constitutiva rumo à superfície. Na doença das células I a enzima que fosforila está ausente, as hidrolases são secretadas em vez de entregues, e os [lisossomos](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) se enchem de material não digerido.

![O mapa do tráfego de membranas. Para fora (verde): do retículo ao Golgi em vesículas COPII, do Golgi à superfície, seja de modo constitutivo, seja por grânulos que esperam um sinal. Para trás (vermelho): vesículas COPI devolvem proteínas do retículo que escaparam. Para baixo (laranja): as enzimas lisossomais marcadas com manose-6-fosfato vão ao endossomo e ao lisossomo. Para dentro (azul): endocitose a partir da superfície, com a maioria dos receptores reciclada.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/fig-28995fa019f3.svg)

*O mapa do tráfego de membranas. Para fora (verde): do retículo ao Golgi em vesículas [COPII](#def-b3-membrane-traffic-coats), do Golgi à superfície, seja de modo constitutivo, seja por grânulos que esperam um sinal. Para trás (vermelho): vesículas [COPI](#def-b3-membrane-traffic-coats) devolvem proteínas do retículo que escaparam. Para baixo (laranja): as enzimas lisossomais marcadas com manose-6-fosfato vão ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) e ao [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis). Para dentro (azul): endocitose a partir da superfície, com a maioria dos receptores reciclada.*

## 8.4 A endocitose e o lisossomo

**Definição 8.10 (Endocitose).**

A *endocitose mediada por receptor* concentra um ligante preso a receptores de superfície em fossetas revestidas de [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats), que se destacam (a GTPase dinamina estrangula o colo) como vesículas de cerca de $100\,\mathrm{nm}$ — mil por minuto num fibroblasto, renovando toda a membrana de superfície em uma hora. As vesículas se fundem em *endossomos iniciais*, cujo lúmen é acidificado até pH 6 por uma bomba de prótons; a maioria dos ligantes solta ali seus receptores, os receptores voltam à superfície em vesículas de reciclagem, e o ligante segue viagem à medida que o endossomo amadurece em endossomo tardio (pH 5.5) e se funde com um *lisossomo*: um compartimento a pH 4.5–5 que contém umas sessenta hidrolases — proteases, nucleases, lipases, glicosidases —, ativas só naquele pH, de modo que um vazamento para o citosol neutro faz pouco estrago. O lisossomo também digere o material da própria célula entregue pela *autofagia*: uma membrana dupla cresce em torno de uma porção de citoplasma ou de uma organela gasta, fecha-se num autofagossomo e se funde com o lisossomo; os produtos são devolvidos ao citosol. A autofagia é induzida pela inanição (ela recicla a própria substância da célula como energia) e limpa agregados e mitocôndrias danificadas; sua falha é implicada na neurodegeneração.

**Evidência.** Brown e Goldstein (anos 1970) acompanharam a lipoproteína de baixa densidade (LDL), a partícula que carrega colesterol no sangue, para dentro de fibroblastos em cultura. A LDL se ligava de modo saturável a uns $20\,000$ sítios de superfície por célula, era internalizada em minutos em fossetas revestidas, e seu colesterol era liberado nos [lisossomos](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) e desligava a síntese de colesterol da própria célula. Fibroblastos de pacientes com hipercolesterolemia familiar não ligavam LDL (receptor ausente) ou a ligavam, mas não a internalizavam (uma mutação na cauda citosólica do receptor que impede sua captura pelos adaptadores de [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats)): a doença era um defeito de endocitose, a cauda do receptor continha o sinal de internalização, e o receptor reciclado — cada um fazendo centenas de viagens de ida e volta — ficou estabelecido como o mecanismo geral de captação. ∎

**Proposição 8.11 (Captação por receptores reciclados).**

Seja uma célula com $R$ receptores ao todo, dos quais $S$ estão na superfície e $R - S$ dentro, a caminho de volta. Um receptor de superfície está ocupado com probabilidade $\theta = [L]/(K_{d} + [L])$, um receptor ocupado é internalizado à taxa $k_{i}$, e um receptor internalizado retorna à taxa $k_{r}$. No estado estacionário o fluxo de ligante para dentro da célula é

$$
J = \frac{R\,k_{i}k_{r}\,\theta}{k_{r} + k_{i}\theta},
$$

que satura, à medida que a concentração de ligante sobe, em $J_{\max} =
R\,k_{i}k_{r}/(k_{i} + k_{r})$: a captação de uma célula é limitada não só por seus receptores, mas pela rapidez com que ela consegue trazê-los de volta.

**Demonstração.** Os receptores de superfície são perdidos à taxa $k_{i}\theta S$ e recuperados à taxa $k_{r}(R - S)$; no estado estacionário essas taxas se equilibram, de modo que $S = R\,k_{r}/(k_{r}
+ k_{i}\theta)$. Cada internalização carrega um ligante, logo $J =
k_{i}\theta S$, o que dá a fórmula. Quando $\theta \to 1$ o fluxo tende a $R\,k_{i}k_{r}/(k_{r} + k_{i})$ — os receptores ciclam tão depressa quanto as duas taxas permitem, com uma fração $k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ deles na superfície a cada momento. ∎

**Exemplo 8.12 (Colesterol partícula a partícula).**

Um fibroblasto com $R = 20\,000$ receptores de LDL, tempo de internalização de $5\,\mathrm{min}$ ($k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$) e tempo de retorno de $10\,\mathrm{min}$ ($k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$) capta, com LDL saturante, $J_{\max} = 20\,000\times 0.2\times 0.1/0.3 \approx 1300$ partículas por minuto, com um terço de seus receptores na superfície a cada momento; cada partícula traz umas $1500$ moléculas de colesterol, dois milhões por minuto, o bastante para construir cerca de um décimo de micrômetro quadrado de membrana. Um heterozigoto para hipercolesterolemia familiar, com metade dos receptores, capta metade; o colesterol do sangue dobra, e a doença cardíaca chega vinte anos mais cedo. As estatinas elevam $R$ privando a célula do fígado de seu próprio colesterol.

![Captação de LDL por receptores reciclados, pela fórmula da proposição com k_i = 0.2\, min-1 e k_r = 0.1\, min-1: saturando com o ligante, e reduzida à metade quando metade dos receptores falta.](https://one-course.com/images/onecourse/chapters/biology-5/b3-membrane-traffic/fig-d9e7d2b31780.svg)

*Captação de LDL por receptores reciclados, pela fórmula da proposição com $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ e $k_{r} =
0.1\,\mathrm{min}^{-1}$: saturando com o ligante, e reduzida à metade quando metade dos receptores falta.*

**Observação 8.13 (Uma membrana, muitos compartimentos).**

Toda membrana do sistema secretor e endocítico é, topologicamente, uma só membrana: o lúmen do retículo é contínuo, por meio de vesículas, com o exterior da célula, e um lipídio ou uma proteína feitos no retículo podem chegar à superfície sem jamais atravessar uma bicamada. O que mantém os compartimentos distintos não são paredes, mas tráfego — empacotamento seletivo para fora, recuperação seletiva de volta e um par específico de moléculas de reconhecimento em cada fusão. Os compartimentos são estados estacionários de fluxos, como os poços de um rio, e uma célula que para de traficar perde sua geografia em poucas horas.

## 8.5 Exercícios

**Exercício 8.1 ★.**

Dê o sinal e o destino de cada um: um trecho de vinte resíduos hidrofóbicos na extremidade amino; PKKKRKV; uma hélice anfipática amino-terminal; KDEL na extremidade carboxi; uma manose-6-fosfato nos açúcares.

**Solução de Exercício 8.1.**

Trecho hidrofóbico amino-terminal: [peptídeo-sinal](#def-b3-membrane-traffic-signals), rumo ao retículo endoplasmático (e, por padrão, adiante até a superfície). PKKKRKV: [sinal de localização nuclear](#def-b3-membrane-traffic-signals), rumo ao núcleo pelo poro. Hélice anfipática amino-terminal: [pré-sequência](#def-b3-membrane-traffic-signals) mitocondrial, rumo à matriz mitocondrial. KDEL: recuperação do Golgi de volta ao retículo. Manose-6-fosfato: do Golgi trans rumo ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) e ao [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis).

**Exercício 8.2 ★.**

Descreva as três observações-chave do experimento de Blobel–Dobberstein e o que cada uma mostrou.

**Solução de Exercício 8.2.**

(1) Sem membranas, a cadeia traduzida era cerca de vinte resíduos mais longa que a proteína secretada: um segmento é removido durante a secreção. (2) Com membranas presentes durante a tradução, o produto tinha o tamanho maduro e ficava protegido da protease: ele entrara nas vesículas e perdera o segmento dentro delas. (3) Membranas acrescentadas depois da tradução não faziam nem uma coisa nem outra: a entrada é acoplada à síntese — é cotraducional — e o segmento, o [peptídeo-sinal](#def-b3-membrane-traffic-signals), só funciona numa cadeia nascente.

**Exercício 8.3 ★.**

Nomeie o [revestimento](#def-b3-membrane-traffic-coats) e o sentido do transporte para: do retículo ao Golgi; do Golgi ao retículo; do Golgi trans ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis); da membrana plasmática ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis).

**Solução de Exercício 8.3.**

Do retículo ao Golgi: [COPII](#def-b3-membrane-traffic-coats), para a frente. Do Golgi ao retículo: [COPI](#def-b3-membrane-traffic-coats), retrógrado. Do Golgi trans ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis): [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats) com seus adaptadores, para a frente rumo ao [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis). Da membrana plasmática ao [endossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis): [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats), para dentro (endocitose).

**Exercício 8.4 ★.**

Por que os açúcares de uma proteína da membrana plasmática estão sempre do lado de fora da célula?

**Solução de Exercício 8.4.**

Os açúcares só são acrescentados dentro do lúmen do retículo e do Golgi. A face lumenal de cada vesícula continua lumenal ao longo do brotamento e da fusão, e, quando uma vesícula se funde com a membrana plasmática, sua face lumenal se torna o exterior da célula; a orientação nunca se inverte, de modo que o que foi glicosilado por dentro acaba por fora.

**Exercício 8.5 ★★.**

No modelo do [Teorema 8.4](#thm-b3-membrane-traffic-pulse-chase) com $k_{1}
= 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ e $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$, determine quando a marcação do Golgi tem seu pico e quanto há ali no pico; depois, a fração nos grânulos aos $60\,\mathrm{min}$.

**Solução de Exercício 8.5.**

$t^{*} = \ln(0.05/0.2)/(0.05 - 0.2) = \ln 4/0.15 = 9.2\,\mathrm{min}$; $B(t^{*}) = (0.2/(-0.15))(e^{-1.85} - e^{-0.46}) = 0.63$. Aos $60\,\mathrm{min}$, $A \approx 0$, $B = 1.33\,(e^{-3} - e^{-12}) = 0.066$, logo $C = 0.93$.

**Exercício 8.6 ★★.**

Uma proteína de membrana tem trechos hidrofóbicos de $22$ resíduos nas posições 30, 90, 150 e 210 e um [peptídeo-sinal](#def-b3-membrane-traffic-signals) amino-terminal. Desenhe ou descreva sua topologia: quantas hélices, e para que lado dá cada segmento entre elas. Onde ela pode ser glicosilada?

**Solução de Exercício 8.6.**

O [peptídeo-sinal](#def-b3-membrane-traffic-signals) põe a extremidade amino no lúmen; cada trecho hidrofóbico é alternadamente uma sequência de parada ou de início de transferência, de modo que há quatro hélices transmembrana (cerca dos resíduos 30–52, 90–112, 150–172, 210–232). Segmentos: extremidade amino lumenal; 52–90 citosólico; 112–150 lumenal; 172–210 citosólico; extremidade carboxi lumenal. Glicosilação só nos segmentos lumenais — a extremidade amino, 112–150 e a extremidade carboxi —, que se tornam extracelulares na superfície.

**Exercício 8.7 ★★.**

Usando a [Proposição 8.11](#prop-b3-membrane-traffic-uptake) com $R = 30\,000$, $k_{i} = 0.25\,\mathrm{min}^{-1}$, $k_{r} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$, calcule $J_{\max}$ e a fração de receptores na superfície na saturação. Que mudança única dobraria a captação?

**Solução de Exercício 8.7.**

$J_{\max} = 30\,000\times 0.25\times 0.05/0.30 = 1250$ por minuto; fração na superfície $k_{r}/(k_{i} + k_{r}) = 0.05/0.30 = 0.17$. Dobrar $R$ dobra $J$ exatamente; a taxa de retorno é o gargalo (a maioria dos receptores está dentro), e dobrar $k_{r}$ daria $30\,000\times 0.25
\times 0.1/0.35 \approx 2140$, um fator $1.7$.

**Exercício 8.8 ★★.**

Preveja o destino das hidrolases lisossomais, e o fenótipo, em (a) uma célula sem o receptor de manose-6-fosfato, (b) uma célula sem a fosfotransferase que acrescenta a marca, (c) uma célula tratada com um fármaco que neutraliza o pH endossomal.

**Solução de Exercício 8.8.**

(a) Sem receptor: as hidrolases marcadas seguem a rota padrão e são secretadas; os [lisossomos](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) ficam sem enzimas e se enchem de material não digerido — uma doença de depósito. (b) Sem fosfotransferase: o mesmo fenótipo por outra lesão (doença das células I), com as enzimas sem marca e secretadas. (c) [Endossomos](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) neutralizados: o receptor não consegue soltar sua carga, e por isso não é reciclado e as hidrolases são mal entregues ou secretadas; a LDL e outros receptores também param de ciclar.

**Exercício 8.9 ★★.**

A mutação JD no receptor de LDL troca uma tirosina da cauda citosólica. Células que ligam LDL normalmente não conseguem captá-la. Explique o mecanismo e preveja onde os receptores são encontrados na superfície celular em relação às fossetas revestidas.

**Solução de Exercício 8.9.**

A tirosina pertence ao [motivo](https://one-course.com/books/biology/5/pt/chapter/5-bioinformatica-e-analise-de-sequencias#def-b3-bioinformatics-motif) da cauda que o adaptador de [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats) reconhece; sem ela o receptor não é recolhido para as fossetas revestidas. Os receptores ligam a LDL normalmente, mas ficam espalhados de modo uniforme pela superfície, excluídos das fossetas, e o ligante permanece do lado de fora — uma doença de endereçamento, e não de ligação.

**Exercício 8.10 ★★★.**

Resolva o modelo de pulso–caça para o caso $k_{1} = k_{2} = k$ (a fórmula do teorema é singular aí): mostre que $B(t) = kt\,e^{-kt}$ e determine o pico. Depois explique por que medir apenas a fração granular $C(t)$ não permite determinar as duas taxas separadamente.

**Solução de Exercício 8.10.**

Com $k_{1} = k_{2} = k$, tente $B = kt\,e^{-kt}$: $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t
= k e^{-kt} - k^{2}t e^{-kt} = kA - kB$, como se pedia, com $B(0) = 0$. O pico está onde $1 - kt = 0$: $t^{*} = 1/k$, $B = e^{-1} = 0.37$. Em geral, $C(t) = 1 - (k_{2}e^{-k_{1}t} - k_{1}e^{-k_{2}t})/(k_{2} - k_{1})$, que é simétrica na troca de $k_{1}$ por $k_{2}$: a curva dos grânulos sozinha não pode dizer qual dos dois compartimentos é o rápido.

**Exercício 8.11 ★★★.**

Um fibroblasto internaliza $1000$ vesículas de [clatrina](#def-b3-membrane-traffic-coats) de $100\,\mathrm{nm}$ de diâmetro por minuto e tem uma superfície de $3000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$. Quanto tempo leva para internalizar o equivalente a toda a superfície? Por que a célula não encolhe, e o que esse equilíbrio implica sobre a taxa de exocitose e sobre o volume de líquido captado por hora?

**Solução de Exercício 8.11.**

Cada vesícula tem área $4\pi(50\,\text{nm})^{2} = 0.031\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$; mil por minuto dão $31\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{min}$, e portanto toda a superfície em $3000/31 \approx 95\,\mathrm{min}$. A célula não encolhe porque a membrana volta por exocitose (vesículas de reciclagem) à mesma taxa — um equilíbrio de fluxos. Cada vesícula contém $5\times 10^{-19}$ L; mil por minuto durante uma hora dão $3\times 10^{-14}$ L, cerca de $1.5\,\%$ do volume de uma célula de $2\,\mathrm{pL}$ por hora.

**Exercício 8.12 ★★★.**

A toxina botulínica cliva uma [SNARE](#def-b3-membrane-traffic-fusion) nos terminais nervosos motores; a toxina tetânica cliva a mesma [SNARE](#def-b3-membrane-traffic-fusion) em interneurônios inibitórios da medula espinhal. Explique por que a primeira causa paralisia flácida e a segunda, paralisia espástica, e por que uma toxina que bloqueia a fusão é útil na medicina em doses mínimas.

**Solução de Exercício 8.12.**

A toxina botulínica age no terminal motor: nenhuma acetilcolina é liberada, o músculo não recebe comando e fica frouxo — paralisia flácida. A toxina tetânica é levada pelo axônio motor acima e passa aos interneurônios inibitórios que normalmente contêm os neurônios motores; com a [SNARE](#def-b3-membrane-traffic-fusion) deles clivada, nenhuma glicina ou GABA é liberada, os neurônios motores disparam sem oposição e todo músculo se contrai — paralisia espástica. Alguns nanogramas de toxina botulínica injetados num músculo hiperativo o silenciam localmente por meses (até que nova [SNARE](#def-b3-membrane-traffic-fusion) seja feita e o terminal se recupere): um tratamento para distonias, espasticidade, estrabismo e rugas.

## 8.6 Problema: o dia de uma célula pancreática

**Problema 8.1.**

Problema de fim de semana — a produção de uma célula secretora contada em moléculas, vesículas e micrômetros quadrados, suas curvas de pulso–caça resolvidas, a captação de colesterol de uma célula do fígado calculada por receptores reciclados e um lisossomo acidificado próton a próton, terminando no instante do pico do Golgi, nas vesículas que brotam por minuto e nas partículas de LDL captadas por hora

Dados: uma célula acinar produz $10^{7}$ moléculas de enzima por minuto, cada uma de $25\,\mathrm{kDa}$ e $4\,\mathrm{nm}$ de diâmetro. As vesículas de transporte são esferas de $70\,\mathrm{nm}$ de diâmetro; um grânulo é uma esfera de $1\,\text{µ}\mathrm{m}$. Área de membrana por molécula de lipídio $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$, duas monocamadas. O retículo da célula tem área de $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$. Pulso–caça: $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$, $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$. Uma célula do fígado: $R = 50\,000$ receptores de LDL, $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$, $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$, $K_{d} = 2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$, concentração plasmática de partículas de LDL $2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$; $1500$ moléculas de colesterol por partícula. Um [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis): esfera de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$, pH de $7.2$ a $4.7$, capacidade de tamponamento tal que $50$ prótons precisam ser bombeados para cada um que fica livre; uma bomba de prótons move $200$ prótons por segundo.

**Parte I — Produção.**

1. Que massa de enzima a célula produz por minuto, e por dia? Compare com o conteúdo proteico da própria célula, de cerca de $300\,\mathrm{pg}$ .
2. Quantas moléculas de enzima cabem numa vesícula se elas preenchem $30\,\%$ de seu volume (esfera de $4\,\mathrm{nm}$ )? Quantas vesículas por minuto deixam o retículo?
3. Que área de membrana essas vesículas carregam por minuto, e em quanto tempo elas consumiriam todo o retículo se nada voltasse?
4. Quantas moléculas de lipídio são essas por minuto? O que a célula precisa fazer para manter seu retículo?
5. Quantas moléculas de enzima cabem num grânulo com o mesmo empacotamento, e quantos grânulos a célula enche por hora?
6. Uma refeição esvazia $300$ grânulos em dez minutos por fusão com a membrana apical, acrescentando a membrana deles a uma superfície de $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Por qual fator a superfície apical cresce, e o que precisa vir em seguida?

**Parte II — Tempos.**

7. Com as taxas dadas, quando a marcação do Golgi tem seu pico, e que fração está ali?
8. Que fração de um pulso está no retículo, no Golgi e nos grânulos aos $30\,\mathrm{min}$ ?
9. Tempos médios de residência nos dois compartimentos? Qual é o tempo total médio da síntese até o grânulo?
10. Um fármaco retarda a saída do Golgi para $k_{2} = 0.01\,\mathrm{min}^{-1}$ . Novo instante do pico e nova fração no pico; como fica o Golgi ao microscópio?
11. Explique por que a fração do Golgi no pico é $k_{1}/k_{2}$ elevado a uma potência (dê a potência) e, portanto, sempre menor que $1$ .
12. Se a etapa do retículo fosse muito mais rápida que a do Golgi, de que $B(t)$ se aproximaria? Interprete.

**Parte III — Colesterol.**

13. Calcule $\theta$ na concentração plasmática de LDL, e a captação $J$ em partículas por minuto e por hora.
14. Quantas moléculas de colesterol por hora? As membranas da célula contêm $5\times 10^{9}$ moléculas de colesterol; quanto tempo para substituí-las todas apenas a partir da LDL?
15. Calcule a fração de receptores na superfície e o número de viagens de ida e volta que cada receptor faz em suas $20\,\mathrm{h}$ de vida.
16. Um heterozigoto tem $R = 25\,000$ : recalcule $J$ . A LDL plasmática sobe até que a captação iguale a produção: por qual fator, se $\theta$ está bem abaixo da saturação?
17. Uma estatina dobra $R$ nas células do fígado do heterozigoto. O que acontece com a LDL plasmática, pelo mesmo raciocínio?
18. Explique por que o homozigoto sem receptor, com LDL plasmática cinco vezes a normal, está ainda pior do que a aritmética da questão 16 sozinha sugere.

**Parte IV — Ácido.**

19. Calcule o volume do [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) em litros e o número de prótons livres a pH $7.2$ e a pH $4.7$ .
20. Quantos prótons precisam ser bombeados ao todo, com o tamponamento? Quanto tempo isso leva com $50$ bombas?
21. A bomba move prótons para dentro contra o gradiente. Que problema elétrico surge, e como ele é resolvido (pense num contraíon)?
22. Por que as hidrolases só são ativas a pH 5, e o que isso protege?
23. Por que o receptor de LDL solta a LDL a pH 6 enquanto o receptor de manose-6-fosfato solta sua carga no mesmo pH — o que as duas proteínas precisam ter em comum?
24. A cloroquina é uma base fraca que atravessa membranas sem carga e fica presa depois de protonada. Por qual fator ela se concentra num [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) a pH $4.7$ em relação ao citosol a pH $7.2$ (a razão das concentrações de prótons), e o que isso faz ao [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) ?
25. Resuma: o instante do pico do Golgi (questão 7), as vesículas que deixam o retículo por minuto (questão 2) e as partículas de LDL captadas por hora (questão 13).

**Solução de Problema 8.1.**

**1.** $10^{7}\times 25\,000\,\mathrm{Da}\times 1.66\times 10^{-24}$ g $= 0.42\,\mathrm{pg}$ por minuto, $600\,\mathrm{pg}$ por dia — o dobro de seu próprio conteúdo proteico. **2.** Volume da vesícula $\tfrac{4}{3}\pi\,35^{3} = 1.8\times 10^{5}$ nm$^{3}$, $30\,\%$ disso $5.4\times 10^{4}$; uma molécula de enzima $\tfrac{4}{3}\pi\,2^{3} = 34$ nm$^{3}$: cerca de $1600$ moléculas por vesícula; $10^{7}/1600 \approx 6200$ vesículas por minuto. **3.** Área $4\pi\,35^{2} = 0.0154\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ cada, $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ por minuto: os $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ do retículo em cerca de uma hora, se nada voltasse. **4.** $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2} = 9.5\times 10^{7}$ nm$^{2}$, duas monocamadas a $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$: $2.7\times 10^{8}$ lipídios por minuto. A célula devolve membrana por vesículas [COPI](#def-b3-membrane-traffic-coats) e por reciclagem, e sintetiza lipídio para repor o que sai de vez nos grânulos. **5.** Volume do grânulo $5.2\times 10^{8}$ nm$^{3}$, $30\,\%$ disso $1.6\times 10^{8}$: $4.7\times 10^{6}$ moléculas por grânulo; $6\times
10^{8}$ moléculas por hora enchem cerca de $130$ grânulos. **6.** Cada grânulo acrescenta $\pi d^{2} = 3.1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$; $300$ acrescentam $940\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ a $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$: vinte vezes mais. A membrana precisa ser recuperada por endocitose compensatória em minutos. **7.** $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$, $B = 0.50$. **8.** $A = e^{-3} = 0.05$; $B = 2(e^{-1.5} - e^{-3}) = 0.35$; $C = 0.60$. **9.** $10\,\mathrm{min}$ e $20\,\mathrm{min}$; total médio $30\,\mathrm{min}$. **10.** $t^{*} = \ln(0.1)/(-0.09) = 25.6\,\mathrm{min}$; $B(t^{*}) =
(0.1/(-0.09))(e^{-2.56} - e^{-0.256}) = 0.77$: o Golgi incha, abarrotado com três quartos da carga. **11.** No pico, $k_{1}e^{-k_{1}t^{*}} = k_{2}e^{-k_{2}t^{*}}$; substituindo em $B$ obtém-se $B_{\max} = (k_{1}/k_{2})^{\,k_{2}/(k_{2} -
k_{1})}$: a potência é $k_{2}/(k_{2} - k_{1})$. Para $k_{1} > k_{2}$ o expoente é negativo e a base é maior que $1$; para $k_{1} < k_{2}$ a base é menor que $1$ e o expoente é positivo — nos dois casos o valor fica abaixo de $1$ (confira: $2^{-1} = 0.5$ aqui). **12.** Para $k_{1} \gg k_{2}$, $B(t) \to e^{-k_{2}t}$: a marcação está no Golgi de imediato e sai a $k_{2}$ — a etapa do retículo fica invisível e a curva do Golgi é um simples decaimento. **13.** $\theta = 2/(2+2) = 0.5$; $J = 50\,000\times 0.2\times
0.1\times 0.5/(0.1 + 0.1) = 2500$ partículas por minuto, $150\,000$ por hora. **14.** $1.5\times 10^{5}\times 1500 = 2.3\times 10^{8}$ moléculas de colesterol por hora; $5\times 10^{9}/2.3\times 10^{8} \approx 22$ horas. **15.** Fração na superfície $k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta) = 0.5$; uma viagem de ida e volta leva $1/(k_{i}\theta) + 1/k_{r} = 10 + 10 = 20\,\mathrm{min}$: cerca de $60$ viagens em vinte horas. **16.** $J = 1250$ por minuto. Abaixo da saturação $J \propto R\,[L]$, de modo que, com metade dos receptores, a LDL plasmática precisa dobrar para a mesma depuração. **17.** Com $R$ de volta a $50\,000$: a depuração se restabelece e a LDL plasmática volta rumo ao normal — o efeito da estatina. **18.** Sem receptores, a LDL só é depurada por rotas inespecíficas lentas, e por isso circula por dias em vez de horas, é oxidada e é captada pelos receptores depuradores dos macrófagos, que se tornam as células espumosas das placas ateroscleróticas; e as estatinas, que funcionam induzindo receptores, não têm o que induzir. **19.** $V = \tfrac{4}{3}\pi(0.25)^{3} = 0.065\,\text{µ}\mathrm{m}^{3} =
6.5\times 10^{-17}$ L. A pH $7.2$: $6.3\times 10^{-8}\times 6.5\times
10^{-17} = 4\times 10^{-24}$ mol — cerca de $2$ prótons livres. A pH $4.7$: $2\times 10^{-5}\times 6.5\times 10^{-17} = 1.3\times 10^{-21}$ mol, cerca de $780$. **20.** $50\times 780 \approx 39\,000$ prótons; $50$ bombas a $200$ por segundo movem $10\,000$ por segundo: cerca de $4\,\mathrm{s}$. **21.** Bombear carga positiva para dentro deixa o lúmen positivo, e alguns milhares de cargas parariam a bomba; o cloreto entra por um canal (ou cátions saem) para neutralizar a carga. **22.** Enzimas inativas em pH neutro não fazem mal se um [lisossomo](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) vaza ou se elas são mal endereçadas ao citosol ou à superfície: a exigência de acidez confina a digestão ao compartimento construído para ela. **23.** As duas precisam carregar um sensor de pH — histidinas, cuja protonação perto de pH 6 muda a superfície de ligação: o receptor de LDL dobra um domínio sobre seu próprio sítio de ligação quando protonado, e o receptor de manose-6-fosfato perde afinidade do mesmo modo. **24.** $10^{7.2 - 4.7} = 10^{2.5} \approx 300$ vezes de concentração; a base aprisionada consome prótons, eleva o pH lisossomal e inativa as hidrolases — que é como a cloroquina mata os parasitos da malária em seu vacúolo alimentar e como ela bloqueia a [autofagia](#def-b3-membrane-traffic-endocytosis) nos experimentos. **25.** Pico do Golgi aos $14\,\mathrm{min}$; umas $6200$ vesículas deixam o retículo por minuto; $150\,000$ partículas de LDL captadas por hora.