Sebuah matriks substitusi memberi bagi tiap pasangan asam amino sebagai skor log-ods:
dengan frekuensi ditemukannya dan terjajar di dalam penjajaran protein berkerabat yang tepercaya, frekuensi terpasangkannya keduanya secara kebetulan, dan sebuah skala yang dipilih agar entrinya menjadi bilangan bulat yang praktis. Skor positif berarti pasangannya lebih sering muncul pada homolog daripada secara kebetulan; skor keidentikannya terbesar bagi asam amino yang langka (triptofan , sisteina pada BLOSUM62) dan terkecil bagi yang lazim (leusina , alanina ), dan substitusi konservatif (isoleusina–valina ) berskor positif sedangkan yang radikal (triptofan–glisina ) berskor negatif. Matriks PAM (Dayhoff, 1978) diturunkan dari protein yang berkerabat dekat lalu diekstrapolasi ke jarak yang lebih jauh dengan perkalian matriks; matriks BLOSUM (Henikoff dan Henikoff, 1992) dicacah langsung di dalam blok urutan terjajar yang dikelompokkan pada keidentikan tertentu — BLOSUM62 dari blok pada — dan menjadi bakunya karena matriks itu diukur, bukan diekstrapolasi, pada jarak tempat ia dipakai.