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Biologia · Glossário

O que é Sequenciamento massivamente paralelo?

Definição 4.2 Biologia universitária — 3.º ano · Capítulo 4 — Genômica e sequenciamento

Os instrumentos de segunda geração leem de milhões a bilhões de fragmentos ao mesmo tempo. No sequenciamento por síntese os fragmentos, com adaptadores ligados às suas extremidades, são fixados numa célula de fluxo de vidro e amplificados no lugar em aglomerados de moléculas idênticas; os aglomerados são então estendidos uma base por ciclo com nucleotídeos fluorescentes reversivelmente bloqueados, fotografados, desbloqueados e estendidos de novo, de modo que cada ciclo acrescenta uma base à leitura de cada aglomerado. As leituras têm 100 a 300 bp100\text{ a }300\,\mathrm{bp}, em geral vindas das duas pontas de um fragmento (extremidades pareadas), com taxa de erro de cerca de 10−310^{-3} por base, e uma corrida dá até 101210^{12} bases. Os instrumentos de terceira geração, de leituras longas, leem moléculas isoladas sem amplificação: observando uma polimerase incorporar nucleotídeos fluorescentes em tempo real, ou passando o DNA por um nanoporo proteico e registrando a corrente iônica, que cada sequência de bases modula a seu modo. Leituras de 10 a 100 kb10\text{ a }100\,\mathrm{kb} e mais atravessam as repetições que as leituras curtas não vencem, a uma taxa bruta de erro maior que o consenso reduz.

À esquerda: uma célula de fluxo, a lâmina de vidro sobre a qual bilhões de aglomerados de DNA são crescidos e lidos uma base por ciclo. À direita: um sequenciador de nanoporo do tamanho de um bolso, lendo moléculas isoladas como variações de uma corrente iônica. À esquerda: uma célula de fluxo, a lâmina de vidro sobre a qual bilhões de aglomerados de DNA são crescidos e lidos uma base por ciclo. À direita: um sequenciador de nanoporo do tamanho de um bolso, lendo moléculas isoladas como variações de uma corrente iônica.
À esquerda: uma célula de fluxo, a lâmina de vidro sobre a qual bilhões de aglomerados de DNA são crescidos e lidos uma base por ciclo. À direita: um sequenciador de nanoporo do tamanho de um bolso, lendo moléculas isoladas como variações de uma corrente iônica.

Exemplos

Exemplo 4.4 (Quanto basta)

Com c=5c = 5 a fração não sequenciada é e−5=0.7 %e^{-5} = 0.7\,\% — para um genoma de 3.2 Gb3.2\,\mathrm{Gb}, vinte milhões de bases em algumas dezenas de milhares de lacunas. Com c=10c = 10 ela é 4.5×10−54.5\times 10^{-5}, 150 kb150\,\mathrm{kb} no total. Os genomas humanos são sequenciados de rotina a c=30c = 30, não por causa das lacunas de cobertura (e−30≈10−13e^{-30} \approx 10^{-13}), mas porque cada base precisa ser lida várias vezes em cada um dos dois cromossomos para que uma variante heterozigota seja chamada com confiança contra uma taxa de erro de 10−310^{-3} por leitura. Os genomas bacterianos são sequenciados a c=50c = 50–100100 pela mesma razão e porque é barato. A fórmula também mostra o que a cobertura não resolve: uma repetição mais longa que uma leitura é um lugar onde o grafo de sobreposições se ramifica, e nenhuma quantidade de leituras curtas a resolve. É para isso que servem as leituras longas.

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