विश्वविद्यालय जीवविज्ञान — वर्ष 3 · Bachelor Year 3

6आनुवंशिक अभियांत्रिकी और जैवप्रौद्योगिकी

1982 तक संसार का हर मधुमेही सूअरों और गोवंश के अग्न्याशयों से निकाले गए इंसुलिन के सहारे जीवित रहता था — एक किलोग्राम हॉर्मोन के लिए कोई आठ हज़ार किलोग्राम ग्रंथियाँ — और रोगियों का एक अंश उस पराए प्रोटीन के विरुद्ध अनुक्रिया करता था। उसी वर्ष किसी आनुवंशिक रूप से अभियंत्रित जीव से बनी पहली औषध बाज़ार में आई: मानव इंसुलिन, जिसे मानव जीन किसी प्लाज़्मिड पर ढोते Escherichia coli ने संश्लेषित किया। जिन औज़ारों ने यह संभव किया वे पिछले दशक में जुटाए गए थे — ऐसे एंज़ाइम जो DNA को चुने हुए अनुक्रमों पर काटते हैं, ऐसे एंज़ाइम जो टुकड़े जोड़ते हैं, ऐसे प्लाज़्मिड जो उन्हें किसी कोशिका में ले जाते और वहाँ उनकी नकल करते हैं — और अगले दशकों में उनमें पॉलीमरेज़ शृंखला अभिक्रिया, भ्रूणों में जीनों का अंतःक्षेपण, और 2012 से कोई ऐसी जीवाणु प्रतिरक्षा-प्रणाली जुड़ी जिसे क्रमादेश्य कैंची में बदल दिया गया है और जो किसी जीवित कोशिका में जीनोम का एक अक्षर फिर से लिख सकती है। यह अध्याय उन्हीं औज़ारों के बारे में है, उनके उपयोग को चलाने वाले अंकगणित के बारे में, और उनसे जो बना है उसके बारे में — किसी चमकते चूहे से लेकर दात्र-कोशिका रोग के इलाज तक।

6.1 DNA काटना, जोड़ना और नकल करना

परिभाषा 6.1 (प्रतिबंधन एंज़ाइम, लाइगेज़ और संवाहक)

कोई प्रकार II प्रतिबंधन एंज़ाइम ऐसी जीवाणु एंडोन्यूक्लिएज़ है जो द्विलड़ी DNA को $4\text{ से }8$ क्षार युग्मों के किसी विशिष्ट अनुक्रम पर काटती है, जो प्रायः कोई तालमेलक होता है: EcoRI G $^{\downarrow}$ AATTC काटती है और चार-क्षार की एकलड़ी अधिलंब (चिपचिपे सिरे) छोड़ती है, जो किसी भी दूसरे EcoRI सिरे के पूरक हैं; दूसरी एंज़ाइम भोथरे सिरे छोड़ती हैं। DNA लाइगेज़ ऐसे दो खंड जोड़ देती है जिनके सिरे आपस में बैठते हों। कोई संवाहक ऐसा DNA अणु है जो किसी परपोषी में प्रतिकृत होता है और कोई अंतर्वेशित खंड ढो सकता है: कुछ किलोक्षारों का कोई प्लाज़्मिड, जिसमें प्रतिकृति का उद्गम, कोई वरणीय चिह्नक (कोई प्रतिजैविक-प्रतिरोध जीन, ताकि प्रतिजैविक पर केवल वही कोशिकाएँ उगें जिन्होंने प्लाज़्मिड लिया) और अंतर्वेशन के लिए अनन्य प्रतिबंधन स्थलों का एक गुच्छा हो; जीवाणुभोजी $\lambda$ , कॉस्मिड, और $20\text{ से }1000\,\mathrm{kb}$ के अंतर्वेशनों के लिए जीवाणु अथवा खमीर के कृत्रिम गुणसूत्र। DNA किसी जीवाणु में रूपांतरण से घुसता है, किसी ऐसे रासायनिक या वैद्युत आघात के बाद जो झिल्ली को क्षण भर के लिए पारगम्य बना देता है, और दक्षता प्रति माइक्रोग्राम प्लाज़्मिड $10^{6}$ से $10^{9}$ रूपांतरित कोशिकाएँ होती है। कोई पुनर्योगज अणु वह है जो दो स्रोतों का DNA जोड़ता है।

प्रमाण-सामग्री. कोहेन, चांग, बॉयर और हेलिंग (1973) ने प्लाज़्मिड pSC101 और किसी दूसरे प्रतिरोध जीन वाले दूसरे प्लाज़्मिड को EcoRI से काटा, खंडों को मिलाकर जोड़ा, E. coli का रूपांतरण किया, और ऐसी बस्तियाँ पाईं जो दोनों प्रतिजैविकों के प्रति प्रतिरोधी थीं और दोनों से बना एक ही प्लाज़्मिड ढो रही थीं — किसी कोशिका में प्रतिकृत होने वाला पहला पुनर्योगज DNA। अगले वर्ष उन्होंने किसी भेक के राइबोसोमी RNA जीन pSC101 में डाले और दिखाया कि मेंढक का DNA जीवाणु में प्रतिकृत भी हुआ और अनुलेखित भी: जीन जगतों की सीमा बिना बदले पार करते हैं, और कोई जीवाणु उसे दिया गया कोई भी DNA नकल कर देगा। ∎

कोई क्लोनन संवाहक और उसकी रसायन। प्लाज़्मिड एक उद्गम, एक वरणीय चिह्नक और एक अनन्य प्रतिबंधन स्थल ढोता है, जिसमें उसी एंज़ाइम से कटा कोई खंड जोड़ा जाता है; चिपचिपे सिरे एक ही एंज़ाइम से कटे किन्हीं भी दो खंडों को संगत बना देते हैं।

विधि 6.2 (किसी जीन का क्लोनन)

(1) अंतर्वेशन पाइए: जीनोमी DNA को किसी प्रतिबंधन एंज़ाइम से काटिए, या संदेशवाहक RNA की नकल पूरक DNA (cDNA, जिसमें अंतर्वेशन नहीं होते और इसलिए जिसे जीवाणुओं में अभिव्यक्त किया जा सकता है) में कीजिए, या प्रतिबंधन स्थल ढोते प्रारंभकों से जीन को PCR द्वारा प्रवर्धित कीजिए। (2) संवाहक और अंतर्वेशन को एक ही एंज़ाइम (या एंज़ाइमों) से काटिए — दो भिन्न एंज़ाइम अंतर्वेशन की दिशा बाध्य कर देते हैं — और जोड़िए। (3) जीवाणुओं का रूपांतरण कीजिए और प्रतिजैविक पर फैलाइए: केवल वही कोशिकाएँ उगती हैं जिनमें कोई प्लाज़्मिड है। (4) अंतर्वेशन वाले प्लाज़्मिडों को उनसे अलग कीजिए जो स्वयं पर ही बंद हो गए: क्लोनन स्थल से टूटा कोई चिह्नक जीन (lacZ: सफ़ेद बस्तियों में अंतर्वेशन है, नीली में नहीं)। (5) वांछित अंतर्वेशन के लिए बस्तियों की छानबीन कीजिए: किसी अंकित अन्वेषी से संकरण द्वारा, PCR से, या प्रतिबंधन पाचन तथा जेल वैद्युत-कणसंचलन से। (6) अंतर्वेशन का अनुक्रमण कीजिए। कोई संचय किसी पूरे जीनोम या अनुलेखितांश के क्लोनों का समूह है, जिसमें से उसी छानबीन द्वारा कोई भी जीन निकाला जा सकता है।

पराबैंगनी प्रकाश के नीचे कोई ऐगरोज़ जेल: DNA खंड धनाग्र की ओर ऐसी चाल से चलते हैं जो उनकी लंबाई के साथ गिरती है, इसलिए हर पट्टी एक ही आकार के अणुओं की समष्टि है, जिसकी तुलना बाहरी पथों में ज्ञात आकारों की सीढ़ी से की जाती है।

परिभाषा 6.3 (पॉलीमरेज़ शृंखला अभिक्रिया)

पॉलीमरेज़ शृंखला अभिक्रिया (PCR) दो प्रारंभकों के बीच के किसी चुने हुए DNA खंड को प्रवर्धित करती है — प्रारंभक लगभग बीस क्षारों के संश्लेषित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड हैं जो लक्ष्य के सिरों पर दोनों लड़ियों के पूरक हैं — तीन तापों के चक्रों के द्वारा: लड़ियाँ अलग करने के लिए $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , प्रारंभकों के तापानुशीतन के लिए $50\text{ से }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , और किसी ताप-स्थायी पॉलीमरेज़ (Taq, जो गर्म-सोते के जीवाणु Thermus aquaticus से आती है) द्वारा उन्हें बढ़ाने के लिए $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ । हर चक्र प्रारंभकों के बीच के खंड की प्रतियों की संख्या दोगुनी कर देता है, इसलिए तीस चक्र एक अकेले अणु को एक अरब बना देते हैं। प्रतिलोम अनुलेखन PCR पहले RNA की नकल DNA में करती है और इस तरह अनुलेखों या RNA विषाणुओं को मापती है; मात्रात्मक PCR (qPCR) प्रवर्धन को वास्तविक समय में किसी प्रतिदीप्त रंजक से देखती है और आरंभिक मात्रा उस चक्र से पढ़ लेती है जिस पर संकेत किसी देहली को पार करता है।

प्रमेय 6.4 (प्रवर्धन का अंकगणित)

प्रति चक्र दक्षता $E$ के साथ (पूर्ण द्विगुणन के लिए $E = 1$ ), $N_{0}$ आरंभिक प्रतियाँ बन जाती हैं

N_{n} = N_{0}\,(1 + E)^{n}

$n$ चक्रों के बाद। यदि प्रतिदीप्ति किसी नियत देहली को तब पार करे जब प्रति-संख्या $N_{T}$ तक पहुँचे, तो देहली चक्र है

C_{T} = \frac{\log N_{T} - \log N_{0}}{\log(1 + E)},

जो $\log N_{0}$ में ढाल $-1/\log(1+E)$ वाली एक सरल रेखा है: $E = 1$ के लिए, आरंभिक मात्रा में हर दस गुना वृद्धि $C_{T}$ को $\log_{2} 10 = 3.32$ चक्र नीचे ले आती है, और जिन दो प्रतिदर्शों के देहली चक्र $\Delta C_{T}$ से भिन्न हों उनकी आरंभिक प्रतियों में गुणक $(1 + E)^{\Delta C_{T}}$ का अंतर होता है।

उपपत्ति. हर चक्र प्रति-संख्या को $1 + E$ से गुणा करता है, इसलिए $N_{n}$ कोई गुणोत्तर अनुक्रम है। $N_{n} = N_{T}$ रखकर $n$ के लिए हल करने पर $C_{T}$ मिलता है; ढाल $\log N_{0}$ का गुणांक है। दो प्रतिदर्शों के लिए $C_{T,1} - C_{T,2} = (\log N_{0,2} - \log N_{0,1})/\log(1+E)$ , जिससे $N_{0,2}/N_{0,1} = (1+E)^{\Delta C_{T}}$ । ∎

उदाहरण 6.5 (कोई qPCR पट्टिका पढ़ना)

कोई विषाणु-RNA परीक्षण एक रोगी के लिए चक्र $22$ पर और दूसरे के लिए चक्र $32$ पर देहली पार करता है; $E \approx 1$ के साथ पहले में $2^{10} \approx 1000$ गुना अधिक विषाणु है। दस प्रतियों वाला कोई प्रतिदर्श लगभग चक्र $37$ पर पार करता है जब देहली $10^{12}$ प्रतियाँ हो ( $\log_{2} 10^{11} = 36.5$ ); इसलिए $40$ चक्रों की कोई बारी कुछ ही अणु पकड़ लेती है, और किसी पिछले प्रवर्धित उत्पाद का एक अकेला संदूषक अणु भी पकड़ा जाता है, यही कारण है कि प्रयोगशालाएँ PCR लगाने के कमरे उन कमरों से अलग रखती हैं जहाँ उत्पाद सँभाले जाते हैं।

N_0 = 107 (नीला), 104 (लाल) और 10 प्रतियों (हरा) के लिए प्रवर्धन-वक्र, E = 1, और वह पठार जो अभिकर्मक थोप देते हैं। N_0 में हज़ार गुना अंतर देहली चक्र को 10 खिसका देता है; पठार सब एक जैसे हैं, इसीलिए अंतिम उत्पाद आरंभ के बारे में कुछ नहीं बताता। — $N_{0} = 10^{7}$ (नीला), $10^{4}$ (लाल) और $10$ प्रतियों (हरा) के लिए प्रवर्धन-वक्र, $E = 1$ , और वह पठार जो अभिकर्मक थोप देते हैं। $N_{0}$ में हज़ार गुना अंतर देहली चक्र को $10$ खिसका देता है; पठार सब एक जैसे हैं, इसीलिए अंतिम उत्पाद आरंभ के बारे में कुछ नहीं बताता।

6.2 प्रोटीन बनाना

परिभाषा 6.6 (अभिव्यक्ति प्रणालियाँ)

कोई अभिव्यक्ति संवाहक क्लोनित कूटलेखी अनुक्रम को परपोषी के किसी प्रबल, नियंत्रणीय प्रवर्तक के अधीन रखता है (E. coli में lac या T7 प्रवर्तक, जो किसी शर्करा-अनुरूप से प्रेरित होता है), साथ में कोई राइबोसोम-बंधक स्थल, कोई समापक, और प्रायः कोई अनुलग्नक — छह हिस्टिडीन, कोई छोटा प्रोटीन — जो स्तंभ पर शुद्धीकरण के लिए उत्पाद से संलयित होता है। जीवाणु किसी सरल प्रोटीन (इंसुलिन, वृद्धि हॉर्मोन, एंज़ाइम) के प्रति लीटर ग्राम बना देते हैं पर जटिल स्तनधारी प्रोटीनों का ग्लाइकोसिलीकरण या वलन नहीं कर सकते; खमीर अपनी ही तरह की शर्कराएँ जोड़ता है; कीट और स्तनधारी कोशिकाएँ (चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाएँ उद्योग का मानक हैं) प्रतिरक्षी और स्कंदन कारक ऐसे वलित तथा ग्लाइकोसिलित बनाती हैं जैसे किसी मनुष्य में। कोई एकक्लोनी प्रतिरक्षी किसी संकरार्बुद से बनता है — कोई प्रतिरक्षी बनाती B कोशिका जो किसी अमर मज्जार्बुद कोशिका से संलयित हो (क्योलर और मिलश्टाइन, 1975) — या, अब, प्रतिरक्षी जीनों को किसी स्तनधारी अभिव्यक्ति वंश में क्लोनित करके, जहाँ प्रतिरक्षा-अस्वीकृति से बचने के लिए चूहे के ढाँचे को मानव अनुक्रम से बदला जा सकता है (अध्याय 16)।

उदाहरण 6.7 (इंसुलिन)

मानव इंसुलिन दो शृंखलाएँ हैं, A (21 अवशेष) और B (30), जो डाइसल्फ़ाइड बंधों से जुड़ी हैं और $\beta$ कोशिका में किसी एक ही प्रोइंसुलिन पूर्वगामी से काटी जाती हैं। पहली प्रक्रिया ने दोनों शृंखलाएँ E. coli में अलग-अलग अभिव्यक्त कीं, हर एक को $\beta$ -गैलैक्टोसिडेज़ से संलयित करके, फिर उन्हें रासायनिक ढंग से काटकर पात्रे जोड़ा; बाद की प्रक्रियाएँ प्रोइंसुलिन अभिव्यक्त करती हैं और उसे उन्हीं एंज़ाइमों से काटती हैं जो अग्न्याशय काम में लेता है। 1996 से स्वयं अनुक्रम बदला जाने लगा है: एक-दो अवशेष बदलने या जोड़ने से ऐसे अनुरूप मिलते हैं जो तेज़ी से वियोजित होते हैं (किसी भोजन के लिए) या अंतःक्षेपण-स्थल पर अवक्षेपित होकर दिन भर में मुक्त होते हैं। जिस प्रोटीन के प्रति किलोग्राम आठ टन ग्रंथियाँ लगती थीं वह अब किसी किण्वक में बनता है, मानव प्रोटीन के समान या उससे बेहतर।

6.3 पारजीनी जीव

परिभाषा 6.8 (पारजीनन और जीन-लक्ष्यन)

कोई पारजीनी जीव अपने जनन-वंश में डाला गया कोई जीन ढोता है, जिससे वह हर कोशिका में रहता है और वंशागत होता है। चूहों में शास्त्रीय मार्ग किसी निषेचित अंडाणु के एक पूर्वकेंद्रक में DNA का सूक्ष्म-अंतःक्षेपण है (गॉर्डन और रडल, 1980), जो भ्रूणों के किसी अंश में किसी यादृच्छिक स्थल पर समाकलित हो जाता है; पामिटर और ब्रिन्स्टर (1982) ने चूहे का वृद्धि-हॉर्मोन जीन किसी मेटैलोथायोनिन प्रवर्तक के पीछे अंतःक्षेपित करके सामान्य से दोगुने आकार के चूहे बनाए। जीन-लक्ष्यन इसके बजाय किसी चुने हुए जीन को बदल या तोड़ देता है: लक्ष्य से समजात लंबी भुजाओं वाली कोई रचना भ्रूणीय स्तंभ कोशिकाओं में डाली जाती है, वे दुर्लभ कोशिकाएँ चुनी जाती हैं जिनमें समजात पुनर्संयोजन ने उसे सही जगह रख दिया है और उन्हें किसी कंदुक में अंतःक्षेपित किया जाता है, और जो विचित्रकाय चूहा बनता है वह बदला हुआ जीन आगे देता है (कपेक्की, स्मिथीज़ और ऐवंस, 1980 के दशक)। कोई निष्क्रियण जीन से वंचित है; कोई अंतःस्थापन कोई बदला हुआ रूप ढोता है; loxP स्थलों से घिरा कोई सप्रतिबंध युग्मविकल्पी केवल वहीं और तब विलोपित होता है जहाँ और जब Cre अभिव्यक्त हो (अध्याय 3)। चूहे के कोई दस हज़ार जीन निष्क्रिय किए जा चुके हैं, और अधिकांश के लिए लक्षण-प्ररूप ही पहला संकेत था कि जीन क्या करता है।

बाएँ: चूषण से थामा गया कोई निषेचित चूहा-अंडाणु, जबकि कोई काँच की सुई एक पूर्वकेंद्रक में DNA अंतःक्षेपित कर रही है। दाएँ: हर कोशिका में किसी जेलीफ़िश का हरा प्रतिदीप्त प्रोटीन अभिव्यक्त करता कोई पारजीनी चूहा, पराबैंगनी प्रकाश के नीचे किसी साधारण सहोदर के बगल में।

परिभाषा 6.9 (पारजीनी पौधे)

पौधों का रूपांतरण Agrobacterium tumefaciens से होता है, जो मिट्टी का ऐसा जीवाणु है जो स्वाभाविक रूप से अपने अर्बुद-प्रेरक प्लाज़्मिड का एक खंड, T-DNA, किसी घायल पौधे के जीनोम में डाल देता है ताकि पौधा कोई गाँठ उगाए और जीवाणु को खिलाए। T-DNA के अपने जीनों को किसी भी चुने जीन से बदल देना, उन्हीं सीमा-अनुक्रमों के बीच जिन्हें जीवाणु पहचानता है, रोगजनक को एक संवाहक बना देता है; रूपांतरित कोशिकाएँ चुनी जाती हैं और पूरे पौधों में पुनर्जनित की जाती हैं, जो हर पादप कोशिका कर सकती है। जिन जातियों को यह जीवाणु संक्रमित नहीं करता (बहुत समय तक अनाज) उनका रूपांतरण DNA-लेपित सोने के कणों को ऊतक में दागकर होता है। बड़े पैमाने पर उगाई जाने वाली आनुवंशिक रूपांतरित फ़सलें कीट-डिंभों के विरुद्ध कोई जीवाणु विष जीन (Bt) ढोती हैं, या कोई जीवाणु एंज़ाइम जो किसी खरपतवारनाशी के प्रति सहिष्णुता देता है, या दोनों; स्वर्ण चावल कैरोटीनॉयड पथ के दो जीन ढोता है (कोई पादप फ़ाइटोईन सिंथेज़ और कोई जीवाणु डीसैचुरेज़) ताकि उसका भ्रूणपोष $\beta$ -कैरोटीन बनाए, जो विटामिन A का पूर्वगामी है और जिसकी कमी हर वर्ष कई लाख बच्चों को अंधा करती और मारती है।

साधारण और स्वर्ण चावल। पीला दाना अपने भ्रूणपोष में कैरोटीनॉयड पथ के दो जोड़े गए जीनों से -कैरोटीन बनाता है। दाएँ: दोनों चावल अंतरराष्ट्रीय चावल अनुसंधान संस्थान (IRRI, CC BY 2.0) में तुलना में। — साधारण और स्वर्ण चावल। पीला दाना अपने भ्रूणपोष में कैरोटीनॉयड पथ के दो जोड़े गए जीनों से $\beta$ -कैरोटीन बनाता है। दाएँ: दोनों चावल अंतरराष्ट्रीय चावल अनुसंधान संस्थान (IRRI, CC BY 2.0) में तुलना में।

टिप्पणी 6.10 (बहस)

करोड़ों हेक्टेयर पर तीस वर्षों की खेती, और वैज्ञानिक अकादमियों की हर व्यवस्थित समीक्षा, में स्वीकृत पारजीनी फ़सलों का ऐसा कोई स्वास्थ्य प्रभाव नहीं मिला जो उनके परंपरागत समकक्षों से भिन्न हो; पारजीन चालीस हज़ार में एक और जीन है, और वह जो प्रोटीन बनाता है उसकी जाँच किसी भी खाद्य योजक की तरह होती है। असली प्रश्न पारिस्थितिक और आर्थिक हैं: एकरूप चयन के अंतर्गत नाशीजीवों तथा खरपतवारों में प्रतिरोध का फैलना, वन्य संबंधियों में जीन-प्रवाह, बीज-बाज़ार का संकेंद्रण, और लाभ किसे मिलता है। ये वही प्रश्न हैं जो कोई भी सामर्थ्यवान कृषि-प्रौद्योगिकी उठाती है, और उत्तर उस लक्षण और उस परिवेश पर निर्भर करते हैं, न कि उस विधि पर जिससे जीन खिसकाया गया।

6.4 जीनोम संपादित करना

परिभाषा 6.11 (CRISPR–Cas9)

जीवाणु उन फ़ेजों के जीनोमों के खंड, जिन्होंने उनके पूर्वजों को संक्रमित किया था, पुनरावृत्तियों की किसी शृंखला (CRISPR) में सँजोकर रखते हैं, उनका अनुलेखन छोटे मार्गदर्शक RNA में करते हैं, और उनसे किसी न्यूक्लिएज़ को यह निर्देश देते हैं कि कोशिका में घुसने वाला कोई भी मेल खाता DNA काट दे: आनुवंशिक स्मृति वाली एक अनुकूली प्रतिरक्षा-प्रणाली। Streptococcus pyogenes में यह न्यूक्लिएज़ अकेला प्रोटीन Cas9 है, जो किसी मार्गदर्शक RNA और किसी दूसरे छोटे RNA से बँधता है, DNA में किसी तीन-क्षार प्रोटोस्पेसर-सन्निकट अभिप्ररूप (PAM, 5 $'$ -NGG) की खोज करता है, सटे DNA को खोलता है, और यदि PAM के पास के बीस क्षार मार्गदर्शक से युग्मित हों तो PAM से तीन क्षार दूर दोनों लड़ियाँ काट देता है। जिनेक, शार्पान्त्ये, डूडना और सहयोगियों (2012) ने दोनों RNA को एक एकल-मार्गदर्शक RNA में संलयित किया और दिखाया कि किसी भी चुने अनुक्रम के मार्गदर्शक वाला Cas9 किसी परखनली में DNA को उसी अनुक्रम पर काटता है; एक वर्ष के भीतर यह जोड़ी मानव, चूहा, ज़ेब्राफ़िश, पादप और खमीर कोशिकाओं में काम करती दिखा दी गई। कटाव के साथ कोशिका जो करती है वही जीनोम संपादन है सिरा-संयोजन कोई छोटा अंतर्वेशन या विलोपन छोड़ जाता है जो जीन को तोड़ देता है (एक ही चरण में, किसी भी जीव में, हफ़्तों में कोई निष्क्रियण), और दिए गए किसी साँचे के साथ समजात पुनर्संयोजन कोई चुना हुआ अनुक्रम लिख देता है।

Cas9 और उसका मार्गदर्शक। प्रोटीन किसी PAM से बँधता है, उसके पास का DNA खोलता है, और यदि बीस क्षार मार्गदर्शक RNA से युग्मित हों तो काट देता है। विखंडन की मरम्मत या तो सिरा-संयोजन से होती है, जो जीन तोड़ देता है, या किसी साँचे के साथ पुनर्संयोजन से, जो उसे फिर से लिख देता है।

प्रतिज्ञप्ति 6.12 (बिना विखंडन के संपादन)

दोनों लड़ियाँ काटना सबसे भोंडा संपादन है: सिरा-संयोजन का परिणाम यादृच्छिक होता है, और कहीं और पड़ा कोई विखंडन — कोई लक्ष्येतर स्थल जो मार्गदर्शक से कुछ स्थितियों पर भिन्न हो और जिसे Cas9 सह लेता है — ऐसा उत्परिवर्तन है जो किसी ने माँगा नहीं था। जिस Cas9 का एक न्यूक्लिएज़ प्रांत निष्क्रिय हो वह एक ही लड़ी में कटान लगाती है; दोनों निष्क्रिय हों तो वह केवल बँधती है, और दूसरे एंज़ाइमों को किसी अनुक्रम तक ले जा सकती है। क्षार संपादक कटान लगाती Cas9 को ऐसी डीएमिनेज़ से संलयित करते हैं जो खुली लड़ी में C को U (जो T पढ़ा जाता है) या A को I (जो G पढ़ा जाता है) में बदल देती है, और यह बिना किसी विखंडन और बिना किसी साँचे के एक क्षार बदल देता है; प्राइम संपादक कोई प्रतिलोम अनुलेखक और वांछित अनुक्रम से बढ़ाया गया कोई मार्गदर्शक ढोते हैं, और उस अनुक्रम की नकल कटान लगी लड़ी में कर देते हैं, जिससे कोई भी प्रतिस्थापन और छोटे अंतर्वेशन या विलोपन संभव हो जाते हैं। लक्ष्येतर क्रियाशीलता अभियंत्रित उच्च-निष्ठा Cas9 रूपांतरों से, एंज़ाइम को जीन के बजाय प्रोटीन के रूप में थोड़ी देर पहुँचाने से, और ऐसे मार्गदर्शक चुनने से घटाई जाती है जिनके निकटतम जीनोमी संबंधी कई स्थितियों पर भिन्न हों; उसका मापन पूर्वानुमानित स्थलों के अनुक्रमण से, और ऐसी निष्पक्ष विधियों से होता है जो जीनोम का हर विखंडन पकड़ लेती हैं।

उदाहरण 6.13 (एक इलाज)

दात्र-कोशिका रोग $\beta$ -ग्लोबिन में एक ही क्षार का बदलाव है। $\gamma$ -ग्लोबिन से बना भ्रूणीय हीमोग्लोबिन उसकी जगह ले सकता था, पर $\gamma$ जीन जन्म के बाद दमनकारी BCL11A द्वारा बंद कर दिए जाते हैं। पहली स्वीकृत CRISPR चिकित्सा (2023) रोगी की अपनी रक्त-स्तंभ कोशिकाएँ लेती है, BCL11A के रक्ताणु संवर्धक को Cas9 से काटती है ताकि सिरा-संयोजन उसे अधिकांश कोशिकाओं में निष्क्रिय कर दे, और रोगी की मज्जा साफ़ कर देने के बाद कोशिकाएँ लौटा देती है: वे जो लाल कोशिकाएँ बनाती हैं वे भ्रूणीय हीमोग्लोबिन से भरपूर होती हैं, दात्राकार नहीं होतीं, और संकट रुक जाते हैं। यह संपादन कायिक है — जनन-वंश अछूता रहता है और बदलाव वंशागत नहीं होता — और वह “भोंडा” परिणाम, यानी तोड़ना, वहीं काम में लेता है जहाँ तोड़ना ही चाहिए।

प्रमेय 6.14 (किसी जीन-चालक का अति-मेंडेली फैलाव)

कोई जीन-चालक ऐसी रचना है जो Cas9 और ऐसे मार्गदर्शक का कूटलेखन करती है जो किसी विषमयुग्मजी में अपने ही स्थल पर वन्य-प्ररूप युग्मविकल्पी को काट देता है; पुनर्संयोजन से मरम्मत चालक की नकल कटे गुणसूत्र में उतार देती है, जिससे मेंडेली आधे के बजाय विषमयुग्मजी के युग्मकों का कोई अंश $c$ चालक ढोता है। यदि किसी बड़ी, यादृच्छिक रूप से संगम करती समष्टि में चालक की बारंबारता $p$ हो और कोई अनुकूलता-लागत न हो, तो अगली पीढ़ी में उसकी बारंबारता है

p' = p + c\,p\,(1 - p),

इसलिए वह दुर्लभता से $c$ के समानुपाती दर से फैलता है, और लगभग $\ln(1/p_{0})/\ln(1 + c)$ पीढ़ियों में आधी समष्टि तक पहुँच जाता है, जब आरंभिक बारंबारता $p_{0}$ हो।

उपपत्ति. यादृच्छिक संगम चालक के समयुग्मजी बारंबारता $p^{2}$ पर देता है, विषमयुग्मजी $2p(1-p)$ पर, वन्य-प्ररूप समयुग्मजी $(1-p)^{2}$ पर। समयुग्मजी चालक अपने सारे युग्मकों को देते हैं, विषमयुग्मजी $(1 + c)/2$ अंश को (आधा मेंडेल से, और $c$ गुना वन्य-प्ररूप आधा रूपांतरित), वन्य-प्ररूप किसी को नहीं। इसलिए $p' = p^{2} + 2p(1-p)(1+c)/2 = p^{2} + p(1-p) + c\,p(1-p) = p + c\,p(1-p)$ । छोटे $p$ के लिए यह $p' \approx (1+c)p$ है, यानी अनुपात $1 + c$ से गुणोत्तर वृद्धि, जो $1/2$ तक पहुँचती है, $p_{0}$ से लगभग $\ln(1/2p_{0})/\ln(1+c)$ पीढ़ियों में; संभार्य पद उसे केवल अंत के पास धीमा करता है। ∎

एक प्रतिशत पर छोड़ा गया कोई जीन-चालक, रूपांतरण-दक्षता 0.9 या 0.5 और बिना किसी अनुकूलता-लागत के। बिना किसी लाभ वाला कोई मेंडेली युग्मविकल्पी एक प्रतिशत पर ही रहता; चालक दस या बीस पीढ़ियों में छा जाता है। — एक प्रतिशत पर छोड़ा गया कोई जीन-चालक, रूपांतरण-दक्षता $0.9$ या $0.5$ और बिना किसी अनुकूलता-लागत के। बिना किसी लाभ वाला कोई मेंडेली युग्मविकल्पी एक प्रतिशत पर ही रहता; चालक दस या बीस पीढ़ियों में छा जाता है।

टिप्पणी 6.15 (क्या संपादित किया जा सकता है)

किसी सहमत रोगी की कायिक कोशिकाओं का संपादन चिकित्सा है, जिसे किसी भी उपचार की तरह उसके जोखिमों और लाभों से परखा जाता है। जनन-वंश का संपादन — किसी भ्रूण का, जिसका हर वंशज वह बदलाव ढोएगा — प्रकार से ही भिन्न है: जो व्यक्ति प्रभावित होगा वह सहमति नहीं दे सकता, बदलाव वंशागत होता है, और तकनीक के लक्ष्येतर तथा विचित्र परिणाम अभी नियंत्रित नहीं हैं; 2018 में एक चीनी वैज्ञानिक द्वारा जुड़वाँ बच्चों में ऐसा करने की घोषणा के बाद अधिकांश देशों की वैज्ञानिक अकादमियों ने रोक की माँग की और कई राज्यों ने उसे अपराध बना दिया। किसी वन्य समष्टि में छोड़ा गया कोई जीन-चालक ऐसा निर्णय है जो आगे आने वाले सबके लिए लिया जाता है, इसीलिए मलेरिया-मच्छरों को समाप्त करने के लिए इसी क्षेत्र के अपने प्रस्ताव चालकों को विफलता-सुरक्षाओं से — उलटने वाले चालक, स्वयं-सीमित अभिकल्प — और संबंधित देशों की सार्वजनिक सहमति से जोड़ते हैं।

6.5 अभ्यास

अभ्यास 6.1 ★

किसी क्लोनन प्लाज़्मिड में जो तीन अंग होने चाहिए उन्हें गिनाइए और हर एक का प्रयोजन समझाइए।

हल

हल — अभ्यास 6.1.

प्रतिकृति का कोई उद्गम, ताकि परपोषी प्लाज़्मिड की नकल करे और उसे पुत्री कोशिकाओं तक पहुँचाए; कोई वरणीय चिह्नक, प्रायः प्रतिजैविक-प्रतिरोध, ताकि केवल वही कोशिकाएँ उगें जो प्लाज़्मिड ढो रही हैं; और कोई अनन्य प्रतिबंधन स्थल (या स्थलों का गुच्छा) जिस पर अंतर्वेशन जोड़ा जाए, बिना प्लाज़्मिड को कहीं और काटे।

अभ्यास 6.2 ★

EcoRI GAATTC को पहचानती है। यादृच्छिक DNA में यह स्थल औसतन कितनी बार आता है, और $4.6\,\mathrm{Mb}$ के E. coli जीनोम के वह कितने खंड बनाती है? असली संख्या कुछ भिन्न क्यों है?

हल

हल — अभ्यास 6.2.

यादृच्छिक DNA में कोई दिया हुआ छह-क्षार अनुक्रम हर $4^{6} = 4096$ bp में एक बार आता है: लगभग $4.6\times 10^{6}/4096 \approx 1100$ खंड, औसतन $4.1\,\mathrm{kb}$ के। असली जीनोम यादृच्छिक नहीं होते — क्षार-संघटन, कूटक-उपयोग और कुछ अनुक्रमों से बचाव गिनती खिसका देते हैं (E. coli में EcoRI स्थलों की वास्तविक संख्या कुछ सौ है)।

अभ्यास 6.3 ★

किसी PCR चक्र के तीन ताप-चरण और हर एक पर क्या होता है, बताइए। पॉलीमरेज़ का ताप-स्थायी होना क्यों आवश्यक है?

हल

हल — अभ्यास 6.3.

$95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ पर विकृतीकरण लड़ियाँ अलग करता है; $50\text{ से }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ पर तापानुशीतन प्रारंभकों को उनके स्थलों से युग्मित होने देता है; $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ पर दीर्घन पॉलीमरेज़ को हर प्रारंभक से नकल करने देता है। कोई साधारण पॉलीमरेज़ पहले ही चक्र में $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ पर नष्ट हो जाती और उसे तीस बार नए सिरे से जोड़ना पड़ता; Taq सारे चक्र झेल जाती है।

अभ्यास 6.4 ★

किसी दिए हुए अनुक्रम को काटने के लिए Cas9 को क्या चाहिए, और कटाव के बाद कौन-से दो परिणाम हो सकते हैं?

हल

हल — अभ्यास 6.4.

कोई ऐसा मार्गदर्शक RNA जिसके बीस क्षार लक्ष्य से मेल खाएँ, और अलक्ष्य लड़ी पर लक्ष्य के ठीक 3 $'$ ओर कोई PAM (NGG)। द्विलड़ी विखंडन के बाद: सिरा-संयोजन, जो कोई छोटा अंतर्वेशन या विलोपन छोड़ता है और प्रायः जीन का वाचन-ढाँचा नष्ट कर देता है; या वांछित अनुक्रम ढोते किसी साँचे के साथ समजात पुनर्संयोजन, जो उसे लिख देता है।

अभ्यास 6.5 ★★

कोई PCR $35$ चक्र दक्षता $E = 0.9$ पर $50$ प्रतियों से चलती है। कितनी प्रतियाँ मिलती हैं? दो प्रतिदर्शों की qPCR $C_{T} = 18.2$ और $25.5$ देती है; $E = 0.95$ के साथ उनकी आरंभिक मात्राओं का अनुपात क्या है?

हल

हल — अभ्यास 6.5.

$50\times 1.9^{35} = 50\times 5.7\times 10^{9} \approx 3\times 10^{11}$ प्रतियाँ। $\Delta C_{T} = 7.3$ ; अनुपात $1.95^{7.3} = e^{7.3\ln 1.95} \approx 130$ : पहले प्रतिदर्श में लगभग $130$ गुना अधिक साँचा था।

अभ्यास 6.6 ★★

जीवाणुओं में किसी मानव प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए कोई cDNA संचय काम में आता है, कोई जीनोमी संचय क्यों नहीं? E. coli में कोई मानव प्रोटीन बनाने की दो और अड़चनें बताइए और हर एक को कैसे पार किया जाता है।

हल

हल — अभ्यास 6.6.

जीवाणु विच्छेदन नहीं कर सकते: अंतर्वेशनों वाली कोई जीनोमी प्रति ऐसे संदेश में अनुलेखित होती जो काम का न होता, इसलिए परिपक्व mRNA से नकल की गई, अंतर्वेशन-रहित cDNA काम में ली जाती है। दूसरी अड़चनें: मानव प्रवर्तक को जीवाणु पॉलीमरेज़ नहीं पहचानती (कोई जीवाणु प्रवर्तक और राइबोसोम-बंधक स्थल दीजिए); मानव कूटक-उपयोग भिन्न है (जीन को परपोषी के पसंदीदा कूटकों से संश्लेषित कीजिए); प्रोटीन वलित न हो या पुंजित हो जाए (ताप घटाइए, किसी विलेय साथी से संलयित कीजिए, या अंतर्वेशी पिंडों से फिर वलित कीजिए); ग्लाइकोसिलीकरण नहीं होता (यदि वह मायने रखे तो खमीर या स्तनधारी कोशिकाएँ लीजिए); डाइसल्फ़ाइडों को ऑक्सीकारी परिकोशिकाद्रव्य चाहिए।

अभ्यास 6.7 ★★

भ्रूणीय स्तंभ कोशिकाओं में जीन-लक्ष्यन से कोई निष्क्रियण-चूहा बनाया जाता है। समझाइए कि जन्मा पहला चूहा विचित्रकाय क्यों होता है, उसका प्रजनन क्यों करना पड़ता है, और यदि किसी ऐसे विचित्रकाय के, जिसका जनन-वंश आधा लक्षित है, विषमयुग्मजी नाती-पोतों का अंतःसंकरण कराया जाए तो उसके नाती-पोतों का कितना अंश समयुग्मजी निष्क्रियण होगा।

हल

हल — अभ्यास 6.7.

लक्षित स्तंभ कोशिकाएँ किसी परपोषी कंदुक में अंतःक्षेपित की जाती हैं और उसकी अपनी कोशिकाओं से मिल जाती हैं, इसलिए चूहा दो जीन-प्ररूपों से बना होता है — एक विचित्रकाय — और वह युग्मविकल्पी तभी आगे देता है जब उसकी कुछ जनन-कोशिकाएँ लक्षित कोशिकाओं से बनी हों। विचित्रकाय का वन्य-प्ररूप चूहे से प्रजनन विषमयुग्मजी देता है (यदि जनन-वंश आधा लक्षित हो तो उसके आधे युग्मकों से); विषमयुग्मजियों का अंतःसंकरण एक-चौथाई समयुग्मजी निष्क्रियण देता है।

अभ्यास 6.8 ★★

NGG PAM वाला 20 क्षारों का कोई मार्गदर्शक RNA चुना जाता है। $3.2\times 10^{9}$ bp के किसी जीनोम में (दोनों लड़ियाँ) संयोग से कितने स्थल मार्गदर्शक से ठीक-ठीक मेल खाएँगे? यदि Cas9 दो तक असंगतियाँ सह ले तो कितने मेल खाएँगे? (दो असंगतियों के भीतर के अनुक्रम $1 + 3\binom{20}{1} + 9\binom{20}{2}$ गिनिए।)

हल

हल — अभ्यास 6.8.

ठीक-ठीक: $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}\times (1/16) \approx 4\times 10^{-4}$ स्थल (PAM के GG की कीमत $16$ का गुणक है) — व्यवहार में कोई नहीं। दो असंगतियों के भीतर $1 + 60 + 1710 = 1771$ अनुक्रम हैं: $1771\times 4\times 10^{-4} \approx 0.7$ संयोगी स्थल। असली जीनोम यादृच्छिक नहीं है, और किसी मार्गदर्शक की जाँच सीधे उसी के सामने की जाती है।

अभ्यास 6.9 ★★

प्रमेय 6.14 का उपयोग करते हुए $c = 0.8$ वाले किसी चालक की बारंबारता $p_{0} = 0.05$ से तीन पीढ़ियों के बाद निकालिए, और $0.5$ तक पहुँचने में लगने वाली पीढ़ियों का आकलन कीजिए।

हल

हल — अभ्यास 6.9.

$p_{1} = 0.05 + 0.8\times 0.05\times 0.95 = 0.088$ ; $p_{2} = 0.152$ ; $p_{3} = 0.255$ ; फिर $0.41$ , $0.60$ : $0.5$ पार करने में लगभग पाँच पीढ़ियाँ, आकलन $\ln(1/(2\times 0.05))/\ln 1.8 \approx 4$ के सामने।

अभ्यास 6.10 ★★★

दात्र-कोशिका चिकित्सा $\beta$ -ग्लोबिन उत्परिवर्तन को सुधारने के बजाय किसी संवर्धक को तोड़ती है। रक्त-स्तंभ कोशिकाओं में समजात पुनर्संयोजन से सुधार के बजाय सिरा-संयोजन से तोड़ना क्यों चुना गया, इसके दो कारण दीजिए, और एक हानि भी।

हल

हल — अभ्यास 6.10.

सिरा-संयोजन हर कोशिका में चलता है, उन शांत स्तंभ कोशिकाओं में भी जिनमें समजात पुनर्संयोजन, जो S/G2 की प्रक्रिया है, अदक्ष है; उसे कोई साँचा पहुँचाना नहीं पड़ता और उसका उत्पाद — संवर्धक का कोई भी तोड़ — काम पूरा कर देता है, जबकि सुधार के लिए ठीक-ठीक अनुक्रम चाहिए और वह कोशिकाओं का अल्पांश ही देता है। साथ ही, वही संपादन हर $\beta$ -ग्लोबिन उत्परिवर्तन के लिए काम करता है, दात्र हो या थैलेसीमिक। हानि: वह कोई नियामक अवयव हटा देता है (उसकी और जो भी भूमिकाएँ हों उनके साथ), दात्र युग्मविकल्पी अपनी जगह छोड़ जाता है, और अंतर्वेशन-विलोपनों का मिश्रण अनियंत्रित रहता है।

अभ्यास 6.11 ★★★

किसी मच्छर के विरुद्ध कोई जीन-चालक समयुग्मजियों में अनुकूलता-लागत $s$ ढोता है। चालक-समयुग्मजियों के विरुद्ध चयन को समाविष्ट करने के लिए पुनरावृत्ति-संबंध बदलिए और चालक के दुर्लभता से फैलने के लिए $c$ तथा $s$ पर प्रतिबंध ढूँढ़िए। फिर समझाइए कि व्यवहार में प्रतिरोध युग्मविकल्पी — लक्ष्य पर बने वे सिरा-संयोजन उत्पाद जिन्हें मार्गदर्शक अब नहीं पहचानता — मुख्य बाधा क्यों हैं।

हल

हल — अभ्यास 6.11.

समयुग्मजी अनुकूलता $1 - s$ के साथ: $p' = \bigl[p^{2}(1-s) + p(1-p)(1+c) \bigr]/(1 - sp^{2})$ । दुर्लभता पर समयुग्मजी नगण्य हैं और चालक $(1+c)p$ की तरह बढ़ता है, $s$ जो भी हो; वह स्थिरीकरण तक जाएगा या नहीं, यह $p = 1$ के पास तय होता है, जहाँ बारंबारता $q$ वाला कोई दुर्लभ वन्य-प्ररूप युग्मविकल्पी $q' \approx q(1-c)/(1-s)$ के रूप में लौटता है: $c > s$ हो तो स्थिरीकरण, अन्यथा कोई मध्यवर्ती साम्य। प्रतिरोध: हर विफल रूपांतरण (पुनर्संयोजन के बजाय सिरा-संयोजन) ऐसा युग्मविकल्पी छोड़ जाता है जिसे मार्गदर्शक अब नहीं पहचानता; यदि ऐसे युग्मविकल्पी अनुकूल हों — किसी अनावश्यक क्षेत्र में कोई ढाँचा-रक्षी अंतर्वेशन-विलोपन — तो उन पर कोई लागत नहीं जबकि चालक पर है, इसलिए चयन उन्हें वरीयता देता है और वे चालक की जगह ले लेते हैं। उपाय हैं ऐसे अनिवार्य अनुक्रमों को लक्ष्य बनाना जहाँ अंतर्वेशन-विलोपन घातक हों, और एक साथ कई मार्गदर्शक काम में लेना।

अभ्यास 6.12 ★★★

इस अध्याय की और अध्याय 3 की क्रियाविधियों से तर्क दीजिए कि किसी मानव भ्रूण का जनन-वंश-संपादन अभी हर कोशिका में अभीष्ट परिणाम की गारंटी क्यों नहीं दे सकता, और किसी विवेकी व्यक्ति के उसे सुरक्षित मानने से पहले कौन-से प्रमाण चाहिए होंगे।

हल

हल — अभ्यास 6.12.

किसी युग्मनज में अंतःक्षेपित Cas9 पहले विभाजनों के बाद भी काम कर सकती है, इसलिए भिन्न कोशिकाओं को भिन्न मरम्मत मिलती है — विचित्रता; हर विखंडन की मरम्मत कोशिका चुनती है, और सिरा-संयोजन कटाव पर अप्रत्याशित अंतर्वेशन-विलोपन तथा बड़े विलोपन या विषमयुग्मजता-ह्रास देता है; समजात-पुनर्संयोजन परिणाम अल्पांश होता है; लक्ष्येतर विखंडन ऐसे स्थलों पर होते हैं जिनका पूर्वानुमान पूरा नहीं लगाया जा सकता; और भ्रूण की जाँच केवल कुछ बायोप्सी कोशिकाओं के अनुक्रमण से हो सकती है, जो शेष के लिए नहीं बोल सकतीं। जो प्रमाण चाहिए: ऐसी विधियाँ जो हर कोशिका को एक जैसा संपादित करें (पहली S प्रावस्था से पहले) और जिनकी दक्षता $100\,\%$ के निकट हो, संपादित पशु-भ्रूणों की हर कोशिका का पूर्ण-जीनोम अनुक्रमण जो कोई अनपेक्षित बदलाव न दिखाए, और पीढ़ियों तक संपादित पशुओं का दीर्घकालिक अनुवर्तन — इनमें से कुछ भी उपलब्ध नहीं।

6.6 समस्या: किसी जीन से एक औषध और एक फ़सल तक

समस्या 6.1

सप्तांत समस्या — प्रतिबंधन स्थलों तथा रूपांतरण के अंकगणित से क्लोनित कोई जीन, qPCR से गिना गया कोई विषाणु, किसी किण्वक में टन भर बनता कोई हॉर्मोन, लक्ष्येतर स्थलों की गिनती के साथ संपादित कोई जीनोम, और समयबद्ध किया गया कोई जीन-चालक, जिसका अंत किसी प्रतिदर्श में विषाणु की प्रतियों, संसार भर के इंसुलिन के लिए वार्षिक किण्वक-आयतन और किसी चालक को चाहिए पीढ़ियों की संख्या पर होता है

आँकड़े: कोई $1.5\,\mathrm{kb}$ जीन; कोई छह-क्षार प्रतिबंधन स्थल; $4\,\mathrm{kb}$ का कोई प्लाज़्मिड; रूपांतरण दक्षता प्रति माइक्रोग्राम प्लाज़्मिड $2\times 10^{7}$ बस्तियाँ; जोड़ने से $10\,\%$ प्लाज़्मिडों को कोई अंतर्वेशन मिलता है। qPCR दक्षता $E = 1$ , देहली $N_{T} = 10^{12}$ । इंसुलिन: $5.8\,\mathrm{kDa}$ , कोई रोगी दिन में $40$ इकाई काम में लेता है, और एक इकाई $35\,\text{µ}\mathrm{g}$ है; $10^{7}$ रोगी; कोई किण्वक प्रति बारी $2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ उत्पाद देता है, वर्ष में दस बारियाँ। जीनोम $3.2\times 10^{9}$ bp। चालक रूपांतरण $c = 0.9$ , $p_{0} = 0.001$ पर छोड़ा गया।

भाग I — क्लोनन।

यादृच्छिक DNA में कोई दिया हुआ छह-क्षार स्थल कितनी बार आता है? इसकी प्रायिकता क्या है कि $1.5\,\mathrm{kb}$ जीन में ऐसा कोई स्थल न हो, ताकि एंज़ाइम से उसे पूरा क्लोनित किया जा सके?
यदि उसमें कोई स्थल हो तो आप उसे फिर भी कैसे क्लोनित करेंगे? (दो विधियाँ।)
जोड़े गए प्लाज़्मिड का $100\,\mathrm{ng}$ रूपांतरित किया जाता है। कितनी बस्तियाँ, और कितनी में अंतर्वेशन है?
नीली–सफ़ेद छानबीन काम में ली जाती है। बस्तियों का कितना अंश सफ़ेद है, और $99\,\%$ संभावना के लिए कि कम-से-कम एक में जीन सही दिशा में हो (अंतर्वेशनों का आधा), कितनी सफ़ेद बस्तियाँ उठानी पड़ेंगी?
पुनर्योगज प्लाज़्मिड $5.5\,\mathrm{kb}$ का है। कोई कोशिका $50$ प्रतियाँ रखती है और हर $30\,\mathrm{min}$ में विभाजित होती है। एक कोशिका से रात भर की वृद्धि ( $16\,\mathrm{h}$ ) के बाद कितने प्लाज़्मिड अणु, और प्लाज़्मिड DNA का कितना द्रव्यमान ( $650\,\mathrm{Da}$ प्रति क्षार युग्म)?
प्लाज़्मिड को कोई जीवाणु उद्गम क्यों चाहिए, पर अंतर्वेशित मानव जीन को क्लोनन के लिए कोई जीवाणु प्रवर्तक नहीं चाहिए, जबकि अभिव्यक्ति के लिए चाहिए?

भाग II — कोई विषाणु गिनना।

किसी रोगी का प्रतिदर्श $C_{T} = 28$ पर देहली पार करता है। अभिक्रिया में कितनी प्रतियाँ थीं? $C_{T} = 35$ वाले दूसरे में?
संवेदिता: किसी एक प्रति को देहली तक लाने में कितने चक्र लगते हैं?
परीक्षण की कट-ऑफ़ $C_{T} = 38$ पर रखी गई है। वह कितनी प्रतियों के तुल्य है, और $45$ चक्र क्यों न रखें?
किसी पिछली बारी के उत्पाद का कोई संदूषक अणु किसी ऋणात्मक प्रतिदर्श में घुस जाता है। वह किस चक्र पर देहली पार करेगा? कौन-सा प्रयोगशाला-व्यवहार इसे रोकता है?
प्रतिलोम अनुलेखन विषाणु-RNA का $40\,\%$ DNA में बदलता है। पहले प्रतिदर्श के लिए प्रश्न 7 की गणना संशोधित कीजिए।
दो प्रतिदर्श $\Delta C_{T} = 3.3$ से भिन्न हैं, $E = 1$ के साथ, पर दक्षता वस्तुतः $0.9$ है। विश्लेषक कितने गुने का अंतर बताता है, और सही अंतर क्या है?

भाग III — टन भर इंसुलिन।

प्रति रोगी दैनिक इंसुलिन-द्रव्यमान और $10^{7}$ रोगियों के लिए वार्षिक विश्व-आवश्यकता किलोग्राम में निकालिए।
वह कितने मोल इंसुलिन हुआ, और कितने अणु?
वर्ष में दस बारियाँ चलाने पर उसे कौन-सा किण्वक-आयतन बनाता है? $2500\,\mathrm{m}^{3}$ के किसी तरण-ताल से तुलना कीजिए।
ग्रंथियों से निष्कर्षण $8000\,\mathrm{kg}$ अग्न्याशय से $1\,\mathrm{kg}$ इंसुलिन देता था; किसी सूअर के अग्न्याशय का भार $100\,\mathrm{g}$ है। संसार को वर्ष में कितने सूअर चाहिए होते?
जहाँ पशु-इंसुलिन सस्ता है वहाँ भी पुनर्योगज हॉर्मोन को वरीयता क्यों दी जाती है? दो कारण दीजिए।
इंसुलिन अनुरूप मानव अनुक्रम से एक-दो अवशेष भिन्न होते हैं। समझाइए कि कोई अनुरूप फिर भी ऐसी औषध क्यों है जो मानव ग्राही पर काम करती है, और एक अवशेष का बदलाव उसका वियोजन-काल क्यों बदल सकता है।

भाग IV — संपादन और चालन।

20-क्षार मार्गदर्शक और NGG के कितने ठीक-ठीक मेल जीनोम में संयोग से हैं (दोनों लड़ियाँ: $6.4\times 10^{9}$ स्थितियाँ)?
यदि Cas9 तीन तक असंगतियाँ सह ले, तो मार्गदर्शक से तीन असंगतियों के भीतर कितने अनुक्रम हैं, और इससे कितने संयोगी लक्ष्येतर स्थल बनते हैं?
संपादित रक्त-स्तंभ कोशिकाएँ $10^{7}$ हैं; $80\,\%$ में अभीष्ट तोड़ हुआ है। यदि किसी दिए हुए स्थल पर $10^{4}$ में एक कोशिका कटती हो तो उस स्थल पर कितनी कोशिकाओं में लक्ष्येतर विखंडन है, और किसी एक स्तंभ कोशिका में किसी अर्बुद-दमनकारी जीन का विखंडन चिंता की बात क्यों है?
चालक की बारंबारता $1, 2, 3$ पीढ़ियों के बाद $p_{0} = 0.001$ से निकालिए, और $0.5$ तक पीढ़ियों का आकलन कीजिए।
किसी मच्छर की वर्ष में दस पीढ़ियाँ होती हैं। छा जाने में कितने वर्ष? समयुग्मजियों में $20\,\%$ की अनुकूलता-लागत चित्र को गुणात्मक रूप से कैसे बदल देती है?
कोई प्रतिरोध युग्मविकल्पी तब उठता है जब कटाव की मरम्मत पुनर्संयोजन से नहीं, सिरा-संयोजन से हो, और यह प्रति रूपांतरण-प्रयास प्रायिकता $1 - c = 0.1$ से होता है। एक पीढ़ी में $10^{6}$ विषमयुग्मजियों की किसी समष्टि में बने प्रतिरोध युग्मविकल्पियों की संख्या आँकिए, और बताइए कि यदि वे अनुकूल हों तो चालक का क्या होता है।
सारांश दीजिए: पहले प्रतिदर्श में प्रतियाँ (प्रश्न 7), संसार का वार्षिक इंसुलिन किण्वक-आयतन (प्रश्न 15), और चालक के आधी समष्टि तक पहुँचने की पीढ़ियाँ (प्रश्न 22)।

हल

हल — समस्या 6.1.

1. प्रति $4096$ bp एक बार। $P(\text{कोई स्थल नहीं}) = (1 - 1/4096)^{1500} = e^{-0.37} = 0.69$ । 2. ऐसी एंज़ाइम चुनिए जिसका जीन में कोई स्थल न हो; या जीन को PCR से ऐसे प्रारंभकों के साथ प्रवर्धित कीजिए जो अपने 5 $'$ सिरों पर नए प्रतिबंधन स्थल ढोते हों (या भोथरा अथवा जोड़-निरपेक्ष क्लोनन काम में लीजिए)। 3. $0.1\,\text{µ}\mathrm{g}$ $\times 2\times 10^{7} = 2\times 10^{6}$ बस्तियाँ; $10\,\%$ , यानी $2\times 10^{5}$ , में अंतर्वेशन है। 4. सफ़ेद: $10\,\%$ । अंतर्वेशनों का आधा सही दिशा में है, इसलिए $P(\text{कोई नहीं, } n \text{ सफ़ेदों में}) = 0.5^{n} \le 0.01$ से $n \ge 6.6$ : सात उठाइए। 5. $32$ द्विगुणन, $2^{32} = 4.3\times 10^{9}$ कोशिकाएँ, $2.1\times 10^{11}$ प्लाज़्मिड; हर एक $5500\times 650 = 3.6\times 10^{6}$ Da $= 5.9\times 10^{-18}$ g: $1.3\,\text{µ}\mathrm{g}$ प्लाज़्मिड। 6. क्लोनन को केवल प्रतिकृति चाहिए, जो प्लाज़्मिड का उद्गम देता है; मानव प्रवर्तक को जीवाणु RNA पॉलीमरेज़ नहीं पढ़ती, इसलिए अभिव्यक्ति के लिए (अंतर्वेशन-रहित) कूटलेखी अनुक्रम के आगे कोई जीवाणु प्रवर्तक और राइबोसोम-बंधक स्थल रखना पड़ता है। 7. $N_{0} = N_{T}/2^{C_{T}}$ : $10^{12}/2^{28} \approx 3700$ प्रतियाँ; $C_{T} = 35$ पर $10^{12}/2^{35} \approx 29$ प्रतियाँ। 8. $2^{n} = 10^{12}$ : $n = 39.9$ , चालीस चक्र। 9. $10^{12}/2^{38} \approx 3.6$ प्रतियाँ। लगभग $40$ चक्रों से आगे कोई अकेला संदूषक अणु, या प्रारंभक-कृतक, देहली तक पहुँच जाते हैं, और एक प्रति से कम वाला प्रतिदर्श निरर्थक है। 10. एक अणु चक्र $40$ पर पार करता है: एक धनात्मक। इसे लगाने और उत्पाद सँभालने के लिए अलग कमरे तथा उपकरण, एकतरफ़ा कार्य-प्रवाह, हर बारी में ऋणात्मक नियंत्रण, और ढुले हुए प्रवर्धित उत्पादों के एंज़ाइमी विनाश से रोकिए। 11. $3700/0.4 \approx 9000$ RNA प्रतियाँ। 12. बताया गया $2^{3.3} \approx 10$ गुना; सही $1.9^{3.3} = e^{3.3\ln 1.9} \approx 8.3$ गुना। 13. $40\times 35\,\text{µ}\mathrm{g} = 1.4\,\mathrm{mg}$ प्रति दिन, $0.51\,\mathrm{g}$ प्रति वर्ष; $\times 10^{7}$ : $5100\,\mathrm{kg}$ प्रति वर्ष। 14. $5.1\times 10^{6}/5800 \approx 880$ mol; $5.3\times 10^{26}$ अणु। 15. $5.1\times 10^{6}$ g $/ (20$ g/L $) = 2.6\times 10^{5}$ L $= 260\,\mathrm{m}^{3}$ — ताल का दसवाँ भाग। 16. $5100\times 8000 = 4.1\times 10^{7}$ kg अग्न्याशय, प्रति अग्न्याशय $0.1\,\mathrm{kg}$ की दर से: वर्ष में $4\times 10^{8}$ सूअर। 17. पुनर्योगज हॉर्मोन मानव हॉर्मोन के समान है, इसलिए वह कोई प्रतिरक्षी नहीं उठाता और कोई एलर्जी नहीं करता; वह कोई पशु-रोगजनक (विषाणु, प्रायॉन) नहीं ढोता; आपूर्ति वध पर निर्भर नहीं; और अनुक्रम सुधारा जा सकता है। 18. जो अवशेष ग्राही को छूते हैं वे अपरिवर्तित हैं, इसलिए बंधन और संकेतन इंसुलिन के ही हैं; बदले हुए अवशेष उस पृष्ठ पर हैं जहाँ इंसुलिन अणु द्विलकों और षट्लकों में जुड़ते हैं, और उन्हें बदलने से यह बदल जाता है कि अंतःक्षेपित भंडार कितनी तेज़ी से अवशोषणीय एकलकों में टूटता है। 19. $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}/16 \approx 3.6\times 10^{-4}$ : कोई ठीक-ठीक संयोगी मेल नहीं। 20. $1 + 60 + 1710 + 27\times 1140 = 32\,551$ अनुक्रम; $32\,551\times 3.6\times 10^{-4} \approx 12$ संयोगी लक्ष्येतर स्थल। 21. $10^{7}\times 10^{-4} = 1000$ कोशिकाएँ। कोई स्तंभ कोशिका रोगी के जीवन भर जीती और विभाजित होती है; जिसने कोई अर्बुद-दमनकारी खोया है, या कोई स्थानांतरण पाया है, वह ऐसा क्लोन बसा सकती है जो कोई श्वेतरक्तता बन जाए। 22. $p_{1} = 0.0019$ , $p_{2} = 0.0036$ , $p_{3} = 0.0069$ ; प्रति पीढ़ी $1.9$ की गुणोत्तर वृद्धि से $\ln 500/\ln 1.9 \approx 10$ मिलता है; पुनरावृत्ति-संबंध दोहराने पर बारंबारता $0.5$ पीढ़ी $11$ पर पार होती है ( $0.45 \to 0.68$ )। 23. लगभग एक वर्ष। समयुग्मजियों में $20\,\%$ लागत $c = 0.9$ से कम है, इसलिए चालक फिर भी स्थिरीकरण तक जाता है, और धीमे, जबकि समष्टि की माध्य अनुकूलता गिरती है — किसी दमन-चालक का यही प्रयोजन है; $c$ से अधिक लागत उसे किसी मध्यवर्ती बारंबारता पर रोक देती। 24. एक पीढ़ी में $10^{6}\times 0.1 = 10^{5}$ प्रतिरोध युग्मविकल्पी। वे कटने योग्य नहीं हैं और, यदि अनुकूल हों, तो चालक के महँगे होते हुए भी निर्लागत हैं, इसलिए उन्हें वरीयता मिलती है और वे फैल जाते हैं, और चालक समाप्त हो जाता है — इसीलिए चालक ऐसे स्थल लक्ष्य करते हैं जहाँ सिरा-संयोजन उत्पाद घातक हों, एक साथ कई मार्गदर्शकों के साथ। 25. पहले प्रतिदर्श में लगभग $3700$ प्रतियाँ; संसार भर के इंसुलिन के लिए वर्ष में कोई $260\,\mathrm{m}^{3}$ किण्वक; चालक के लिए लगभग $11$ पीढ़ियाँ, यानी मच्छर का एक वर्ष।

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