Biologie bovenbouw · Grades 10–12

11De verdubbeling van het DNA

Elke dag maakt je beenmerg tweehonderd miljard nieuwe rode bloedcellen, vervangt de bekleding van je darm zichzelf om de paar dagen, en krijgt elk van die nieuwe cellen een volledige kopie van de twee meter DNA die de vorige hoofdstukken als de tekst van de cel beschreven. Drie miljard letters overschrijven, zonder een voorbeeld om te raadplegen, in enkele uren, met minder fouten dan een beroepstypist er op één bladzijde maakt: hoe kan dat? Het antwoord werd in 1953 uit de bouw van het molecuul zelf geraden, en vijf jaar later bewezen door een van de elegantste proeven uit de biologie.

11.1 Het probleem van het kopiëren

Definitie 11.1 (Replicatie)

De DNA-replicatie is het proces waarmee een cel uit één dubbelstrengs DNA-molecuul twee moleculen maakt die aan dat molecuul en aan elkaar gelijk zijn, voordat zij zich deelt. Zij vindt plaats in een bepaalde periode van de celcyclus, de S-fase (Hoofdstuk 12), waarin de hoeveelheid DNA in de celkern verdubbelt.

Propositie 11.2 (Het matrijsbeginsel)

Doordat de twee strengen van een DNA-molecuul complementair zijn — A tegenover T, G tegenover C — draagt elke streng alle informatie die nodig is om de andere opnieuw op te bouwen. De replicatie verloopt dus door de twee strengen te scheiden en elk als matrijs te gebruiken waarop een nieuwe complementaire streng nucleotide voor nucleotide wordt opgebouwd.

Bewijs. Op dit niveau zonder bewijs aangenomen. ∎

Voorbeeld 11.3 (Drie denkbare uitkomsten)

Uit het matrijsbeginsel volgden in de jaren vijftig drie manieren waarop oude en nieuwe strengen verdeeld konden worden:

semiconservatief: elk dochtermolecuul behoudt één oude streng en krijgt er één nieuwe bij;
conservatief: het oorspronkelijke molecuul blijft heel en er wordt ernaast een volledig nieuwe dubbele streng gebouwd;
dispersief: oude en nieuwe stukken wisselen elkaar af langs elke streng van beide dochters.

De drie zijn niet met kijken uit elkaar te houden; met wegen wel.

11.2 De proef van Meselson en Stahl

Propositie 11.4 (De replicatie is semiconservatief)

Elk dochtermolecuul DNA bevat één streng van het oudermolecuul en één pas gemaakte streng.

Bewijsmateriaal. Meselson en Stahl (1958) kweekten bacteriën vele generaties lang in een medium waarvan de enige stikstof de zware isotoop $^{15}$ N was, zodat al hun DNA zwaar was. Zij brachten de bacteriën daarna over naar gewoon $^{14}$ N-medium en namen na elke generatie (om de twintig minuten) een monster van de kweek. Het DNA dat uit elk monster werd gewonnen, werd vele uren gecentrifugeerd in een dichte zoutoplossing, waar een molecuul op de hoogte blijft zweven die bij zijn eigen dichtheid past, en gefotografeerd onder ultraviolet licht: zwaar en licht DNA vormen banden op een meetbare afstand van elkaar. Uitkomsten: vóór de overgang één zware band; na één generatie één enkele band precies halverwege zwaar en licht — elk molecuul een mengvorm; na twee generaties twee even sterke banden, één mengvorm en één licht; na drie was de lichte band drie keer zo sterk als de mengvormband. Het conservatieve model voorspelt in generatie één een zware en een lichte band en nooit een mengvorm; het dispersieve model voorspelt één enkele band die elke generatie lichter opschuift en zich nooit in tweeën splitst. Alleen het semiconservatieve model geeft eerst één mengvormband en daarna mengvorm plus licht in de waargenomen verhoudingen. ∎

Het resultaat van Meselson en Stahl. Zwaar DNA vóór de overgang; één mengvormband na één generatie in licht medium; mengvorm en licht in gelijke hoeveelheden na twee; licht drie keer de mengvorm na drie. De dikte van een band staat voor de hoeveelheid DNA.

Een centrifugebuis onder ultraviolet licht: DNA-moleculen van twee dichtheden zijn naar twee hoogtes van de zoutgradiënt gezweefd en verschijnen als twee banden. Hun plaats meet hun dichtheid, hun helderheid hun hoeveelheid.

Voorbeeld 11.5 (De vierde generatie voorspellen)

Na $n$ generaties in licht medium zijn de twee oorspronkelijke zware strengen er nog altijd, elk in een van twee mengvormmoleculen; elk ander molecuul is volledig licht. Van de $2^n$ moleculen zijn er 2 mengvorm en $2^n - 2$ licht: bij generatie 4 zijn dat 2 mengvorm tegen 14 licht — een lichte band zeven keer de mengvormband, en de mengvormband verdwijnt nooit, hij vervaagt alleen. De twee oorspronkelijke strengen zijn in feite onsterfelijk.

11.3 De machinerie

Propositie 11.6 (Replicatievorken)

De replicatie begint op vaste plaatsen, de startpunten, waar de twee strengen tot een blaasje uit elkaar worden getrokken. Aan elke rand van het blaasje schuift een replicatievork vooruit: een enzym, het DNA-polymerase, beweegt langs elke geopende streng en voegt er één voor één de nucleotiden aan toe die daarmee complementair zijn, en rijgt die aaneen tot de nieuwe streng. De twee vorken van een blaasje reizen in tegengestelde richting tot zij de vorken van naburige blaasjes ontmoeten; het bacteriële chromosoom, één enkele ring, heeft één startpunt en twee vorken; een menselijk chromosoom heeft duizenden startpunten die tegelijk werken.

Bewijs. Op dit niveau zonder bewijs aangenomen. ∎

Een replicatievork. De ouderlijke strengen (blauw) gaan uiteen; op elk ervan bouwt een DNA-polymerase een nieuwe complementaire streng (rood). Achter de vork liggen twee dubbele strengen, elk met één oude en één nieuwe streng.

Voorbeeld 11.7 (Snelheid en schaal)

Een bacteriële vork voegt ongeveer 1000 nucleotiden per seconde toe, een menselijke ongeveer 50. Het chromosoom van E. coli, $4.6 \times 10^{6}$ basenparen, dat door twee vorken vanuit één startpunt wordt gekopieerd, kost $4.6 \times 10^{6}/(2 \times 1000) \approx 2300\,\mathrm{s}$ , zo’n 40 minuten — de duur van de celcyclus van de bacterie in een rijk medium. Een menselijke cel, met $6.4 \times 10^{9}$ basenparen te kopiëren in een S-fase van ongeveer 8 uur, heeft haar duizenden startpunten nodig: één enkele vork zou er ruim twee jaar over doen.

Replicatie van een lang chromosoom vanuit vele startpunten. Bij de startpunten gaan blaasjes open, elk met twee vorken die uit elkaar bewegen; zij groeien, ontmoeten elkaar en smelten samen, en laten twee volledige dubbele strengen achter, elk half oud (blauw) en half nieuw (rood).

Propositie 11.8 (Nauwkeurigheid)

Het DNA-polymerase koppelt ongeveer één keer op $10^5$ de verkeerde nucleotide; het controleert elke nucleotide zodra het haar toevoegt en verwijdert de meeste misparingen meteen, en andere enzymen verbeteren de meeste van de resterende vlak achter de vork. Het uiteindelijke foutenpercentage is ongeveer één op $10^9$ nucleotiden: een menselijke cel, die $6.4 \times 10^{9}$ nucleotiden kopieert, maakt gemiddeld een stuk of zes fouten per deling. Wat ontsnapt, zijn mutaties, het onderwerp van Hoofdstuk 13.

Bewijs. Op dit niveau zonder bewijs aangenomen. ∎

Methode 11.9 (Berekeningen over replicatie)

Tijd: de te kopiëren lengte (basenparen) gedeeld door de totale snelheid van alle werkende vorken (vorken $\times$ nucleotiden per seconde per vork).
Benodigde startpunten: de totale lengte gedeeld door wat één startpunt (twee vorken) in de beschikbare tijd kan kopiëren.
Fouten: gekopieerde nucleotiden $\times$ foutenpercentage; bedenk dat een cel beide strengen kopieert, dus twee keer het aantal basenparen.
Isotoopproeven: volg de twee oorspronkelijke strengen; na $n$ generaties zitten zij in 2 mengvormmoleculen op $2^n$ .

Opmerking 11.10 (Waarom de bouw en het mechanisme bij elkaar passen)

Watson en Crick besloten hun artikel uit 1953 met de opmerking dat de paring "onmiddellijk een mogelijk kopieermechanisme suggereert". Meselson en Stahl lieten zien dat het ook het werkelijke mechanisme was; de enzymologie die volgde liet zien hoe. Het is een van de zeldzame gevallen in de biologie waarin de vorm van een molecuul, eenmaal gezien, het proces dicteerde dat er gebruik van maakt.

11.4 Oefeningen

Oefening 11.1 ★

Geef het matrijsbeginsel en leg uit waarom het van de complementariteit afhangt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.1.

Elke streng dient als matrijs waarop een nieuwe complementaire streng wordt gebouwd. Dat werkt alleen doordat A met T en G met C paart: de volgorde van de ene streng legt die van de andere vast, dus draagt een streng alleen al de volledige informatie.

Oefening 11.2 ★

Definieer semiconservatieve replicatie en zet haar tegenover het conservatieve model.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.2.

Semiconservatief: elk dochtermolecuul behoudt één ouderlijke streng en krijgt er één nieuwe bij. Conservatief: het oudermolecuul blijft heel en er wordt ernaast een volledig nieuwe dubbele streng gebouwd.

Oefening 11.3 ★

In welke fase van de celcyclus vindt de replicatie plaats, en wat gebeurt er in die fase met de hoeveelheid DNA per celkern?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.3.

De S-fase van de celcyclus; de hoeveelheid DNA per celkern verdubbelt.

Oefening 11.4 ★

Wat doet het DNA-polymerase? Wat is een replicatievork?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.4.

Het DNA-polymerase voegt aan een groeiende streng één voor één de nucleotiden toe die complementair zijn met de matrijs. Een replicatievork is het bewegende punt waar de ouderlijke strengen worden gescheiden en de twee nieuwe strengen worden gebouwd.

Oefening 11.5 ★

Een streng luidt GATTACAGGC. Schrijf de nieuwe streng op die een polymerase erop bouwt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.5.

CTAATGTCCG, base onder base.

Oefening 11.6 ★★

Wat zou in de proef van Meselson en Stahl het conservatieve model bij generatie 1 voorspellen, en het dispersieve model bij generatie 2? Waarom faalt elk van beide?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.6.

Conservatief, generatie 1: een zware en een lichte band, geen mengvorm — maar er werd alleen een mengvormband gezien. Dispersief, generatie 2: één enkele band op een kwart van licht naar zwaar — maar er werden twee afzonderlijke banden gezien. Elk model voorspelt banden die niet zijn waargenomen.

Oefening 11.7 ★★

Voorspel de banden en hun onderlinge sterkte bij generatie 5.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.7.

$2^5 = 32$ moleculen, 2 mengvorm en 30 licht: een lichte band vijftien keer de mengvormband, geen zware band.

Oefening 11.8 ★★

Bacteriën die in licht medium zijn gekweekt, worden naar zwaar medium overgebracht. Beschrijf de banden bij de generaties 0, 1 en 2.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.8.

Generatie 0: één lichte band. Generatie 1: één mengvormband. Generatie 2: even sterke banden van mengvorm en zwaar — het spiegelbeeld van de oorspronkelijke proef.

Oefening 11.9 ★★

Bereken de tijd die één enkele menselijke vork van 50 nucleotiden per seconde nodig heeft om een chromosoom van $2.5 \times 10^{8}$ basenparen te kopiëren. Vergelijk met een S-fase van 8 uur en trek een conclusie.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.9.

$2.5 \times 10^{8}/50 = 5 \times 10^{6}\,\mathrm{s}$ , ongeveer 58 dagen — veel langer dan 8 uur. Het chromosoom moet vanuit vele startpunten tegelijk worden gekopieerd, die elk twee vorken openen.

Oefening 11.10 ★★

Hoeveel nucleotiden rijgt een menselijke cel tijdens één S-fase aaneen? Hoeveel fouten maakt zij daarbij, bij één fout per $10^9$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.10.

Beide strengen van $3.2 \times 10^{9}$ basenparen, dus twee keer: $6.4 \times 10^{9}$ basenparen, oftewel $6.4 \times 10^{9}$ nieuw aaneengeregen nucleotiden (één per gekopieerd basenpaar). Bij $10^{-9}$ per nucleotide zijn dat ongeveer 6 fouten.

Oefening 11.11 ★★

Waarom moeten de twee vorken van een blaasje in tegengestelde richting bewegen? Wat gebeurt er als twee naburige blaasjes elkaar ontmoeten?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.11.

Een blaasje openen legt aan beide kanten van het startpunt matrijs bloot; elke vork kopieert van het startpunt af, dus gaan de twee in tegengestelde richting en bestrijken zij samen het hele gebied. Ontmoeten twee blaasjes elkaar, dan versmelten hun vorken en worden de dochterstrengen aaneengekoppeld tot doorlopende moleculen.

Oefening 11.12 ★★★

Een chemische stof blokkeert het DNA-polymerase. Voorspel het effect ervan op een bacteriekweek, op een genezende wond en op een zenuwcel die zich niet meer deelt. Welk effect wijst op een toepassing in de geneeskunde?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.12.

De bacteriën houden op zich te delen (geen replicatie, geen deling). De wond geneest niet meer, want haar herstel vergt celdelingen. De zenuwcel merkt er niets van: zij verdubbelt haar DNA niet meer. Een middel dat snel delende cellen stillegt terwijl het niet-delende spaart, wijst op een behandeling tegen bacteriën of tegen delende kankercellen.

Oefening 11.13 ★★★

In de proef van Meselson en Stahl verdwijnt de mengvormband nooit. Leg dat uit, en bereken welk deel van de moleculen na 10 generaties mengvorm is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.13.

De twee oorspronkelijke strengen worden nooit vernietigd: bij elke generatie wordt elk opnieuw met een nieuwe lichte streng gepaard, zodat er altijd precies twee mengvormmoleculen bestaan. Na 10 generaties is dat $2/2^{10} = 2/1024 \approx 0.2\%$ — aanwezig maar te zwak om te zien.

Oefening 11.14 ★★★

Een polymerase zonder zijn controlefunctie maakt één fout op $10^5$ . Bereken de fouten per menselijke celdeling zonder controle, en leg uit waarom zo’n cellijn niet veel delingen zou overleven.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.14.

$6.4 \times 10^{9} \times 10^{-5} = 64\,000$ fouten per deling. Met twintigduizend genen zouden er bij elke deling honderden genen worden beschadigd; na enkele delingen zouden de cellen dodelijke gebreken dragen en zou de lijn uitsterven.

Oefening 11.15 ★★★

Leg uit waarom een bacterie in een rijk medium zich om de 20 minuten kan delen, terwijl het kopiëren van haar chromosoom 40 minuten kost. (Tip: denk na over wanneer de volgende kopieerronde kan beginnen.)

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.15.

Een nieuwe kopieerronde begint bij het startpunt voordat de vorige ronde is afgelopen: het chromosoom draagt dan verscheidene in elkaar geschoven paren vorken tegelijk. Elke deling krijgt dan een chromosoom dat al deels voor de volgende is gekopieerd, en delingen kunnen elkaar sneller opvolgen dan één kopieerronde duurt.

11.5 Probleem: Een molecuul wegen om het te zien kopiëren

Probleem 11.1

Weekendprobleem — de proef van Meselson en Stahl gereconstrueerd: de isotopen, de drie modellen en hun voorspellingen, de banden die de beslissing brachten, en de vorken die een chromosoom in veertig minuten kopiëren

Gewone stikstof is $^{14}$ N; de zware isotoop $^{15}$ N is per atoom 7% zwaarder. Stikstof vormt ongeveer 16% van de massa van DNA. Bacteriën die veertien generaties in $^{15}$ N-medium zijn gekweekt, worden op tijd nul naar $^{14}$ N-medium overgebracht en delen zich om de 20 minuten.

Deel I — Zwaar en licht.

Met welk deel is volledig zwaar DNA dichter dan licht DNA? (Neem aan dat de dichtheid met de massa meegaat.) Waarom is zo’n klein verschil genoeg om banden te scheiden?
Waarom werden de bacteriën vóór de overgang veertien generaties in zwaar medium gekweekt, en niet één of twee?
Een mengvormmolecuul heeft één zware en één lichte streng. Waar zweeft het ten opzichte van de zware en de lichte band?
Leg uit waarom het DNA uit een groot aantal bacteriën moet worden gewonnen om de banden zichtbaar te maken.
Hoe konden de onderzoekers er zeker van zijn dat de overgang naar licht medium het DNA van de bacteriën niet zelf veranderde?

Deel II — Drie voorspellingen. Geef voor elk model de banden (plaats en onderlinge hoeveelheid) die na één en na twee generaties worden verwacht.

Het semiconservatieve model.
Het conservatieve model.
Het dispersieve model.
Na één generatie verschijnt één enkele band halverwege zwaar en licht. Welk model valt onmiddellijk af, en welke twee blijven over?
Na twee generaties zijn er twee even sterke banden, mengvorm en licht. Welk model blijft overeind, en waarom faalt het andere?

Deel III — Strengen tellen.

Hoeveel DNA-moleculen stammen na $n$ generaties van één oorspronkelijk molecuul af, en hoeveel daarvan bevatten een oorspronkelijke zware streng?
Bereken de verhouding licht : mengvorm bij de generaties 3, 4 en 6.
Bij welke generatie zakt de mengvormband onder 5% van het DNA?
De onderzoekers verhitten het mengvorm-DNA om de twee strengen te scheiden en centrifugeerden de losse strengen. Voorspel de banden. Welk model toetst dit?
Leg uit hoe dezelfde proef in omgekeerde richting (licht naar zwaar) de conclusie zou bevestigen.

Deel IV — De vorken. Het bacteriële chromosoom is een ring van $4.6 \times 10^{6}$ basenparen met één startpunt; elke vork voegt 1000 nucleotiden per seconde toe.

Bereken de tijd die nodig is om het chromosoom met zijn twee vorken te kopiëren.
Hoelang zou het met slechts één vork duren? Waarom is één startpunt met twee vorken het minimum voor een ring?
Een menselijke cel kopieert $6.4 \times 10^{9}$ basenparen in 8 uur met vorken van 50 nucleotiden per seconde. Wat is het kleinste aantal startpunten dat moet aanslaan, als zij allemaal tegelijk beginnen?
Hoeveel fouten maakt de bacterie per replicatie bij één fout per $10^9$ nucleotiden, en hoeveel de menselijke cel? Waarom is het menselijke getal voor het organisme niet evenredig slechter?
Geef het resultaat: wat de banden bij twee generaties bewezen, en de tijd die de twee vorken nodig hebben om het bacteriële chromosoom te kopiëren — vergeleken met de generatietijd van de bacterie.

Oplossing

Oplossing van Probleem 11.1.

1. Stikstof vormt 16% van de massa en is 7% zwaarder: $0.16 \times 0.07 \approx 1.1\%$ . De gradiëntmethode scheidt dichtheden die een fractie van een procent verschillen, dus geeft 1% goed gescheiden banden.

2. Zodat vrijwel al het DNA zwaar was, en niet slechts de helft of drie kwart: na 14 generaties blijft er minder dan één deel op $10^4$ van de oorspronkelijke lichte strengen over.

3. Precies halverwege de twee banden: zijn dichtheid is het gemiddelde.

4. Eén bacterie bevat enkele femtogram DNA; de foto vraagt microgrammen, en dus miljarden cellen.

5. Door een kweek in zwaar medium als controle aan te houden en na te gaan of haar band zwaar bleef, en door de lichte band te controleren van bacteriën die steeds in licht medium waren gekweekt.

6. Semiconservatief: generatie 1, één mengvormband; generatie 2, even sterke banden van mengvorm en licht.

7. Conservatief: generatie 1, even sterke zware en lichte banden; generatie 2, één zwaar op drie licht.

8. Dispersief: generatie 1, één band op de mengvormplaats; generatie 2, één band op een kwart van licht naar zwaar.

9. Het conservatieve model, dat geen mengvormband voorspelde, valt af. Het semiconservatieve en het dispersieve voorspellen allebei die ene mengvormband en blijven over.

10. Het semiconservatieve blijft overeind: alleen dat voorspelt twee afzonderlijke banden. Het dispersieve model voorspelt één band die lichter opschuift en zich nooit splitst.

11. $2^n$ moleculen, waarvan er precies 2 een oorspronkelijke streng dragen.

12. Licht : mengvorm $= (2^n - 2) : 2$ : generatie 3, $3:1$ ; generatie 4, $7:1$ ; generatie 6, $31:1$ .

13. Het mengvormaandeel $2/2^n < 0.05$ zodra $2^n > 40$ : vanaf generatie 6 ( $2/64 \approx 3\%$ ).

14. Twee even grote banden, één zwaar en één licht: een mengvormmolecuul is één zware streng plus één lichte streng. Dit toetst het dispersieve model, dat voorspelt dat elke losse streng een tussenliggende dichtheid heeft, en verwerpt het onafhankelijk.

15. Beginnend bij licht geeft één generatie in zwaar medium één mengvormband en geven twee generaties mengvorm plus zwaar: hetzelfde patroon gespiegeld, wat laat zien dat het resultaat niet afhangt van welke isotoop "oud" is.

16. $4.6 \times 10^{6}/(2 \times 1000) = 2300\,\mathrm{s}$ , ongeveer 38 minuten.

17. 77 minuten. Op een ring liggen de twee strengen aan beide kanten van elke opening bloot; twee vorken die vanuit één startpunt in tegengestelde richting vertrekken, is de eenvoudigste manier om de hele ring te bestrijken.

18. Eén startpunt kopieert $2 \times 50 \times 8 \times 3600 = 2.88 \times 10^{6}$ basenparen in 8 uur; $6.4 \times 10^{9}/2.88 \times 10^{6} \approx 2200$ startpunten op zijn allerminst (in werkelijkheid tienduizenden, die op verschillende momenten aanslaan).

19. De bacterie: $9.2 \times 10^{6} \times 10^{-9} \approx 0.01$ fout per replicatie; de menselijke cel: ongeveer 6. Het grootste deel van het menselijke genoom bestaat niet uit genen, dus vallen de meeste fouten waar zij niets veranderen, en de cel heeft van elk gen twee kopieën.

20. De twee banden bij generatie twee — mengvorm en licht in gelijke hoeveelheden — bewezen dat de replicatie semiconservatief is; de twee vorken kopiëren het bacteriële chromosoom in ongeveer 38 minuten, ruwweg de generatietijd van de bacterie, zodat het kopiëren het tempo van de deling bepaalt.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Replicatie

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst