Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

23Ontwikkelingsgenetica en de evolutie van de vorm

Het ei van een fruitvlieg is een halve millimeter lang, en in de drie uur na de bevruchting, voordat er ook maar één celmembraan tussen zijn zesduizend kernen is gevormd, beslist het welk uiteinde de kop wordt en welk de staart, waar elk van de veertien segmenten komt te liggen, en welke ervan poten, vleugels of antennen zullen dragen. Het doet dat met enkele tientallen genen, die in een hiërarchie van steeds fijnere strepen worden aangezet, waarbij elke streep wordt afgelezen uit de concentraties van de producten van de strepen ervoor. In 1980 doorzochten twee jonge onderzoekers in Heidelberg duizenden gemuteerde vliegen op larven met ontbrekende of verdubbelde delen, en vonden de hele hiërarchie: genen wier verlies een blok segmenten wist, genen wier verlies elk tweede segment wist, genen wier verlies elk segment achterstevoren keert. Het werk van datzelfde jaar aan een gen dat het derde segment van een vlieg in een kopie van het tweede verandert — waarmee zij vier vleugels krijgt, zoals haar voorouders — opende een reeks meestergenen die, zo bleek, in dezelfde volgorde op de chromosomen van een muis en een mens liggen en hetzelfde werk doen. Dit hoofdstuk gaat over hoe een embryo zijn eigen meetkunde berekent, hoe een paar honderd regelgenen elk dierlijk lichaam bouwen, en hoe het veranderen van wanneer en waar zij werken de verscheidenheid van de dierlijke vorm heeft voortgebracht.

23.1 De coördinaten van de vlieg

Definitie 23.1 (De hiërarchie van de segmentatie)

Het embryo van Drosophila ontwikkelt zich gedurende zijn eerste dertien kerndelingen als een syncytiaal blastoderm, één enkele cel wier kernen één cytoplasma delen, zodat eiwitten vrij kunnen diffunderen vanaf de plaats waar zij worden gemaakt. Vier gradiënten die door de cellen van de moeder zijn aangelegd bepalen de assen: het mRNA van bicoid ligt vastgelegd aan de voorste pool en zijn eiwit diffundeert naar achteren tot een exponentiële gradiënt van kop naar staart; het mRNA van nanos aan de achterste pool maakt de spiegelgradiënt; de mRNA’s van hunchback en caudal zijn gelijkmatig verdeeld, maar het Bicoid-eiwit onderdrukt de translatie van caudal en Nanos onderdrukt hunchback, zodat ook hun eiwitten gradiënten vormen. Deze maternaal-effectproducten, wier mutante verschijningsvorm van het genotype van de moeder afhangt en niet van dat van het embryo, zetten de gapgenen (hunchback, Krüppel, knirps, giant) aan in brede banden, die elk op een bereik van Bicoid-concentraties antwoorden en hun buren onderdrukken; de gapeiwitten zetten, in combinatie, de paarregelgenen (even-skipped, fushi tarazu, hairy) aan in zeven strepen elk, om en om; en de paarregeleiwitten zetten de segmentpolariteitsgenen (engrailed, wingless, hedgehog) aan in veertien strepen, één per segment, die de voor- en achterkant van elk segment vastleggen en, nadat de cellen zijn gevormd, door signalen tussen die cellen in stand worden gehouden. Drie uur, vier lagen, van één gradiënt tot veertien segmenten — en de namen van de mutanten leggen de zoektocht vast: hunchback mist het borststuk, Krüppel (“kreupel”) het midden, fushi tarazu (“niet genoeg segmenten”) elk tweede segment, hedgehog heeft een grasveld van borstels.

De hiërarchie van de segmentatie. Een maternale gradiënt wordt gelezen als vier banden van gapgenen; de gapeiwitten, in combinatie, als zeven strepen van paarregelgenen; die weer als veertien strepen van segmentpolariteit. Elke streep is een grens, getrokken waar een concentratie een drempel passeert.

Stelling 23.2 (Een morfogeengradiënt uit aanmaak, diffusie en afbraak)

Een eiwit dat aan het ene uiteinde van een weefsel met snelheid $J$ (per oppervlakte-eenheid) wordt gemaakt, met coëfficiënt $D$ diffundeert en met snelheidsconstante $k$ wordt afgebroken, bereikt een stationaire toestand waarin zijn concentratie langs de as $x$ voldoet aan

D\,\frac{\mathrm{d}^{2}c}{\mathrm{d}x^{2}} - k\,c = 0, \qquad c(x) = c_{0}\,\mathrm{e}^{-x/\lambda}, \qquad \lambda = \sqrt{D/k}, \quad c_{0} = \frac{J}{\sqrt{Dk}} .

De vervallengte $\lambda$ bepaalt hoe ver de gradiënt reikt; een cel leest haar positie af door $c$ met drempels te vergelijken — de Franse vlag van Wolpert (1969): boven $T_{1}$ blauw, tussen $T_{1}$ en $T_{2}$ wit, eronder rood — en de grens voor drempel $T$ ligt bij $x_{T} = \lambda\ln(c_{0}/T)$ . Twee gevolgen: de bron verdubbelen verschuift elke grens met dezelfde $\lambda\ln 2$ naar achteren, en een relatieve fout $\delta c/c$ bij het aflezen van de concentratie is een positiefout $\delta x = \lambda\,\delta c/c$ , zodat een gradiënt een grens alleen tot op één cel nauwkeurig kan plaatsen als de cellen haar tot op enkele procenten aflezen. Bicoid heeft $\lambda \approx 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ in een ei van $500\,\text{µ}\mathrm{m}$ : de gradiënt overspant een factor $\mathrm{e}^{5} \approx 150$ , en de grens van hunchback ligt halverwege het ei, waar Bicoid tot ongeveer een twaalfde van zijn piek is gedaald.

Bewijs. Behoud in een schijf tussen $x$ en $x + \mathrm{d}x$ : de netto diffusieve instroom $D\,\partial^{2}c/\partial x^{2}$ is in de stationaire toestand in evenwicht met de afbraak $kc$ , wat de vergelijking geeft; de oplossing die begrensd blijft als $x \to \infty$ is de dalende e-macht met $\lambda^{2} = D/k$ . De bron: de diffusieve stroom bij $x = 0$ , $-D\, c'(0) = Dc_{0}/\lambda$ , is gelijk aan $J$ , dus $c_{0} = J\lambda/D = J/\sqrt{Dk}$ . Drempel: $c_{0}\mathrm{e}^{-x_{T}/\lambda} = T$ geeft $x_{T}$ ; $c_{0}$ verdubbelen telt $\lambda\ln 2$ bij elke $x_{T}$ op, ongeacht $T$ . Fout: differentiëren van $x_{T} = \lambda\ln(c_{0}/c)$ geeft $\delta x = -\lambda\,\delta c/c$ . De stationaire toestand wordt bereikt op de tijdschaal $1/k$ , die voor Bicoid ( $50\,\mathrm{min}$ ) vergelijkbaar is met de twee uur die beschikbaar zijn, zodat de gradiënt wordt afgelezen terwijl hij nog tot rust komt. ∎

De Franse vlag, getekend door een e-macht. Drempels op één gradiënt verdelen het ei in gebieden; een sterkere bron schuift alle grenzen met dezelfde afstand naar achteren, en dat is wat embryo’s van moeders met extra kopieën van bicoid laten zien. — De Franse vlag, getekend door een e-macht. Drempels op één gradiënt verdelen het ei in gebieden; een sterkere bron schuift alle grenzen met dezelfde afstand naar achteren, en dat is wat embryo’s van moeders met extra kopieën van *bicoid* laten zien.

Bewijsmateriaal. Nüsslein-Volhard en Wieschaus (1980) gaven vliegen een mutageen te eten, kweekten de nakomelingen tot homozygotie en bekeken onder de microscoop de cuticula van zo’n $27\,000$ dode larven op ontbrekend of herhaald patroon: ongeveer honderdtwintig genen, naar hun verschijningsvorm gesorteerd in de klassen van de gap-, de paarregel- en de segmentpolariteitsgenen — een hiërarchie die zichtbaar was voordat er ook maar één molecuul bekend was. Driever en Nüsslein-Volhard (1988) kleurden embryo’s voor het Bicoid-eiwit en zagen de exponentiële gradiënt vanaf de voorste pool; embryo’s van moeders met één, twee, vier of zes kopieën van het gen hadden gradiënten met een evenredige hoogte, en de kopplooi en de grens van hunchback verschoven met de dosis naar achteren, zoals het drempelmodel voorspelt en ruwweg met de $\lambda\ln 2$ per verdubbeling die het vereist. Het mRNA van bicoid in het midden van een ei spuiten leverde daar een kop op. ∎

Links: een syncytiaal embryo gekleurd voor het Bicoid-eiwit, het helderst aan de voorste pool en exponentieel wegdovend naar achteren. Rechts: een embryo een uur later, gekleurd voor een paarregeleiwit, zeven strepen getekend naar de banden van de gapgenen.

23.2 Identiteit: de Hox-genen

Definitie 23.3 (Homeotische genen en colineariteit)

Een homeotische mutatie verandert het ene lichaamsdeel in het andere: het woord van Bateson (1894) voor de afwijkingen die “het ene lid van een reeks door een ander vervangen”. Bij de vlieg laten dominante mutanten van Antennapedia poten groeien waar antennen horen; mutanten van bithorax (Lewis, 1978) veranderen het derde borstsegment in een kopie van het tweede, zodat de halters een tweede paar vleugels worden. De acht genen die daarvoor verantwoordelijk zijn, de Hox-genen, liggen in twee clusters op één chromosoom, en Lewis merkte op dat hun volgorde op het DNA overeenkomt met de volgorde langs het lichaam van de segmenten die zij besturen — de colineariteit, die nog altijd niet volledig is verklaard. Elk codeert een transcriptiefactor met hetzelfde DNA-bindende homeobox-domein van 60 aminozuren (McGinnis, Gehring, 1984), dat daarna in elk dier werd gevonden: muizen en mensen dragen vier clusters van elk dertien genen, op dezelfde wijze colineair, tot expressie gebracht in geneste gebieden langs de lichaamsas, waarbij de latere genen in het cluster verder naar achteren liggen. De identiteit van een cel langs de as wordt gegeven door de combinatie van Hox-genen die zij tot expressie brengt, de Hox-code; achterste genen overheersen voorste (achterste overwicht), zodat het verliezen van een achterste gen het segment de identiteit van het segment ervoor laat aannemen. Hox-genen bouwen geen segment; zij vertellen een reeds gebouwd segment welk segment het is, door de batterijen van stroomafwaartse genen aan te zetten die bij een poot, een vleugel, een rib of een lendenwervel horen.

Hox-clusters bij een vlieg en een muis. De genen liggen op het DNA in de volgorde van de lichaamsgebieden die zij vastleggen, bij beide dieren, en de homologe genen zijn aan hun sequentie te herkennen: het gen Hoxb6 van een muis is herkenbaar het Antennapedia van de vlieg. — Hox-clusters bij een vlieg en een muis. De genen liggen op het DNA in de volgorde van de lichaamsgebieden die zij vastleggen, bij beide dieren, en de homologe genen zijn aan hun sequentie te herkennen: het gen *Hoxb6* van een muis is herkenbaar het *Antennapedia* van de vlieg.

Bewijsmateriaal. Lewis (1978) bracht het bithorax-complex in kaart als een reeks mutaties die elk één segment in het segment ervoor veranderden, op het chromosoom in de volgorde van het lichaam gerangschikt, en stelde voor dat de genen langs de as achtereenvolgens werden geactiveerd. McGinnis en collega’s (1984) vonden de homeobox door kruishybridisatie tussen Antennapedia en Ultrabithorax en daarna in kikkers en muizen. De functionele gelijkwaardigheid werd rechtstreeks aangetoond: een gen Hoxb6 van een muis dat in een vlieg tot expressie wordt gebracht geeft de verschijningsvorm van Antennapedia, poten uit antennen (jaren 1990); een muis zonder Hoxc8 heeft een extra rib op haar eerste lendenwervel, omdat dat segment de identiteit van het segment ervoor heeft aangenomen; en het verschuiven van de expressiegrenzen van Hox bij kip en muis verplaatst de plek waar de voorpoten ontstaan, waarbij de lengte van de nek van een zwaan wordt geëvenaard door een verschuiving van dezelfde grens naar achteren. ∎

Links: de kop van een vlieg met de mutatie Antennapedia, een paar poten waar de antennen horen — het segment is correct gebouwd en heeft de verkeerde identiteit gekregen. Rechts: het skelet van een muizenembryo, kraakbeen blauw en bot rood, de wervels waarlangs de Hox-code wordt gelezen. — Links: de kop van een vlieg met de mutatie *Antennapedia*, een paar poten waar de antennen horen — het segment is correct gebouwd en heeft de verkeerde identiteit gekregen. Rechts: het skelet van een muizenembryo, kraakbeen blauw en bot rood, de wervels waarlangs de Hox-code wordt gelezen.

23.3 Een gewervelde bouwen

Definitie 23.4 (Organisatoren en signaalcentra)

Embryo’s van gewervelden bestaan vanaf het begin uit cellen, dus worden hun gradiënten gemaakt door uitgescheiden eiwitten in plaats van door diffusie in een syncytium, en dezelfde paar families doen alles: Wnt, Hedgehog, BMP en andere verwanten van TGF- $\beta$ , FGF, Notch en retinoïnezuur. Spemann en Mangold (1924) plaatsten een stukje van de rugzijdige lip van een gastrula van een watersalamander op de buik van een andere en verkregen een tweede embryo, van kop tot staart, grotendeels uit cellen van de gastheer: het transplantaat was een organisator, die zijn buren tot het vormen van een zenuwstelsel en een as aanzette, en zeventig jaar later bleken zijn moleculen uitgescheiden tegenspelers (Chordin, Noggin) te zijn die BMP blokkeren, wier afwezigheid het ectoderm neuraal laat worden — de standaardkeuze. De neurale buis wordt daarna van rug naar buik gepatroneerd door sonic hedgehog uit de chorda en de bodemplaat (veel: motorneuronen; weinig: interneuronen) tegen BMP van het dak; en de ledemaatknop door twee centra, de zone van polariserende activiteit aan de achterrand, die Shh uitscheidt (een transplantaat ervan naar de voorrand geeft een spiegelbeeldige verdubbeling van de vingers, zes vingers die duim tegen duim staan), en de apicale ectodermale lijst aan de top, die FGF’s uitscheidt die de cellen eronder aan het delen houden en de volgorde van opperarmbeen, onderarm en hand van binnen naar buiten vastleggen. Transplanteren, wegnemen en in eiwit gedrenkte bolletjes blijven het gereedschap; de logica — een plaatselijke bron, een gradiënt, drempels, een code van transcriptiefactoren — is die van de vlieg.

De twee signaalcentra van de ledemaatknop. Sonic hedgehog van de achterrand vertelt cellen welke vinger zij moeten worden; FGF van de top vertelt hun hoe ver naar buiten langs het ledemaat zij zitten. Transplantaten die een centrum verplaatsen verplaatsen het patroon mee.

Propositie 23.5 (Spontaan patroon: het mechanisme van Turing)

Niet elk patroon wordt uit een reeds bestaande gradiënt gelezen. Turing (1952) toonde aan dat twee diffunderende stoffen die reageren — een activator die zijn eigen aanmaak en die van een remmer prikkelt, en een remmer die de activator onderdrukt en veel sneller diffundeert — een gelijkmatig veld spontaan in een regelmatige reeks pieken kunnen veranderen: een kleine plaatselijke overmaat aan activator groeit door zelfversterking terwijl de remmer die hij voortbrengt zich uitspreidt en verhindert dat er vlakbij nieuwe pieken ontstaan, zodat de pieken verschijnen met een afstand die door het bereik van de remmer wordt bepaald, $\lambda \sim \sqrt{D_{\text{inh}}/k_{\text{inh}}}$ , en niet door een uitwendige coördinaat. Het mechanisme, waarvan de wiskunde hier wordt aangenomen, is de beste verklaring voor de vlekken en strepen van dierenvachten, de afstand tussen haarzakjes en verenknoppen, de richels van het verhemelte, de vingers van de hand (wier aantal stijgt wanneer de golflengte van het patroon wordt verkort door de Hox-activiteit te verlagen), en de strepen van de zebravis, waar de wisselwerkende cellen — pigmentcellen die buren van de ene soort afstoten en die van een andere op afstand aantrekken — zijn aangewezen en hun strepen zich na wegbranden met een laser precies zoals de theorie voorspelt opnieuw hebben gevormd.

Bewijs. Op dit niveau zonder bewijs aangenomen. ∎

23.4 De evolutie van de vorm

Definitie 23.6 (Evo-devo)

De genen die dieren bouwen vormen een oude en gedeelde gereedschapskist: een paar honderd transcriptiefactoren en signaalroutes die al in de gemeenschappelijke voorouder van alle dieren aanwezig waren, en de verscheidenheid van de dieren komt vooral voort uit veranderingen in wanneer, waar en hoeveel zij tot expressie komen en niet in wat zij coderen. Diepe homologie: het gen Pax6 stuurt de vorming van het oog bij vliegen, inktvissen en muizen, wier ogen als organen niet homoloog zijn — een Pax6 van een muis dat op de poot van een vlieg tot expressie komt maakt daar een extra vliegenoog (Halder, Gehring, 1995). Cis-regulatoire evolutie: het verlies van bekkenstekels bij stekelbaarzen in zoet water is de verwijdering van één versterker van het gen Pitx1, terwijl het eiwit onaangeroerd blijft en elders nog dienst doet; het verlies van vleugelvlekken bij sommige fruitvliegen is een verandering in een versterker van yellow; het verlies van poten bij slangen een kapotte versterker van sonic hedgehog in het ledemaat. Verschuivingen van Hox: de grens van de expressie van Hoxc6 markeert bij muis, kip, gans en slang gelijkelijk de eerste borstwervel, bij wervel 7, 14, 23 en 3; het verlies van poten op het achterlijf bij insecten was het Hox-eiwit Ubx dat een onderdrukkend domein verwierf dat het potengen Distal-less uitzet, terwijl het dat bij kreeftachtigen niet doet. Heterochronie, een verandering in de tijdsordening van een ontwikkelingsprogramma, maakte van de axolotl een blijvende larve en van het menselijke gezicht dat van een jonge mensaap. De oude vraag hoe nieuwe vormen ontstaan wordt een vraag over regelend DNA: het grootste deel van het genoom dat voor de vorm telt is geen gen maar schakelaar.

Voorbeeld 23.7 (Vier vleugels)

De voorouders van de vliegen hadden vier vleugels, zoals libellen en bijen nog altijd; vliegen hebben er twee, met het achterste paar teruggebracht tot de halters. Bij vliegen komt Ultrabithorax in het derde borstsegment tot expressie en onderdrukt daar het vleugelprogramma — een honderdtal doelgenen, waarbij een halter een vleugel is met die genen uitgezet. De drievoudige mutant van Lewis, die in het derde segment geen werkzaam Ubx heeft, laat een tweede paar vleugels groeien: geen nieuwe structuur maar het vrijkomen van een oude. Bij vlinders komt Ubx ook in de achtervleugel tot expressie, en daar onderdrukt het de vleugel niet maar verandert het haar patroon: hetzelfde eiwit, een andere verzameling doelwitten. Vierhonderd miljoen jaar evolutie van de tweevleugeligen hing af van de beslissing van één gen in één segment, en één mutatie draait haar in één generatie terug — en daarom is de geschiedenis van de vorm leesbaar in de genen die haar bouwen.

Opmerking 23.8 (Meetkunde uit chemie)

Een embryo heeft geen bouwtekening en geen landmeter. Het heeft een paar gradiënten die door diffusie en afbraak worden gemaakt, cellen die ze tegen drempels aflezen en transcriptiefactoren aanzetten, en een code van die factoren die elk gebied vertelt wat het moet worden; het heeft plaatselijke organisatoren die hun buren aanzetten, en reacties die zichzelf patroneren. De wiskunde is die van de eerste-ordekinetiek en de diffusie — een e-macht, een vierkantswortel, een drempel — en zij verklaart niet alleen hoe de kop van een vlieg wordt geplaatst, maar ook waarom een gen verdubbelen een grens over een vaste afstand verschuift, waarom er zes vingers verschijnen wanneer een signaal wordt verdubbeld, en waarom een slang driehonderd ribben heeft. De evolutie bewerkt de schakelaars, niet de machine: de gereedschapskist van een spons en die van een mens zijn vrijwel gelijk, en wat verschilt is de bedrading.

23.5 Opgaven

Oefening 23.1 ★

Noem de vier lagen van de segmentatiehiërarchie van de vlieg, van elk één gen, en de verschijningsvorm van de mutant die het in zijn klasse plaatste.

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.1.

Maternaal effect: bicoid, embryo’s van mutante moeders missen kop en borststuk. Gap: Krüppel, een aaneengesloten blok segmenten ontbreekt. Paarregel: fushi tarazu (of even-skipped), elk tweede segment ontbreekt. Segmentpolariteit: hedgehog (of engrailed), waarbij een deel van elk segment is vervangen door een spiegelbeeld van de rest.

Oefening 23.2 ★

Wat is een maternaal-effectgen? Een vrouwtje dat homozygoot is voor een nulmutatie van bicoid wordt met een wildtype mannetje gepaard: beschrijf haar embryo’s en leg uit waarom hun eigen genotype hen niet redt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.2.

Een gen waarvan het product door de moeder in het ei wordt gelegd, zodat de verschijningsvorm van het embryo haar genotype volgt. Haar embryo’s missen kop en borststuk en dragen aan beide uiteinden achterste structuren; zij sterven. Het wildtype-allel van de vader zit in de zygote, maar het mRNA van bicoid wordt tijdens de eicelvorming door de voedstercellen van de moeder gemaakt en vóór de bevruchting aan de pool verankerd; de eigen kopie van de zygote zou uren later worden afgeschreven, wanneer de tijd van de gradiënt voorbij is.

Oefening 23.3 ★

Formuleer de colineariteit en het achterste overwicht. Voorspel de verschijningsvorm van een muis zonder Hoxc8 en van een vlieg die Antennapedia in haar kop tot expressie brengt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.3.

Colineariteit: de volgorde van de Hox-genen op het chromosoom komt overeen met de volgorde van hun expressiegebieden langs het lichaam. Achterste overwicht: waar er meerdere tot expressie komen, bepaalt het achterste de identiteit. Een muis zonder Hoxc8 vertoont een transformatie naar voren — haar eerste lendenwervel neemt de identiteit van een borstwervel aan en draagt een rib. Antennapedia in de kop maakt van antennen poten, de identiteit van het tweede borstsegment.

Oefening 23.4 ★

Wat toonde het transplantaat van Spemann en Mangold aan, en welke moleculen bleken die van de organisator te zijn? Waarom heet het neurale lot de “standaardkeuze”?

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.4.

Een getransplanteerde rugzijdige lip wekte een tweede volledige as op, grotendeels uit cellen van de gastheer: het transplantaat gaf zijn buren instructies — een organisator. Zijn moleculen zijn uitgescheiden tegenspelers van BMP (Chordin, Noggin, Follistatine). Ectoderm wordt neuraal wanneer het BMP-signaal ontbreekt en opperhuid wanneer BMP aanwezig is, dus is neuraal wat ectoderm doet wanneer het niets te horen krijgt: de organisator werkt door een instructie het zwijgen op te leggen.

Oefening 23.5 ★★

Bicoid: $D = 4\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , halveringstijd $35\,\mathrm{min}$ . Bereken $k$ , $\lambda$ , en de verhouding van de concentraties aan de voorste pool en halverwege het ei ( $250\,\text{µ}\mathrm{m}$ ).

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.5.

$k = \ln 2/(35\times 60) = 3.3 \times 10^{-4}\,\mathrm{s}^{-1}$ ; $\lambda = \sqrt{4/ 3.3\times 10^{-4}} = 110\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; verhouding $\mathrm{e}^{250/110} = \mathrm{e}^{2.27} = 9.7$ .

Oefening 23.6 ★★

Met $\lambda = 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ligt een grens op $240\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Waar ligt zij als de moeder vier kopieën van bicoid draagt in plaats van twee? En bij één kopie? Druk de verschuivingen uit als fractie van een ei van $500\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.6.

Vier kopieën verdubbelen $c_{0}$ : de grens verschuift met $\lambda\ln 2 = 69\,\text{µ}\mathrm{m}$ naar achteren, tot $309\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; één kopie halveert haar: $69\,\text{µ}\mathrm{m}$ naar voren, tot $171\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Elke verschuiving is $14\,\%$ van de eilengte — meer dan wordt waargenomen, wat zelf een aanwijzing is voor mechanismen die de afhankelijkheid van de dosis dempen.

Oefening 23.7 ★★

Kernen liggen in het blastoderm $8\,\text{µ}\mathrm{m}$ uiteen. Hoe nauwkeurig moet een kern de Bicoid-concentratie aflezen om met $\lambda = 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ een grens tot op één kern te plaatsen? Als de kern gedurende een tijd $\tau$ moleculen telt en de telling Poisson-verdeeld is, hoeveel moet zij er dan tellen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.7.

$\delta x = \lambda\,\delta c/c$ : voor $8\,\text{µ}\mathrm{m}$ is $\delta c/c = 8/100 = 8\,\%$ . Een Poisson-telling $N$ heeft relatieve fout $1/\sqrt{N}$ , dus moeten er $N = 1/0.08^{2} \approx 160$ moleculen worden geteld — enkele procenten van de moleculen die in een kern aanwezig zijn, of één telling die over de tijd wordt opgeteld.

Oefening 23.8 ★★

De gradiënt nadert de stationaire toestand op de tijdschaal $1/k$ . Welk deel van de stationaire concentratie is bij een halveringstijd van $35\,\mathrm{min}$ bereikt na $60\,\mathrm{min}$ , $90\,\mathrm{min}$ en $120\,\mathrm{min}$ ? Wat betekent dat voor een embryo dat de gradiënt vóór $150\,\mathrm{min}$ moet aflezen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.8.

$k = \ln 2/35 = 0.0198\,\mathrm{min}^{-1}$ : $1 - \mathrm{e}^{-kt}$ geeft $0.70$ na $60\,\mathrm{min}$ , $0.83$ na $90\,\mathrm{min}$ , $0.91$ na $120\,\mathrm{min}$ en $0.95$ na $150\,\mathrm{min}$ . De gradiënt stijgt terwijl hij wordt afgelezen nog met enkele procenten, wat een grens over het afleesvenster met $\lambda\ln(1/0.9) \approx 10\,\text{µ}\mathrm{m}$ zou verschuiven, ongeveer één kern: het embryo moet ofwel op een vast tijdstip aflezen ofwel een aflezing gebruiken die ongevoelig is voor het algemene niveau.

Oefening 23.9 ★★

Er wordt een ZPA op de voorrand van een ledemaatknop van een kip geplaatst. Voorspel het vingerpatroon, en het patroon als er in plaats daarvan een bolletje wordt ingebracht dat een lage dosis Shh afgeeft.

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.9.

Een tweede ZPA geeft een spiegelbeeldige verdubbeling, 4-3-2-2-3-4: de voorste cellen zien nu veel Shh en worden achterste vingers. Een bolletje dat weinig Shh afgeeft geeft een gedeeltelijke verdubbeling — een extra vinger 2 vooraan, zeg 2-2-3-4 — omdat de voorste cellen alleen de lage concentratie zien die vinger 2 vastlegt.

Oefening 23.10 ★★★

Een morfogeen wordt in een weefsel van lengte $L$ overal met snelheid $s$ per volume-eenheid gemaakt, met snelheid $k$ afgebroken, en aan de rand $x = L$ vernietigd (een absorberende put), zonder stroom bij $x = 0$ . Los $Dc'' - kc + s = 0$ op voor $c(x)$ en schets het resultaat. Waarin verschilt de vorm van deze gradiënt van die met een bron aan één uiteinde, en wat gebeurt er als $L \ll \lambda$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.10.

Bijzondere oplossing $s/k$ ; homogene oplossingen $\cosh(x/\lambda)$ , $\sinh(x/\lambda)$ ; geen stroom bij $0$ doodt de $\sinh$ ; $c(L) = 0$ legt de amplitude vast: $c(x) = (s/k)\bigl[1 - \cosh(x/\lambda)/\cosh(L/\lambda)\bigr]$ . Het profiel is een plateau nabij $x = 0$ dat in een grenslaag ter breedte $\lambda$ bij de put tot nul daalt — geen e-macht vanuit een punt, maar een vlak veld met een rand; de hoogste concentratie ligt het verst van de put. Voor $L \ll \lambda$ geldt $\cosh u \approx 1 + u^{2}/2$ en $c \approx s(L^{2} - x^{2})/(2D)$ : een parabool die niet van $k$ afhangt, omdat de moleculen de put bereiken voordat zij kunnen vervallen.

Oefening 23.11 ★★★

Twee drempels bij $T_{1} = 0.3c_{0}$ en $T_{2} = 0.08c_{0}$ verdelen een gradiënt in drie gebieden. Toon aan dat de breedten van de eerste twee gebieden niet van $c_{0}$ afhangen, en leg uit waarom een embryo wiens lengte van individu tot individu varieert ( $450\,$ tot $550\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) meer nodig heeft dan één e-macht om zijn patroon mee te schalen. Stel één mechanisme voor.

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.11.

$x_{1} = \lambda\ln(1/0.3) = 1.20\lambda$ en $x_{2} = \lambda\ln(1/0.08) = 2.53\lambda$ : het eerste gebied is $1.20\lambda$ breed, het tweede $1.32\lambda$ , beide onafhankelijk van $c_{0}$ , dat ze samen verschuift. Het derde gebied, $L - 2.53\lambda$ , vangt alle variatie in de eilengte op: in een ei van $450\,\text{µ}\mathrm{m}$ met $\lambda = 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ is het achterlijf $197\,\text{µ}\mathrm{m}$ , in een ei van $550\,\text{µ}\mathrm{m}$ $297\,\text{µ}\mathrm{m}$ — het patroon schaalt niet mee. Mechanismen: een tweede gradiënt vanaf de achterste pool (Nanos, Caudal, of het terminale systeem) die samen met Bicoid wordt gelezen, zodat de posities door de verhouding worden vastgelegd; of een “uitrekker” die wordt gemaakt waar het morfogeen laag is en $\lambda$ verlengt tot de gradiënt het ei vult.

Oefening 23.12 ★★★

Stekelbaarzen verloren hun bekkenstekels door een versterker van Pitx1 te verwijderen, slangen verloren hun ledematen door een versterker van sonic hedgehog te breken. Leg uit waarom veranderingen in de regeling en niet in de codering de gebruikelijke weg zijn naar een verloren of veranderde structuur, in termen van pleiotropie en van wat hetzelfde eiwit elders doet.

Oplossing

Oplossing van Oefening 23.12.

Een verandering in de codering verandert het eiwit overal waar het werkt: Pitx1 bouwt ook de hypofyse en de kaak, sonic hedgehog patroneert ook de neurale buis, de darm en de tanden, dus is een kapot eiwit dodelijk of pleiotroop verlammend. Een versterker stuurt de expressie in één weefsel op één tijdstip; hem verwijderen haalt de structuur weg die dat weefsel zou hebben gebouwd en laat elk ander gebruik van het eiwit ongemoeid. Versterkers zijn modulair en vaak ten dele overtollig, zodat tussenstappen leefbaar zijn, en dezelfde weg — een verloren schakelaar — is in vele stekelbaarsmeren onafhankelijk ingeslagen.

23.6 Vraagstuk: de Franse vlag

Probleem 23.1

Weekendvraagstuk — het coördinatenstelsel van een ei berekend uit eerste-ordekinetiek: de lengte van de Bicoid-gradiënt, zijn bron en de tijd om te ontstaan, de grenzen die hij trekt en hun nauwkeurigheid, wat de gendosis en de eigrootte ermee doen, en de Hox-code die stroomafwaarts wordt gelezen, eindigend bij de vervallengte, de verschuiving per verdubbeling en de nauwkeurigheid van de positie

Gegevens: eilengte $500\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; Bicoid $D = 4\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , halveringstijd $35\,\mathrm{min}$ ; een bronstroom zo dat $c_{0} = 50\,\mathrm{nM}$ bij twee maternale kopieën; afstand tussen de kernen $8.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ in cyclus 14; drempels $T_{1} = 0.3\,c_{0}$ (kop/borststuk) en $T_{2} = 0.08\,c_{0}$ (grens van hunchback) voor het geval met twee kopieën. Afleesruis $\delta c/c = 0.1$ voor één kern. Het getal van Avogadro $6 \times 10^{23}\,$ ; een kern is een bol met straal $3\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Deel I — De gradiënt.

Bereken $k$ uit de halveringstijd, in $\mathrm{s}^{-1}$ , en de levensduur $1/k$ in minuten.
Bereken $\lambda = \sqrt{D/k}$ in micrometer. Hoeveel vervallengten is het ei?
Met welke factor daalt de concentratie van pool tot pool? Met welke factor over één kernafstand halverwege het ei?
Bereken de bronstroom $J = c_{0}\sqrt{Dk}$ in $\mathrm{nM}\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}^{-1}$ , en het aantal moleculen dat per seconde een vlakje van $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ van de voorste pool binnenkomt.
Het aantal Bicoid-moleculen in een kern aan de pool ( $c_{0}$ ) en halverwege het ei.
Het deel van de stationaire toestand dat is bereikt na $60\,\mathrm{min}$ en $120\,\mathrm{min}$ ( $1 - \mathrm{e}^{-kt}$ ). Is de gradiënt stationair wanneer de grenzen worden getrokken, na ongeveer $120\,\mathrm{min}$ ?

Deel II — Grenzen.

De posities van de twee grenzen, in $\text{µ}\mathrm{m}$ en als fracties van de eilengte.
De moeder heeft vier kopieën: nieuwe $c_{0}$ , en de twee posities. Met hoeveel is elke grens verschoven? Bij zes kopieën?
Eén kopie: de posities. Welke gebieden groeiden, welke krompen?
De positiefout bij een afleesruis van $10\,\%$ , in micrometer en in kernafstanden.
Als de fout één kern moet zijn, welke afleesnauwkeurigheid is er dan nodig? Als de kern over $n$ onafhankelijke aflezingen middelt en de ruis als $1/\sqrt{n}$ daalt, hoeveel aflezingen?
Een kern op de grens van hunchback bevat het aantal dat in vraag 5 is berekend. Wat is de Poisson-ruis $1/\sqrt{N}$ van één ogenblikkelijke telling? Vergelijk met $10\,\%$ en geef commentaar.

Deel III — Schaling en robuustheid.

Eieren lopen uiteen van $450\,$ tot $550\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Waar valt de grens van hunchback bij een vaste $\lambda$ en $c_{0}$ als fractie van de eilengte? Is het patroon geschaald?
Stel dat $D$ in plaats daarvan met $L^{2}$ schaalt (dezelfde levensduur, maar een bron wier verspreiding met het ei meegroeit). Toon aan dat $\lambda/L$ dan constant is en het patroon meeschaalt. Is dat aannemelijk?
Het gen hunchback antwoordt op Bicoid met een Hill-coëfficiënt van $5$ : zijn expressie is $c^{5}/(c^{5} + T^{5})$ . Over hoeveel micrometer gaat de expressie rond de grens van $10\,\%$ naar $90\,\%$ ? Vergelijk met één kernafstand.
Leg uit waarom een steil antwoord een grens scherper maakt maar op zichzelf de positiefout door concentratieruis niet verkleint.
Wederzijdse onderdrukking tussen gapgenen maakt hun grenzen scherper en stabieler. Beredeneer in één zin waarom twee genen die elkaar onderdrukken in de stationaire toestand niet allebei in dezelfde kern aan kunnen staan.
Temperatuur verhoogt $D$ met $2\,\%$ en $k$ met $6\,\%$ per graad. De verandering van $\lambda$ per graad, en de verschuiving van de grens in een kamer die $5\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ warmer is. Waarom zouden embryo’s een compenserend mechanisme nodig hebben?

Deel IV — Identiteit.

De Hox-code: hoeveel codes zijn er mogelijk met acht Hox-genen van de vlieg die elk aan of uit staan? Hoeveel worden er gebruikt (veertien segmenten)? Waarom verkleint het achterste overwicht het effectieve aantal?
Een vlieg mist Ubx in haar derde borstsegment. Wat wordt dat segment, en waarom is het resultaat vier vleugels en geen nieuwe structuur?
De grens van Hoxc6 van een muis ligt bij wervel 7, die van een gans bij 23. Wat voorspelt dat over hun nekken, en wat is er in de evolutie veranderd: het gen of zijn expressie?
Een transplantaat van een ZPA geeft de vingers 4-3-2-2-3-4. Verklaar het patroon uit twee Shh-gradiënten die elkaar in het midden ontmoeten.
Halder en Gehring brachten Pax6 van een muis in de poot van een vlieg tot expressie en verkregen daar een vliegenoog. Wat toont dat over het gen, en wat toont het niet over de ogen van vliegen en muizen?
De zesde vinger: het verkorten van de golflengte van Turing voegt een vinger toe. Welke verandering van de golflengte geeft er zes bij vijf vingers over een handplaat van $2\,\mathrm{mm}$ ? Welke parameter van het reactie–diffusiesysteem zou die voortbrengen?
Vat samen: $\lambda$ (vraag 2), de verschuiving van de grens per verdubbeling van de bron (vraag 8), en de positiefout bij een ruis van $10\,\%$ (vraag 10).

Oplossing

Oplossing van Probleem 23.1.

1. $k = \ln 2/(35\times 60) = 3.3 \times 10^{-4}\,\mathrm{s}^{-1}$ ; $1/k = 3030\,\mathrm{s} = 50\,\mathrm{min}$ . 2. $\lambda = \sqrt{4/3.3\times 10^{-4}} = 110\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; het ei is $4.5\lambda$ . 3. $\mathrm{e}^{4.5} \approx 90$ van pool tot pool; $\mathrm{e}^{8.5/110} = 1.08$ , een verandering van $8\,\%$ per kern. 4. $J = 50\times\sqrt{4\times 3.3\times 10^{-4}} = 50\times 0.036 = 1.8\,\mathrm{nM}\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Eén nM is $0.6$ moleculen per $\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , dus ongeveer $1.1$ moleculen per $\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ per seconde. 5. Kernvolume $\tfrac{4}{3}\pi\times 27 = 113\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ . Bij $50\,\mathrm{nM}$ zijn dat $30$ moleculen per $\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ : $3400$ moleculen. Halverwege het ei is $c = 50\,\mathrm{e}^{-2.27} = 5.2\,\mathrm{nM}$ : ongeveer $350$ moleculen. 6. $kt = 1.19$ na $60\,\mathrm{min}$ : $0.70$ ; $kt = 2.38$ na $120\,\mathrm{min}$ : $0.91$ . De gradiënt zit bij het aflezen op $10\,\%$ van de stationaire waarde — nog altijd stijgend met een bedrag dat een grens met $\lambda\ln(1/0.91) \approx 10\,\text{µ}\mathrm{m}$ zou verplaatsen, één kern. 7. $x_{1} = 110\ln(1/0.3) = 132\,\text{µ}\mathrm{m}$ ( $26\,\%$ ); $x_{2} = 110\ln(1/0.08) = 278\,\text{µ}\mathrm{m}$ ( $56\,\%$ ). 8. Vier kopieën: $c_{0} = 100\,\mathrm{nM}$ ; beide grenzen verschuiven met $\lambda\ln 2 = 76\,\text{µ}\mathrm{m}$ naar achteren, tot $208$ en $354\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Zes kopieën: $\lambda\ln 3 = 121\,\text{µ}\mathrm{m}$ , tot $253$ en $399\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 9. Eén kopie: $76\,\text{µ}\mathrm{m}$ naar voren, tot $56$ en $202\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Het kopgebied kromp van $132$ tot $56\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; het borststuk behield zijn breedte ( $146\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) en schoof naar voren; het achterlijf groeide van $222$ tot $298\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 10. $\delta x = 110\times 0.1 = 11\,\text{µ}\mathrm{m}$ , $1.3$ kernafstanden. 11. Eén kern: $\delta c/c = 8.5/110 = 7.7\,\%$ . Vanaf $10\,\%$ is $n = (10/7.7)^{2} \approx 1.7$ : twee onafhankelijke aflezingen (of het gemiddelde van twee naburige kernen) volstaan. 12. $1/\sqrt{350} = 5.3\,\%$ : één ogenblikkelijke telling is al nauwkeuriger dan de aangenomen $10\,\%$ , dus komt de waargenomen ruis niet alleen van het tellen maar ook van de bindingskinetiek en de afleesmachinerie — en middelen over de tijd verbetert haar nog. 13. $278/450 = 62\,\%$ en $278/550 = 51\,\%$ van de eilengte: een verschil van $11\,\%$ , zes kernen. Het patroon schaalt niet mee bij een vaste $\lambda$ . 14. Als $D \propto L^{2}$ bij een vaste $k$ , dan is $\lambda \propto L$ en is $x_{T}/L = (\lambda/L)\ln(c_{0}/T)$ in elk ei hetzelfde: volmaakte schaling. Maar $D$ is een eigenschap van het molecuul en het cytoplasma, niet van de grootte van het ei, dus is dit zoals gesteld onaannemelijk; de schaling in echte embryo’s is gedeeltelijk en komt van andere aflezingen. 15. $c^{5}/(c^{5} + T^{5}) = 0.1$ bij $c/T = 9^{-1/5} = 0.64$ en $0.9$ bij $c/T = 9^{1/5} = 1.55$ : een factor $2.4$ in concentratie, $\Delta x = 110\ln 2.4 = 97\,\text{µ}\mathrm{m}$ — elf kernen, veel breder dan de waargenomen grens van twee of drie; het aflezen van de gradiënt alleen is niet scherp genoeg. 16. Steilheid zet een gegeven concentratie beslissender om in aan of uit, zodat het overgangsgebied smaller is; maar een fout van $10\,\%$ in de concentratie verplaatst het punt waar de drempel wordt overschreden nog altijd met $\lambda\,\delta c/c$ : het antwoord kan een volmaakte stap zijn en die stap toch op de verkeerde plek landen. 17. Stonden beide aan, dan zou elk het andere onderdrukken, zodat er ten minste één zou worden uitgezet; bij coöperatieve onderdrukking zijn de enige stabiele toestanden één aan en één uit, en is een grens ertussen een schakelaar en geen helling. 18. $\mathrm{d}\ln\lambda = \tfrac{1}{2}(0.02 - 0.06) = -0.02$ per graad: $\lambda$ daalt $2\,\%$ per graad, $10\,\%$ bij $5\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , tot $99\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; de grens van hunchback verschuift van $278$ naar $250\,\text{µ}\mathrm{m}$ , drie kernen naar voren. Vliegen ontwikkelen zich tussen $18\,$ en $29\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ met normale verhoudingen, dus compenseert er iets — een bron of een aflezing die met de temperatuur de andere kant op schuift. 19. $2^{8} = 256$ codes; er worden er veertien gebruikt. Bij achterste overwicht telt alleen het achterste gen dat aan staat, dus zijn er hoogstens negen verschillende identiteiten (acht genen, of geen): de code is een rangorde, geen binair woord. 20. Het derde borstsegment wordt een tweede: Ubx onderdrukte het vleugelprogramma dat een borstsegment standaard uitvoert, en de repressor weghalen maakt de voorouderlijke toestand vrij — vier vleugels, zoals bij de viervleugelige voorouders van de vlieg. 21. Het halsgebied van de gans loopt tot wervel 22: een lange nek van vele wervels, tegen zeven bij de muis. Het gen is hetzelfde; de voorste grens van zijn expressie is naar achteren verschoven — een verandering in de regeling van waar een Hox-gen wordt aangezet. 22. Elke rand is nu een bron; Shh is aan beide randen het hoogst (vinger 4), daalt naar het midden (3, dan 2) en bereikt nooit het lage niveau dat vinger 1 vastlegt, zodat het midden twee vingers 2 rug aan rug bevat: 4-3-2-2-3-4. 23. Pax6 is een geconserveerde meesterregelaar die welk oogprogramma de gastheer ook draagt in gang kan zetten: de vlieg bouwde een vliegenoog, dus draagt het muizengen geen informatie over een muizenoog, alleen het bevel “bouw hier een oog”. Het toont de diepe homologie van het gennetwerk, niet de homologie van de organen: het samengestelde oog en het cameraoog zijn afzonderlijk ontstaan uit een voorouder met een plek fotoreceptoren onder Pax6. 24. Vijf vingers over $2\,\mathrm{mm}$ is een golflengte van $0.4\,\mathrm{mm}$ ; zes vergt $0.33\,\mathrm{mm}$ , een verkorting met een zesde. Omdat $\lambda \propto \sqrt{D_{\text{inh}}/k_{\text{inh}}}$ , verhoog het verval van de remmer met $44\,\%$ of verlaag zijn diffusie met $31\,\%$ ; in de handplaat lukt dat door de dosis van de achterste Hox-genen te verlagen, en de mutante muizen hebben zes, zeven of meer dunne vingers. 25. $\lambda \approx 110\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; een verdubbeling van de bron verschuift elke grens met $76\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; een ruis van $10\,\%$ in de concentratie is $11\,\text{µ}\mathrm{m}$ positiefout, ongeveer één kern.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst