Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

24Stamcellen, regeneratie en veroudering

Snijd een axolotl een poot af en binnen twee maanden heeft hij een nieuwe laten groeien, met bot, spier, zenuw en huid op de juiste plaatsen, en hij doet het telkens opnieuw, hoe vaak er ook wordt gesneden. Snijd een planarie in twintig stukken en elk wordt binnen veertien dagen een hele worm, waarbij het stuk dat een staart was een kop met ogen en een brein laat teruggroeien. Snijd een mens een vinger af boven het laatste kootje en die geneest als een litteken. Toch is het menselijke lichaam niet zonder vernieuwing: elke seconde maakt het twee miljoen rode bloedcellen, de bekleding van de darm wordt om de vijf dagen vervangen en de huid elke maand, en dat alles stamt af van kleine groepen cellen die zich een leven lang delen zonder zichzelf uit te putten. Dit hoofdstuk gaat over die cellen — wat een stamcel tot stamcel maakt, hoe haar nis haar zo houdt, hoe de hele hiërarchie van bloed of darm eruit wordt opgebouwd — over de dieren die kunnen laten teruggroeien wat de mens niet kan en waarom, over de ontdekking dat elke cel met vier genen naar de embryonale toestand kan worden teruggeduwd, en over wat de rekenkunde van de celdeling te zeggen heeft over waarom de mens veroudert.

24.1 Wat een stamcel is

Definitie 24.1 (Stamcellen en hun hiërarchie)

Een stamcel heeft twee kenmerkende eigenschappen: zij kan zichzelf vernieuwen en dochters voortbrengen die stamcel zijn, en zij kan dochters voortbrengen die differentiëren. Zij kan beide tegelijk doen, door een asymmetrische deling met van elke soort één dochter, waarbij het lot wordt bepaald door een ongelijke overerving van determinanten of door welke dochter in contact blijft met de nis — de omgeving van naburige cellen, matrix en signalen die een cel stamcel houdt; of zij kan symmetrisch delen, waarbij sommige delingen twee stamcellen en andere twee differentiërende cellen opleveren, met een populatie die gemiddeld constant blijft. De differentiërende dochters doorlopen gewoonlijk stadia van voorlopercel of doorgangsversterking, waarin zij nog enkele malen delen met een steeds nauwere potentie voordat zij rijpen: de hiërarchie versterkt enkele trage delingen van stamcellen tot een grote opbrengst, en beperkt het aantal delingen dat een stamcel moet maken. Stamcellen van de volwassene zijn zeldzaam en traag — een bloedvormende stamcel deelt misschien eens per jaar, een stamcel van de darm eens per dag — en multipotent, beperkt tot de lijnen van hun eigen weefsel; embryonale stamcellen, uit de binnenste celmassa van de blastocyste, zijn pluripotent en kunnen elk weefsel van het lichaam maken maar niet de placenta.

De hiërarchie van de bloedvorming. Enkele duizenden trage stamcellen in het merg voeden voorlopercellen die snel delen en zich stap voor stap vastleggen, zodat de opbrengst van een biljoen cellen per dag de stamcellen bijna niets kost.

Bewijsmateriaal. Till en McCulloch (1961) spoten mergcellen in dodelijk bestraalde muizen en telden de knobbeltjes die tien dagen later op de milt verschenen: elk was een kolonie bloedcellen van verscheidene lijnen, hun aantal evenredig met het aantal ingespoten cellen, en het merken van de chromosomen van de donorcellen toonde dat elke kolonie een kloon was — één cel had rode cellen, granulocyten en bloedplaatjes gemaakt, en sommige kolonies bevatten cellen die in een tweede muis nieuwe kolonies konden zaaien: zelfvernieuwing en multipotentie in één cel, de werkbare definitie van een stamcel en de grondslag van de beenmergtransplantatie. Barker en Clevers (2007) merkten cellen die het gen Lgr5 tot expressie brengen aan de basis van darmcrypten met een erfelijke kleur en zagen die kleur in de loop van weken de crypte opklimmen en hele villi vullen: de gemerkte cellen waren de stamcellen van de darm, en één ervan, gekweekt in een gel met de juiste drie groeifactoren, groeide uit tot een darm in het klein, een organoïde, met eigen crypten en villi (Sato, 2009). ∎

Propositie 24.2 (De nis en de crypte)

De crypte van de darm is de best begrepen nis. Aan haar basis zitten ongeveer veertien Lgr5-stamcellen ingeklemd tussen Panethcellen, die de signalen van Wnt en Notch en de groeifactoren uitscheiden die hen stamcel houden; een stamcel die omhoog wordt geduwd en het contact met de Panethcellen verliest, mist het signaal binnen enkele celdiameters en wordt een doorgangsversterkende cel, die in de crypte vier of vijf maal deelt en daarna differentieert tot de opnemende en uitscheidende cellen die de villus op trekken en vijf dagen later van de punt worden afgestoten. De stamcellen delen symmetrisch, ongeveer eens per dag, en wedijveren om de beperkte ruimte in de nis: bij toeval breidt één kloon zich uit en gaan de andere verloren, zodat binnen enkele maanden elke crypte van één stamcel afstamt — de neutrale drift op de schaal van een crypte, een toevalswandeling met absorberende randen. De nis, niet de cel, draagt de stamcelaard: zet een gedifferentieerde cel na een verwonding weer in contact met de signalen van de Panethcellen en zij kan terugkeren; haal de stamcel eruit en geef haar de signalen in een schaaltje en zij maakt een organoïde. Beenmerg, haarzakjes, de teelbal en de zones met neurale stamcellen in het brein volgen dezelfde logica met andere signalen.

Bewijsmateriaal. Snippert en collega’s (2010) merkten de stamcellen van crypten met een “confetti” van vier willekeurige kleuren; de crypten waren aanvankelijk veelkleurig en waren na enkele maanden eenkleurig geworden, met een tempo dat past bij symmetrische deling en neutrale mededinging tussen ongeveer veertien cellen — en niet bij asymmetrische deling, die elke kleur onbeperkt zou hebben behouden. De Panethcellen weghalen doet de voorraad stamcellen krimpen; het Wnt-signaal weghalen leegt de crypte binnen dagen. ∎

De crypte als nis. De stamcelaard is een plaats: cellen die in contact staan met de signalen van de Panethcellen blijven stamcel, cellen die uit dat contact worden geduwd beginnen aan de reis van vijf dagen naar de punt van de villus. Met willekeurige kleuren gemerkt drijven de stamcellen van een crypte binnen maanden naar één kloon af.

24.2 Pluripotentie en herprogrammering

Definitie 24.3 (Embryonaal, geïnduceerd en gekweekt)

Embryonale stamcellen (Evans, Kaufman, Martin, 1981, muis; Thomson, 1998, mens) zijn cellen uit de binnenste celmassa die in kweek aan het delen worden gehouden zonder te differentiëren, door signalen (LIF, of FGF en activine) die een kern van transcriptiefactoren — Oct4, Sox2, Nanog — in stand houden, die elkaar activeren en de genen van elke lijn onderdrukken. In een blastocyste gespoten voegen zij zich bij het embryo en dragen zij bij aan al zijn weefsels, met inbegrip van de kiembaan, en zo wordt de knock-outmuis gemaakt: verander een gen in de cellen en maak er een muis van. De kernoverdracht uit het deel van het tweede jaar liet zien dat een gedifferentieerde kern door het cytoplasma van een eicel kan worden teruggezet; Takahashi en Yamanaka (2006) vonden wat dat terugzetten doet. Van vierentwintig kandidaatgenen zetten er vier — Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc — samen op virussen in huidfibroblasten gebracht, in drie weken ongeveer één cel op duizend om in een geïnduceerde pluripotente stamcel die niet van een embryonale te onderscheiden is en elk weefsel en een hele muis kan vormen. Herprogrammering is traag en ondoelmatig omdat de factoren chromatine moeten openen dat door jaren van differentiatie is gesloten, en de cellen een toevallige fase doorlopen waarin de meeste blijven steken; zij is in beginsel ook een weg van de eigen cellen van een patiënt naar elk weefsel. Geef de juiste signalen in de juiste volgorde en pluripotente cellen in een schaaltje spelen de ontwikkeling na: hartspier die klopt, dopamineneuronen om in een brein met de ziekte van Parkinson te plaatsen, netvliescellen, en organoïden — zichzelf ordenende driedimensionale weefsels van enkele millimeters, van darm, nier, lever en hersenen, met de bouw en de celtypen van het orgaan, waarin de menselijke ontwikkeling en ziekte kunnen worden bekeken en geneesmiddelen kunnen worden getoetst.

Links: een hersenorganoïde gekweekt uit menselijke pluripotente cellen — enkele millimeters zichzelf ordenend weefsel dat op schors lijkt, met holten als ventrikels en gelaagde neuronen. Rechts: een uitstrijkje van beenmerg, de hiërarchie van de eerste figuur in één beeld: blasten, rijpende granulocyten, voorlopers van rode cellen en een megakaryocyt.

Methode 24.4 (Lijnen volgen)

Om te vinden welke cellen de stamcellen van een weefsel zijn: (1) kies een gen dat door de kandidaatcellen tot expressie wordt gebracht en zet onder zijn promotor een induceerbaar recombinase (Cre-ER, dat alleen werkt wanneer er tamoxifen wordt gegeven); (2) breng in hetzelfde dier een reportergen in dat blijvend actief wordt zodra het recombinase er een stopcassette uit knipt — een kleur die door elke nakomeling wordt geërfd; (3) geef één dosis tamoxifen om de kandidaatcellen op één ogenblik te merken; (4) neem met tussenpozen weefsel af en beoordeel de gemerkte klonen: een kloon die groeit, maanden blijft bestaan en elk celtype van het weefsel bevat komt van een stamcel; een kloon die binnen een week wordt afgestoten komt van een doorgangscel. (5) Volg met een meerkleurig reportergen de mededinging tussen de klonen. (6) Toets de functie rechtstreeks door de gemerkte cellen te doden met een gifreceptor onder dezelfde promotor, en kijk of het weefsel zich niet meer vernieuwt.

24.3 Regeneratie

Definitie 24.5 (Hoe dieren teruggroeien)

Regeneratie verloopt langs drie wegen. Hydra en de planarie steunen op pluripotente stamcellen van de volwassene: de neoblasten van een planarie, een vijfde van haar cellen, zijn de enige delende cellen die zij heeft, trekken naar een wond en bouwen elk ontbrekend deel opnieuw op, geleid door positiesignalen (een Wnt-gradiënt vertelt het stuk welk uiteinde de staart is; blokkeer die en een staartstuk laat een tweede kop groeien). Salamanders bouwen een ledemaat opnieuw uit een blasteem, een kapje delende cellen op de stomp dat grotendeels door dedifferentiatie ontstaat: spiervezels vallen uiteen in cellen met één kern, kraakbeen- en bindweefselcellen keren terug naar een voorloperstaat, elk met een geheugen voor het weefsel van herkomst en de plaats langs het ledemaat, en het blasteem voert het embryonale ledemaatprogramma opnieuw uit onder de wondopperhuid en de zenuwen, wier aanwezigheid nodig is (haal de zenuwen uit de stomp en er groeit niets). Zebravissen laten vinnen en hart op dezelfde wijze teruggroeien, waarbij de overlevende spiercellen van het hart delen en in een maand een vijfde van de kamer vervangen. Zoogdieren doen weinig van dit alles: de lever herwint haar massa nadat er twee derde is weggenomen, maar doordat de overgebleven cellen ter plaatse delen (compenserende groei), niet door de verloren kwabben te herbouwen; een vingertop regenereert bij kinderen; het gewei van een hert groeit elk jaar opnieuw uit een beenvlies met stamcellen. Waarom niet meer is een kwestie van afwegingen: het wondantwoord van het zoogdier — snelle stolling, ontsteking, een litteken van fibroblasten — sluit een wond snel tegen besmetting en bloedverlies, en het litteken sluit het blasteem uit; en cellen die naar believen kunnen dedifferentiëren en delen zijn cellen die kanker kunnen worden, een risico dat een langlevend warmbloedig dier zich misschien niet kan veroorloven.

Links: een axolotl, die in twee maanden een ledemaat laat teruggroeien uit een blasteem van gededifferentieerde cellen en dat zijn hele leven kan blijven doen. Rechts: een planarie in stukken gesneden, waarbij elk stuk binnen twee weken uit zijn neoblasten een complete worm laat teruggroeien.

Bewijsmateriaal. Morgan (1898) sneed planariën in 279 stukken en vond dat elk een hele worm liet teruggroeien tot een ondergrens van ongeveer een honderdste van het lichaam; Reddien en collega’s (2011) plaatsten één neoblast in een dodelijk bestraalde worm en herstelden die volledig — één cel, elk weefsel. Kragl en collega’s (2009) maakten axolotls waarvan telkens één weefsel groen was gemerkt en plaatsten die in ongemerkte gastheren: na amputatie leverde groene spier alleen spier op en groen kraakbeen alleen kraakbeen — het blasteem is geen poel van pluripotente cellen maar een verzameling voorlopercellen die tot hun eigen lijn beperkt zijn, elk niet verder gededifferentieerd dan tot de voorloper van het eigen weefsel. Singer (1952) liet zien dat een ledemaat van een salamander alleen regenereert als er een drempelaantal zenuwvezels de stomp bereikt, en dat een zenuw omleiden naar een wond op de flank daar een ledemaat deed groeien. ∎

24.4 De rekenkunde van de veroudering

Stelling 24.6 (Telomeren en de limiet van Hayflick)

Elk chromosoom eindigt in een telomeer, enkele kilobasen van de herhaling TTAGGG. Omdat het DNA-polymerase het laatste stuk van de achterblijvende streng niet kan voltooien (het eindreplicatieprobleem), verkort elke deling elk telomeer met $\Delta \approx$ $50\text{ tot }100\,\mathrm{bp}$ . Uitgaande van $L_{0} \approx 10\,\mathrm{kb}$ en met een replicatieve veroudering — een blijvende, door p53 afgedwongen stilstand — die intreedt zodra het kortste telomeer $L_{\text{crit}} \approx 4\,\mathrm{kb}$ bereikt, kan een cellijn hoogstens

n_{\max} = \frac{L_{0} - L_{\text{crit}}}{\Delta} \approx \frac{6000}{50\text{--}100} \approx 60\text{--}120

maal delen: de limiet van Hayflick, de ruim vijftig populatieverdubbelingen die menselijke fibroblasten in kweek voltooien voordat zij stoppen. Het enzym telomerase, een reverse transcriptase met een RNA-sjabloon, verlengt de uiteinden weer; het is werkzaam in de kiembaan, in embryonale en vele volwassen stamcellen, en in $90\,\%$ van de kankers, die aan de limiet zijn ontsnapt door het weer aan te zetten. Een stamcel die $d$ maal per jaar deelt en wier telomerase een deel $f$ van het verlies goedmaakt, heeft $n_{\max} = (L_{0} - L_{\text{crit}})/[(1 - f)\Delta]$ delingen, en een levensduur van $n_{\max}/d$ jaar: met $f = 0.7$ , $\Delta = 60$ en $d = 1$ zo’n 330 jaar voor een bloedvormende stamcel — maar haar voorlopercellen, met telomerase uit en twintig delingen tot een rode cel, besteden bij elke lijn een vijfde van hun reserve, en daarom hebben de bloedcellen van oude mensen kortere telomeren dan die van jonge, met ongeveer $30\,\mathrm{bp}$ per jaar.

Bewijs. Het verlies per deling is een vaste lengte, dus daalt de lengte van het telomeer lineair met het aantal delingen, $L_{n} = L_{0} - n\Delta$ , en bereikt zij $L_{\text{crit}}$ bij $n = (L_{0} - L_{\text{crit}})/\Delta$ ; met gedeeltelijke compensatie is het netto verlies per deling $(1 - f)\Delta$ . Hayflick en Moorhead (1961) toonden aan dat normale menselijke fibroblasten na ongeveer vijftig verdubbelingen stoppen, welke kweekomstandigheden er ook heersen, dat cellen die na twintig verdubbelingen worden ingevroren en later ontdooid alleen de resterende dertig voltooien — zij tellen delingen, geen tijd — en dat de limiet lager ligt voor cellen van oude donoren. Harley, Futcher en Greider (1990) maten hoe telomeren korter werden met het aantal verdubbelingen in kweek en met de leeftijd van de donor; Bodnar en collega’s (1998) brachten telomerase in normale cellen en die deelden onbeperkt voorbij de limiet zonder kankerachtig te worden, waarmee het telomeer als klok werd vastgesteld. ∎

Telomeren als teller van delingen. Een vast verlies per deling geeft een rechte lijn; waar zij de kritieke lengte kruist houdt de lijn op. Telomerase vlakt de helling af en heft de limiet, volledig werkzaam, geheel op — in de kiembaan, en in kankers.

Propositie 24.7 (De wet van Gompertz)

Boven ongeveer dertig jaar verdubbelt het menselijke sterftecijfer $\mu(t)$ — de kans om in het komende jaar te sterven — elke acht jaar: $\mu(t) = \mu_{0}\,\mathrm{e}^{\gamma(t - t_{0})}$ met $\gamma = \ln 2/8 \approx 0.087\,\mathrm{yr}^{-1}$ (Gompertz, 1825). De overleving tot leeftijd $t$ is dan

S(t) = \exp\!\Bigl[-\frac{\mu_{0}}{\gamma}\bigl(\mathrm{e}^{\gamma(t - t_{0})} - 1\bigr)\Bigr],

een kromme die decennialang vlak is en daarna steil daalt, met een mediane levensduur $t_{1/2} = t_{0} + \gamma^{-1}\ln(1 + \gamma\ln 2/\mu_{0})$ : voor $\mu_{0} = 10^{-3}$ per jaar op dertigjarige leeftijd ongeveer $30 + 47 = 77$ jaar. Dezelfde wet geldt, met andere constanten, voor muizen (verdubbelingstijd drie maanden), honden, vliegen en wormen: veroudering is een exponentiële stijging van de kwetsbaarheid, geen klok die afloopt. De biologie achter de exponent is een stel op elkaar inwerkende kenmerken: opgehoopte DNA-schade en epigenetische drift, slijtage van de telomeren, verlies van de eiwithuishouding, achteruitgang van de mitochondriën, uitputting van de voorraden stamcellen, de ophoping van verouderde cellen die niet meer delen maar ontstekingssignalen uitscheiden, en chronische ontsteking; bij muizen verlengt het opruimen van verouderde cellen of het beperken van de calorieën het leven, en bij wormen verdubbelt één mutatie in de insulineachtige route het. Of de exponent bij de mens kan worden verlaagd, in plaats van de constante $\mu_{0}$ die de geneeskunde in een eeuw tienvoudig heeft verkleind, is de open vraag.

Bewijs. Is $\mu$ het risico, dan geldt $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = -\mu(t)S$ , dus $\ln S = -\int_{t_{0}}^{t}\mu = -(\mu_{0}/\gamma)(\mathrm{e}^{\gamma(t-t_{0})} - 1)$ . Stel $S = 1/2$ : $\mathrm{e}^{\gamma(t-t_{0})} = 1 + \gamma\ln 2/ \mu_{0}$ , waaruit de mediaan volgt; met $\gamma = 0.087$ en $\mu_{0} = 10^{-3}$ is $\ln(1 + 60) = 4.1$ en $t - t_{0} = 47$ . De empirische wet is de fit van Gompertz aan de Engelse sterftetafels; dat zij zoveel soorten met een gedeelde vorm en soortspecifieke constanten beschrijft wordt hier aangenomen als de samenvatting van een eeuw demografie. ∎

De wet van Gompertz. Links: op een logaritmische as is het sterftecijfer vanaf dertig jaar een rechte lijn. Rechts: de overlevingskromme die daaruit volgt — een plateau en dan een klif, met de mediaan waar de integraal van het risico 2 bereikt. — De wet van Gompertz. Links: op een logaritmische as is het sterftecijfer vanaf dertig jaar een rechte lijn. Rechts: de overlevingskromme die daaruit volgt — een plateau en dan een klif, met de mediaan waar de integraal van het risico $\ln 2$ bereikt.

Opmerking 24.8 (Vernieuwing en haar prijs)

Een lichaam dat zichzelf vernieuwt moet cellen houden die onbeperkt kunnen delen, en cellen die onbeperkt kunnen delen zijn de grondstof van kanker; een lichaam dat zich tegen kanker beschermt door delingen te tellen en veroudering af te dwingen moet op den duur te weinig cellen overhouden die kunnen delen. De hiërarchie van de stamcellen is één oplossing — weinig trage cellen beschermd in nissen, veel snelle cellen die spoedig sterven — en de limiet van Hayflick een andere, en de e-macht van Gompertz is de som van hun kosten. De salamander betaalt anders: hij verdraagt cellen die dedifferentiëren en laat een poot teruggroeien, en hij is koudbloedig, traag en leeft zelden lang genoeg om de rekening van de kanker te betalen. De cellen waarmee een mens is geboren zijn grotendeels niet de cellen die hij heeft; de cellen die de vervangers maakten zijn de cellen die hij moet behouden.

24.5 Opgaven

Oefening 24.1 ★

Definieer zelfvernieuwing, potentie, nis en doorgangsversterkende cel, en geef van elk een voorbeeld in de darm.

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.1.

Zelfvernieuwing: een deling die ten minste één dochter oplevert die nog stamcel is — de Lgr5-cellen aan de basis van de crypte. Potentie: het bereik van lotgevallen dat een cel nog kan aannemen — de stamcel van de crypte is multipotent en maakt opnemende cellen, slijmbekercellen, entero-endocriene cellen, Panethcellen en tuftcellen. Nis: de Panethcellen en hun signalen van Wnt, Notch en EGF, die de stamcelaard op haar plaats houden. Doorgangsversterkende cel: een vastgelegde dochter die in de crypte nog vier of vijf maal deelt voordat zij op weg naar boven langs de villus differentieert.

Oefening 24.2 ★

Wat toonde de proef met de miltkolonies aan, en welke eigenschap van een stamcel vergde een tweede muis om te worden aangetoond?

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.2.

Afzonderlijke mergcellen brachten kolonies op de milt voort met rode cellen, granulocyten en bloedplaatjes: één cel, verscheidene lijnen — multipotentie, en het lineaire verband met de dosis liet zien dat elke kolonie van één cel kwam. Voor de zelfvernieuwing was een tweede muis nodig: cellen uit een kolonie, in een tweede bestraalde ontvanger gespoten, maakten nieuwe kolonies, dus had de stichtende cel dochters met haar eigen vermogen voortgebracht.

Oefening 24.3 ★

Noem de vier factoren van Yamanaka en leg uit waarom het herprogrammeren weken duurt en bij één op de duizend cellen slaagt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.3.

Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. Het chromatine van de fibroblast heeft de genen van de pluripotentie achter heterochromatine en DNA-methylering gesloten, zodat de factoren aanvankelijk weinig toegankelijke plaatsen vinden en over vele celcycli verbouwingsenzymen moeten aantrekken; de cel moet bovendien haar eigen programma afzetten, aan de veroudering ontsnappen en een toevallige tussentoestand doorlopen waarin de meeste cellen blijven steken of sterven. Alleen de zeldzame cel waarin elke stap slaagt komt er weken later pluripotent uit.

Oefening 24.4 ★

Zet de wegen naar regeneratie van de planarie en van de salamander tegenover elkaar, en zeg wat de transplantaties van Kragl over het blasteem lieten zien.

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.4.

De planarie houdt pluripotente stamcellen van de volwassene aan, de neoblasten, die naar de wond trekken en bouwen wat er ontbreekt. De salamander heeft zo’n voorraad niet: gedifferentieerde cellen bij de stomp dedifferentiëren tot voorlopercellen, die met de stamcellen van de weefsels zelf een blasteem vormen dat het ledemaatprogramma opnieuw uitvoert. De transplantaties van Kragl met telkens één gemerkt weefsel lieten zien dat de cellen van het blasteem hun herkomst trouw blijven — spier maakt spier, kraakbeen kraakbeen — zodat het blasteem een mengsel van tot hun lijn beperkte voorlopercellen is en geen pluripotente massa.

Oefening 24.5 ★★

Telomeren beginnen op $11\,\mathrm{kb}$ , de veroudering treedt in bij $5\,\mathrm{kb}$ , het verlies is $75\,\mathrm{bp}$ per deling. Limiet van Hayflick? Cellen van een donor van 70 jaar hebben $8\,\mathrm{kb}$ : hoeveel verdubbelingen resten er? Als telomerase $60\,\%$ van het verlies goedmaakt, wat is dan de limiet?

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.5.

$(11 - 5)/0.075 = 80$ verdubbelingen. Vanaf $8\,\mathrm{kb}$ : $(8 - 5)/0.075 = 40$ . Met een compensatie van $60\,\%$ is het netto verlies $30\,\mathrm{bp}$ : $6000/30 = 200$ .

Oefening 24.6 ★★

Een crypte bevat 14 stamcellen die eens per dag delen en doorgangscellen voeden die nog 4 maal delen, en de crypte levert haar villus $300$ cellen per dag. Controleer de rekenkunde: hoeveel delingen van stamcellen per dag leveren differentiërende dochters op, en met hoeveel stamcellen aan delingen komt dat overeen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.6.

Veertien delingen van stamcellen per dag leveren 28 dochters; er moeten er 14 stamcel blijven, dus leggen er 14 zich vast — één vastgelegde dochter per stamcel per dag. Elk daarvan levert $2^{4} = 16$ cellen op: $14\times 16 = 224$ villuscellen per dag, van de orde van de $300$ die worden waargenomen (een vijfde doorgangsdeling geeft $448$ ). De laag van de stamcellen draagt veertien cellen aan delingen bij, de doorgangslaag de andere $200$ .

Oefening 24.7 ★★

Het lichaam maakt $2\times 10^{11}$ rode cellen per dag, elk het resultaat van ongeveer 20 delingen vanaf een stamcel. Hoeveel delingen van stamcellen per dag vergt dat, en hoe vaak deelt elk van de $10\,000$ stamcellen dan? Vergelijk met de waargenomen “ongeveer eens per jaar” en verklaar het verschil.

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.7.

$2\times 10^{11}/2^{20} = 1.9\times 10^{5}$ vastgelegde dochters per dag; met $10\,000$ stamcellen zijn dat er 19 per stamcel per dag — tegenover één deling per jaar. De telling van twintig delingen geldt per lijn van stamcel tot rode cel, maar de tussenliggende voorlopercellen zijn niet eenmalig: de voorraden multipotente en vastgelegde voorlopercellen houden zichzelf wekenlang in stand met hun eigen delingen, zodat vrijwel alle deling in de lagen van de voorlopercellen gebeurt en er zelden een beroep op de stamcel wordt gedaan.

Oefening 24.8 ★★

Bereken met $\gamma = 0.087\,\mathrm{yr}^{-1}$ en $\mu_{0} = 10^{-3}$ op dertigjarige leeftijd het sterftecijfer op 50, 70 en 90 jaar, de overleving tot 70 en 90, en de mediane levensduur. Wat doet het halveren van $\mu_{0}$ met de mediaan? En het halveren van $\gamma$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.8.

$\mu(50) = 10^{-3}\mathrm{e}^{1.74} = 5.7\times 10^{-3}$ ; $\mu(70) = 10^{-3}\mathrm{e}^{3.48} = 0.032$ ; $\mu(90) = 10^{-3}\mathrm{e}^{5.22} = 0.19$ per jaar. Met $\mu_{0}/\gamma = 0.0115$ : $S(70) = \exp[-0.0115 \times 31.5] = 0.70$ , $S(90) = \exp[-0.0115\times 184] = 0.12$ . Mediaan: $30 + \ln(61)/0.087 = 77$ . Halvering van $\mu_{0}$ : $\ln(121)/0.087 = 55$ , mediaan 85 — één verdubbelingstijd, acht jaar, gewonnen. Halvering van $\gamma$ tot $0.0435$ : $\ln(31)/0.0435 = 79$ , mediaan 109: de exponent vertragen wint vier maal zoveel als de constante halveren.

Oefening 24.9 ★★

Twee derde van de lever van een rat wordt weggenomen. De overgebleven levercellen, die alle delen, herstellen de massa in tien dagen. Hoeveel delingen heeft elk nodig? Waarom heet dit compenserende groei en geen regeneratie, en wat bouwt de lever niet opnieuw op?

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.9.

Het overgebleven derde deel moet verdrievoudigen: $\log_{2}3 = 1.6$ delingen per cel. Compenserende groei, omdat de bestaande kwabben groter worden doordat de cellen ter plaatse delen; de weggenomen kwabben, met hun gangen, vaten en bouw, worden niet herbouwd — de lever herwint haar massa en haar functie maar niet haar vorm.

Oefening 24.10 ★★★

Neutrale drift: $N$ stamcellen in een nis delen symmetrisch; bij elke gebeurtenis deelt er één cel en gaat er één willekeurig verloren, zodat het aantal van een gegeven kloon een toevalswandeling tussen $0$ en $N$ maakt. Beredeneer dat de kans dat een kloon van $k$ cellen de nis uiteindelijk overneemt gelijk is aan $k/N$ , en dat een kloon van één cel bij $N = 14$ een kans van $1/14$ heeft. Wat voorspelt dit voor het lot van een stamcel met een nieuwe neutrale mutatie?

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.10.

Bij elke gebeurtenis gaat de omvang $k$ van de kloon met gelijke kans naar $k + 1$ of $k - 1$ , dus verandert haar verwachte omvang nooit; eindigt de wandeling, dan is die $N$ (overname) of $0$ (verlies), en de verwachting $N\,P + 0 = k$ geeft $P = k/N$ . Voor één cel: $1/14$ . Een neutrale mutatie in één stamcel wordt met kans $1/14$ in haar crypte vastgelegd en gaat anders binnen maanden verloren — de drift ruimt dertien van de veertien mutaties op.

Oefening 24.11 ★★★

Een mutatie geeft een kloon stamcellen een voordeel van $10\,\%$ in de mededinging van Oefening 24.10. Leg in grote lijnen uit waarom haar kans op overname ruim boven $k/N$ stijgt, waarom de crypten en het merg van oude mensen steeds meer door enkele klonen worden beheerst (klonale hematopoëse), en waarom dat een eerste stap naar kanker is zonder kanker te zijn.

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.11.

De wandeling is nu scheef: de kloon wint vaker een plaats dan zij er een verliest, dus groeit haar verwachte omvang en nadert haar kans op overname de zekerheid naarmate $k$ groeit — bij een voordeel van $10\,\%$ in een nis van veertien ruwweg driemaal boven $1/14$ voor één cel, en nog hoger zodra de kloon een paar plaatsen bezet. In de loop van decennia nemen stamcellen met zulke mutaties (DNMT3A, TET2 in het merg) hun nissen over, en op zeventigjarige leeftijd heeft een vijfde van de mensen een groot deel van het bloed uit één kloon. Het is geen kanker: de cellen differentiëren nog en gehoorzamen hun hiërarchie. Maar de volgende mutatie heeft nu een kloon van miljarden om in te ontstaan, en het risico op leukemie is tienvoudig verhoogd.

Oefening 24.12 ★★★

Stel dat de exponent $\gamma$ van Gompertz een tempo van opstapelende schade weerspiegelt en de constante $\mu_{0}$ de omgeving. De geneeskunde heeft $\mu_{0}$ sinds 1900 tienvoudig verkleind zonder $\gamma$ te veranderen. Bereken de winst in mediane levensduur die die tienvoudige verlaging geeft, en de verdere winst van nog een tienvoudige verlaging; leg uit waarom de opbrengst afneemt, en wat een verlaging van $\gamma$ met $20\,\%$ in plaats daarvan zou doen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 24.12.

Mediaan $= 30 + \gamma^{-1}\ln(1 + \gamma\ln 2/\mu_{0})$ : voor $\mu_{0} = 10^{-2}$ is dat $30 + \ln 7/0.087 = 52$ ; voor $10^{-3}$ 77; voor $10^{-4}$ $30 + \ln 604/0.087 = 104$ . In de zuivere vorm van Gompertz voegt elke tienvoudige verlaging dezelfde $\ln 10/\gamma = 26$ jaar toe. In de praktijk neemt de opbrengst af omdat de historische winst kwam van het wegnemen van een leeftijdsonafhankelijke term — besmetting, bevalling, ongeval, de constante $A$ van Makeham in $\mu = A + \mu_{0}\mathrm{e}^{\gamma t}$ — en zodra $A$ klein is ten opzichte van de e-macht op de leeftijden die ertoe doen, verandert hem verder verlagen bijna niets; de intrinsieke $\mu_{0}$ is veel minder opgeschoven. Een verlaging van $\gamma$ met $20\,\%$ (tot $0.070$ ) geeft $30 + \ln 49/0.070 = 86$ : negen jaar, gewonnen op elke leeftijd in plaats van door een paar doodsoorzaken uit te stellen.

24.6 Vraagstuk: de cellen van bij de geboorte

Probleem 24.1

Weekendvraagstuk — de vernieuwing van een lichaam in getallen: de hiërarchie van het bloed en wat zij van haar stamcellen vraagt, de drift in de crypte, de telomeerklok en hoe telomerase en voorlopercellen haar besteden, de kromme van Gompertz voor de bevolking, en de afwegingen die een regenererend dier aanvaardt, eindigend bij het aantal van Hayflick, de levensreserve van de stamcel en de mediane levensduur

Gegevens: rode cellen $2.5\times 10^{11}$ per dag, granulocyten $10^{11}$ per dag; $20$ delingen van stamcel tot rijpe cel; $10\,000$ bloedvormende stamcellen. Telomeren: $L_{0} = 10\,\mathrm{kb}$ , $L_{\text{crit}} = 4\,\mathrm{kb}$ , $\Delta = 60\,\mathrm{bp}$ per deling; het telomerase in stamcellen maakt $f = 0.7$ goed, dat in voorlopercellen niets. Crypte: $N = 14$ stamcellen, één deling per dag. Gompertz: $\mu_{0} = 10^{-3}$ per jaar op 30-jarige leeftijd, $\gamma = 0.087\,\mathrm{yr}^{-1}$ . Ledemaat van een axolotl: $40\,\mathrm{mm}$ teruggegroeid in $60\,\mathrm{dagen}$ ; een blasteem van $10^{5}$ cellen dat tot $10^{8}$ groeit.

Deel I — Het bloed.

Het aantal cellen dat per dag in totaal wordt gemaakt, en per seconde.
Elke rijpe cel is het einde van $20$ delingen: hoeveel cellen levert één vastgelegde dochter van een stamcel op? Hoeveel vastgelegde dochters per dag zijn er nodig?
Hoeveel differentiërende delingen per stamcel per dag betekent dat met $10\,000$ stamcellen? En per jaar?
De gemeten deling van stamcellen is ongeveer eens per jaar. Breng dat in overeenstemming: wat moeten de voorlopercellen doen wat de berekening van vraag 3 aan de stamcellen toeschreef?
Voorlopercellen hebben geen telomerase. Welke telomeerlengte bereikt een voorloper van een rode cel na haar $20$ delingen, uitgaande van $10\,\mathrm{kb}$ ? Maakt het uit dat die boven $L_{\text{crit}}$ ligt?
Een stamcel die eens per jaar deelt met $f = 0.7$ : het netto verlies per deling, de delingen tot veroudering, en de jaren. Geef commentaar.

Deel II — De crypte.

Delingen per crypte per dag op de laag van de stamcellen; als de helft van de gebeurtenissen een verloren stamcel vervangt en de helft de doorgangszone voedt, hoeveel vastgelegde cellen per dag, en hoeveel villuscellen na $4$ doorgangsdelingen?
De kans op overname van een kloon van één cel is $1/N$ . De verwachte tijd tot eenkleurigheid is van de orde $N^{2}$ delingsgebeurtenissen per cel; schat die in dagen en vergelijk met de waarnemingen met confetti (maanden).
Een stamcel verwerft een mutatie. Wat is de kans dat zij uiteindelijk in haar crypte wordt vastgelegd? In hoeveel van de $10^{7}$ crypten van een dikke darm zou een mutatie die eens per crypte ontstaat worden vastgelegd?
Waarom beschermt de drift in een crypte beter tegen kanker dan een weefsel waarin elke stamcel levenslang asymmetrisch deelt?
Nadat bestraling de stamcellen heeft gedood keren doorgangscellen terug en vullen zij de nis opnieuw. Wat zegt dat over waar de stamcelaard huist?
Schets het lijnvolgexperiment dat symmetrische drift van asymmetrische deling onderscheidt, en de twee uitkomsten.

Deel III — De klok.

De limiet van Hayflick voor een somatische lijn zonder telomerase.
Een kweek fibroblasten wordt na $25$ verdubbelingen ingevroren en tien jaar later ontdooid: hoeveel verdubbelingen resten er? Wat toont dat over wat de cel telt?
Telomeren van leukocyten worden bij volwassenen $30\,\mathrm{bp}$ per jaar korter. Wanneer zouden zij vanaf $8\,\mathrm{kb}$ op twintigjarige leeftijd $L_{\text{crit}}$ bereiken? Vergelijk met de levensduur en geef commentaar.
Telomerase in normale fibroblasten laat hen de limiet passeren zonder kankerachtig te worden. Telomerase is werkzaam in $90\,\%$ van de kankers. Breng die twee uitspraken met elkaar in overeenstemming.
Bereken het sterftecijfer van Gompertz op 40, 60, 80 en 100 jaar, en de overleving tot elk.
De mediane levensduur; en de leeftijd waarop $10\,\%$ nog leeft.

Deel IV — Teruggroeien.

Axolotl: het gemiddelde tempo van teruggroei in mm/dag; het aantal verdubbelingen waarmee het blasteem van $10^{5}$ tot $10^{8}$ cellen groeit, en de gemiddelde verdubbelingstijd over 60 dagen.
Als gededifferentieerde cellen hun leven lang delen zoals die van het blasteem en een deling per cel een kans van $10^{-9}$ op een oncogene mutatie draagt, hoeveel van zulke mutaties ontstaan er dan bij één regeneratie? Waarom krijgt de axolotl toch bijna nooit kanker, en waarom zou een zoogdier daar niet mee wegkomen?
De zenuwen uit de stomp halen stopt de regeneratie. Stel een experiment voor dat laat zien dat de zenuw een diffundeerbare stof levert, en één mogelijke identiteit van die stof.
Een staartstuk van een planarie laat een tweede staart in plaats van een kop groeien wanneer een remmer van Wnt wordt uitgeschakeld. Verklaar dat met een gradiënt en met het positiegeheugen van het stuk.
Een menselijke lever na een resectie van twee derde: welk deel van de levercellen moet één maal delen, welk deel tweemaal, om de massa te herstellen? Waarom is het resultaat een werkende lever met de verkeerde vorm?
Waarom zou een lichaam dat als een axolotl regenereerde een andere kromme van Gompertz hebben, en welke kant op?
Vat samen: het aantal van Hayflick (vraag 13), de delingen en jaren van een stamcel met hulp van telomerase (vraag 6), en de mediane levensduur (vraag 18).

Oplossing

Oplossing van Probleem 24.1.

1. $3.5\times 10^{11}$ per dag, $4\times 10^{6}$ per seconde. 2. $2^{20} \approx 10^{6}$ cellen per vastgelegde dochter; $3.5\times 10^{11}/10^{6} = 3.3\times 10^{5}$ vastgelegde dochters per dag. 3. $33$ per stamcel per dag, $12\,000$ per jaar. 4. De voorraden voorlopercellen moeten zichzelf in stand houden: multipotente en vastgelegde voorlopercellen delen wekenlang en houden hun eigen aantallen op peil, zodat bijna elke deling van de twintig plaatsvindt in lagen die zichzelf vernieuwen, en de stamcel zelden een vastgelegde dochter bijdraagt — in de orde van eens per jaar. 5. $10 - 20\times 0.06 = 8.8\,\mathrm{kb}$ : ruim boven $L_{\text{crit}}$ , en de rode cel deelt nooit meer; de reserve telt alleen voor voorlopercellen die opnieuw worden gebruikt. 6. Netto verlies $0.3\times 60 = 18\,\mathrm{bp}$ ; $6000/18 = 333$ delingen; bij één per jaar $333$ jaar — ver voorbij een mensenleven, dus begrenzen de telomeren de stamcel zelf niet; andere schade doet dat. 7. $14$ delingen per dag; $7$ vervangen verloren stamcellen en $7$ leggen zich vast; $7\times 2^{4} = 112$ villuscellen per dag. 8. $N^{2} = 196$ gebeurtenissen per cel bij één per dag: ongeveer $200\,\mathrm{dagen}$ , zes tot zeven maanden — de tijd waarin de crypten met confetti eenkleurig werden. 9. $1/14 \approx 7\,\%$ ; $10^{7}/14 \approx 7\times 10^{5}$ crypten. 10. De drift werpt dertien van elke veertien mutaties binnen maanden weg. Levenslange asymmetrische deling zou elke gemuteerde stamcel een leven lang behouden, zodat mutaties zich in elke lijn zouden ophopen zonder ooit te worden opgeruimd. 11. De stamcelaard is een plaats in de nis en een stel signalen, geen blijvende eigenschap van een cel: elke cel die de signalen van de Panethcellen bereikt kan de rol op zich nemen. 12. Wek op één ogenblik een meerkleurige merking in de stamcellen op en volg de crypten. Symmetrische drift: de crypten worden binnen maanden eenkleurig. Asymmetrische deling: elke crypte behoudt al haar kleuren onbeperkt, elk als een dun lint langs de villus. 13. $6000/60 = 100$ verdubbelingen. 14. Ongeveer $75$ over: de cel telt delingen, geen kalendertijd, want het decennium in de vriezer kostte niets. 15. $(8000 - 4000)/30 = 133$ jaar na het twintigste — op leeftijd 153. De gemiddelde telomeerlengte van leukocyten begrenst het leven dus niet zelf; de kortste telomeren, en de andere kenmerken, tellen zwaarder. 16. Telomerase neemt één hindernis weg, de replicatieve veroudering, en wordt daarom in vrijwel elke kanker gevonden, die onbeperkte deling nodig heeft; maar de fibroblasten die telomerase kregen behielden hun controlepunten, hun contactremming en een gaaf p53, zodat onbeperkte deling alleen er geen kankers van maakte. Noodzakelijk, niet voldoende. 17. $\mu(40) = 2.4\times 10^{-3}$ , $\mu(60) = 0.014$ , $\mu(80) = 0.077$ , $\mu(100) = 0.44$ per jaar. $S = \exp[-0.0115(\mathrm{e}^{\gamma (t-30)} - 1)]$ : $0.98$ op 40, $0.87$ op 60, $0.42$ op 80 en $0.006$ op 100. 18. Mediaan $30 + \ln 61/0.087 = 77$ . Tien procent leeft nog bij $\mathrm{e}^{\gamma(t-30)} = 1 + \gamma\ln 10/\mu_{0} = 201$ : $t = 30 + 5.3/0.087 = 91$ . 19. $0.67\,\mathrm{mm}/\mathrm{dag}$ ; $\log_{2}1000 = 10$ verdubbelingen in 60 dagen, één per zes dagen. 20. Ongeveer $10^{8}$ delingen, dus $0.1$ oncogene mutatie per regeneratie — één op de tien ledematen. Axolotls krijgen vrijwel nooit tumoren: zij zijn koudbloedig en traag, met een stevige onderdrukking van tumoren, en de cellen van het blasteem blijven tot hun lijn beperkt en differentiëren opnieuw in plaats van te blijven delen; regenererend weefsel onderdrukt zelfs opgewekte tumoren. Een zoogdier heeft meer cellen, een hogere temperatuur en stofwisseling, en een langer leven waarin een ontsnapte kloon kan uitgroeien. 21. Haal de zenuwen uit de stomp en breng een bolletje aan dat het kandidaat-eiwit afgeeft, of plaats weefsel dat door zenuwen is voorbehandeld: keert de regeneratie terug, dan is er een diffundeerbare stof. Kandidaten die bij watersalamanders en axolotls zijn gevonden: het eiwit nAG van de voorste gradiënt, neureguline-1 en FGF’s. 22. Het Wnt-signaal is hoog aan de staart en laag aan de kop, en de wond aan het voorste eind van een stuk maakt gewoonlijk een kop omdat Wnt daar laag is; een remmer van Wnt uitschakelen verhoogt Wnt overal, lezen beide wonden “achterkant”, en groeien er twee staarten. Het stuk kent zijn eigen as aan de gradiënt die in zijn spier is achtergebleven, en de wond bouwt de gradiënt daarop weer op. 23. Het overgebleven derde deel moet verdrievoudigen: elke levercel deelt één maal (tot twee derde) en de helft deelt nog eens — gemiddeld $1.6$ delingen. De overgebleven kwabben zwellen tot de oorspronkelijke massa; de ontbrekende kwabben en hun gangen en vaten worden niet herbouwd. 24. Regeneratie die versleten en beschadigd weefsel vervangt zou de ophoping vertragen die de exponent meet, wat $\gamma$ verlaagt en de kromme afvlakt — axolotls vertonen weinig veroudering. De prijs zou een hogere constante term zijn door kankers in een warm, groot, langlevend lichaam. 25. Het aantal van Hayflick is ongeveer $100$ verdubbelingen; een stamcel met hulp van telomerase heeft zo’n $330$ delingen, meer dan drie eeuwen bij één per jaar; de mediane levensduur is $77$ jaar.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst