Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

6Genetische modificatie en biotechnologie

Tot 1982 werd elke diabetespatiënt ter wereld in leven gehouden met insuline die uit de alvleesklieren van varkens en runderen was gehaald — zo’n achtduizend kilogram klieren voor een kilogram hormoon — en een deel van de patiënten reageerde tegen het lichaamsvreemde eiwit. Dat jaar bereikte het eerste geneesmiddel dat door een genetisch gemodificeerd organisme was gemaakt de markt: menselijke insuline, gemaakt door Escherichia coli met het menselijke gen op een plasmide. Het gereedschap dat dat mogelijk maakte was in het voorafgaande decennium bijeengebracht — enzymen die DNA op gekozen sequenties knippen, enzymen die de stukken samenvoegen, plasmiden die ze een cel in dragen en er kopiëren — en kreeg in de volgende decennia gezelschap van de polymerasekettingreactie, van het injecteren van genen in embryo’s, en, sinds 2012, van een bacterieel afweersysteem dat tot een programmeerbare schaar is omgebouwd en één letter van een genoom in een levende cel kan herschrijven. Dit hoofdstuk gaat over dat gereedschap, over de rekenkunde die het gebruik ervan beheerst, en over wat ermee is gebouwd, van een lichtgevende muis tot een genezing voor sikkelcelziekte.

6.1 DNA knippen, samenvoegen en kopiëren

Definitie 6.1 (Restrictie-enzymen, ligase en vectoren)

Een restrictie-enzym van type II is een bacterieel endonuclease dat dubbelstrengs DNA knipt op een bepaalde sequentie van $4\text{ tot }8$ basenparen, meestal een palindroom: EcoRI knipt G $^{\downarrow}$ AATTC en laat enkelstrengs overhangen van vier basen achter (plakkende uiteinden) die complementair zijn aan elk ander EcoRI-uiteinde; andere enzymen laten stompe uiteinden achter. Het DNA-ligase sluit twee fragmenten waarvan de uiteinden op elkaar passen. Een vector is een DNA-molecuul dat in een gastheer repliceert en een ingevoegd fragment kan dragen: een plasmide van enkele kilobasen met een replicatie-oorsprong, een selecteerbare marker (een gen voor antibioticaresistentie, zodat alleen cellen die het plasmide hebben opgenomen op het antibioticum groeien) en een groepje unieke restrictieplaatsen voor het invoegsel; bacteriofaag $\lambda$ , cosmiden, en bacteriële of gistkunstchromosomen voor invoegsels van $20\text{ tot }1000\,\mathrm{kb}$ . DNA komt een bacterie binnen door transformatie, na een chemische of elektrische schok die het membraan kortstondig doorlaatbaar maakt, met een doeltreffendheid van $10^{6}$ tot $10^{9}$ transformanten per microgram plasmide. Een recombinant molecuul is er een dat DNA uit twee bronnen samenvoegt.

Bewijsmateriaal. Cohen, Chang, Boyer en Helling (1973) knipten het plasmide pSC101 en een tweede plasmide met een ander resistentiegen met EcoRI, mengden en ligeerden de fragmenten, transformeerden E. coli, en kregen kolonies die tegen beide antibiotica bestand waren en één enkel plasmide uit beide droegen — het eerste recombinante DNA dat in een cel repliceerde. Het jaar daarop voegden zij ribosomale RNA-genen van een pad in pSC101 in en toonden zij aan dat het padden-DNA in de bacterie werd gerepliceerd en afgeschreven: genen steken de grens tussen rijken ongewijzigd over, en een bacterie kopieert welk DNA zij ook krijgt. ∎

Een kloneringsvector en zijn chemie. Het plasmide draagt een oorsprong, een selecteerbare marker en een unieke restrictieplaats waarin een met hetzelfde enzym geknipt fragment wordt geligeerd; plakkende uiteinden maken elke twee met hetzelfde enzym geknipte fragmenten verenigbaar.

Methode 6.2 (Een gen kloneren)

(1) Verkrijg het invoegsel: knip genomisch DNA met een restrictie-enzym, of kopieer boodschapper-RNA naar complementair DNA (cDNA, dat geen introns heeft en dus in bacteriën tot expressie kan komen), of vermeerder het gen met PCR met primers die restrictieplaatsen dragen. (2) Knip vector en invoegsel met hetzelfde enzym of dezelfde enzymen — twee verschillende enzymen dwingen de richting van het invoegsel af — en ligeer. (3) Transformeer bacteriën en breng ze uit op het antibioticum: alleen cellen met een plasmide groeien. (4) Onderscheid plasmiden met een invoegsel van plasmiden die zich op zichzelf hebben gesloten: een markergen dat door de kloneringsplaats is onderbroken (lacZ: witte kolonies hebben een invoegsel, blauwe niet). (5) Doorzoek de kolonies op het gewenste invoegsel: door hybridisatie met een gemerkte probe, met PCR, of met restrictieverteringen en gelelektroforese. (6) Sequenceer het invoegsel. Een bibliotheek is de verzameling klonen van een heel genoom of transcriptoom, waaruit met dezelfde screening elk gen kan worden opgevist.

Een agarosegel onder ultraviolet licht: DNA-fragmenten lopen naar de anode met een snelheid die met hun lengte afneemt, zodat elke band een populatie moleculen van één grootte is, vergeleken met de ladder van bekende groottes in de buitenste banen.

Definitie 6.3 (De polymerasekettingreactie)

De polymerasekettingreactie (PCR) vermeerdert een gekozen stuk DNA tussen twee primers — synthetische oligonucleotiden van ongeveer twintig basen, complementair aan de twee strengen aan de uiteinden van het doelwit — via cycli van drie temperaturen: $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ om de strengen te scheiden, $50\text{ tot }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ om de primers te laten paren, en $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ om een hittebestendig polymerase (Taq, uit de heetwaterbronbacterie Thermus aquaticus) ze te laten verlengen. Elke cyclus verdubbelt het aantal kopieën van het segment tussen de primers, zodat dertig cycli van één molecuul een miljard maken. De reverse-transcriptie-PCR kopieert eerst RNA naar DNA en meet zo transcripten of RNA-virussen; de kwantitatieve PCR (qPCR) volgt de vermeerdering in reële tijd met een fluorescerende kleurstof en leest de beginhoeveelheid af uit de cyclus waarin het signaal een drempel overschrijdt.

Stelling 6.4 (De rekenkunde van de vermeerdering)

Bij een doeltreffendheid $E$ per cyclus ( $E = 1$ voor volmaakte verdubbeling) worden $N_{0}$ beginkopieën

N_{n} = N_{0}\,(1 + E)^{n}

na $n$ cycli. Overschrijdt de fluorescentie een vaste drempel wanneer het aantal kopieën $N_{T}$ bereikt, dan is de drempelcyclus

C_{T} = \frac{\log N_{T} - \log N_{0}}{\log(1 + E)},

een rechte lijn in $\log N_{0}$ met richtingscoëfficiënt $-1/\log(1+E)$ : bij $E = 1$ verlaagt elke tienvoudige toename van de beginhoeveelheid $C_{T}$ met $\log_{2} 10 = 3.32$ cycli, en twee monsters waarvan de drempelcycli $\Delta C_{T}$ schelen verschillen in beginkopieën met de factor $(1 + E)^{\Delta C_{T}}$ .

Bewijs. Elke cyclus vermenigvuldigt het aantal kopieën met $1 + E$ , dus is $N_{n}$ een meetkundige rij. Stelt men $N_{n} = N_{T}$ en lost men naar $n$ op, dan volgt $C_{T}$ ; de richtingscoëfficiënt is de coëfficiënt van $\log N_{0}$ . Voor twee monsters geldt $C_{T,1} - C_{T,2} = (\log N_{0,2} - \log N_{0,1})/\log(1+E)$ , waaruit $N_{0,2}/N_{0,1} = (1+E)^{\Delta C_{T}}$ . ∎

Voorbeeld 6.5 (Een qPCR-plaat lezen)

Een test op viraal RNA overschrijdt de drempel bij cyclus $22$ voor de ene patiënt en bij cyclus $32$ voor de andere; bij $E \approx 1$ draagt de eerste $2^{10} \approx 1000$ keer zoveel virus. Een monster van tien kopieën overschrijdt de drempel rond cyclus $37$ wanneer de drempel $10^{12}$ kopieën is ( $\log_{2} 10^{11} = 36.5$ ); een run van $40$ cycli spoort dus enkele moleculen op, en één enkel verontreinigend molecuul van een eerder product doet dat ook, en daarom scheiden laboratoria de ruimtes waar PCR wordt opgezet van die waar producten worden gehanteerd.

Vermeerderingscurven voor N_0 = 107 (blauw), 104 (rood) en 10 kopieën (groen), E = 1, met het plateau dat de reagentia opleggen. Een duizendvoudig verschil in N_0 verschuift de drempelcyclus met 10; de plateaus zijn alle gelijk, en daarom zegt het eindproduct niets over het begin. — Vermeerderingscurven voor $N_{0} = 10^{7}$ (blauw), $10^{4}$ (rood) en $10$ kopieën (groen), $E = 1$ , met het plateau dat de reagentia opleggen. Een duizendvoudig verschil in $N_{0}$ verschuift de drempelcyclus met $10$ ; de plateaus zijn alle gelijk, en daarom zegt het eindproduct niets over het begin.

6.2 Eiwitten maken

Definitie 6.6 (Expressiesystemen)

Een expressievector plaatst de gekloneerde coderende sequentie onder een sterke, regelbare promotor van de gastheer (de lac- of T7-promotor in E. coli, aangezet met een suikeranaloog), met een ribosoombindingsplaats, een terminator en vaak een tag — zes histidines, een klein eiwit — die aan het product wordt gefuseerd om het over een kolom te zuiveren. Bacteriën maken grammen per liter van een eenvoudig eiwit (insuline, groeihormoon, enzymen) maar kunnen complexe zoogdiereiwitten niet glycosyleren of vouwen; gist voegt suikers van eigen soort toe; insecten- en zoogdiercellen (ovariumcellen van de Chinese hamster zijn de norm in de industrie) maken antilichamen en stollingsfactoren die zijn gevouwen en geglycosyleerd als bij de mens. Een monoklonaal antilichaam wordt gemaakt door een hybridoom — een antilichaamproducerende B-cel gefuseerd met een onsterfelijke myeloomcel (Köhler en Milstein, 1975) — of tegenwoordig door de antilichaamgenen in een zoogdierexpressielijn te kloneren, waar het muizenraamwerk door menselijke sequentie kan worden vervangen om afstoting te vermijden (Hoofdstuk 16).

Voorbeeld 6.7 (Insuline)

Menselijke insuline bestaat uit twee ketens, A (21 residuen) en B (30), verbonden door zwavelbruggen en in de $\beta$ -cel uit één enkele voorloper, pro-insuline, geknipt. Het eerste proces bracht de twee ketens afzonderlijk in E. coli tot expressie, elk gefuseerd aan $\beta$ -galactosidase, knipte ze er chemisch af en voegde ze in vitro samen; latere processen brengen pro-insuline tot expressie en knippen het met de enzymen die de alvleesklier gebruikt. Sinds 1996 is ook de sequentie zelf veranderd: één of twee residuen verwisselen of toevoegen geeft analogen die sneller uiteenvallen (voor bij een maaltijd) of op de injectieplaats neerslaan en over een dag vrijkomen. Een eiwit dat acht ton klieren per kilogram kostte wordt nu in een fermentor gemaakt, gelijk aan het menselijke of beter dan dat.

6.3 Transgene organismen

Definitie 6.8 (Transgenese en gerichte genmodificatie)

Een transgeen organisme draagt een gen dat in zijn kiembaan is ingebracht, zodat elke cel het heeft en het wordt geërfd. Bij muizen is de klassieke weg de micro-injectie van het DNA in één voorkern van een bevruchte eicel (Gordon en Ruddle, 1980), waarna het bij een deel van de embryo’s op een willekeurige plaats integreert; Palmiter en Brinster (1982) maakten muizen van tweemaal de normale grootte door het rattengen voor groeihormoon achter een metallothioneïnepromotor in te spuiten. De gerichte genmodificatie vervangt of verstoort in plaats daarvan een gekozen gen: een construct met lange armen die homoloog zijn aan het doelwit wordt in embryonale stamcellen gebracht, de zeldzame cellen waarin de homologe recombinatie het op de juiste plaats heeft gezet worden geselecteerd en in een blastocyst gespoten, en de chimere muis die daaruit ontstaat geeft het gewijzigde gen door (Capecchi, Smithies en Evans, jaren tachtig). Een knock-out mist het gen; een knock-in draagt een gewijzigde versie; een conditioneel allel, geflankeerd door loxP-plaatsen, wordt alleen verwijderd waar en wanneer Cre tot expressie komt (Hoofdstuk 3). Zo’n tienduizend muizengenen zijn uitgeschakeld, en voor de meeste was het fenotype de eerste aanwijzing van wat het gen doet.

Links: een bevruchte muizeneicel die door zuiging wordt vastgehouden terwijl een glazen naald DNA in één voorkern spuit. Rechts: een transgene muis die het groene fluorescerende eiwit van een kwal in elke cel tot expressie brengt, naast een gewone nestgenoot, onder ultraviolet licht.

Definitie 6.9 (Transgene planten)

Planten worden getransformeerd met Agrobacterium tumefaciens, een bodembacterie die van nature een deel van haar tumorinducerende plasmide, het T-DNA, in het genoom van een gewonde plant invoegt om die een gal te laten vormen die de bacterie voedt. De eigen genen van het T-DNA vervangen door een willekeurig gen, tussen de grenssequenties die de bacterie herkent, maakt van de ziekteverwekker een vector; de getransformeerde cellen worden geselecteerd en tot hele planten geregenereerd, wat elke plantencel kan. Soorten die de bacterie niet infecteert (lange tijd de granen) worden getransformeerd door met DNA beklede gouddeeltjes in weefsel te schieten. Genetisch gemodificeerde gewassen die op grote schaal worden geteeld dragen een bacterieel toxinegen (Bt) tegen insectenlarven, of een bacterieel enzym dat verdraagzaamheid voor een onkruidbestrijder geeft, of beide; Golden Rice draagt twee genen van de carotenoïdroute (een plantaardig fytoeensynthase en een bacterieel desaturase) zodat zijn endosperm $\beta$ -caroteen maakt, de voorloper van vitamine A, waarvan het tekort jaarlijks enkele honderdduizenden kinderen blind maakt en doodt.

Gewone rijst en Golden Rice. De gele korrel maakt in haar endosperm -caroteen uit twee toegevoegde genen van de carotenoïdroute. Rechts: de twee rijstsoorten vergeleken bij het International Rice Research Institute (IRRI, CC BY 2.0). — Gewone rijst en Golden Rice. De gele korrel maakt in haar endosperm $\beta$ -caroteen uit twee toegevoegde genen van de carotenoïdroute. Rechts: de twee rijstsoorten vergeleken bij het International Rice Research Institute (IRRI, CC BY 2.0).

Opmerking 6.10 (Het debat)

Dertig jaar teelt op honderden miljoenen hectaren, en elke stelselmatige beoordeling door wetenschappelijke academies, hebben geen enkel gezondheidseffect van goedgekeurde transgene gewassen gevonden dat van dat van hun gewone tegenhangers verschilt; het transgen is één gen te midden van veertigduizend, en het eiwit dat het maakt wordt getoetst zoals elk levensmiddelenadditief. De werkelijke vragen zijn ecologisch en economisch: de verspreiding van resistentie bij plagen en onkruiden onder eenvormige selectie, genenstroom naar wilde verwanten, de concentratie van de zaadmarkt, en wie ervan profiteert. Het zijn de vragen die elke krachtige landbouwtechniek oproept, en de antwoorden hangen af van de eigenschap en van de omstandigheden, niet van de methode waarmee het gen is verplaatst.

6.4 Genomen bewerken

Definitie 6.11 (CRISPR–Cas9)

Bacteriën bewaren fragmenten van de genomen van fagen die hun voorouders hebben besmet in een reeks herhalingen (CRISPR), schrijven ze af tot korte gids-RNA’s, en sturen daarmee een nuclease naar elk passend DNA dat de cel binnenkomt: een adaptief afweersysteem met een genetisch geheugen. Bij Streptococcus pyogenes is het nuclease het enkele eiwit Cas9, dat een gids-RNA en een tweede klein RNA bindt, DNA afzoekt op een protospacer-aangrenzend motief van drie basen (PAM, 5 $'$ -NGG), het aangrenzende DNA ontwindt en, als de twintig basen naast de PAM met de gids paren, beide strengen drie basen van de PAM doorknipt. Jinek, Charpentier, Doudna en collega’s (2012) versmolten de twee RNA’s tot één enkelvoudig gids-RNA en toonden aan dat Cas9 met een gids van willekeurige sequentie DNA op die sequentie in een reageerbuis knipt; binnen een jaar was aangetoond dat het paar werkt in cellen van mens, muis, zebravis, plant en gist. Genoombewerking is wat de cel met de knip doet: eindverbinding laat een kleine insertie of deletie achter die het gen verstoort (een knock-out in één stap, in elk organisme, binnen weken), en homologe recombinatie met een aangeboden matrijs schrijft er een gekozen sequentie in.

Cas9 en zijn gids. Het eiwit bindt een PAM, ontwindt het DNA ernaast, en knipt als de twintig basen met het gids-RNA paren. De breuk wordt hersteld ofwel door eindverbinding, die het gen verstoort, ofwel door recombinatie met een matrijs, die het herschrijft.

Propositie 6.12 (Bewerken zonder breuk)

Beide strengen doorknippen is de grofste bewerking: de uitkomst van de eindverbinding is willekeurig, en een breuk elders — een off-target-plaats die op enkele posities van de gids afwijkt en die Cas9 duldt — is een mutatie waar niemand om vroeg. Een Cas9 waarvan één nucleasedomein is uitgeschakeld knipt één streng in; met beide uitgeschakeld bindt het alleen nog, en kan het andere enzymen naar een sequentie brengen. Basebewerkers fuseren een inknippend Cas9 aan een deaminase dat in de ontwonden streng C naar U omzet (gelezen als T) of A naar I (gelezen als G), en veranderen zo één base zonder breuk en zonder matrijs; prime-bewerkers dragen een reverse transcriptase en een gids die met de gewenste sequentie is verlengd, en kopiëren die sequentie in de ingeknipte streng, wat elke substitutie en kleine inserties of deleties toelaat. Activiteit buiten het doelwit wordt beperkt door Cas9-varianten met hoge getrouwheid, door het enzym kortstondig als eiwit in plaats van als gen aan te bieden, en door gidsen te kiezen waarvan de naaste genomische verwanten op verscheidene posities verschillen; zij wordt gemeten door de voorspelde plaatsen te sequencen en met onbevooroordeelde methoden die elke breuk in het genoom vangen.

Voorbeeld 6.13 (Een genezing)

Sikkelcelziekte is één basenverandering in $\beta$ -globine. Foetaal hemoglobine, gemaakt uit $\gamma$ -globine, zou het kunnen vervangen, maar de $\gamma$ -genen worden na de geboorte uitgezet door de repressor BCL11A. De eerste goedgekeurde CRISPR-therapie (2023) neemt de eigen bloedstamcellen van de patiënt, knipt met Cas9 de erytroïde enhancer van BCL11A door zodat de eindverbinding haar in de meeste cellen uitschakelt, en geeft de cellen terug nadat het beenmerg van de patiënt is leeggemaakt: de rode cellen die zij maken zijn rijk aan foetaal hemoglobine, sikkelen niet, en de crises houden op. De bewerking is somatisch — de kiembaan blijft onaangeroerd en de verandering wordt niet geërfd — en zij gebruikt de “grove” uitkomst, verstoring, juist waar verstoring is wat men wil.

Stelling 6.14 (Supermendeliaanse verspreiding van een gendrive)

Een gendrive is een construct dat codeert voor Cas9 en een gids die in een heterozygoot het wildtype-allel op zijn eigen locus knipt; herstel door recombinatie kopieert de drive in het geknipte chromosoom, zodat een deel $c$ van de gameten van de heterozygoot de drive draagt in plaats van de mendeliaanse helft. Heeft de drive frequentie $p$ in een grote, willekeurig parende populatie en geen fitnesskosten, dan is haar frequentie in de volgende generatie

p' = p + c\,p\,(1 - p),

zodat zij zich vanuit zeldzaamheid verspreidt met een snelheid evenredig aan $c$ , en de helft van de populatie bereikt in ongeveer $\ln(1/p_{0})/\ln(1 + c)$ generaties vanaf een beginfrequentie $p_{0}$ .

Bewijs. Willekeurige paring geeft homozygoten voor de drive met frequentie $p^{2}$ , heterozygoten met $2p(1-p)$ en wildtype-homozygoten met $(1-p)^{2}$ . De homozygoten geven de drive aan al hun gameten door, de heterozygoten aan een deel $(1 + c)/2$ (de helft volgens Mendel, plus $c$ maal de omgezette wildtypehelft), de wildtypes aan geen enkele. Dus $p' = p^{2} + 2p(1-p)(1+c)/2 = p^{2} + p(1-p) + c\,p(1-p) = p + c\,p(1-p)$ . Voor kleine $p$ is dit $p' \approx (1+c)p$ , meetkundige groei met verhouding $1 + c$ , die $1/2$ bereikt vanaf $p_{0}$ na ongeveer $\ln(1/2p_{0})/\ln(1+c)$ generaties; de logistische term remt haar pas tegen het eind. ∎

Een gendrive losgelaten bij één procent, met een omzettingsdoeltreffendheid van 0.9 of 0.5 en zonder fitnesskosten. Een mendeliaans allel zonder voordeel zou op één procent blijven; de drive neemt het in tien of twintig generaties over. — Een gendrive losgelaten bij één procent, met een omzettingsdoeltreffendheid van $0.9$ of $0.5$ en zonder fitnesskosten. Een mendeliaans allel zonder voordeel zou op één procent blijven; de drive neemt het in tien of twintig generaties over.

Opmerking 6.15 (Wat bewerkt mag worden)

De somatische cellen van een instemmende patiënt bewerken is geneeskunde, te beoordelen als elke behandeling naar risico’s en baten. De kiembaan bewerken — een embryo, waarvan elke afstammeling de verandering zou dragen — is van een andere orde: de betrokken persoon kan niet instemmen, de verandering wordt geërfd, en de uitkomsten buiten het doelwit en in mozaïek zijn nog niet beheerst; nadat een Chinese onderzoeker in 2018 bekendmaakte dat hij het bij een tweeling had gedaan, riepen de wetenschappelijke academies van de meeste landen op tot een moratorium en maakten verscheidene staten het strafbaar. Een gendrive die in een wilde populatie wordt losgelaten is een beslissing die voor iedereen stroomafwaarts wordt genomen, en daarom koppelt het vakgebied in zijn eigen voorstellen om malariamuggen uit te roeien de drives aan noodremmen — omkeerdrives, zelfbeperkende ontwerpen — en aan publieke instemming in de betrokken landen.

6.5 Opgaven

Oefening 6.1 ★

Noem de drie onderdelen die een kloneringsplasmide moet hebben en leg het doel van elk uit.

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.1.

Een replicatie-oorsprong, zodat de gastheer het plasmide kopieert en aan de dochtercellen doorgeeft; een selecteerbare marker, meestal antibioticaresistentie, zodat alleen cellen met het plasmide groeien; en een unieke restrictieplaats (of een groepje plaatsen) waarin het invoegsel wordt geligeerd zonder het plasmide elders te knippen.

Oefening 6.2 ★

EcoRI herkent GAATTC. Hoe vaak komt de plaats gemiddeld voor in willekeurig DNA, en hoeveel fragmenten maakt zij van het genoom van E. coli van $4.6\,\mathrm{Mb}$ ? Waarom is het werkelijke aantal enigszins anders?

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.2.

Een gegeven sequentie van zes basen komt in willekeurig DNA eens per $4^{6} = 4096$ bp voor: ongeveer $4.6\times 10^{6}/4096 \approx 1100$ fragmenten van gemiddeld $4.1\,\mathrm{kb}$ . Echte genomen zijn niet willekeurig — basensamenstelling, codongebruik en het mijden van sommige sequenties verschuiven de telling (het werkelijke aantal EcoRI-plaatsen in E. coli is enkele honderden).

Oefening 6.3 ★

Noem de drie temperatuurstappen van een PCR-cyclus en wat er bij elk gebeurt. Waarom moet het polymerase hittebestendig zijn?

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.3.

Denaturatie bij $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ scheidt de strengen; de paring bij $50\text{ tot }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ laat de primers op hun plaatsen aanhechten; de verlenging bij $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ laat het polymerase vanaf elke primer kopiëren. Een gewoon polymerase zou bij $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ in de eerste cyclus worden vernietigd en zou dertig keer opnieuw moeten worden toegevoegd; Taq overleeft alle cycli.

Oefening 6.4 ★

Wat heeft Cas9 nodig om een gegeven sequentie te knippen, en welke twee uitkomsten kunnen op de knip volgen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.4.

Een gids-RNA waarvan de twintig basen op het doelwit passen, en een PAM (NGG) onmiddellijk 3 $'$ van het doelwit op de niet-doelstreng. Na de dubbelstrengsbreuk: eindverbinding, die een kleine insertie of deletie achterlaat en meestal het leesraam van het gen vernielt; of homologe recombinatie met een matrijs die de gewenste sequentie draagt, die haar erin schrijft.

Oefening 6.5 ★★

Een PCR loopt $35$ cycli bij doeltreffendheid $E = 0.9$ vanaf $50$ kopieën. Hoeveel kopieën levert dat op? Een qPCR van twee monsters geeft $C_{T} = 18.2$ en $25.5$ ; wat is bij $E = 0.95$ de verhouding van hun beginhoeveelheden?

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.5.

$50\times 1.9^{35} = 50\times 5.7\times 10^{9} \approx 3\times 10^{11}$ kopieën. $\Delta C_{T} = 7.3$ ; verhouding $1.95^{7.3} = e^{7.3\ln 1.95} \approx 130$ : het eerste monster had ongeveer $130$ keer meer matrijs.

Oefening 6.6 ★★

Waarom wordt voor de expressie van een menselijk eiwit in bacteriën een cDNA-bibliotheek gebruikt en geen genomische bibliotheek? Noem twee andere hindernissen bij het maken van een menselijk eiwit in E. coli en zeg hoe elk wordt genomen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.6.

Bacteriën kunnen niet splitsen: een genomische kopie met introns zou tot een onbruikbare boodschapper worden afgeschreven, dus wordt het intronvrije cDNA gebruikt, gekopieerd van het rijpe mRNA. Andere hindernissen: de menselijke promotor wordt niet herkend door het bacteriële polymerase (lever een bacteriële promotor en ribosoombindingsplaats); het menselijke codongebruik verschilt (synthetiseer het gen met de voorkeurscodons van de gastheer); het eiwit vouwt zich misschien niet of klontert (verlaag de temperatuur, fuseer het aan een oplosbare partner, of hervouw het uit insluitlichaampjes); glycosylering ontbreekt (gebruik gist- of zoogdiercellen als zij ertoe doet); zwavelbruggen hebben het oxiderende periplasma nodig.

Oefening 6.7 ★★

Een knock-outmuis wordt gemaakt met gerichte genmodificatie in embryonale stamcellen. Leg uit waarom de eerste muis die wordt geboren een chimeer is, waarom men haar moet doorfokken, en welk deel van de kleinkinderen van een chimeer waarvan de kiembaan half gemodificeerd is homozygoot knock-out is als heterozygote grootouders onderling worden gekruist.

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.7.

De gemodificeerde stamcellen worden in een gastblastocyst gespoten en mengen zich met haar eigen cellen, zodat de muis uit twee genotypen is opgebouwd — een chimeer — en zij geeft het allel alleen door als een deel van haar kiemcellen van de gemodificeerde cellen afstamt. De chimeer met een wildtype-muis kruisen geeft heterozygoten (uit de helft van haar gameten als de kiembaan half gemodificeerd is); heterozygoten onderling kruisen geeft een kwart homozygote knock-outs.

Oefening 6.8 ★★

Er wordt een gids-RNA van 20 basen met een NGG-PAM gekozen. Hoeveel plaatsen in een genoom van $3.2\times 10^{9}$ bp (beide strengen) passen door toeval precies op de gids? Hoeveel passen met hoogstens twee verschillen, als Cas9 die duldt? (Tel het aantal sequenties binnen twee verschillen als $1 + 3\binom{20}{1} + 9\binom{20}{2}$ .)

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.8.

Exact: $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}\times (1/16) \approx 4\times 10^{-4}$ plaatsen (de GG van de PAM kost een factor $16$ ) — in de praktijk geen. Binnen twee verschillen liggen $1 + 60 + 1710 = 1771$ sequenties: $1771\times 4\times 10^{-4} \approx 0.7$ toevallige plaatsen. Het echte genoom is niet willekeurig, en een gids wordt er rechtstreeks tegen gecontroleerd.

Oefening 6.9 ★★

Bereken met Stelling 6.14 de frequentie van een drive met $c = 0.8$ na drie generaties vanaf $p_{0} = 0.05$ , en schat het aantal generaties tot $0.5$ .

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.9.

$p_{1} = 0.05 + 0.8\times 0.05\times 0.95 = 0.088$ ; $p_{2} = 0.152$ ; $p_{3} = 0.255$ ; daarna $0.41$ , $0.60$ : ongeveer vijf generaties om $0.5$ te passeren, tegen de schatting $\ln(1/(2\times 0.05))/\ln 1.8 \approx 4$ .

Oefening 6.10 ★★★

De therapie voor sikkelcelziekte verstoort een enhancer in plaats van de mutatie in $\beta$ -globine te corrigeren. Geef twee redenen waarom in bloedstamcellen voor verstoring door eindverbinding is gekozen en niet voor correctie door homologe recombinatie, en één nadeel.

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.10.

De eindverbinding werkt in elke cel, ook in rustende stamcellen waarin de homologe recombinatie, een proces van S en G2, weinig doeltreffend is; zij heeft geen matrijs nodig die moet worden aangeleverd, en haar product — welke verstoring van de enhancer ook — doet het werk, terwijl correctie de precieze sequentie vergt en maar een minderheid van de cellen oplevert. Bovendien werkt dezelfde bewerking voor elke mutatie in $\beta$ -globine, of die nu sikkel- of thalassemisch is. Nadeel: zij haalt een regulerend element weg (met alle andere rollen die het heeft), zij laat het sikkelallel zitten, en het mengsel van indels is onbeheerst.

Oefening 6.11 ★★★

Een gendrive tegen een mug brengt bij homozygoten fitnesskosten $s$ met zich mee. Pas de recursie aan zodat zij selectie tegen homozygoten voor de drive omvat, en zoek de voorwaarde op $c$ en $s$ waaronder de drive zich vanuit zeldzaamheid verspreidt. Leg daarna uit waarom resistentie-allelen — producten van de eindverbinding op het doelwit die de gids niet meer herkent — in de praktijk de voornaamste hindernis zijn.

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.11.

Met homozygotenfitness $1 - s$ : $p' = \bigl[p^{2}(1-s) + p(1-p)(1+c) \bigr]/(1 - sp^{2})$ . Vanuit zeldzaamheid zijn de homozygoten verwaarloosbaar en groeit de drive als $(1+c)p$ , wat $s$ ook is; of zij tot fixatie komt wordt beslist bij $p = 1$ , waar een zeldzaam wildtype-allel met frequentie $q$ terugkeert als $q' \approx q(1-c)/(1-s)$ : fixatie als $c > s$ , anders een tussenliggend evenwicht. Resistentie: elke mislukte omzetting (eindverbinding in plaats van recombinatie) laat een allel achter dat de gids niet meer herkent; zijn zulke allelen fit — een indel in het leesraam in een niet-essentieel gebied — dan kosten zij niets terwijl de drive dat wel doet, zodat de selectie ze bevoordeelt en zij de drive vervangen. De remedies zijn essentiële sequenties als doelwit nemen, waar indels dodelijk zijn, en verscheidene gidsen tegelijk gebruiken.

Oefening 6.12 ★★★

Beredeneer met de mechanismen van dit hoofdstuk en van Hoofdstuk 3 waarom het bewerken van de kiembaan van een menselijk embryo op dit moment de beoogde uitkomst niet in elke cel kan waarborgen, en welk bewijs nodig zou zijn voordat een redelijk mens het veilig zou kunnen achten.

Oplossing

Oplossing van Oefening 6.12.

Cas9 dat in een zygote wordt gespoten kan na de eerste delingen toeslaan, zodat verschillende cellen een verschillend herstel krijgen — mozaïcisme; het herstel van elke breuk wordt door de cel gekozen, waarbij de eindverbinding onvoorspelbare indels en grote deleties of verlies van heterozygotie op de knip geeft; de uitkomst van de homologe recombinatie is een minderheid; breuken buiten het doelwit treden op plaatsen op die niet alle te voorspellen zijn; en het embryo kan alleen worden nagekeken door enkele gebiopteerde cellen te sequencen, die niet voor de rest kunnen spreken. Benodigd bewijs: methoden die elke cel op dezelfde wijze bewerken (vóór de eerste S-fase) met een doeltreffendheid bij $100\,\%$ , sequencing van het hele genoom van elke cel van bewerkte dierembryo’s zonder enige onbedoelde verandering, en langdurige opvolging van bewerkte dieren over generaties — en niets daarvan bestaat.

6.6 Vraagstuk: van een gen naar een geneesmiddel en een gewas

Probleem 6.1

Weekendvraagstuk — een gen gekloneerd met de rekenkunde van restrictieplaatsen en transformatie, een virus geteld met qPCR, een hormoon per ton in een fermentor gemaakt, een genoom bewerkt met telling van de treffers buiten het doelwit, en een gendrive in de tijd gezet, met als besluit de kopieën van een virus in een monster, het jaarlijkse fermentorvolume voor de insuline van de wereld en het aantal generaties dat een drive nodig heeft

Gegevens: een gen van $1.5\,\mathrm{kb}$ ; een restrictieplaats van zes basen; een plasmide van $4\,\mathrm{kb}$ ; transformatiedoeltreffendheid $2\times 10^{7}$ kolonies per microgram plasmide; de ligatie geeft $10\,\%$ van de plasmiden een invoegsel. qPCR-doeltreffendheid $E = 1$ , drempel $N_{T} = 10^{12}$ . Insuline: $5.8\,\mathrm{kDa}$ , een patiënt gebruikt $40$ eenheden per dag, en één eenheid is $35\,\text{µ}\mathrm{g}$ ; $10^{7}$ patiënten; een fermentor levert $2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ product per partij, tien partijen per jaar. Genoom $3.2\times 10^{9}$ bp. Omzetting van de drive $c = 0.9$ , losgelaten bij $p_{0} = 0.001$ .

Deel I — Kloneren.

Hoe vaak komt een gegeven plaats van zes basen voor in willekeurig DNA? Wat is de kans dat het gen van $1.5\,\mathrm{kb}$ geen zo’n plaats bevat, zodat het enzym kan worden gebruikt om het in zijn geheel te kloneren?
Als het er wel een bevat, hoe zou het dan toch te kloneren zijn? (Twee methoden.)
Er wordt $100\,\mathrm{ng}$ geligeerd plasmide getransformeerd. Hoeveel kolonies, en hoeveel daarvan dragen het invoegsel?
Er wordt blauw-witscreening gebruikt. Welk deel van de kolonies is wit, en hoeveel witte kolonies moeten worden opgepikt om $99\,\%$ kans te hebben dat er minstens één het gen in de juiste richting draagt (de helft van de invoegsels)?
Het recombinante plasmide is $5.5\,\mathrm{kb}$ . Een cel bevat $50$ kopieën en deelt zich elke $30\,\mathrm{min}$ . Hoeveel plasmidemoleculen zijn er na een nacht groeien ( $16\,\mathrm{h}$ ) vanuit één cel, en welke massa plasmide-DNA is dat ( $650\,\mathrm{Da}$ per basenpaar)?
Waarom heeft het plasmide een bacteriële oorsprong nodig, maar het ingevoegde menselijke gen geen bacteriële promotor om te kloneren, terwijl het er voor expressie wel een nodig heeft?

Deel II — Een virus tellen.

Het monster van een patiënt overschrijdt de drempel bij $C_{T} = 28$ . Hoeveel kopieën zaten er in de reactie? En bij een ander monster bij $C_{T} = 35$ ?
Gevoeligheid: hoeveel cycli zijn nodig om één enkele kopie tot de drempel te brengen?
De afkapwaarde van de test ligt bij $C_{T} = 38$ . Met welk aantal kopieën komt dat overeen, en waarom niet $45$ cycli gebruiken?
Er komt een verontreinigend molecuul van het product van een eerdere run in een negatief monster. Bij welke cyclus overschrijdt het de drempel? Welke laboratoriumpraktijk voorkomt dit?
De reverse transcriptie zet $40\,\%$ van het virale RNA om in DNA. Corrigeer daarvoor de telling van vraag 7 voor het eerste monster.
Twee monsters verschillen $\Delta C_{T} = 3.3$ bij $E = 1$ , maar de doeltreffendheid is in werkelijkheid $0.9$ . Welk verschil in factor meldt de analist, en wat is het werkelijke?

Deel III — Insuline per ton.

Bereken de dagelijkse massa insuline per patiënt en de jaarlijkse wereldbehoefte voor $10^{7}$ patiënten, in kilogram.
Hoeveel mol insuline is dat, en hoeveel moleculen?
Welk fermentorvolume levert dat op bij tien partijen per jaar? Vergelijk met een zwembad van $2500\,\mathrm{m}^{3}$ .
Winning uit klieren gaf $1\,\mathrm{kg}$ insuline per $8000\,\mathrm{kg}$ alvleesklier; een varkensalvleesklier weegt $100\,\mathrm{g}$ . Hoeveel varkens per jaar zou de wereld nodig hebben?
Waarom heeft het recombinante hormoon zelfs de voorkeur waar dierlijke insuline goedkoop is? Geef twee redenen.
Insulineanalogen verschillen één of twee residuen van de menselijke sequentie. Leg uit waarom een analoog toch een geneesmiddel is dat op de menselijke receptor werkt, en waarom een verandering van één residu zijn dissociatietijd kan wijzigen.

Deel IV — Bewerken en drijven.

Hoeveel exacte treffers van een gids van 20 basen plus NGG bevat het genoom door toeval (beide strengen: $6.4\times 10^{9}$ posities)?
Als Cas9 hoogstens drie verschillen duldt, hoeveel sequenties liggen er dan binnen drie verschillen van de gids, en hoeveel toevallige plaatsen buiten het doelwit levert dat op?
De bewerkte bloedstamcellen zijn er $10^{7}$ ; $80\,\%$ draagt de beoogde verstoring. Hoeveel cellen dragen een breuk buiten het doelwit op een gegeven plaats als die in één cel op $10^{4}$ wordt geknipt, en waarom is een breuk in een tumorsuppressorgen in één enkele stamcel zorgelijk?
Bereken de frequentie van de drive na $1, 2, 3$ generaties vanaf $p_{0} = 0.001$ , en schat het aantal generaties tot $0.5$ .
Een mug heeft tien generaties per jaar. Hoeveel jaar duurt de overname? Hoe verandert een fitnesskost van $20\,\%$ bij homozygoten het beeld in grote lijnen?
Een resistentie-allel ontstaat wanneer de eindverbinding en niet de recombinatie de knip herstelt, met kans $1 - c = 0.1$ per omzettingspoging. Schat het aantal resistentie-allelen dat in één generatie ontstaat in een populatie van $10^{6}$ heterozygoten, en leg uit wat er met de drive gebeurt als zij fit zijn.
Vat samen: de kopieën in het eerste monster (vraag 7), het jaarlijkse fermentorvolume voor de insuline van de wereld (vraag 15), en het aantal generaties waarin de drive de helft van de populatie bereikt (vraag 22).

Oplossing

Oplossing van Probleem 6.1.

1. Eens per $4096$ bp. $P(\text{geen plaats}) = (1 - 1/4096)^{1500} = e^{-0.37} = 0.69$ . 2. Kies een enzym zonder plaats in het gen; of vermeerder het gen met PCR met primers die aan hun 5 $'$ -uiteinden nieuwe restrictieplaatsen dragen (of gebruik stompe of ligatieonafhankelijke klonering). 3. $0.1\,\text{µ}\mathrm{g}$ $\times 2\times 10^{7} = 2\times 10^{6}$ kolonies; $10\,\%$ , dus $2\times 10^{5}$ , dragen het invoegsel. 4. Wit: $10\,\%$ . De helft van de invoegsels zit in de juiste richting, dus geeft $P(\text{geen in } n \text{ witte}) = 0.5^{n} \le 0.01$ dat $n \ge 6.6$ : pik er zeven. 5. $32$ verdubbelingen, $2^{32} = 4.3\times 10^{9}$ cellen, $2.1\times 10^{11}$ plasmiden; elk $5500\times 650 = 3.6\times 10^{6}$ Da $= 5.9\times 10^{-18}$ g: $1.3\,\text{µ}\mathrm{g}$ plasmide. 6. Kloneren vergt alleen replicatie, die de oorsprong van het plasmide levert; de menselijke promotor wordt niet door het bacteriële RNA-polymerase gelezen, dus moeten er voor expressie een bacteriële promotor en een ribosoombindingsplaats vóór de (intronvrije) coderende sequentie worden gezet. 7. $N_{0} = N_{T}/2^{C_{T}}$ : $10^{12}/2^{28} \approx 3700$ kopieën; bij $C_{T} = 35$ , $10^{12}/2^{35} \approx 29$ kopieën. 8. $2^{n} = 10^{12}$ : $n = 39.9$ , veertig cycli. 9. $10^{12}/2^{38} \approx 3.6$ kopieën. Voorbij ongeveer $40$ cycli halen één enkel verontreinigend molecuul, of artefacten van de primers, de drempel, en een monster met minder dan één kopie zegt niets. 10. Eén molecuul overschrijdt de drempel bij cyclus $40$ : een positief resultaat. Voorkom het met gescheiden ruimten en apparatuur voor het opzetten en voor het hanteren van producten, met een eenrichtingswerkstroom, met negatieve controles in elke run, en met enzymatische vernietiging van meegesleepte producten. 11. $3700/0.4 \approx 9000$ RNA-kopieën. 12. Gemeld $2^{3.3} \approx 10$ -voudig; werkelijk $1.9^{3.3} = e^{3.3\ln 1.9} \approx 8.3$ -voudig. 13. $40\times 35\,\text{µ}\mathrm{g} = 1.4\,\mathrm{mg}$ per dag, $0.51\,\mathrm{g}$ per jaar; $\times 10^{7}$ : $5100\,\mathrm{kg}$ per jaar. 14. $5.1\times 10^{6}/5800 \approx 880$ mol; $5.3\times 10^{26}$ moleculen. 15. $5.1\times 10^{6}$ g $/ (20$ g/L $) = 2.6\times 10^{5}$ L $= 260\,\mathrm{m}^{3}$ — een tiende van het zwembad. 16. $5100\times 8000 = 4.1\times 10^{7}$ kg alvleesklier, à $0.1\,\mathrm{kg}$ per stuk: $4\times 10^{8}$ varkens per jaar. 17. Het recombinante hormoon is gelijk aan het menselijke, dus wekt het geen antilichamen op en veroorzaakt het geen allergische reacties; het draagt geen dierlijke ziekteverwekkers (virussen, prionen); de aanvoer hangt niet van slacht af; en de sequentie kan worden verbeterd. 18. De residuen die de receptor raken zijn onveranderd, dus zijn binding en signalering die van insuline; de gewijzigde residuen liggen aan het oppervlak waar insulinemoleculen zich tot dimeren en hexameren verenigen, en ze veranderen wijzigt hoe snel het ingespoten depot in opneembare monomeren uiteenvalt. 19. $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}/16 \approx 3.6\times 10^{-4}$ : geen exacte toevalstreffer. 20. $1 + 60 + 1710 + 27\times 1140 = 32\,551$ sequenties; $32\,551\times 3.6\times 10^{-4} \approx 12$ toevallige plaatsen buiten het doelwit. 21. $10^{7}\times 10^{-4} = 1000$ cellen. Een stamcel leeft en deelt zich het leven van de patiënt lang; een stamcel die een tumorsuppressor heeft verloren, of een translocatie heeft opgelopen, kan een kloon stichten die een leukemie wordt. 22. $p_{1} = 0.0019$ , $p_{2} = 0.0036$ , $p_{3} = 0.0069$ ; meetkundige groei met $1.9$ per generatie geeft $\ln 500/\ln 1.9 \approx 10$ ; bij het doorrekenen van de recursie passeert de frequentie $0.5$ in generatie $11$ ( $0.45 \to 0.68$ ). 23. Ongeveer een jaar. Een kost van $20\,\%$ bij homozygoten is kleiner dan $c = 0.9$ , dus komt de drive nog steeds tot fixatie, trager, terwijl de gemiddelde fitness van de populatie daalt — en dat is het doel van een onderdrukkingsdrive; een kost boven $c$ zou haar bij een tussenliggende frequentie tot stilstand brengen. 24. $10^{6}\times 0.1 = 10^{5}$ resistentie-allelen in één generatie. Omdat zij niet te knippen zijn en, als zij fit zijn, niets kosten terwijl de drive kostbaar is, worden zij bevoordeeld en verspreiden zij zich, en wordt de drive weggedrukt — daarom richten drives zich op plaatsen waar de producten van de eindverbinding dodelijk zijn, met verscheidene gidsen tegelijk. 25. Ongeveer $3700$ kopieën in het eerste monster; zo’n $260\,\mathrm{m}^{3}$ fermentor per jaar voor de insuline van de wereld; en ongeveer $11$ generaties, een muggenjaar, voor de drive.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst