Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

9Dynamiek van het cytoskelet en celbeweging

Een neutrofiel die een bacterie door een weefsel achtervolgt kruipt tien micrometer per minuut en verandert binnen seconden van richting wanneer het spoor verschuift. Een blaasje met neurotransmitter dat in het cellichaam van een motorisch neuron is gemaakt legt een meter door het axon naar de voet af, gesleept door een motoreiwit dat stappen van acht nanometer zet, honderd per seconde, veertien dagen lang. De trilharen die de luchtpijp bekleden slaan twaalf keer per seconde in gecoördineerde golven die het stof van een dag naar de keel voeren. Dit alles wordt gedaan door drie soorten eiwitfilament die zich in seconden samenstellen en weer uiteenvallen, en door motoren die per stap één molecuul ATP verbranden. Het cytoskelet is helemaal geen skelet in de zin van een vast geraamte; het is een verzameling polymeren in voortdurende omzet, waarvan de dynamiek het mechanisme van vorm, deling en beweging is. Dit hoofdstuk behandelt de polymeren en hun kinetiek, de motoren en de natuurkunde die hen begrenst, het kruipen van een cel, en het slaan van trilharen en zweepstaarten.

9.1 Drie polymeren

Definitie 9.1 (Actinefilamenten, microtubuli, intermediaire filamenten)

Een actinefilament is een tweestrengs helicaal polymeer van bolvormig actine, $7\,\mathrm{nm}$ dik, met elke subeenheid $2.7\,\mathrm{nm}$ langs de as, en het is polair: het gekartelde (plus)uiteinde groeit sneller dan het gepunte (min)uiteinde, en elke subeenheid draagt een ATP dat na de inbouw wordt gehydrolyseerd. Een microtubulus is een holle buis met een buitendiameter van $25\,\mathrm{nm}$ , opgebouwd uit dertien protofilamenten van $\alpha\beta$ -tubulinedimeren ( $8\,\mathrm{nm}$ per dimeer), eveneens polair, met een plusuiteinde dat sneller groeit en een minuiteinde dat meestal is verankerd aan het centrosoom bij de kern; de $\beta$ -subeenheid hydrolyseert haar GTP na de inbouw. Een intermediair filament is een touw van $10\,\mathrm{nm}$ van coiled-coil-eiwitten (keratines in epitheel, vimentine in mesenchym, neurofilamenten in axonen, lamines onder het kernmembraan), apolair, zonder nucleotide en veel stabieler — eerder een kabel die trek opvangt dan een dynamische baan. Actine zit vooral onder het plasmamembraan en in uitstulpingen; microtubuli stralen uit het centrosoom en dienen als de banen van transport over lange afstand en als spoelfiguur; intermediaire filamenten geven een cel en haar kern hun mechanische veerkracht.

De drie filamenten, op schaal naar diameter. De polymeren van actine en tubuline zijn polair en hydrolyseren na het samenstellen een nucleotide, en dat maakt hen dynamisch; het intermediaire filament is een apolair touw dat voor uithoudingsvermogen is gebouwd.

Links: actine (groen) in een migrerende fibroblast — spanningsvezels door het cellichaam, een dicht netwerk aan de brede voorrand rechts. Rechts: microtubuli (oranje) die vanaf het centrosoom naast de kern (blauw) naar de celrand uitstralen.

9.2 De kinetiek van een polymeer

Stelling 9.2 (Kritische concentratie en treadmilling)

Laat een uiteinde van een filament subeenheden toevoegen met snelheid $k_{\text{on}}C$ , waarin $C$ de concentratie vrij monomeer is, en ze verliezen met snelheid $k_{\text{off}}$ . Het uiteinde groeit wanneer $C$ boven zijn kritische concentratie $C_{c} = k_{\text{off}}/k_{\text{on}}$ ligt en krimpt eronder. Hebben de twee uiteinden verschillende kritische concentraties, $C_{c}^{+} < C_{c}^{-}$ , dan is in de evenwichtstoestand waarin het filament noch langer noch korter wordt de monomeerconcentratie

C_{\text{ss}} = \frac{k_{\text{off}}^{+} + k_{\text{off}}^{-}} {k_{\text{on}}^{+} + k_{\text{on}}^{-}}, \qquad C_{c}^{+} < C_{\text{ss}} < C_{c}^{-},

en groeit het plusuiteinde terwijl het minuiteinde met dezelfde snelheid krimpt, $J = k_{\text{on}}^{+}C_{\text{ss}} - k_{\text{off}}^{+} > 0$ : subeenheden stromen van plus naar min door het filament — treadmilling — ten koste van één gehydrolyseerd nucleotide per subeenheid.

Bewijs. De nettosnelheid aan een uiteinde is $k_{\text{on}}C - k_{\text{off}}$ , nul bij $C_{c}$ . Een constante lengte vergt dat de som van de twee nettosnelheden verdwijnt, wat $C_{\text{ss}}$ geeft; die ligt tussen de twee kritische concentraties omdat zij er een gewogen gemiddelde van is ( $C_{\text{ss}} = (k_{\text{on}}^{+}C_{c}^{+} + k_{\text{on}}^{-}C_{c}^{-})/(k_{\text{on}}^{+} + k_{\text{on}}^{-})$ ). Boven $C_{c}^{+}$ groeit het plusuiteinde; onder $C_{c}^{-}$ krimpt het minuiteinde; de stroom is de nettosnelheid van het plusuiteinde. Twee uiteinden van hetzelfde chemische polymeer zouden dezelfde $C_{c}$ hebben (dezelfde evenwichtsconstante), dus vergt een verschil dat de subeenheid na de inbouw verandert — de hydrolyse van ATP of GTP — wat de uiteinden verschillend maakt en de stroom betaalt. ∎

Voorbeeld 9.3 (Actine in de reageerbuis)

Voor actine-ATP geldt $k_{\text{on}}^{+} = 11.6\,\text{µ}\mathrm{M}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ , $k_{\text{off}}^{+} = 1.4\,\mathrm{s}^{-1}$ ( $C_{c}^{+} = 0.12\,\text{µ}\mathrm{M}$ ); $k_{\text{on}}^{-} = 1.3\,\text{µ}\mathrm{M}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ , $k_{\text{off}}^{-} = 0.8\,\mathrm{s}^{-1}$ ( $C_{c}^{-} = 0.6\,\text{µ}\mathrm{M}$ ). Dan is $C_{\text{ss}} = 2.2/12.9 = 0.17\,\text{µ}\mathrm{M}$ en $J = 11.6\times 0.17 - 1.4 = 0.6$ subeenheden per seconde: $1.6\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ , niet waarneembaar. In een cel doen de filamenten honderd keer sneller aan treadmilling, omdat cofiline het oude ADP-actine van de gepunte uiteinden knipt en afstroopt, profiline vers ATP-actine op de gekartelde uiteinden laadt, en afdekeiwitten beslissen welke gekartelde uiteinden überhaupt mogen groeien: het kale polymeer levert het mechanisme, de regulatoren leveren de snelheid.

Nettogroeisnelheid van elk uiteinde van een actinefilament tegen het vrije monomeer, met de snelheidsconstanten van het voorbeeld. Tussen de twee kritische concentraties groeit het gekartelde uiteinde en krimpt het gepunte; bij de streepjeslijn heffen de twee elkaar precies op en doet het filament aan treadmilling.

Definitie 9.4 (Dynamische instabiliteit)

Microtubuli doen iets vreemders dan treadmilling. Een groeiend plusuiteinde draagt een GTP-kap van pas toegevoegde dimeren; daarachter wordt het GTP gehydrolyseerd, en GDP-tubuline, dat de voorkeur geeft aan een gekromde conformatie, wordt onder spanning recht in het rooster gehouden. Gaat de kap verloren — het uiteinde pauzeert of de groei vertraagt — dan pellen de gespannen protofilamenten naar buiten en krimpt de microtubulus met $300\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ , twintig keer haar groeisnelheid: een catastrofe, die eindigt wanneer een GTP-dimeer landt en een nieuwe kap vormt (een redding). In één populatie groeien daarom sommige microtubuli terwijl hun buren instorten: dat is de dynamische instabiliteit. Zij laat een cel haar eigen volume om de paar minuten met plusuiteinden verkennen en de hele reeks opnieuw opbouwen wanneer het centrosoom verschuift of de cel zich deelt. De cel stemt haar af met eiwitten die plusuiteinden volgen, microtubuli stabiliseren (tau, MAP2), knippen (katanine) of depolymeriseren (kinesine-13); de geneesmiddelen colchicine en de vinca-alkaloïden blokkeren het samenstellen en taxol blokkeert het uiteenvallen, en het zijn alle vergiften van de mitotische spoelfiguur die tegen kanker worden gebruikt.

Bewijsmateriaal. Mitchison en Kirschner (1984) keken naar populaties microtubuli die in vitro vanuit centrosomen waren gegroeid. Door het tubuline onder de kritische concentratie te verdunnen verwachtten zij dat alle microtubuli traag zouden krimpen; in plaats daarvan daalde het aantal microtubuli terwijl de overlevenden bleven groeien — sommige waren volledig en snel uiteengevallen, andere in het geheel niet. Losse microtubuli die later met videomicroscopie werden gefilmd schakelden abrupt tussen fasen van gestage groei en snelle krimp. De GTP-kap verklaarde beide: alleen de uiteinden met kap groeien, en het verlies van de kap is een zeldzame alles-of-nietsgebeurtenis. ∎

9.3 Motoren

Definitie 9.5 (Motoreiwitten)

Een motoreiwit zet de vrije energie van de ATP-hydrolyse om in gerichte beweging langs een filament: de myosines langs actine (myosine II, de motor van spier en samentrekking, naar het gekartelde uiteinde; myosine V, een tweekoppige blaasjesdrager die stappen van $36\,\mathrm{nm}$ zet), de kinesines langs microtubuli naar het plusuiteinde (kinesine-1 zet per ATP een stap van $8\,\mathrm{nm}$ , één tubulinedimeer, hand over hand, met ongeveer $800\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ ), en de dyneïnen naar het minuiteinde (cytoplasmatisch dyneïne sleept met zijn adaptor dynactine vracht terug naar het celcentrum; axonemale dyneïnen buigen trilharen). Een motor is processief als hij vele stappen zet voordat hij loslaat: kinesine-1 loopt alleen ongeveer een micrometer, honderd stappen; één enkele kop van myosine II maakt één slag en laat los, zodat een spier honderden koppen op één filament nodig heeft. Motoren lezen de polariteit van de baan, zodat de geografie van een cel — plusuiteinden aan de rand, minuiteinden in het centrum — een kaart is van waar elke motor zijn vracht heen brengt.

Bewijsmateriaal. Vale, Reese en Sheetz (1985) vonden kinesine als het eiwit uit het axoplasma van een inktvis dat latexbolletjes langs microtubuli in de plusrichting liet glijden, en in de jaren erna werden de tweekoppige bouw, de richting van elke familie en de retrograde partner dyneïne uitgezocht. Svoboda, Schmidt, Schnapp en Block (1993) hielden een bolletje met één enkel kinesine in een optische val en registreerden zijn positie met een nauwkeurigheid van een nanometer: het bolletje schoof op in afzonderlijke stappen van $8\,\mathrm{nm}$ , bij lage ATP-concentratie één per ATP, en liep vast tegen een kracht van ongeveer $6\,\mathrm{pN}$ . De moleculaire trap werd rechtstreeks gezien. ∎

Kinesine op zijn baan en zijn voetafdruk in een optische val. De twee koppen wisselen elkaar af en elke stap schuift de motor één tubulinedimeer op, 8\, nm; bij weinig ATP worden de stappen gescheiden door wachten op het volgende nucleotide en is de trap rechtstreeks te zien. — Kinesine op zijn baan en zijn voetafdruk in een optische val. De twee koppen wisselen elkaar af en elke stap schuift de motor één tubulinedimeer op, $8\,\mathrm{nm}$ ; bij weinig ATP worden de stappen gescheiden door wachten op het volgende nucleotide en is de trap rechtstreeks te zien.

Propositie 9.6 (Wat de natuurkunde een motor toestaat)

De hydrolyse van één ATP in de cel maakt ongeveer $50\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ vrij, dat is $8\times 10^{-20}$ J per molecuul. Een motor die per ATP $d$ opschuift tegen een kracht $F$ in verricht arbeid $Fd$ , zodat zijn blokkeerkracht niet boven $F_{\max} = \Delta G/d$ kan uitkomen: voor de stap van $8\,\mathrm{nm}$ van kinesine is dat $10\,\mathrm{pN}$ ; de gemeten $6\,\mathrm{pN}$ betekent een rendement van bijna $60\,\%$ , hoger dan van welke motor ook. De thermische energie $k_{B}T = 4.1\times 10^{-21}$ J, of $4.1\,\mathrm{pN}\,\mathrm{nm}$ , is maar een twintigste van de ATP-energie maar wordt de motor voortdurend als brownse schopjes geleverd; een motor is een inrichting die die gelijkricht, door de kop vooruit te laten diffunderen en te binden zodra hij landt, zodat de chemische energie wordt besteed aan het onomkeerbaar maken van de stap en niet aan duwen. Transport door een motor verslaat de diffusie over elke afstand die in een grote cel telt: een blaasje met diffusiecoëfficiënt $D = 1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ heeft een tijd $L^{2}/2D$ nodig om een afstand $L$ af te dwalen — een halve seconde voor een micrometer, maar $16\,000$ jaar voor een meter axon — terwijl een motor bij $1\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{s}$ die meter in twaalf dagen aflegt.

Bewijs. Op dit niveau zonder bewijs aangenomen. ∎

9.4 Hoe een cel kruipt

Definitie 9.7 (Celmigratie)

Een kruipende cel herhaalt een cyclus van vier stappen. De uitstulping: aan de voorrand polymeriseert actine in een blad tegen het membraan aan, het lamellipodium, waarvan het vertakte netwerk wordt gebouwd door het Arp2/3-complex, dat onder $70{}^{\circ}$ een nieuw filament uit de zijkant van een bestaand filament laat ontstaan, terwijl afdekeiwit de groei van elk filament begrenst en cofiline het netwerk enkele micrometers verderop hergebruikt; vingervormige filopodia van gebundelde filamenten tasten vooruit. De hechting: de nieuwe uitstulping hecht zich aan de ondergrond via integrines, transmembraanreceptoren die buiten matrixeiwitten binden en binnen, via adaptoreiwitten, actine, en die zich groeperen in focale adhesies. De samentrekking: myosine II trekt aan de spanningsvezels die aan de adhesies zijn verankerd en sleept het cellichaam vooruit. De intrekking: de adhesies achteraan laten los en de staart wordt ingetrokken. De cyclus wordt afgestemd door drie kleine GTPasen van de Rho-familie — Rac drijft lamellipodia aan, Cdc42 filopodia, Rho de spanningsvezels en de samentrekking — en die zijn de doelwitten van de receptoren die de richting van een chemische gradiënt lezen (chemotaxis) of de stijfheid en het patroon van de ondergrond.

De kruipcyclus, met van links naar rechts de bewegingsrichting: de polymerisatie van vertakt actine duwt de voorkant naar buiten, integrines verankeren haar, myosine trekt het lichaam vooruit, en de achterkant laat los.

Voorbeeld 9.8 (De komeet van Listeria)

De bacterie Listeria monocytogenes vertoont, eenmaal in een cel, op haar oppervlak één enkel eiwit, ActA, dat het Arp2/3-complex van de gastheer aantrekt. Actine polymeriseert aan het bacterieoppervlak en blijft als staart achter; de bacterie wordt met tot $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{s}$ door het cytoplasma geduwd en naar buurcellen, zonder ooit het cytosol te verlaten. De staart is een binnenstebuiten gekeerd lamellipodium, met één eiwit waar de cel er tientallen gebruikt, en zij toonde aan dat de polymerisatie van actine alleen — zonder enige motor — de kracht van de uitstulping opwekt: elke subeenheid die zich tussen het netwerk en het membraan wringt zodra een thermische schommeling een spleet heeft geopend, ratelt de voorkant $2.7\,\mathrm{nm}$ vooruit.

Methode 9.9 (De omzet van de polymeren bekijken)

Om de dynamiek van een filamentsysteem in een levende cel te meten: (1) breng de subeenheid, gefuseerd aan een fluorescerend eiwit, op een laag niveau tot expressie, zodat zij in het eigen polymeer wordt ingebouwd; (2) bleek ofwel een klein gebied met een felle laserpuls en film de terugkeer van de fluorescentie terwijl ongebleekte subeenheden uitwisselen (fluorescentieherstel na bleken, FRAP) — de halveringstijd is de verblijfstijd van de subeenheden, en het deel dat nooit terugkeert is de onbeweeglijke voorraad; of (3) breng zo weinig gemerkte subeenheid tot expressie dat het polymeer als losse spikkels verschijnt, en volg die: hun beweging is de treadmillingstroom, hun verschijnen en verdwijnen het samenstellen en uiteenvallen. In een lamellipodium stromen de spikkels ten opzichte van de ondergrond een micrometer per minuut naar achteren terwijl de rand vooruitgaat: het netwerk wordt vooraan gebouwd en enkele micrometers daarachter verbruikt.

9.5 Trilharen, zweepstaarten en een draaimotor

Definitie 9.10 (Trilharen en zweepstaarten)

Een eukaryoot trilhaar of zweepstaart is een met membraan bekleed uitsteeksel dat op het axoneem is gebouwd: negen dubbele microtubuli in een ring om een centraal paar, bijeengehouden door nexineverbindingen en radiale spaken, en gegroeid vanuit een basaal lichaampje, een gewijzigd centriool. Axonemale dyneïnen die aan elke dubbel vastzitten lopen langs de naburige dubbel naar diens minuiteinde aan de basis; omdat de dubbels aan elkaar vastzitten kunnen zij niet vrij schuiven, en het schuiven wordt omgezet in een buiging, die als een golf langs het axoneem wordt voortgeplant doordat de actieve dyneïnen van de ene kant van de ring naar de andere overschakelen. Een trilhaar is $5\text{ tot }10\,\text{µ}\mathrm{m}$ lang en slaat $10\text{ tot }20$ keer per seconde; een zweepstaart van een zaadcel is $50\,\text{µ}\mathrm{m}$ lang en golft. De eiwitten van een trilhaar worden vanuit het cellichaam omhoog gebracht door kinesine-2 en terug door dyneïne-2 langs de dubbels, het intraflagellaire transport, waarmee ook een onbeweeglijke primaire cilie — op de meeste cellen van gewervelden aanwezig, één per cel — wordt gebouwd; die cilie is een zintuiglijke antenne met receptoren voor licht (het buitensegment van een staafje), geuren, stroming en ontwikkelingssignalen, en haar gebreken veroorzaken de ciliopathieën: polycysteuze nieren, netvliesdegeneratie, obesitas, extra vingers.

Het axoneem in dwarsdoorsnede (links): negen dubbels om een centraal paar, met dyneïne-armen en radiale spaken. Rechts: dyneïnen schuiven de ene dubbel langs de volgende, en omdat de dubbels zijn vastgemaakt wordt het schuiven een buiging die langs het trilhaar loopt.

Links: het trilhaarepitheel van de luchtpijp in de rasterelektronenmicroscoop, een grasveld van trilharen tussen koepelvormige slijmproducerende cellen. Rechts: de flagellaire motor van een bacterie, een draaimotor van ringen in het celomhulsel, aangedreven door de stroom van protonen.

Propositie 9.11 (De flagellaire motor van een bacterie)

De zweepstaart van een bacterie is niet verwant aan die van een eukaryoot: een stijf helicaal filament van flagelline, $20\,\mathrm{nm}$ dik en enkele micrometers lang, gedraaid door een draaimotor die in het celomhulsel is ingebed — een rotor van zo’n vijfenveertig eiwitten omringd door een ring van statoreenheden, elk een kanaal waardoor protonen langs hun gradiënt de cel in stromen, ongeveer duizend protonen per omwenteling. De motor draait tot $300\,\mathrm{Hz}$ , keert binnen een milliseconde van richting om en ontwikkelt een koppel van zo’n $1000\,\mathrm{pN}\,\mathrm{nm}$ ; hij is uit ongeveer twintig eiwitten gebouwd waarvan de genen worden aangezet in de volgorde waarin de onderdelen worden gemonteerd, van binnen naar buiten. Bij E. coli bundelt de draaiing linksom de verscheidene zweepstaarten tot een schroef en rent de cel rechtdoor; een omschakeling naar rechtsom blaast de bundel uiteen en tuimelt de cel naar een nieuwe willekeurige richting. De chemotaxisroute beïnvloedt niets dan de frequentie van de tuimelingen — minder zodra de omstandigheden verbeteren — en dat volstaat om een gradiënt op te klimmen.

Opmerking 9.12 (Het cytoskelet is een werkwoord)

Vrijwel niets in dit hoofdstuk is een structuur in de zin waarin een bot dat is: het lamellipodium is een golf van polymerisatie, de spoelfiguur van Hoofdstuk 10 een evenwichtstoestand van groeiende en instortende microtubuli, de slag van het trilhaar een schakelpatroon van motoren. De omzet is geen prijs die de cel erbij neemt maar het mechanisme zelf, en daarom draait elk van deze systemen op de hydrolyse van nucleotiden en staat het binnen minuten stil zodra het ATP opraakt, en daarom zijn de vergiften die de polymeren in beide toestanden bevriezen — taxol of colchicine, falloïdine of cytochalasine — even dodelijk.

9.6 Opgaven

Oefening 9.1 ★

Vergelijk actinefilamenten, microtubuli en intermediaire filamenten naar diameter, subeenheid, polariteit, nucleotide en gebruikelijke rol.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.1.

Actine: $7\,\mathrm{nm}$ , bolvormig actine, polair (gekarteld/gepunt), ATP; cortex, uitstulping, samentrekking met myosine. Microtubulus: $25\,\mathrm{nm}$ , $\alpha\beta$ -tubulinedimeer, polair (plus/min), GTP; transport over lange afstand, spoelfiguur, trilharen. Intermediair filament: $10\,\mathrm{nm}$ , coiled-coil-eiwitten (keratine, vimentine, lamine), apolair, geen nucleotide; mechanische sterkte van cel en kern.

Oefening 9.2 ★

Definieer de kritische concentratie. Waarom hebben de twee uiteinden van een actinefilament verschillende kritische concentraties, en wat zou er gebeuren als zij gelijk waren?

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.2.

De monomeerconcentratie waarbij een uiteinde noch groeit noch krimpt, $k_{\text{off}}/k_{\text{on}}$ . De twee uiteinden verschillen omdat de subeenheid haar ATP na de inbouw hydrolyseert, zodat de uiteinden verschillende chemische soorten tonen (ATP-actine dat aan het gekartelde uiteinde aankomt, ADP-actine dat het gepunte uiteinde verlaat) met verschillende affiniteiten. Bij gelijke kritische concentraties zou er één evenwicht zijn: geen treadmilling, geen stroom, en geen manier om een gerichte omzet te betalen.

Oefening 9.3 ★

Noem voor elk een motor: een blaasje naar de celrand over microtubuli; een blaasje naar het centrum; de samentrekking van een spanningsvezel; het buigen van een trilhaar. Geef de richting die elk op zijn baan neemt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.3.

Naar de rand over microtubuli: kinesine, naar het plusuiteinde. Naar het centrum: cytoplasmatisch dyneïne, naar het minuiteinde. Spanningsvezel: myosine II, naar het gekartelde uiteinde van actine. Trilhaar: axonemaal dyneïne, naar het minuiteinde van de naburige dubbel (de basis).

Oefening 9.4 ★

Noem de vier stappen van de kruipcyclus en het GTPase van de Rho-familie dat elk van de eerste drie bestuurt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.4.

Uitstulping (Rac voor lamellipodia, Cdc42 voor filopodia), hechting (integrines; stroomafwaarts van Rac en Rho), samentrekking (Rho, via myosine II), intrekking van de achterkant (het loslaten van de adhesies, aangedreven door de samentrekking).

Oefening 9.5 ★★

Het plusuiteinde van een polymeer heeft $k_{\text{on}} = 5\,\text{µ}\mathrm{M}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ en $k_{\text{off}} = 1\,\mathrm{s}^{-1}$ , het minuiteinde $k_{\text{on}} = 1\,\text{µ}\mathrm{M}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ en $k_{\text{off}} = 0.8\,\mathrm{s}^{-1}$ . Bepaal de twee kritische concentraties, de evenwichtsconcentratie en de treadmillingsnelheid in subeenheden per seconde en, voor subeenheden van $2.7\,\mathrm{nm}$ , in nanometer per seconde.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.5.

$C_{c}^{+} = 1/5 = 0.2\,\text{µ}\mathrm{M}$ , $C_{c}^{-} = 0.8/1 = 0.8\,\text{µ}\mathrm{M}$ ; $C_{\text{ss}} = (1 + 0.8)/(5 + 1) = 0.3\,\text{µ}\mathrm{M}$ ; $J = 5\times 0.3 - 1 = 0.5$ subeenheden per seconde, $1.35\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ .

Oefening 9.6 ★★

Kinesine loopt met $800\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ in stappen van $8\,\mathrm{nm}$ , elk één ATP. Hoeveel ATP per seconde per motor? Het axon van een neuron is $1\,\mathrm{m}$ : hoe lang duurt de reis, en hoeveel ATP besteedt één motor eraan? Vergelijk met de diffusietijd uit Propositie 9.6.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.6.

$800/8 = 100$ ATP per seconde. De meter kost $1/(8\times 10^{-7}) = 1.25\times 10^{6}$ s, ongeveer twee weken, en $1.25\times 10^{8}$ stappen en ATP. Diffusie zou $16\,000$ jaar kosten: een verschil van een miljard keer duizend.

Oefening 9.7 ★★

Myosine V zet per ATP een stap van $36\,\mathrm{nm}$ . Wat is zijn maximale blokkeerkracht, en waarom is die lager dan die van kinesine? Welke motor is geschikter voor een zware last, en welke om snel te bewegen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.7.

$F_{\max} = 8.3\times 10^{-20}/3.6\times 10^{-8} = 2.3\,\mathrm{pN}$ . Dezelfde energie over een langere stap geeft minder kracht — een langere hefboom. Kinesine (korte stap, $6\,\mathrm{pN}$ ) past bij zware lasten; myosine V (lange stap) legt per ATP meer afstand af en past bij snel transport van lichte vracht.

Oefening 9.8 ★★

Voorspel het effect op een delende cel en op een kruipende cel van (a) taxol, (b) colchicine, (c) cytochalasine, (d) een Rac-remmer, en verklaar elk uit het mechanisme.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.8.

(a) Taxol bevriest de microtubuli: de spoelfiguur kan niet zoeken, vangen en corrigeren, en de mitose loopt vast bij het controlepunt; de kruipende cel blijft uitstulpen maar verliest haar polariteit op termijn. (b) Colchicine haalt de microtubuli weg: geen spoelfiguur, mitotische stilstand; het kruipen gaat op actine door maar zonder volgehouden richting. (c) Cytochalasine dekt de gekartelde uiteinden af: geen uitstulping, geen kruipen; de mitose verloopt wel, maar de cytokinese faalt, wat tweekernige cellen geeft. (d) Remming van Rac: geen lamellipodia, dus geen kruipen; de deling blijft grotendeels onaangetast.

Oefening 9.9 ★★

In een FRAP-experiment op een lamellipodium keert de fluorescentie met een halveringstijd van $20\,\mathrm{s}$ terug tot $90\,\%$ van haar beginwaarde. Wat zijn de verblijfstijd van actine in het netwerk en de onbeweeglijke fractie? De spikkels stromen met $1.5\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ naar achteren terwijl de rand met $1\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ vooruitgaat: met welke snelheid polymeriseert het actine aan de rand?

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.9.

Verblijfstijd van de orde van de halveringstijd, $20\,\mathrm{s}$ (tijdconstante $20/\ln 2 \approx 29\,\mathrm{s}$ ); onbeweeglijke fractie $10\,\%$ . De polymerisatie aan de rand moet zowel de voortgang als de achterwaartse stroom leveren: $1 + 1.5 = 2.5\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ .

Oefening 9.10 ★★★

Verklaar de dynamische instabiliteit met de GTP-kap, en laat zien waarom een populatie microtubuli die net boven de kritische concentratie wordt gehouden bimodaal wordt in lengte in plaats van uniform. Wat wint de cel met een gedrag dat GTP verspilt?

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.10.

Een groeiend uiteinde houdt een kap van GTP-tubuline; daarachter maakt de hydrolyse gespannen GDP-tubuline. Het verlies van de kap — een toevallige gebeurtenis waarvan de kans stijgt naarmate de groei vertraagt — laat de spanning los en het uiteinde krimpt snel tot er een nieuwe kap ontstaat. Net boven de kritische concentratie is elke microtubulus op elk moment ofwel voorzien van een kap en groeiend, ofwel zonder kap en instortend, zodat de lengtes uiteenlopen in een lange populatie en een verdwijnende in plaats van zich rond een gemiddelde te scharen. De cel wint er een snelle verkenning van haar volume mee en het vermogen om selectief te stabiliseren — een plusuiteinde dat een kinetochoor of een plek in de cortex bereikt wordt gevangen en gehouden, de overige worden binnen minuten hergebruikt: zoeken en vangen.

Oefening 9.11 ★★★

Een bacterie van $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ zwemt met $25\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{s}$ . In water overheerst op deze schaal de viskeuze weerstand en staat de cel binnen een nanometer stil zodra de motor stopt. Leg uit waarom een heen-en-weergaande beweging (een roeispaan) haar niet kan voortstuwen en een draaiende helix wel, en schat het aantal protonen dat de motor bij $100\,\mathrm{Hz}$ per seconde verbruikt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.11.

Op deze schaal is de traagheid verwaarloosbaar en zijn de vloeistofvergelijkingen omkeerbaar in de tijd: een beweging die zichzelf terugvolgt (een roeispaan die uitgaat en terugkomt) brengt het lichaam terug waar het begon, hoe snel elke slag ook is. Een draaiende helix volgt zichzelf nooit terug — haar beweging is chiraal en doorlopend — en levert dus netto stuwkracht. Bij $100\,\mathrm{Hz}$ met duizend protonen per omwenteling is dat $10^{5}$ protonen per seconde per motor.

Oefening 9.12 ★★★

Het syndroom van Kartagener — onbeweeglijke trilharen — geeft chronische bronchitis, mannelijke onvruchtbaarheid en bij de helft van de patiënten een hart aan de rechterkant. Verklaar elk daarvan uit de biologie van het axoneem, en zeg waarom het laatste maar de helft treft.

Oplossing

Oplossing van Oefening 9.12.

De trilharen van de luchtwegen kunnen niet slaan, slijm en bacteriën worden niet afgevoerd, en infecties keren terug. De zweepstaarten van zaadcellen, op hetzelfde axoneem gebouwd, zijn onbeweeglijk: onvruchtbaarheid. In het embryo drijven beweeglijke trilharen van de knoop een stroming naar links die de links-rechtsas vastlegt; zonder die stroming wordt de kant willekeurig gekozen, zodat bij de helft van de patiënten de organen zijn omgekeerd.

9.7 Vraagstuk: een neutrofiel op pad

Probleem 9.1

Weekendvraagstuk — de actinebegroting van een neutrofiel geteld, haar treadmilling berekend, de reis van een blaasje door een axon tegen de diffusie afgezet, het rendement van een motor gemeten, en de polymerisatie en de ATP-kosten van het kruipende front uitgewerkt, met als besluit de treadmillingsnelheid, de tijd om een axon over te steken en de ATP die een lamellipodium per seconde verstookt

Gegevens: een neutrofiel met een volume van $300\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ bevat actine op $200\,\text{µ}\mathrm{M}$ , half gepolymeriseerd; een subeenheid voegt $2.7\,\mathrm{nm}$ aan een filament toe. Snelheidsconstanten van actine als in Voorbeeld 9.3. Kinesine: stappen van $8\,\mathrm{nm}$ , $800\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ , blokkeerkracht $6\,\mathrm{pN}$ ; ATP-hydrolyse $\Delta G = 50\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ; $k_{B}T = 4.1\,\mathrm{pN}\,\mathrm{nm}$ ; diffusiecoëfficiënt van een blaasje $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ ; axonlengte $1\,\mathrm{m}$ . Het lamellipodium is $20\,\text{µ}\mathrm{m}$ breed met $200$ filamenten per micrometer rand, en gaat $10\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ vooruit; het netwerk valt $3\,\text{µ}\mathrm{m}$ achter de rand uiteen.

Deel I — De actinebegroting.

Hoeveel actinemoleculen bevat de cel, en hoeveel zitten er in filamenten?
Welke totale filamentlengte is dat? Hoeveel filamenten zijn het, als een filament gemiddeld $0.25\,\text{µ}\mathrm{m}$ is?
Het vrije actine is $100\,\text{µ}\mathrm{M}$ , ver boven de kritische concentratie van het gekartelde uiteinde. Waarom groeien de filamenten niet eenvoudig tot het monomeer op is? (Twee eiwitten.)
Treadmilling in vitro: bereken $C_{\text{ss}}$ en $J$ uit de snelheidsconstanten, en de treadmillingsnelheid in nanometer per seconde en in micrometer per minuut.
In de cel is de werkelijke snelheid $1\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ . Met welke factor versnellen de regulatoren het kale polymeer?
Elke subeenheid die door het filament trekt kost één ATP. Als alle $2\times 10^{5}$ filamenten met de celsnelheid aan treadmilling deden, hoeveel ATP per seconde is dat, en welk deel is dat van de totale omzet van een cel van ongeveer $10^{9}$ ATP per seconde?

Deel II — Een blaasje door het axon.

Hoe lang doet een blaasje dat door kinesine wordt getrokken over het axon, en hoeveel stappen en ATP besteedt de motor eraan?
Hoe lang zou de diffusie over $1\,\mathrm{m}$ duren? En over $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ , de breedte van een cellichaam? Wat zegt de vergelijking over waar cellen zich op diffusie kunnen verlaten?
Bereken de energie per ATP in joule en in eenheden $k_{B}T$ .
Bereken de maximale kracht van een motor met stappen van $8\,\mathrm{nm}$ , en het rendement van kinesine bij blokkering.
Een blaasje met straal $100\,\mathrm{nm}$ in cytoplasma met viscositeit $0.01\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ (tien keer water) dat met $800\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ beweegt ondervindt een weerstand $F = 6\pi\eta r v$ . Bereken die, en vergelijk met de blokkeerkracht: hoeveel motoren zijn er nodig?
Het axon van een neuron draagt ongeveer $10^{4}$ blaasjes tegelijk. Wat is het totale ATP-verbruik van het transport per seconde, en hoe verhoudt dat zich tot de kosten van het vuren van het neuron, ongeveer $10^{9}$ ATP per seconde? Wat betekent dit voor een neuron waarin de mitochondriën het laten afweten?

Deel III — Het front.

Reken de randsnelheid om naar nanometer per seconde, en bereken hoeveel subeenheden per seconde elk filament moet toevoegen om bij te blijven.
Hoeveel filamenten duwen tegen de rand, en hoeveel subeenheden per seconde verbruikt de hele rand?
Elke toegevoegde subeenheid is één gehydrolyseerd ATP dat later wordt hergebruikt. Bereken de ATP per seconde voor de uitstulping en het deel van de $10^{9}$ per seconde van de cel.
Het netwerk achter de rand is $3\,\text{µ}\mathrm{m}$ diep en valt daar uiteen. Wat is de levensduur van een subeenheid in het netwerk, en hoeveel subeenheden zitten er op elk moment in?
Het membraan biedt weerstand aan de uitstulping met een kracht van ongeveer $1\,\mathrm{pN}$ per filament. Bereken de arbeid per toegevoegde subeenheid ( $F\times 2.7\,\mathrm{nm}$ ) in $k_{B}T$ en zeg of de brownse ratel — een thermische schommeling die een spleet van $2.7\,\mathrm{nm}$ opent — aannemelijk is.
Waarom heeft de komeetstaart van Listeria geen motor nodig, en hoe hard kan zij duwen als zij dezelfde machinerie aantrekt?

Deel IV — Richting.

De neutrofiel neemt een lokstof waar waarvan de concentratie over haar breedte van $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ met $2\,\%$ stijgt. Hoeveel meer receptoren zijn er met $50\,000$ receptoren en een $K_{d}$ gelijk aan de gemiddelde concentratie bezet op de voorste helft dan op de achterste? (Bezetting $\theta = C/(C + K_{d})$ ; neem per kant de helft van de receptoren.)
De toevallige schommeling in het aantal bezette receptoren aan één kant is ongeveer de wortel uit dat aantal. Is het verschil uit vraag 19 op één enkel moment waarneembaar? Hoe helpt middelen over enkele seconden?
Welk GTPase moet vooraan en welk achteraan worden geactiveerd opdat de cel zich naar de bron draait? Wat zou een cel doen die overal constitutief actief Rac heeft?
De cel bereikt de bacterie in $3\,\mathrm{min}$ vanaf $30\,\text{µ}\mathrm{m}$ afstand. Toets de snelheid aan de gegevens.
Een cel zonder Arp2/3 beweegt in plaats daarvan met blebbing — door druk gedreven uitstulpingen van membraan. Welke stap van de cyclus is vervangen, en wat zegt dat over de rol van actine in de overige stappen?
De hele kruipcyclus duurt minuten, en toch draait de cel binnen seconden wanneer de gradiënt verschuift. Verklaar dat met de levensduur van het netwerk uit vraag 16.
Vat samen: de treadmillingsnelheid in vitro (vraag 4), de tijd die een blaasje over het axon doet (vraag 7), en de ATP per seconde die aan de uitstulping wordt besteed (vraag 15).

Oplossing

Oplossing van Probleem 9.1.

1. $300\,\text{µ}\mathrm{m}^{3} = 3\times 10^{-13}$ L; $\times 2\times 10^{-4}$ mol/L $= 6\times 10^{-17}$ mol $= 3.6\times 10^{7}$ moleculen; $1.8\times 10^{7}$ in filamenten. 2. $1.8\times 10^{7}\times 2.7\,\mathrm{nm} = 4.9\,\mathrm{cm}$ filament; bij $0.25\,\text{µ}\mathrm{m}$ per stuk ongeveer $2\times 10^{5}$ filamenten. 3. Afdekeiwit blokkeert de meeste gekartelde uiteinden, en profiline en thymosine- $\beta$ 4 binden de monomeren, zodat het werkelijk vrije ATP-actine bij de kritische concentratie ligt; de groei blijft beperkt tot de uiteinden die de cel vrijmaakt. 4. $C_{\text{ss}} = 2.2/12.9 = 0.17\,\text{µ}\mathrm{M}$ ; $J = 11.6 \times 0.17 - 1.4 = 0.6$ subeenheden per seconde; $1.6\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ $= 0.1\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ . 5. $1/0.1 = 10$ -voudig. 6. $1\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ $= 16.7\,\mathrm{nm}/\mathrm{s} = 6.2$ subeenheden per seconde per filament; $\times 2\times 10^{5} = 1.2\times 10^{6}$ ATP per seconde, ongeveer $0.1\,\%$ van de omzet van de cel. 7. $1/(8\times 10^{-7}) = 1.25\times 10^{6}$ s $\approx 14.5$ dagen; $1.25\times 10^{8}$ stappen en ATP. 8. $L^{2}/2D$ : $(1)^{2}/(2\times 10^{-12}) = 5\times 10^{11}$ s $\approx 16\,000$ jaar voor een meter; $(10^{-5})^{2}/(2\times 10^{-12}) = 50$ s voor $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Diffusie voldoet binnen een cellichaam; alles wat langer is vergt motoren. 9. $5\times 10^{4}/6.02\times 10^{23} = 8.3\times 10^{-20}$ J $= 20\,k_{B}T$ . 10. $8.3\times 10^{-20}/8\times 10^{-9} = 10\,\mathrm{pN}$ ; rendement $6/10 \approx 60\,\%$ . 11. $F = 6\pi\times 0.01\times 10^{-7}\times 8\times 10^{-7} = 1.5\times 10^{-14}$ N $= 0.015\,\mathrm{pN}$ , vierhonderd keer onder de blokkeerkracht: één motor is ruim voldoende tegen de viskeuze weerstand; de echte lasten zijn obstakels en verankeringen. 12. $10^{4}\times 100 = 10^{6}$ ATP per seconde, $0.1\,\%$ van de begroting van het neuron: het transport is goedkoop. Maar motoren stoppen zodra het ATP daalt, zodat het falen van de mitochondriën de synaps berooft van alles wat in het cellichaam wordt gemaakt — het falende axonale transport dat bij neurodegeneratieve ziekten wordt gezien. 13. $10\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ $= 167\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ ; $167/2.7 = 62$ subeenheden per seconde per filament. 14. $200\times 20 = 4000$ filamenten; $4000\times 62 = 2.5\times 10^{5}$ subeenheden per seconde. 15. $2.5\times 10^{5}$ ATP per seconde, $0.025\,\%$ van de begroting. 16. $3\,\text{µ}\mathrm{m}/(10\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}) = 0.3\,\mathrm{min} = 18\,\mathrm{s}$ ; $2.5\times 10^{5}\times 18 = 4.5\times 10^{6}$ subeenheden in het netwerk. 17. $1\,\text{pN}\times 2.7\,\text{nm} = 2.7\,\mathrm{pN}\,\mathrm{nm} = 0.66\,k_{B}T$ : een schommeling van die energie treedt op met kans ongeveer $e^{-0.66} \approx 0.5$ — spleten van één subeenheid gaan voortdurend open, en de ratel is volstrekt aannemelijk. 18. De polymerisatie zelf duwt, waarbij de bacterie het “membraan” aan de voorkant van haar eigen netwerk is; met de Arp2/3-machinerie van de cel haalt zij de snelheid van een lamellipodium en meer — tot $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{s}$ , $30\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ . 19. Bij $C = K_{d}$ is $\theta = 1/2$ en $\mathrm{d}\theta/ \mathrm{d}C = 1/(4C)$ : een verschil van $2\,\%$ in $C$ geeft $\Delta\theta = 0.005$ ; met $25\,000$ receptoren per kant zijn er vooraan $125$ meer bezet. 20. Elke kant heeft ongeveer $12\,500$ bezette receptoren, die schommelen met $\sqrt{12\,500} \approx 110$ , zodat het verschil van twee kanten met ongeveer $160$ schommelt: de $125$ verdwijnt op elk moment in de ruis. Receptoren binden ongeveer eens per seconde opnieuw; middelen over $N$ seconden krimpt de ruis met $\sqrt{N}$ — tien seconden brengen haar op $50$ en de gradiënt wordt gelezen. 21. Rac (met Cdc42) vooraan, Rho achteraan. Met overal actief Rac stulpt de cel rondom uit, spreidt zij zich en komt zij nergens. 22. $30/3 = 10\,\text{µ}\mathrm{m}/\mathrm{min}$ : zoals gegeven. 23. De uitstulping is vervangen door blebbing dat door druk wordt gedreven; hechting en samentrekking hangen nog steeds van actine en myosine af, zodat actine voor de rest van de cyclus onmisbaar blijft. 24. Het front wordt elke $18\,\mathrm{s}$ opnieuw gebouwd: een verschuiving in de activiteit van Rac stuurt de polymerisatie binnen één levensduur van het netwerk om, het nieuwe front gaat voorop, en de trage stappen achteraan volgen. 25. Treadmilling in vitro $1.6\,\mathrm{nm}/\mathrm{s}$ ; ongeveer $14.5$ dagen om het axon af te leggen; zo’n $2.5\times 10^{5}$ ATP per seconde voor de uitstulping.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst