Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

12Bacteriologie: groei, fysiologie en genetica

Eén enkele cel van Escherichia coli in warme bouillon deelt zich elke twintig minuten. Ongehinderd zouden haar nakomelingen binnen twee dagen zwaarder wegen dan de aarde; in werkelijkheid houden zij binnen uren op, wanneer de suiker op is, en blijven zij wekenlang in een toestand die de honger overleeft. Een verwante bacterie wordt, met een wond en een paar uur, honderd miljoen cellen en koorts; honderd jaar geleden doodde zij een derde van de patiënten die zij besmette, en sinds 1941 heeft het gif van een schimmel ertegen meer levens gered dan enig ander geneesmiddel — terwijl de bacteriën in diezelfde tachtig jaar wegen hebben gevonden om elk gemaakt antibioticum heen. Bacteriën waren de organismen waarin voor het eerst werd aangetoond dat genen DNA zijn, waarin de genregulatie voor het eerst werd begrepen, en waaraan het gereedschap van Hoofdstuk 6 is ontleend. Dit hoofdstuk behandelt hen als organismen: hun omhulsel, de rekenkunde van hun groei in een kolf en in een doorlopende kweek, de manier waarop een populatie haar eigen dichtheid waarneemt, het verkeer van genen tussen cellen, en de chemie en de evolutie van antibiotica en resistentie.

12.1 De bacteriecel

Definitie 12.1 (Het omhulsel)

Op enkele na is elke bacterie omsloten door een wand van peptidoglycaan: ketens van afwisselend N-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur, door korte peptiden dwarsverbonden tot één molecuul dat de cel omringt en de turgordruk van het cytoplasma — enkele atmosferen — weerstaat. Grampositieve bacteriën hebben een dikke wand van $20\text{ tot }80\,\mathrm{nm}$ , uit vele lagen, doorregen met teichoïnezuren; gramnegatieve bacteriën hebben een dunne wand van één of twee lagen en daarbuiten een tweede lipidedubbellaag, het buitenmembraan, waarvan de buitenste laag uit lipopolysacharide bestaat (LPS, endotoxine — het molecuul dat het aangeboren afweersysteem van Hoofdstuk 15 herkent en dat septische shock veroorzaakt), met daartussen een periplasma. Porines in het buitenmembraan laten kleine moleculen door en houden veel antibiotica buiten. Daarbuiten kunnen een polysacharidekapsel tegen fagocyten liggen, zweepstaarten om te zwemmen (Hoofdstuk 9) en pili om te hechten en te conjugeren. Binnenin is het chromosoom — bij de meeste soorten één cirkelvormig molecuul van $1\text{ tot }10\,\mathrm{Mb}$ — zonder membraan tot een nucleoïde gevouwen, naast plasmiden. Sommige geslachten (Bacillus, Clostridium) kunnen een kopie van het chromosoom in een dikke mantel sluiten als endospore, uitgedroogd en stofwisselend inert, die koken, straling en eeuwen droogte overleeft en ontkiemt zodra er weer voedingsstoffen zijn.

Methode 12.2 (De gramkleuring)

De oudste toets in het bacteriologisch laboratorium (Gram, 1884) bepaalt nog altijd de eerste keuze van antibioticum. (1) Strijk het monster uit en fixeer het met warmte; (2) kleur met kristalviolet en daarna met jodium, dat binnen de cellen een groot onoplosbaar complex met de kleurstof vormt; (3) was met alcohol: het dikke peptidoglycaan van grampositieven, door de alcohol uitgedroogd, houdt het complex vast en de cellen blijven paars, terwijl de dunne wand van gramnegatieven het eruit laat; (4) kleur na met safranine, dat de nu kleurloze gramnegatieven roze maakt. Vorm en schikking — kokken in trossen (stafylokokken) of ketens (streptokokken), staafjes, spiralen — brengen de determinatie verder, en een paarse kok in trossen uit een abces is een stafylokok nog voordat er een kweek is opgekomen.

Links: een gramkleuring — paarse grampositieve kokken in trossen, roze gramnegatieve staafjes. Rechts: cellen van Bacillus gekleurd voor endosporen, de heldergroene ovalen in roze cellen en vrije sporen ernaast. — Links: een gramkleuring — paarse grampositieve kokken in trossen, roze gramnegatieve staafjes. Rechts: cellen van *Bacillus* gekleurd voor endosporen, de heldergroene ovalen in roze cellen en vrije sporen ernaast.

De twee omhulsels. Grampositieven wikkelen het membraan in vele lagen peptidoglycaan; gramnegatieven hebben een dunne laag en een buitenmembraan van lipopolysacharide, doorboord door porines, dat veel antibiotica buiten houdt en het endotoxine levert dat septische shock veroorzaakt.

12.2 Groei

Stelling 12.3 (Exponentiële groei, de wet van Monod en de chemostaat)

Een populatie van $N$ cellen die zich met generatietijd $T$ deelt groeit als $N(t) = N_{0}\,2^{t/T} = N_{0}e^{\mu t}$ met specifieke groeisnelheid $\mu = \ln 2/T$ . De snelheid hangt van de beperkende voedingsstof $S$ af volgens de wet van Monod

\mu(S) = \mu_{\max}\,\frac{S}{K_{S} + S},

die bij $\mu_{\max}$ verzadigt en half maximaal is bij $S = K_{S}$ . In een chemostaat — een vat van volume $V$ waarin vers medium met een voedingsstofconcentratie $S_{0}$ met snelheid $F$ instroomt en waaruit kweek met dezelfde snelheid vertrekt, met verdunningssnelheid $D = F/V$ — geldt in evenwicht

\mu(S^{*}) = D,\qquad S^{*} = \frac{K_{S}D}{\mu_{\max} - D},\qquad X^{*} = Y\,(S_{0} - S^{*}),

waarin $X$ de celdichtheid is en $Y$ de opbrengst (cellen gemaakt per eenheid voedingsstof). De onderzoeker stelt de groeisnelheid in door aan een pomp te draaien; de kweek antwoordt door de voedingsstof aan te passen die zij achterlaat. Overschrijdt $D$ de waarde $\mu(S_{0})$ , dan kunnen de cellen het niet bijhouden en worden zij uitgespoeld.

Bewijs. Cellen: $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t = \mu(S)X - DX$ , groei min uitstroom; in evenwicht met $X^{*} > 0$ geldt $\mu(S^{*}) = D$ , en de wet van Monod omkeren geeft $S^{*}$ . Voedingsstof: $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = D(S_{0} - S) - \mu(S)X/Y$ , instroom min uitstroom min verbruik; in evenwicht, met $\mu = D$ , geldt $D(S_{0} - S^{*}) = DX^{*}/Y$ , waaruit $X^{*}$ volgt. De evenwichtstoestand bestaat alleen als $S^{*} < S_{0}$ , dat wil zeggen $D < \mu(S_{0})$ ; daarboven is de enige evenwichtstoestand $X = 0$ , uitspoeling. Stabiliteit: stijgt $X$ boven $X^{*}$ , dan verbruikt zij meer, zakt $S$ onder $S^{*}$ , zakt $\mu$ onder $D$ en neemt $X$ af — een negatieve terugkoppeling via de voedingsstof. ∎

Voorbeeld 12.4 (Een kweek in getallen)

E. coli in rijk medium bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $T = 20\,\mathrm{min}$ , $\mu = 2.1\,\mathrm{h}^{-1}$ . Vanuit één cel na twaalf uur $2^{36}$ — $7\times 10^{10}$ cellen, ongeveer $70\,\mathrm{mg}$ , en daar houdt een kolf van $100\,\mathrm{mL}$ op bij gebrek aan zuurstof en suiker; “de massa van de aarde in twee dagen” is $2^{144}\approx 10^{43}$ cellen, en de rekensom laat alleen zien dat exponentiële groei nooit voortduurt. In een chemostaat op glucose met $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ en $Y = 0.5\,\mathrm{g}$ cellen per gram glucose laat een verdunningssnelheid van $0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ glucose over en houdt zij $X^{*} = 0.495\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ cellen vast, die zich onbeperkt elke $83\,\mathrm{min}$ delen. Met de chemostaat wordt de fysiologie bij een vaste groeisnelheid bestudeerd, en worden duizenden generaties evolutie in een fles doorlopen.

Links: een kweek in een kolf — een vertraging terwijl de enzymen worden aangezet, exponentiële groei, een stationaire fase wanneer de voedingsstof op is, en trage sterfte. Rechts: de wet van Monod, de groeisnelheid tegen de beperkende voedingsstof, met K_S de concentratie voor half maximale groei. — Links: een kweek in een kolf — een vertraging terwijl de enzymen worden aangezet, exponentiële groei, een stationaire fase wanneer de voedingsstof op is, en trage sterfte. Rechts: de wet van Monod, de groeisnelheid tegen de beperkende voedingsstof, met $K_{S}$ de concentratie voor half maximale groei.

Definitie 12.5 (Fasen en toestanden)

In een verse kolf (een kweek in een gesloten vat) pauzeren de cellen eerst — de vertragingsfase, terwijl zij de enzymen aanzetten die het nieuwe medium vraagt — groeien zij daarna exponentieel, en houden zij op zodra een voedingsstof op is of een afvalstof zich ophoopt: de stationaire fase, waarin de cellen krimpen, hun omhulsel verdikken, hun nucleoïde om beschermende eiwitten samenpakken, via de alternatieve sigmafactor RpoS hun stressgenen aanzetten, en maanden kunnen overleven; daarna volgt een sterftefase waarin de meeste cellen uiteenvallen en enkele op de resten verderleven. Sommige soorten beantwoorden de honger met een ontwikkelingsprogramma: Bacillus subtilis deelt zich asymmetrisch en de grotere cel verzwelgt de kleinere en bouwt de spore eromheen, een reeks van acht uur die wordt bestuurd door een cascade van sigmafactoren — de subeenheden die het RNA-polymerase naar één stel promotoren sturen — afwisselend in de twee compartimenten, het eerste bacteriële voorbeeld van differentiatie en van signalering van cel tot cel door een wand heen.

12.3 Elkaar waarnemen

Definitie 12.6 (Quorumdetectie)

Bacteriën nemen hun eigen dichtheid waar met quorumdetectie: elke cel scheidt met een constante snelheid een klein signaalmolecuul af, een auto-inductor — geacyleerde homoserinelactonen bij gramnegatieven, korte peptiden bij grampositieven —; de concentratie in het medium stijgt met het aantal cellen, en zodra zij een drempel overschrijdt bindt zij een receptor die een stel genen aanzet, waaronder het synthase van de auto-inductor zelf (vandaar de naam). De genen die zo worden bestuurd zijn die welke alleen in gezelschap lonen: licht bij Vibrio fischeri, virulentiefactoren bij Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa, de matrix van een biofilm, de bekwaamheid om DNA op te nemen, en het doden van buren. Het meeste waarnemen bij bacteriën verloopt via tweecomponentensystemen: een histidinekinase in het membraan dat een prikkel bemerkt en een responsregulator in het cytoplasma fosforyleert, die DNA bindt — een cel heeft er tientallen, voor fosfaat, osmolariteit, zuurstof en de auto-inductoren van andere soorten.

Bewijsmateriaal. Nealson, Platt en Hastings (1970) kweekten de lichtgevende zeebacterie Vibrio fischeri uit een verdund entsel en vonden dat de cellen geen licht maakten tot zij een dichtheid van zo’n $10^{7}$ per milliliter bereikten, waarna zij allemaal tegelijk oplichtten; medium waarin een dichte kweek was gegroeid, gesteriliseerd en aan een verdunde kweek toegevoegd, zette het licht meteen aan. De cellen telden een afgescheiden stof, niet de tijd of de voeding. De stof werd geïdentificeerd als een acylhomoserinelacton (Eberhard, 1981), en de genen — luxI voor het synthase, luxR voor de receptor, en het luciferase-operon dat zij besturen — werden in E. coli gekloneerd, dat toen bij dichtheid oplichtte. In de inktvis die de bacterie bij $10^{10}$ per milliliter huisvest schijnt het lichtorgaan; in zee, waar de bacteriën verdund zijn, zijn zij donker en besparen zij de kosten. ∎

Propositie 12.7 (Een dichtheidsdrempel)

Laat elk van $N$ cellen in een volume $V$ auto-inductor afscheiden met snelheid $p$ moleculen per seconde, en laat het molecuul met eerste-ordesnelheid $k$ verloren gaan (afgebroken of verdund). De concentratie nadert $A^{*} = pN/(kV)$ , evenredig met de celdichtheid $N/V$ , met tijdconstante $1/k$ ; de receptor gaat aan wanneer $A^{*}$ zijn drempel $A_{\text{thr}}$ bereikt, dat wil zeggen bij de dichtheid

\left(\frac{N}{V}\right)_{\text{thr}} = \frac{k\,A_{\text{thr}}}{p}.

In een afgesloten ruimte — het lichtorgaan van een inktvis, een abces, het slijm van een long — is $k$ klein omdat het signaal niet wordt afgevoerd, zodat de drempeldichtheid door minder cellen wordt gehaald; in open water wordt zij nooit gehaald. De cel meet dus niet haar aantal maar haar aantal per eenheid van het volume dat zij deelt, en dat is wat telt voor elke gezamenlijke daad; de positieve terugkoppeling van de auto-inductor op zijn eigen synthase maakt de schakeling scherp: zodra enkele cellen de drempel overschrijden, duwt hun extra uitstoot de rest eroverheen.

Bewijs. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = pN/V - kA$ heeft de evenwichtstoestand $A^{*} = pN/(kV)$ en nadert die als $e^{-kt}$ . Stelt men $A^{*} = A_{\text{thr}}$ en lost men naar $N/V$ op, dan volgt de drempeldichtheid. ∎

Links: een dichte kweek van Vibrio fischeri die oplicht, naast een verdunde die donker is — dezelfde cellen, boven en onder hun quorum. Rechts: een schijfjestest; de diameter van elke heldere zone meet de gevoeligheid van de bacterie voor het antibioticum op dat schijfje, en het schijfje zonder zone wijst op resistentie. — Links: een dichte kweek van *Vibrio fischeri* die oplicht, naast een verdunde die donker is — dezelfde cellen, boven en onder hun quorum. Rechts: een schijfjestest; de diameter van elke heldere zone meet de gevoeligheid van de bacterie voor het antibioticum op dat schijfje, en het schijfje zonder zone wijst op resistentie.

12.4 Het verkeer van genen

Definitie 12.8 (Horizontale genoverdracht)

Bacteriën planten zich klonaal voort maar wisselen genen uit langs drie wegen. De transformatie: de opname van naakt DNA uit de omgeving door een bekwame cel — de weg waarlangs de pneumokokken van Griffith hun kapsel kregen en waarlangs Avery aantoonde dat het transformerende beginsel DNA was (1944). De transductie: een faag die een stuk gastheer-DNA inpakt en in de volgende gastheer spuit (Hoofdstuk 13). De conjugatie: de overdracht van een plasmide door een pilus en een paringsbrug van een donor die het draagt naar een ontvanger, aangetoond door Lederberg en Tatum (1946) met auxotrofe stammen van E. coli die alleen prototrofe recombinanten opleverden wanneer zij werden gemengd. Conjugatieve plasmiden dragen hun eigen overdrachtsgenen; veel dragen ook resistentiegenen, vaak samengebracht in integronen en geflankeerd door transposons, zodat één paring resistentie tegen vijf antibiotica tegelijk kan overdragen, over de soortgrens heen. Het gevolg is dat een bacteriesoort een kerngenoom heeft dat alle stammen delen en een aanvullend genoom dat verschilt — een pangenoom: twee stammen van E. coli kunnen in een vijfde van hun genen verschillen, en ziekteverwekkende stammen verschillen van onschuldige vooral door verworven eilanden met virulentiegenen. De genen van het mutatiehoofdstuk uit het boek van jaar 2 ontstaan door mutatie; de genen van dit hoofdstuk arriveren meestal.

De drie wegen van horizontale overdracht. Genen voor resistentie, virulentie en stofwisseling verhuizen tussen cellen — en tussen soorten — sneller dan de mutatie ze zou kunnen maken.

Bewijsmateriaal. Robert Koch (1876–1884) stelde vast dat een bepaalde bacterie een bepaalde ziekte veroorzaakt: hij isoleerde Bacillus anthracis uit zieke dieren, kweekte haar zuiver op een vaste bodem (de agarplaat en de enkele kolonie zijn uitvindingen van zijn laboratorium), toonde aan dat de kweek miltvuur in gezonde dieren opwekte en er weer uit te isoleren viel — de postulaten die een ziekteverwekker nog altijd bepalen — en ging daarna door met de tuberkelbacil en de choleravibrio. Alexander Fleming (1928) merkte op dat een schimmel die een plaat met stafylokokken had verontreinigd een heldere zone om zich heen had gemaakt; de stof, penicilline, werd gezuiverd en Florey en Chain (1940–1941) toonden aan dat zij infecties genas, en binnen een decennium waren resistente stafylokokken met een enzym dat penicilline vernietigt gewoon in ziekenhuizen — een waarschuwing die Fleming zelf in zijn Nobellezing gaf. ∎

Robert Koch, die bewees dat bepaalde bacteriën bepaalde ziekten veroorzaken en de methoden bedacht om ze te kweken (Wellcome Collection, CC BY 4.0). Rechts: Alexander Fleming in zijn laboratorium met platen van de schimmel waarvan het product penicilline werd (archief van de Amerikaanse marine, publiek domein).

12.5 Antibiotica en resistentie

Definitie 12.9 (Antibiotica)

Een antibioticum is een molecuul dat bacteriën doodt of hun groei stopt bij concentraties die voor de gastheer onschadelijk zijn, door in te grijpen op een doelwit dat de gastheer niet heeft of in een andere vorm heeft — de selectieve toxiciteit. De doelwitten zijn weinig talrijk. De celwand: de $\beta$ -lactams (penicillines, cefalosporines, carbapenems) bootsen het eindstandige D-Ala-D-Ala van het peptide van het peptidoglycaan na en acyleren de enzymen die het dwarsverbinden, zodat de groeiende wand zwak is en de cel onder haar eigen turgor barst; vancomycine bindt het D-Ala-D-Ala zelf. Het ribosoom, waarvan de bacteriële vorm van de eukaryote verschilt: de aminoglycosiden (de kleine subeenheid, wat verkeerd lezen veroorzaakt), de tetracyclines (die de intrede van tRNA blokkeren), de macroliden en chlooramfenicol (de uitgangstunnel en het peptidyltransferase van de grote subeenheid). Het DNA-gyrase en topo-isomerase IV: de chinolonen. Het RNA-polymerase: rifampicine. De foliumzuursynthese, die dieren niet doen: de sulfonamiden en trimethoprim. Het membraan: de polymyxines, een laatste redmiddel. De minimaal remmende concentratie (MRC) is de laagste concentratie van een middel die zichtbare groei van een stam verhindert; een stam heet resistent wanneer haar MRC hoger ligt dan de concentratie die het middel in de patiënt haalt.

Methode 12.10 (Gevoeligheid meten)

Twee toetsen. De bouillonverdunning: ent een vast aantal cellen (ongeveer $5\times 10^{5}$ per milliliter) in een rij buisjes of putjes met het antibioticum in stappen van twee, laat een nacht groeien, en lees het eerste heldere putje af: die concentratie is de MRC. De schijfjesdiffusie: strijk de stam op een agarplaat uit, leg er papieren schijfjes met bekende hoeveelheden van verscheidene antibiotica op, en laat groeien; het middel diffundeert naar buiten, de concentratie daalt met de afstand, en de groei wordt geremd tot de straal waar de concentratie de MRC is, zodat de diameter van de heldere zone — afgelezen tegen geijkte tabellen — op één plaat de gevoeligheid voor elk schijfje geeft. Beide toetsen kosten een dag; het genoom sequencen op bekende resistentiegenen en mutaties kost dezelfde dag en begint ze te vervangen.

Definitie 12.11 (Resistentie)

Een bacterie weerstaat een antibioticum op een van vijf manieren. Zij vernietigt het middel: de $\beta$ -lactamasen hydrolyseren de $\beta$ -lactamring, en de varianten met verbreed spectrum en de carbapenemasen vernietigen nu ook de nieuwste. Zij verandert het doelwit: een mutatie in het ribosomale eiwit of het gyrase dat het middel bindt, of, bij MRSA (methicillineresistente Staphylococcus aureus), een verworven gen voor een dwarsverbindend enzym dat de $\beta$ -lactams niet binden; de resistentie tegen vancomycine vervangt het eindstandige D-Ala door D-lactaat, dat het middel niet herkent. Zij pompt het middel naar buiten met effluxpompen, vaak met een brede specificiteit. Zij verhindert dat het middel binnenkomt, door een porine te verliezen. Of zij omzeilt de geblokkeerde stap met een ander enzym. Doelwitmutaties ontstaan bij toeval in de patiënt met snelheden van $10^{-8}$ tot $10^{-6}$ per deling en worden tijdens de behandeling geselecteerd; de enzymen en de pompen worden meestal op plasmiden verworven uit het enorme reservoir van bodem- en darmbacteriën, waarin zij in de loop van tijdperken zijn ontstaan tegen de antibiotica die schimmels en andere bacteriën maken. Persisters — sluimerende cellen die een middel overleven zonder genetisch resistent te zijn — verklaren de terugval na een behandeling die had moeten werken.

Propositie 12.12 (Waarom resistentie onvermijdelijk is en de combinatie het antwoord)

Een infectie van $10^{9}$ cellen die wordt behandeld met een middel waartegen resistentiemutaties met $10^{-8}$ per deling ontstaan bevat al ongeveer tien resistente cellen; het middel doodt de rest en die tien nemen het over — precies de rekenkunde van Hoofdstuk 11, omdat een bacteriepopulatie en een tumor beide evoluerende klonen onder selectie zijn. Twee middelen met onafhankelijke doelwitten staan tegenover een dubbel resistente cel bij $10^{-16}$ per deling, en die bevat een miljard cellen niet. Daarom wordt de tuberculose, waarvan de haarden $10^{8}$ – $10^{9}$ bacillen bevatten, sinds de jaren vijftig met drie of vier middelen tegelijk behandeld, en daarom bracht behandeling met één middel binnen maanden resistentie voort; en daarom selecteert elk gebruik van een antibioticum, bij een patiënt of in een mestbedrijf, ergens resistentie, en is het tempo van nieuwe antibiotica — sinds de jaren zestig geen enkele nieuwe klasse tegen gramnegatieven — de maat waartegen de verliezen worden geteld. De remedies zijn die van elke evolutionaire wedstrijd: gebruik minder, combineer, maak de kuur af zodat deels resistente cellen niet overleven om zich voort te planten, en zoek nieuwe doelwitten.

Voorbeeld 12.13 (Het venster van de mutantselectie)

Een stam heeft een MRC van $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; haar resistente mutanten van de eerste stap, die in één op $10^{7}$ aanwezig zijn, hebben een MRC van $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ . Een dosis die het middel op $4\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ houdt doodt het wildtype en laat de mutanten zonder concurrentie groeien: het concentratiegebied tussen de MRC van het wildtype en die van de mutanten is het venster van de mutantselectie, en een behandeling die daarin blijft kweekt resistentie. Een dosis boven $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ doodt beide; een te lage dosis, of een kuur die wordt gestaakt wanneer de patiënt zich beter voelt en het middelniveau door het venster zakt, is de manier waarop een resistente populatie ontstaat. Dezelfde logica bepaalt de schema’s voor de behandeling van tuberculose: zes maanden, vier middelen, in doses boven de MRC van elke mutant van één stap.

Het venster van de mutantselectie. Een middelniveau boven de MRC van de mutanten doodt alles; tussen de twee MRC’s (gearceerd) doodt het het wildtype en selecteert het de mutanten. Een dosis waarvan het niveau urenlang door het venster zakt, of een kuur die te vroeg wordt gestaakt, kweekt resistentie.

Opmerking 12.14 (De meeste bacteriën zijn geen ziekteverwekkers)

De bacteriën van de kliniek in dit hoofdstuk zijn een kleine minderheid. Van de naar schatting miljoen soorten veroorzaken er enkele honderden ziekte bij de mens; de rest laat de kringlopen van stikstof, zwavel en koolstof draaien (het boek van jaar 2), bindt de stikstof van elke vlinderbloemige, verteert de cellulose in elke herkauwer, en vormt de microbiomen van Hoofdstuk 14, waarvan het verlies onder een antibioticabehandeling een kostenpost van elke kuur is. De antibiotica zelf zijn hun moleculen — wapens en signalen die tussen bodembacteriën en schimmels zijn geëvolueerd lang voordat er ziekenhuizen waren — en dat geldt ook voor de meeste resistentiegenen.

12.6 Opgaven

Oefening 12.1 ★

Beschrijf het grampositieve en het gramnegatieve omhulsel en leg uit waarom de gramkleuring ze onderscheidt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.1.

Grampositief: een cytoplasmamembraan gewikkeld in een dikke wand van peptidoglycaan uit vele lagen, doorregen met teichoïnezuren. Gramnegatief: een dunne laag peptidoglycaan in een periplasma, daarna een buitenmembraan waarvan de buitenste laag uit lipopolysacharide bestaat, met porines. Het complex van kristalviolet en jodium blijft gevangen in de dikke, door alcohol uitgedroogde wand van de grampositieve (paars) maar wordt uit de gramnegatieve gespoeld door haar dunne wand en haar ontwrichte buitenmembraan, dat daarna de roze nakleuring opneemt.

Oefening 12.2 ★

Een kweek van $10^{3}$ cellen per milliliter bereikt in $8\,\mathrm{h}$ exponentiële groei $10^{9}$ . Bepaal het aantal generaties, de generatietijd en $\mu$ .

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.2.

$10^{6}$ -voudig $= 2^{19.9}$ : ongeveer $20$ generaties; $T = 8\,\mathrm{h}/20 = 24\,\mathrm{min}$ ; $\mu = \ln 2/0.4\,\mathrm{h} = 1.7\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Oefening 12.3 ★

Noem de drie wegen van horizontale genoverdracht en geef het klassieke experiment dat elk daarvan heeft aangetoond.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.3.

Transformatie — Griffith (1928) en Avery, MacLeod en McCarty (1944): door hitte gedode virulente pneumokokken transformeren levende avirulente, en het middel is DNA. Transductie — Zinder en Lederberg (1952): faag P22 draagt genen van Salmonella van de ene stam naar de andere door een filter dat cellen tegenhoudt. Conjugatie — Lederberg en Tatum (1946): twee auxotrofe stammen van E. coli geven alleen prototrofe recombinanten wanneer zij worden gemengd, waarbij celcontact nodig is (de U-buis van Davis).

Oefening 12.4 ★

Geef het doelwit van penicilline, van streptomycine, van ciprofloxacine en van rifampicine, en zeg waarom elk selectief toxisch is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.4.

Penicilline: de transpeptidasen die het peptidoglycaan dwarsverbinden, die dierlijke cellen niet hebben. Streptomycine: de kleine ribosomale subeenheid, waarvan de bacteriële vorm van de eukaryote verschilt. Ciprofloxacine: het DNA-gyrase, een bacterieel topo-isomerase dat de mens niet heeft. Rifampicine: de $\beta$ -subeenheid van het bacteriële RNA-polymerase, die het eukaryote enzym niet deelt.

Oefening 12.5 ★★

Een chemostaat heeft $\mu_{\max} = 0.8\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ en $Y = 0.4$ . Bereken $S^{*}$ en $X^{*}$ bij $D = 0.2$ , $0.6$ en $0.79$ h $^{-1}$ , en de verdunningssnelheid waarbij de uitspoeling begint.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.5.

$S^{*} = K_{S}D/(\mu_{\max} - D)$ , $X^{*} = Y(S_{0} - S^{*})$ . $D = 0.2$ : $S^{*} = 0.0067\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.80\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . $D = 0.6$ : $S^{*} = 0.06$ , $X^{*} = 0.78$ . $D = 0.79$ : $S^{*} = 1.58$ , $X^{*} = 0.17$ . Uitspoeling bij $D = \mu(S_{0}) = 0.8\times 2/2.02 = 0.79\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Oefening 12.6 ★★

Vergelijk met Propositie 12.7 de drempeldichtheid voor quorumdetectie in het lichtorgaan van een inktvis ( $k = 0.01\,\mathrm{h}^{-1}$ ) en in stromend zeewater ( $k = 10\,\mathrm{h}^{-1}$ ), met $p = 100$ moleculen per cel per uur en $A_{\text{thr}} = 10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ( $6\times 10^{12}$ moleculen per liter).

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.6.

$(N/V)_{\text{thr}} = kA_{\text{thr}}/p$ . Lichtorgaan: $0.01\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{8}$ per liter $= 6\times 10^{5}$ per mL. Zeewater: $10\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{11}$ per liter $= 6\times 10^{8}$ per mL — duizend keer hoger, in zee nooit gehaald.

Oefening 12.7 ★★

Een plaat met schijfjesdiffusie toont zones van $25$ , $12$ en $0\,\mathrm{mm}$ voor drie middelen. Leg elk daarvan uit, en verklaar waarom een zonediameter in een MRC is om te rekenen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.7.

$25\,\mathrm{mm}$ : gevoelig, lage MRC. $12\,\mathrm{mm}$ : verminderd gevoelig, intermediair — kan bij gewone doses falen. $0\,\mathrm{mm}$ : resistent, groei tot aan het schijfje. Het middel diffundeert vanaf het schijfje zodat de concentratie op een reproduceerbare manier met de afstand daalt; de groei stopt waar de concentratie gelijk is aan de MRC, zodat de straal van de zone en de MRC door een ijkcurve zijn verbonden die met stammen van bekende MRC is opgesteld.

Oefening 12.8 ★★

Leg uit hoe één enkele conjugatie een gevoelige Klebsiella resistent kan maken tegen vijf antibiotica, en waarom resistentiegenen zo vaak samen op plasmiden worden gevonden.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.8.

Het conjugatieve plasmide draagt een integron waarvan de cassettereeks verscheidene resistentiegenen bevat, plus transposons met nog meer; het plasmide steekt bij één paring over en brengt ze alle tot expressie. Zij komen bijeen omdat de selectie voor een van de middelen het hele plasmide in stand houdt, zodat genen die erop meeliften blijven bestaan (co-selectie); integronen vangen cassettes; transposons springen op plasmiden; en het plasmide, niet het gen, is de eenheid van overdracht.

Oefening 12.9 ★★

Een patiënt heeft $10^{9}$ bacteriën en neemt een middel waartegen resistentie met $10^{-7}$ per deling ontstaat. Bereken het verwachte aantal resistente cellen aan het begin; daarna met twee onafhankelijke middelen. Waarom zijn persisters een ander probleem?

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.9.

Eén middel: $10^{-7}\times 10^{9} = 100$ resistente cellen te verwachten. Twee onafhankelijke middelen: $10^{-14}\times 10^{9} = 10^{-5}$ . Persisters zijn geen mutanten: een klein deel van de sluimerende cellen overleeft elk middel en groeit weer uit tot een gevoelige populatie zodra het middel weg is, zodat een tweede middel niet helpt; alleen een behandeling die lang genoeg duurt om hen bij het ontwaken te vangen, of een middel dat op sluimerende cellen werkt, doet dat wel.

Oefening 12.10 ★★★

Laat zien dat de evenwichtstoestand van de chemostaat stabiel is: verstoor $X$ een weinig boven $X^{*}$ en volg de tekens van $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t$ en $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t$ . Leg daarna uit waarom twee soorten die om één voedingsstof wedijveren in een chemostaat niet in evenwicht naast elkaar kunnen bestaan, en welke bij een gegeven $D$ wint.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.10.

$X > X^{*}$ : het verbruik $\mu X/Y$ overtreft de aanvoer, dus zakt $S$ onder $S^{*}$ ; dan is $\mu(S) < D$ en $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t < 0$ en zakt $X$ terug; naarmate $X$ daalt stijgt $S$ weer. Beide afwijkingen worden gecorrigeerd: de evenwichtstoestand is stabiel. Twee soorten: elk heeft $\mu_{i}(S) = D$ nodig om te blijven bestaan, wat haar eigen $S_{i}^{*}$ vastlegt; de voedingsstof kan maar één waarde aannemen, dus blijft hoogstens één soort bestaan. Die met de laagste $S^{*}(D)$ drukt $S$ onder wat de andere nodig heeft, en de andere wordt uitgespoeld; welke soort dat is kan met $D$ veranderen als hun monodcurven elkaar kruisen.

Oefening 12.11 ★★★

De auto-inductor zet zijn eigen synthase aan. Pas het model van Propositie 12.7 zo aan dat $p$ van $p_{0}$ naar $p_{1} \gg p_{0}$ springt zodra $A > A_{\text{thr}}$ , en laat zien dat het systeem over een bereik van dichtheden twee stabiele toestanden kan hebben (hysterese): een populatie die is aangegaan blijft aan bij een dichtheid waarbij een onbevangen populatie uit zou staan. Wat is daar biologisch het nut van?

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.11.

Met dichtheid $\rho = N/V$ bestaat de uittoestand $A = p_{0}\rho/k$ zolang die onder $A_{\text{thr}}$ blijft, dus $\rho < kA_{\text{thr}}/p_{0}$ ; de aantoestand $A = p_{1}\rho/k$ bestaat zolang die erboven blijft, dus $\rho > kA_{\text{thr}}/p_{1}$ . Voor $kA_{\text{thr}}/p_{1} < \rho < kA_{\text{thr}}/p_{0}$ zijn beide met zichzelf in overeenstemming: een populatie die is aangegaan houdt zichzelf met haar hogere uitstoot aan, en een die dat niet is blijft uit. Het nut: binding — zodra een kolonie heeft besloten een biofilm te bouwen of toxine vrij te laten, maakt een dip in de dichtheid dat besluit niet ongedaan, en de schakeling is scherp en gelijktijdig in plaats van geleidelijk.

Oefening 12.12 ★★★

Leg het venster van de mutantselectie uit en voer het aan voor of tegen elk van de volgende: (a) hoge doses gedurende korte kuren; (b) lage doses gedurende lange kuren; (c) stoppen zodra de klachten verdwijnen; (d) combinatietherapie.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.12.

(a) Hoge doses gedurende korte kuren: het niveau blijft boven de MRC van de mutanten en doodt wildtype en mutanten van de eerste stap — aan te bevelen, begrensd door de giftigheid. (b) Lage doses gedurende lange kuren: het niveau zit dagenlang in het venster en kweekt resistentie — af te raden. (c) Stoppen zodra de klachten verdwijnen: de overlevenden zijn de minst gevoelige cellen en het dalende niveau gaat door het venster — af te raden. (d) Combinatie: een cel moet tegen beide bestand zijn, en die bevat een miljard cellen niet — aan te bevelen.

12.7 Vraagstuk: een chemostaat en een kliniek

Probleem 12.1

Weekendvraagstuk — een kweek in een kolf gegroeid en in een chemostaat gehouden, een lichtgevende bacterie tot haar quorum geteld, en een infectie behandeld tegen de rekenkunde van de resistentie, met als besluit de cellen in de chemostaat, de dichtheid waarbij het licht aangaat en de kans dat een kuur met twee middelen een resistente cel tegenkomt

Gegevens: E. coli bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $T = 20\,\mathrm{min}$ ; een cel weegt $1\,\mathrm{pg}$ . Chemostaat: $V = 1\,\mathrm{L}$ , $F = 0.5\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ glucose, $Y = 0.5$ . Vibrio: $p = 500$ auto-inductormoleculen per cel per uur, $A_{\text{thr}} = 6\times 10^{12}$ moleculen per liter ( $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ), $k = 0.05\,\mathrm{h}^{-1}$ in het lichtorgaan. Infectie: $10^{9}$ cellen; resistentie tegen middel A met $10^{-8}$ per deling, tegen middel B met $10^{-7}$ ; MRC van het wildtype voor A $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , van de mutant van de eerste stap $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; een dosis geeft $16\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dat met een halveringstijd van $4\,\mathrm{h}$ daalt.

Deel I — De kolf.

Eén cel in $100\,\mathrm{mL}$ bouillon. Hoeveel cellen na $6\,\mathrm{h}$ exponentiële groei, en welke dichtheid per mL?
De bouillon draagt hoogstens $2\times 10^{9}$ cellen per mL. Wanneer houdt de groei op, en wat is de celmassa van de kweek?
Hoe lang zouden de nakomelingen van één cel erover doen om de massa van de aarde ( $6\times 10^{27}$ g) te bereiken? Geef commentaar.
De vertragingsfase duurt $1\,\mathrm{h}$ wanneer cellen uit de stationaire fase in vers medium worden geënt, en vrijwel niets wanneer exponentiële cellen worden gebruikt. Verklaar dat.
Bereken $\mu$ uit $T$ . Als het medium wordt vervangen door een suiker waarop $T = 60\,\mathrm{min}$ , wat is dan $\mu$ , en met welke factor daalt het aantal cellen na $6\,\mathrm{h}$ ?
Een monster van de stationaire kweek wordt op een plaat uitgestreken en geeft $200$ kolonies uit $0.1\,\mathrm{mL}$ van een verdunning $10^{-6}$ . Wat is het aantal levende cellen, en waarom kan dat van een telling onder de microscoop verschillen?

Deel II — De chemostaat.

Bereken de verdunningssnelheid $D$ en de generatietijd die de kweek moet aannemen.
Bereken $S^{*}$ en $X^{*}$ (in g/L en in cellen per mL).
Hoeveel cellen verlaten het vat per uur? Hoeveel generaties doorloopt de kweek in een maand?
De pomp wordt opgevoerd tot $F = 0.95\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ . Wat zijn de nieuwe $S^{*}$ en $X^{*}$ ? Wat gebeurt er bij $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ ?
Er verschijnt een mutant met $\mu_{\max} = 1.2\,\mathrm{h}^{-1}$ en dezelfde $K_{S}$ . Bij $D = 0.5$ : welke $S^{*}$ heeft hij nodig, en wat gebeurt er met de oorspronkelijke stam? (Gebruik Oefening 12.10.)
Een maand draaien is $700$ generaties. Als een gunstige mutatie met $10^{-9}$ per deling ontstaat en het vat $10^{12}$ cellen bevat, hoeveel gunstige mutaties ontstaan er dan per generatie? Wat zegt dat over evolutie in een chemostaat?

Deel III — Het quorum.

Bereken de drempeldichtheid voor licht in het lichtorgaan, in cellen per mL.
Het lichtorgaan bevat $1\,\text{µ}\mathrm{L}$ bacteriën bij $10^{10}$ per mL. Met welke factor ligt de auto-inductor boven de drempel?
In zeewater wordt het signaal weggevoerd met $k = 20\,\mathrm{h}^{-1}$ . Wat is dan de drempeldichtheid? Vergelijk met de $10^{2}$ cellen per mL van de open zee.
Nadat de inktvis bij het ochtendgloren $90\,\%$ van de bacteriën heeft uitgestoten, hoe lang duurt het voordat de overgebleven $10^{9}$ per mL, die zich elke $2\,\mathrm{h}$ delen, weer $10^{10}$ per mL hebben gemaakt? Gaat het licht intussen uit?
Elke lichtgevende cel besteedt ongeveer $20\,\%$ van haar energie aan licht. Waarom is een donkere cel in zee bevoordeeld, en in het orgaan niet?
Een ziekteverwekker gebruikt hetzelfde systeem om zijn toxinen uit te stellen tot hij talrijk is. Stel een strategie voor een geneesmiddel voor die dit benut en zeg waarom zij mogelijk trager resistentie selecteert dan een antibioticum.

Deel IV — De kliniek.

Het verwachte aantal cellen dat aan het begin van de behandeling resistent is tegen A; tegen B; tegen beide.
De kans dat er geen enkele cel resistent tegen A is; tegen beide.
Wanneer zakt het middelniveau na de dosis tot $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , en tot $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ? Hoe lang zit het per dosis in het venster van de mutantselectie?
Welk deel van de tijd zit het niveau in het venster als het middel elke $12\,\mathrm{h}$ wordt gegeven, en wat voorspelt dat over een kuur van tien dagen met alleen A?
Stel een verandering van de dosering voor die het niveau voortdurend boven $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ houdt (bereken het interval of de benodigde dosis), en geef de prijs ervan.
Eén cel op $10^{4}$ is een persister, sluimerend en onaangeroerd door welke concentratie van beide middelen ook. Hoeveel overleven de kuur, wat gebeurt er wanneer het middel wordt gestaakt, en wat betekent dat voor de duur van de behandeling?
Vat samen: het aantal cellen per mL in de chemostaat (vraag 8), de drempeldichtheid voor het licht (vraag 13), en de kans dat de kuur met twee middelen geen resistente cel tegenkomt (vraag 20).

Oplossing

Oplossing van Probleem 12.1.

1. $18$ generaties: $2^{18} = 2.6\times 10^{5}$ cellen, $2.6\times 10^{3}$ per mL. 2. $2\times 10^{9}\times 100 = 2\times 10^{11}$ cellen $= 2^{37.5}$ : na $12.5\,\mathrm{h}$ ; massa $0.2\,\mathrm{g}$ . 3. $6\times 10^{27}/10^{-12} = 6\times 10^{39} = 2^{132}$ cellen: $132$ generaties, $44\,\mathrm{h}$ . Voedingsstoffen, zuurstof en afval leggen het binnen een dag stil; exponentiële groei duurt altijd kort. 4. Cellen uit de stationaire fase hebben hun ribosomen afgebroken en hun stofwisselingsenzymen onderdrukt; zij moeten die eerst weer opbouwen voordat zij zich delen. Exponentiële cellen komen volledig uitgerust aan. 5. $\mu = \ln 2/0.333\,\mathrm{h} = 2.08\,\mathrm{h}^{-1}$ ; bij $T = 60\,\mathrm{min}$ $0.69\,\mathrm{h}^{-1}$ ; na $6\,\mathrm{h}$ $2^{6} = 64$ in plaats van $2^{18}$ : een factor $2^{12} \approx 4000$ minder. 6. $200/(0.1\times 10^{-6}) = 2\times 10^{9}$ levende cellen per mL. De microscoop telt ook dode cellen en cellen die op de plaat niet groeien, en een klontje geeft één kolonie. 7. $D = 0.5/1 = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ ; $T = \ln 2/0.5 = 1.39\,\mathrm{h} = 83\,\mathrm{min}$ . 8. $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; $X^{*} = 0.5\times 1.99 \approx 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 10^{12}$ cellen per liter, $10^{9}$ per mL. 9. $0.5\times 10^{12} = 5\times 10^{11}$ cellen per uur; $720/1.39 \approx 520$ generaties per maand. 10. $D = 0.95$ : $S^{*} = 0.01\times 0.95/0.05 = 0.19\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.5\times 1.81 = 0.9\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . Bij $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ is $D > \mu_{\max}$ : uitspoeling. 11. De mutant houdt $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.7 = 0.0071\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; bij die glucose groeit de oorspronkelijke stam met $1.0\times 0.0071/0.0171 = 0.42\,\mathrm{h}^{-1} < D$ en neemt zij af als $e^{-0.08t}$ : in enkele weken uitgespoeld. De mutant neemt het over. 12. $10^{-9}\times 10^{12} = 1000$ gunstige mutaties per generatie: de aanpassing is doorlopend, met om de paar honderd generaties een nieuwe voordelige kloon die het overneemt — de chemostaat is een evolutiemachine. 13. $kA_{\text{thr}}/p = 0.05\times 6\times 10^{12}/500 = 6\times 10^{8}$ per liter $= 6\times 10^{5}$ cellen per mL. 14. $10^{10}/6\times 10^{5} \approx 1.7\times 10^{4}$ -voudig. 15. $20\times 6\times 10^{12}/500 = 2.4\times 10^{11}$ per liter, $2.4\times 10^{8}$ per mL — zes orden van grootte boven de $10^{2}$ per mL van de zee: donker. 16. Tienvoudig is $3.3$ verdubbelingen, $6.6\,\mathrm{h}$ . Bij $10^{9}$ per mL ligt de populatie nog $1700$ keer boven de drempel: het licht blijft aan. 17. In zee ziet niemand het licht en voedt het geen gastheer: een donkere mutant bespaart $20\,\%$ en groeit de lichtgevers voorbij. In het orgaan selecteert de inktvis voor licht — zij stoot donkere profiteurs uit of voedt ze niet — zodat de kosten een woonplaats kopen. 18. Blokkeer de receptor of vernietig de auto-inductor (quorumdemping): de bacteriën leven maar zetten hun toxinen nooit in, en het afweersysteem ruimt hen op. Omdat gevoelige en “resistente” bacteriën even hard groeien — er wordt niets gedood — is het selectieve voordeel van aan het middel ontsnappen klein, en zou de resistentie zich trager moeten verspreiden dan tegen een dodend middel. 19. A: $10^{-8}\times 10^{9} = 10$ ; B: $100$ ; beide: $10^{-15}\times 10^{9} = 10^{-6}$ . 20. $P_{0}(\text{A}) = e^{-10} = 5\times 10^{-5}$ ; $P_{0}(\text{beide}) = e^{-10^{-6}} = 0.999999$ . 21. $16 \to 8$ : één halveringstijd, $4\,\mathrm{h}$ ; $16 \to 1$ : vier, $16\,\mathrm{h}$ ; in het venster van $4\,\mathrm{h}$ tot $16\,\mathrm{h}$ , dus $12\,\mathrm{h}$ per dosis. 22. Bij dosering elke $12\,\mathrm{h}$ : in het venster van uur $4$ tot uur $12$ , twee derde van de tijd; over tien dagen worden de mutanten van de eerste stap tegen A — tien bij aanvang — geselecteerd en faalt A alleen. 23. Voortdurend boven $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ : doseer elke halveringstijd ( $4\,\mathrm{h}$ ), of geef elke $12\,\mathrm{h}$ een dosis met een piek van $64\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ( $64 \to 8$ in drie halveringstijden), of een doorlopend infuus. De prijs: de giftigheid van hoge pieken, of zes doses per dag die patiënten niet volhouden. 24. $10^{-4}\times 10^{9} = 10^{5}$ persisters overleven wat de middelen ook doen; zodra de behandeling stopt ontwaken zij en groeien zij weer uit tot een volkomen gevoelige populatie — een terugval. De behandeling moet lang genoeg duren om hen bij het verlaten van de sluimering te vangen, en daarom kost tuberculose zes maanden. 25. $10^{9}$ cellen per mL in de chemostaat; het licht gaat aan bij $6\times 10^{5}$ cellen per mL; $P_{0} = 0.999999$ dat de kuur met twee middelen geen resistente cel tegenkomt.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst