Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

8Membraanverkeer en het sorteren van eiwitten

Een cel van de alvleesklier maakt zo’n tien miljoen moleculen verteringsenzym per minuut, verpakt ze in korrels en laat ze op een signaal uit de darm los in een afvoerbuis — zonder ooit één molecuul trypsine in haar eigen cytoplasma vrij te laten. Een levercel haalt cholesterol uit het bloed door de deeltjes die het dragen in hun geheel te verzwelgen, duizenden per minuut, en brengt elke receptor terug naar het oppervlak voor de volgende. Een pas gemaakt eiwit dat voor het mitochondrion, de kern, het lysosoom, het membraan of de buitenwereld bestemd is bereikt zijn adres tussen een tiental compartimenten met een foutenpercentage waar een postdienst zich voor zou schamen. Dit hoofdstuk gaat over dat sorteren: de signalen die in eiwitten zijn geschreven, de machines die ze lezen, de blaasjes die membraan en vracht tussen compartimenten vervoeren, de manteleiwitten die de blaasjes vorm geven en de eiwitten die ze met het juiste doelwit laten versmelten, en het verkeer in twee richtingen — secretie naar buiten, endocytose naar binnen — dat een eukaryote cel elke seconde van haar leven volhoudt.

8.1 Signalen en adressen

Definitie 8.1 (Sorteersignalen)

Een sorteersignaal is een segment van een eiwit, of een wijziging daarvan, dat wordt gelezen door een receptor die het eiwit naar één compartiment brengt. Het signaalpeptide, een stuk van $15\text{ tot }30$ residuen aan de aminoterminus met een hydrofobe kern, stuurt een eiwit tijdens het maken het endoplasmatisch reticulum in; van daaruit leidt de standaardroute via het golgiapparaat naar het plasmamembraan of naar buiten, en verdere signalen leiden het af naar het lysosoom (een gefosforyleerde suiker) of terug naar het reticulum (de carboxyterminale sequentie KDEL). Een kernlokalisatiesignaal, een korte basische plek zoals PKKKRKV, wordt gebonden door importines die het gevouwen eiwit door de kernporie dragen; een mitochondriale presequentie, een amfipathische helix van $20\text{ tot }50$ residuen, wordt herkend door receptoren op het buitenmembraan en ongevouwen door translocasen van beide membranen geregen; peroxisomale enzymen eindigen op SKL. Eiwitten zonder een van deze signalen blijven in het cytosol. Elk signaal is op dezelfde wijze gevonden: het weghalen laat het eiwit in het cytosol, het aan een cytosolisch eiwit enten stuurt dat eiwit naar het compartiment.

Bewijsmateriaal. Blobel en Dobberstein (1975) vertaalden het boodschapper-RNA van een lichte keten van een antilichaam in een celvrij systeem. Zonder membranen was het product ongeveer twintig residuen langer dan het uitgescheiden eiwit; met fragmenten van endoplasmatisch reticulum tijdens de translatie toegevoegd had het product de uitgescheiden grootte en was het beschermd tegen toegevoegd protease — het zat in de blaasjes — terwijl membranen die na de translatie werden toegevoegd niets deden. Het extra aminoterminale segment, het signaalpeptide, is nodig om het reticulum binnen te komen, wordt daarbinnen verwijderd en werkt alleen zolang de keten wordt gemaakt: de signaalhypothese, tot in elk detail bevestigd toen de receptor (het signaalherkenningsdeeltje, Walter en Blobel 1981) en het kanaal (Sec61) waren gezuiverd. ∎

De signaalhypothese. Een signaalpeptide aan het begin van de ontluikende keten wordt gebonden door het signaalherkenningsdeeltje, dat de translatie pauzeert en het ribosoom aan het Sec61-kanaal dokt; de keten steekt daarna het membraan over terwijl zij wordt gemaakt, het signaal wordt in het lumen afgeknipt, en er worden suikers toegevoegd.

Propositie 8.2 (Membraaneiwitten en topologie)

Een hydrofoob stuk van ongeveer twintig residuen midden in een keten die wordt getransloceerd werkt als stoptransfersequentie: het kanaal gaat opzij open en laat het in de dubbellaag los als transmembraanhelix, met het al getransloceerde deel in het lumen en de rest in het cytosol gemaakt. Een tweede zo’n stuk hervat de translocatie, en een eiwit met $n$ afwisselende signalen eindigt met $n$ membraandoorspannende helices. De richting die in het reticulum wordt vastgelegd verandert nooit meer: wat naar het lumen van het reticulum wijst, wijst naar het lumen van het golgiapparaat en van elk blaasje daarna, en na fusie met het plasmamembraan naar de buitenkant van de cel. Daarom zitten suikers, die alleen in het lumen worden toegevoegd, altijd aan de extracellulaire kant van een oppervlakte-eiwit, en is de topologie van een receptor af te lezen aan de ligging van zijn glycosyleringsplaatsen.

Methode 8.3 (Pulsmerking en jacht)

Om een populatie pas gemaakte moleculen door de cel te volgen: (1) stel de cellen kort bloot (de puls, enkele minuten) aan een radioactieve of anderszins gemerkte voorloper — getritieerd leucine voor eiwitten; (2) vervang die door een overmaat ongemerkte voorloper (de jacht), zodat er geen nieuw merkstof meer wordt ingebouwd; (3) fixeer op gezette tijden monsters van cellen en lokaliseer het merkstof met autoradiografie in elektronenmicroscopische opnamen, of door de compartimenten te isoleren en te tellen; (4) zet het deel van het merkstof in elk compartiment tegen de tijd uit. De volgorde waarin de compartimenten vollopen en leeglopen is de route; de tijden geven de verblijfstijd in elk. Het laboratorium van Palade (jaren zestig) paste haar toe op de acinaire cel van de alvleesklier en vond het merkstof na $3\,\mathrm{min}$ in het ruwe reticulum, na $20\,\mathrm{min}$ in het golgiapparaat, na $40\,\mathrm{min}$ in condenserende vacuolen en korrels, en na een uur en op een signaal in de afvoerbuis: de secretieroute, uitgezet in de tijd.

Stelling 8.4 (Opeenvolgende compartimenten en de pulscurven)

Laat een puls gemerkt eiwit compartiment $A$ verlaten voor $B$ met eerste-ordesnelheid $k_{1}$ , en $B$ verlaten voor $C$ met snelheid $k_{2}$ , waarbij $C$ het vasthoudt. Met al het merkstof in $A$ op $t = 0$ geldt

A(t) = e^{-k_{1}t},\qquad B(t) = \frac{k_{1}}{k_{2} - k_{1}}\bigl(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t}\bigr), \qquad C(t) = 1 - A - B,

en bereikt het merkstof in $B$ een maximum op $t^{*} = \ln(k_{2}/k_{1})/(k_{2} - k_{1})$ . De gemiddelde verblijfstijd in $A$ is $1/k_{1}$ en in $B$ is $1/k_{2}$ , wat de volgorde van de twee snelheden ook is.

Bewijs. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = -k_{1}A$ geeft de exponentiële vorm. Voor $B$ geldt $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k_{1}A - k_{2}B = k_{1}e^{-k_{1}t} - k_{2}B$ ; probeer $B = \beta(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t})$ : de afgeleide is $\beta(-k_{1}e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ en $-k_{2}B = \beta(-k_{2} e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ , zodat de vergelijking $\beta(k_{2} - k_{1})e^{-k_{1}t} = k_{1}e^{-k_{1}t}$ vergt, dus $\beta = k_{1}/(k_{2} - k_{1})$ , en $B(0) = 0$ zoals vereist. Stelt men $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = 0$ , dan is $k_{1}e^{-k_{1}t} = k_{2}e^{-k_{2}t}$ , waaruit $t^{*}$ volgt. De gemiddelde tijd die een molecuul doorbrengt in een compartiment dat het met snelheid $k$ verlaat is $\int_{0}^{ \infty} t\,k e^{-kt}\,\mathrm{d}t = 1/k$ . ∎

Voorbeeld 8.5 (De cel van Palade in getallen)

Neem $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ (tien minuten in het reticulum) en $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ (twintig in het golgiapparaat). Het golgiapparaat bereikt zijn maximum op $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ en bevat dan $B = 2(e^{-1.39} - e^{-0.69}) = 2(0.25 - 0.50)\cdot(-1) = 0.50$ : de helft van het merkstof. Na $40\,\mathrm{min}$ is $A = 0.018$ , $B = 2(0.018 - 0.135) \to 0.23$ en $C = 0.75$ : drie kwart van het eiwit heeft de korrels bereikt. De waargenomen curven van het laboratorium van Palade hebben deze vorm, en ze aanpassen was de eerste manier waarop de verblijfstijden werden gemeten.

Pulscurven uit het tweesnelhedenmodel met k_1 = 0.1\, min-1 en k_2 = 0.05\, min-1: het merkstof verlaat het reticulum exponentieel, gaat door het golgiapparaat met een maximum bij 14\, min, en hoopt zich op in de korrels. — Pulscurven uit het tweesnelhedenmodel met $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ en $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ : het merkstof verlaat het reticulum exponentieel, gaat door het golgiapparaat met een maximum bij $14\,\mathrm{min}$ , en hoopt zich op in de korrels.

8.2 Het endoplasmatisch reticulum: vouwen, suikers en kwaliteit

Definitie 8.6 (N-glycosylering en kwaliteitsbewaking)

Zodra de keten het lumen binnenkomt wordt een vooraf samengesteld oligosacharide van veertien suikers (twee N-acetylglucosamines, negen mannoses, drie glucoses) van een lipidedrager overgezet op asparagines in de sequentie Asn-X-Ser/Thr — de N-glycosylering. De drie glucoses worden daarna een voor een weggeknipt, en dat knippen is een vouwklok: een eiwit dat nog één glucose draagt wordt vastgehouden door de chaperonne calnexine; een eiwit waarvan de laatste glucose is verwijderd maar dat nog niet is gevouwen wordt opnieuw geglucosyleerd door een enzym dat blootliggende hydrofobe plekken herkent, en keert terug naar calnexine — de calnexinecyclus. Eiwitten die herhaaldelijk falen worden terug het cytosol in getrokken, geubiquitineerd en door het proteasoom vernietigd: de ER-geassocieerde afbraak (ERAD). Wanneer ongevouwen eiwitten zich sneller ophopen dan zij kunnen worden gevouwen of vernietigd, starten sensoren in het reticulummembraan de respons op ongevouwen eiwitten: de translatie wordt vertraagd, chaperonnegenen worden aangezet, het reticulum wordt uitgebreid, en als de stress aanhoudt wordt de cel gedood. De meest voorkomende mutatie bij taaislijmziekte ( $\Delta$ F508 in CFTR) maakt een kanaal dat zou werken maar zich te traag vouwt, door ERAD wordt opgepakt en het oppervlak nooit bereikt; geneesmiddelen die het helpen vouwen zijn nu een behandeling.

Een acinaire cel van de alvleesklier in de elektronenmicroscoop: gestapeld ruw endoplasmatisch reticulum, bezaaid met ribosomen, vult de basis, het golgiapparaat ligt boven de kern, en dichte secretiekorrels met verteringsenzym liggen opeengepakt onder het apicale oppervlak, wachtend op een signaal.

8.3 Blaasjes: knoppen, richten, versmelten

Definitie 8.7 (Manteleiwitten en het knoppen van blaasjes)

Een transportblaasje wordt gevormd door een mantel van eiwitten die zich op de cytosolische kant van een membraan samenstelt, het membraan tot een knop van $60\text{ tot }100\,\mathrm{nm}$ kromt, vracht verzamelt via receptoren die het membraan doorspannen, en wordt afgeworpen zodra het blaasje is afgesnoerd. Drie mantels bedienen de hoofdroutes: COPII voor blaasjes die het reticulum naar het golgiapparaat verlaten, COPI voor het verkeer terug van het golgiapparaat naar het reticulum en tussen de golgicisternen, en clathrine — een driebenig eiwit dat tot een kooi van zeshoeken en vijfhoeken polymeriseert — voor blaasjes die het trans-golginetwerk verlaten naar endosomen en voor de endocytose aan het plasmamembraan, waar adaptoreiwitten de kooi aan de receptoren koppelen die worden opgenomen. Elke mantel wordt aangetrokken door een klein GTPase (Sar1 voor COPII, Arf1 voor COPI en clathrine) dat zich in zijn GTP-vorm in het membraan steekt en de mantel laat afvallen zodra het na het knoppen GTP hydrolyseert. Terughaalsignalen houden de compartimenten gescheiden: ontsnapte reticulumeiwitten met KDEL worden in het golgiapparaat door een receptor gebonden en in COPI-blaasjes teruggebracht.

Links: een clathrinekooi, het veelvlakkige rooster van driebenige eenheden dat een endocytoseblaasje vorm geeft (opengesneden om het membraan erbinnen te tonen). Rechts: een golgistapel in de elektronenmicroscoop, een stapel afgeplatte cisternen met blaasjes die van de randen knoppen.

Definitie 8.8 (Richten en versmelten)

Een blaasje vindt zijn doelwit met twee lagen herkenning. De Rab-GTPasen — zo’n zestig in een menselijke cel, elk op de membranen van één compartiment — trekken lange touweiwitten aan die een binnenkomend blaasje met het bijbehorende Rab vangen. Daarna treden de SNAREs op: een v-SNARE op het blaasje en t-SNAREs op het doelwit, helicale eiwitten die in hun membranen zijn verankerd, winden zich vanaf hun verre uiteinden naar de membranen toe om elkaar, en de energie van de vierhelixbundel die zij vormen trekt de twee dubbellagen naar elkaar toe tot zij versmelten. Elke SNARE-paring is specifiek, een tweede controle op het adres. Na de fusie wordt de bundel door het ATPase NSF weer uiteengewrikt voor hergebruik. De fusie kan op een signaal worden laten wachten: in het zenuwuiteinde worden de SNAREs half geritst vastgehouden door complexine tot synaptotagmine, dat het calcium bindt dat binnenkomt wanneer een actiepotentiaal aankomt, het ritsen in minder dan een milliseconde voltooit — het vrijkomen van neurotransmitter dat in het boek van jaar 2 is behandeld. De neurotoxinen van tetanus en botulisme zijn proteasen die SNAREs knippen.

Bewijsmateriaal. Novick en Schekman (1980) isoleerden temperatuurgevoelige gistmutanten die bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ met uitscheiden ophielden en eiwit ophoopten in het compartiment waar hun defect de weg versperde — reticulum, golgiapparaat of blaasjes opgestapeld onder het oppervlak; de $23$ sec-genen bakenden de stappen af en bleken, eenmaal gekloneerd, te coderen voor de mantels, de GTPasen en de SNAREs. Rothman bouwde het transport tussen golgicisternen na in een reageerbuis met gezuiverde membranen, cytosol en ATP, en zuiverde daaruit NSF en de SNAREs; de twee benaderingen kwamen op dezelfde eiwitten uit, en de machinerie van gist en die van zoogdieren bleken dezelfde. ∎

Fusie in drie stappen. Een Rab op het blaasje en een touw op het doelwit brengen de twee membranen binnen bereik; de SNAREs van blaasje en doelwit (rood en groen) ritsen tot een vierhelixbundel die de dubbellagen naar elkaar toe sleept; zij versmelten en de vracht komt het doelcompartiment binnen.

Propositie 8.9 (Het golgiapparaat)

Het golgiapparaat is een stapel van vier tot acht afgeplatte cisternen, met de cis-zijde naar het reticulum en de trans-zijde naar het plasmamembraan, waarbij elke cisterne een andere reeks enzymen herbergt die de suikers van passerende glycoproteïnen bijknippen en opnieuw opbouwen en die O-gebonden suikers, sulfaat en fosfaat toevoegen. De vracht schuift vooral op door cisternerijping: aan de cis-zijde ontstaat uit aankomende blaasjes een nieuwe cisterne, die net als de cisternen vóór haar door de stapel beweegt en rijpt terwijl COPI-blaasjes de enzymen van elke cisterne achterwaarts naar de jongere erachter brengen; aan de trans-zijde valt zij uiteen in blaasjes die naar hun bestemming vertrekken. Daar wordt het sorteren beslist: lysosomale hydrolasen, in het cis-golgiapparaat gemerkt met mannose-6-fosfaat, worden door hun receptor gebonden en in clathrineblaasjes voor het endosoom verpakt; gereguleerde secretie-eiwitten klonteren bij de licht zure pH samen tot condenserende korrels; al het overige vertrekt in de constitutieve stroom naar het oppervlak. Bij de I-celziekte ontbreekt het fosforylerende enzym, worden de hydrolasen uitgescheiden in plaats van afgeleverd, en lopen de lysosomen vol onverteerd materiaal.

De kaart van het membraanverkeer. Naar buiten (groen): van het reticulum naar het golgiapparaat in COPII-blaasjes, van het golgiapparaat naar het oppervlak, hetzij constitutief hetzij via korrels die op een signaal wachten. Terug (rood): COPI-blaasjes brengen ontsnapte reticulumeiwitten terug. Omlaag (oranje): lysosomale enzymen gemerkt met mannose-6-fosfaat gaan naar het endosoom en het lysosoom. Naar binnen (blauw): endocytose vanaf het oppervlak, met de meeste receptoren gerecycled.

8.4 Endocytose en het lysosoom

Definitie 8.10 (Endocytose)

De receptorgemedieerde endocytose concentreert een ligand dat aan oppervlaktereceptoren is gebonden in met clathrine beklede putjes, die zich afsnoeren (het GTPase dynamine snoert de hals dicht) als blaasjes van ongeveer $100\,\mathrm{nm}$ — duizend per minuut in een fibroblast, wat het hele oppervlaktemembraan in een uur omzet. De blaasjes versmelten tot vroege endosomen, waarvan het lumen door een protonpomp tot pH 6 wordt aangezuurd; de meeste liganden laten hun receptoren daar los, de receptoren keren in recyclingblaasjes terug naar het oppervlak, en het ligand reist verder terwijl het endosoom tot laat endosoom rijpt (pH 5,5) en met een lysosoom versmelt: een compartiment bij pH 4,5–5 met zo’n zestig hydrolasen — proteasen, nucleasen, lipasen, glycosidasen — die alleen bij die pH werken, zodat een lek in het neutrale cytosol weinig schade doet. Het lysosoom verteert ook het eigen materiaal van de cel, dat door autofagie wordt aangeleverd: een dubbel membraan groeit om een stuk cytoplasma of een versleten organel heen, sluit zich tot een autofagosoom en versmelt met het lysosoom; de producten gaan terug naar het cytosol. De autofagie wordt aangezet door uithongering (zij hergebruikt de eigen stof van een cel voor energie) en ruimt klonters en beschadigde mitochondriën op; haar falen wordt met neurodegeneratie in verband gebracht.

Bewijsmateriaal. Brown en Goldstein (jaren zeventig) volgden het lipoproteïne met lage dichtheid (LDL), het deeltje dat cholesterol in het bloed vervoert, in gekweekte fibroblasten. LDL bond verzadigbaar aan zo’n $20\,000$ plaatsen per cel aan het oppervlak, werd binnen minuten in beklede putjes opgenomen, en zijn cholesterol kwam in de lysosomen vrij en zette de eigen cholesterolsynthese van de cel uit. Fibroblasten van patiënten met familiaire hypercholesterolemie bonden geen LDL (receptor afwezig) of bonden het wel maar namen het niet op (een mutatie in de cytosolische staart van de receptor die belet dat clathrine-adaptoren hem vangen): de ziekte was een defect van de endocytose, de staart van de receptor bevatte het opnamesignaal, en de recyclende receptor — die elk honderden rondreizen maakt — werd als het algemene mechanisme van opname vastgesteld. ∎

Propositie 8.11 (Opname via recyclende receptoren)

Laat een cel in totaal $R$ receptoren hebben, waarvan $S$ aan het oppervlak en $R - S$ binnenin op de terugweg. Een receptor aan het oppervlak is bezet met kans $\theta = [L]/(K_{d} + [L])$ , een bezette receptor wordt met snelheid $k_{i}$ opgenomen, en een opgenomen receptor keert terug met snelheid $k_{r}$ . In evenwicht is de ligandstroom de cel in

J = \frac{R\,k_{i}k_{r}\,\theta}{k_{r} + k_{i}\theta},

die bij stijgende ligandconcentratie verzadigt bij $J_{\max} = R\,k_{i}k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ : de opname van een cel wordt niet alleen begrensd door haar receptoren maar door hoe snel zij die kan terughalen.

Bewijs. Receptoren aan het oppervlak gaan verloren met snelheid $k_{i}\theta S$ en komen terug met snelheid $k_{r}(R - S)$ ; in evenwicht heffen die elkaar op, dus $S = R\,k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta)$ . Elke opname voert één ligand mee, dus $J = k_{i}\theta S$ , wat de formule geeft. Voor $\theta \to 1$ nadert de stroom $R\,k_{i}k_{r}/(k_{r} + k_{i})$ — de receptoren draaien zo snel rond als de twee snelheden toelaten, met een deel $k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ op elk moment aan het oppervlak. ∎

Voorbeeld 8.12 (Cholesterol per deeltje)

Een fibroblast met $R = 20\,000$ LDL-receptoren, een opnametijd van $5\,\mathrm{min}$ ( $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ ) en een terugkeertijd van $10\,\mathrm{min}$ ( $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ ) neemt bij verzadigend LDL $J_{\max} = 20\,000\times 0.2\times 0.1/0.3 \approx 1300$ deeltjes per minuut op, met op elk moment een derde van zijn receptoren aan het oppervlak; elk deeltje brengt zo’n $1500$ moleculen cholesterol, twee miljoen per minuut, genoeg om ongeveer een tiende vierkante micrometer membraan te bouwen. Een heterozygoot voor familiaire hypercholesterolemie, met de helft van de receptoren, neemt half zoveel op; het bloedcholesterol verdubbelt en de hartziekte komt twintig jaar te vroeg. De statines verhogen $R$ door de levercel van haar eigen cholesterol te beroven.

Opname van LDL via recyclende receptoren, met de formule van de propositie en k_i = 0.2\, min-1 en k_r = 0.1\, min-1: verzadigend met ligand, en gehalveerd wanneer de helft van de receptoren ontbreekt. — Opname van LDL via recyclende receptoren, met de formule van de propositie en $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ en $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ : verzadigend met ligand, en gehalveerd wanneer de helft van de receptoren ontbreekt.

Opmerking 8.13 (Eén membraan, vele compartimenten)

Elk membraan van het secretie- en endocytosesysteem is topologisch gezien één membraan: het lumen van het reticulum is via blaasjes doorlopend verbonden met de buitenkant van de cel, en een lipide of eiwit dat in het reticulum wordt gemaakt kan het oppervlak bereiken zonder ooit een dubbellaag over te steken. Wat de compartimenten gescheiden houdt zijn geen wanden maar verkeer — selectief inpakken naar buiten, selectief terughalen naar binnen, en bij elke fusie een bepaald paar herkenningsmoleculen. De compartimenten zijn evenwichtstoestanden van stromen, als de kolken van een rivier, en een cel die het verkeer stillegt verliest haar geografie binnen enkele uren.

8.5 Opgaven

Oefening 8.1 ★

Geef bij elk het signaal en de bestemming: een stuk van twintig hydrofobe residuen aan de aminoterminus; PKKKRKV; een amfipathische aminoterminale helix; KDEL aan de carboxyterminus; een mannose-6-fosfaat op de suikers.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.1.

Hydrofoob stuk aan de aminoterminus: signaalpeptide, het endoplasmatisch reticulum in (en standaard verder naar het oppervlak). PKKKRKV: kernlokalisatiesignaal, de kern in door de porie. Amfipathische aminoterminale helix: mitochondriale presequentie, de mitochondriale matrix in. KDEL: terughaling uit het golgiapparaat naar het reticulum. Mannose-6-fosfaat: van het trans-golginetwerk naar het endosoom en het lysosoom.

Oefening 8.2 ★

Beschrijf de drie belangrijkste waarnemingen van het experiment van Blobel en Dobberstein en wat elk ervan aantoonde.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.2.

(1) Zonder membranen was de vertaalde keten ongeveer twintig residuen langer dan het uitgescheiden eiwit: er wordt tijdens de secretie een segment verwijderd. (2) Met membranen aanwezig tijdens de translatie had het product de rijpe grootte en was het beschermd tegen protease: het was de blaasjes binnengegaan en had het segment daarbinnen verloren. (3) Membranen die na de translatie werden toegevoegd deden geen van beide: de intrede is aan de synthese gekoppeld — cotranslationeel — en het segment, het signaalpeptide, werkt alleen op een ontluikende keten.

Oefening 8.3 ★

Noem de mantel en de richting van het transport voor: reticulum naar golgiapparaat; golgiapparaat naar reticulum; trans-golginetwerk naar endosoom; plasmamembraan naar endosoom.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.3.

Reticulum naar golgiapparaat: COPII, voorwaarts. Golgiapparaat naar reticulum: COPI, retrograad. Trans-golginetwerk naar endosoom: clathrine met zijn adaptoren, voorwaarts naar het lysosoom. Plasmamembraan naar endosoom: clathrine, naar binnen (endocytose).

Oefening 8.4 ★

Waarom zitten de suikers van een eiwit in het plasmamembraan altijd aan de buitenkant van de cel?

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.4.

Suikers worden alleen binnen het lumen van het reticulum en het golgiapparaat toegevoegd. De lumenzijde van elk blaasje blijft door het knoppen en versmelten heen de lumenzijde, en wanneer een blaasje met het plasmamembraan versmelt wordt zijn lumenzijde de buitenkant van de cel; de richting wordt nooit omgekeerd, zodat wat binnen is geglycosyleerd buiten belandt.

Oefening 8.5 ★★

Bepaal in het model van Stelling 8.4 met $k_{1} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ en $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ wanneer het merkstof in het golgiapparaat zijn maximum bereikt en hoeveel er dan zit; daarna het deel in de korrels na $60\,\mathrm{min}$ .

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.5.

$t^{*} = \ln(0.05/0.2)/(0.05 - 0.2) = \ln 4/0.15 = 9.2\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.2/(-0.15))(e^{-1.85} - e^{-0.46}) = 0.63$ . Na $60\,\mathrm{min}$ is $A \approx 0$ , $B = 1.33\,(e^{-3} - e^{-12}) = 0.066$ , dus $C = 0.93$ .

Oefening 8.6 ★★

Een membraaneiwit heeft hydrofobe stukken van $22$ residuen op de posities 30, 90, 150 en 210 en een aminoterminaal signaalpeptide. Teken of beschrijf zijn topologie: hoeveel helices, en naar welke kant elk segment ertussen wijst. Waar kan het worden geglycosyleerd?

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.6.

Het signaalpeptide zet de aminoterminus in het lumen; elk hydrofoob stuk is afwisselend een stoptransfer of een starttransfer, zodat er vier transmembraanhelices zijn (ongeveer de residuen 30–52, 90–112, 150–172, 210–232). Segmenten: aminoterminus lumenaal; 52–90 cytosolisch; 112–150 lumenaal; 172–210 cytosolisch; carboxyterminus lumenaal. Glycosylering alleen op de lumenale segmenten — de aminoterminus, 112–150 en de carboxyterminus — die aan het oppervlak extracellulair worden.

Oefening 8.7 ★★

Bereken met Propositie 8.11 bij $R = 30\,000$ , $k_{i} = 0.25\,\mathrm{min}^{-1}$ en $k_{r} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ de waarde van $J_{\max}$ en het deel van de receptoren dat bij verzadiging aan het oppervlak zit. Welke enkele verandering zou de opname verdubbelen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.7.

$J_{\max} = 30\,000\times 0.25\times 0.05/0.30 = 1250$ per minuut; deel aan het oppervlak $k_{r}/(k_{i} + k_{r}) = 0.05/0.30 = 0.17$ . $R$ verdubbelen verdubbelt $J$ precies; de terugkeersnelheid is de flessenhals (de meeste receptoren zitten binnen), en $k_{r}$ verdubbelen zou $30\,000\times 0.25 \times 0.1/0.35 \approx 2140$ geven, een factor $1.7$ .

Oefening 8.8 ★★

Voorspel het lot van de lysosomale hydrolasen, en het fenotype, in (a) een cel zonder de mannose-6-fosfaatreceptor, (b) een cel zonder het fosfotransferase dat het merkteken aanbrengt, (c) een cel behandeld met een middel dat de pH van het endosoom neutraliseert.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.8.

(a) Geen receptor: de gemerkte hydrolasen volgen de standaardroute en worden uitgescheiden; de lysosomen missen enzymen en lopen vol onverteerd materiaal — een stapelingsziekte. (b) Geen fosfotransferase: hetzelfde fenotype door een ander gebrek (de I-celziekte), met de enzymen ongemerkt en uitgescheiden. (c) Geneutraliseerde endosomen: de receptor kan zijn vracht niet loslaten, wordt dus niet gerecycled en de hydrolasen worden verkeerd afgeleverd of uitgescheiden; ook LDL- en andere receptoren houden op met rondgaan.

Oefening 8.9 ★★

De JD-mutatie in de LDL-receptor verandert een tyrosine in de cytosolische staart. Cellen die LDL normaal binden nemen het niet op. Verklaar het mechanisme, en voorspel waar de receptoren op het celoppervlak liggen ten opzichte van de beklede putjes.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.9.

Het tyrosine hoort bij het staartmotief dat de clathrine-adaptor herkent; zonder dat motief wordt de receptor niet in beklede putjes verzameld. De receptoren binden LDL normaal maar liggen gelijkmatig over het oppervlak verspreid, buiten de putjes gehouden, en het ligand blijft buiten — een ziekte van het sorteren, niet van het binden.

Oefening 8.10 ★★★

Los het pulsmodel op voor het geval $k_{1} = k_{2} = k$ (de formule van de stelling is daar singulier): laat zien dat $B(t) = kt\,e^{-kt}$ en zoek het maximum. Leg daarna uit waarom het meten van alleen het korreldeel $C(t)$ de twee snelheden niet afzonderlijk kan bepalen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.10.

Met $k_{1} = k_{2} = k$ geeft de poging $B = kt\,e^{-kt}$ : $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k e^{-kt} - k^{2}t e^{-kt} = kA - kB$ , zoals vereist, met $B(0) = 0$ . Maximum waar $1 - kt = 0$ : $t^{*} = 1/k$ , $B = e^{-1} = 0.37$ . In het algemeen is $C(t) = 1 - (k_{2}e^{-k_{1}t} - k_{1}e^{-k_{2}t})/(k_{2} - k_{1})$ , wat symmetrisch is onder verwisseling van $k_{1}$ en $k_{2}$ : de korrelcurve alleen kan niet zeggen welk van de twee compartimenten het snelle is.

Oefening 8.11 ★★★

Een fibroblast neemt per minuut $1000$ clathrineblaasjes met een diameter van $100\,\mathrm{nm}$ op en heeft een oppervlak van $3000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Hoe lang duurt het om het equivalent van het hele oppervlak op te nemen? Waarom krimpt de cel niet, en wat zegt de balans over de snelheid van de exocytose en over het volume vloeistof dat per uur wordt opgenomen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.11.

Elk blaasje heeft oppervlak $4\pi(50\,\text{nm})^{2} = 0.031\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; duizend per minuut is $31\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{min}$ , dus het hele oppervlak in $3000/31 \approx 95\,\mathrm{min}$ . De cel krimpt niet omdat er door exocytose (recyclingblaasjes) even snel membraan terugkomt — een evenwicht van stromen. Elk blaasje bevat $5\times 10^{-19}$ L; duizend per minuut gedurende een uur is $3\times 10^{-14}$ L, ongeveer $1.5\,\%$ van het volume van een cel van $2\,\mathrm{pL}$ per uur.

Oefening 8.12 ★★★

Botulinetoxine knipt een SNARE in motorische zenuwuiteinden; tetanustoxine knipt dezelfde SNARE in remmende schakelneuronen van het ruggenmerg. Leg uit waarom het eerste een slappe en het tweede een krampachtige verlamming veroorzaakt, en waarom een toxine dat de fusie blokkeert in de geneeskunde bij minieme doses nuttig is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 8.12.

Botulinetoxine werkt in het motorische uiteinde: er komt geen acetylcholine vrij, de spier krijgt geen opdracht en blijft slap — een slappe verlamming. Tetanustoxine wordt langs het motorische axon omhoog gedragen en over naar de remmende schakelneuronen die de motorische neuronen normaal in toom houden; met hun SNARE geknipt komt er geen glycine of GABA vrij, vuren de motorische neuronen ongeremd en trekt elke spier samen — een krampachtige verlamming. Enkele nanogrammen botulinetoxine in een overactieve spier gespoten leggen die plaatselijk maandenlang stil (tot er nieuw SNARE is gemaakt en het uiteinde herstelt): een behandeling voor dystonieën, spasticiteit, scheelzien en rimpels.

8.6 Vraagstuk: een dag van een alvleeskliercel

Probleem 8.1

Weekendvraagstuk — de doorvoer van een secretiecel geteld in moleculen, blaasjes en vierkante micrometers, haar pulscurven opgelost, de cholesterolopname van een levercel berekend via recyclende receptoren, en een lysosoom proton voor proton aangezuurd, met als besluit het tijdstip van het golgimaximum, het aantal blaasjes dat per minuut knopt en het aantal LDL-deeltjes dat per uur wordt opgenomen

Gegevens: een acinaire cel maakt $10^{7}$ enzymmoleculen per minuut, elk $25\,\mathrm{kDa}$ en $4\,\mathrm{nm}$ groot. Transportblaasjes zijn bollen met een diameter van $70\,\mathrm{nm}$ ; een korrel is een bol van $1\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Membraanoppervlak per lipidemolecuul $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ , twee lagen. Het reticulum van de cel heeft een oppervlak van $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Puls en jacht: $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ . Een levercel: $R = 50\,000$ LDL-receptoren, $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $K_{d} = 2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ , LDL-concentratie in het plasma $2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ; $1500$ cholesterolmoleculen per deeltje. Een lysosoom: bol van $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , pH van $7.2$ naar $4.7$ , met een buffercapaciteit zodanig dat er $50$ protonen moeten worden gepompt voor elk proton dat vrij blijft; een protonpomp verzet $200$ protonen per seconde.

Deel I — Doorvoer.

Welke massa enzym maakt de cel per minuut, en per dag? Vergelijk met haar eigen eiwitgehalte van ongeveer $300\,\mathrm{pg}$ .
Hoeveel enzymmoleculen passen er in een blaasje als zij $30\,\%$ van het volume vullen (bol van $4\,\mathrm{nm}$ )? Hoeveel blaasjes verlaten het reticulum per minuut?
Hoeveel membraanoppervlak voeren die blaasjes per minuut mee, en in hoeveel tijd zouden zij het hele reticulum opgebruiken als er niets terugkwam?
Hoeveel lipidemoleculen is dat per minuut? Wat moet de cel doen om haar reticulum te behouden?
Hoeveel enzymmoleculen passen er bij dezelfde pakking in een korrel, en hoeveel korrels vult de cel per uur?
Een maaltijd leegt $300$ korrels in tien minuten door fusie met het apicale membraan, waarbij hun membraan wordt toegevoegd aan een oppervlak van $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Met welke factor groeit het apicale oppervlak, en wat moet daarop volgen?

Deel II — Timing.

Wanneer bereikt het merkstof in het golgiapparaat met de gegeven snelheden zijn maximum, en welk deel zit daar dan?
Welk deel van een puls zit na $30\,\mathrm{min}$ in het reticulum, het golgiapparaat en de korrels?
Wat zijn de gemiddelde verblijfstijden in de twee compartimenten? Wat is de gemiddelde totale tijd van synthese tot korrel?
Een geneesmiddel vertraagt het vertrek uit het golgiapparaat tot $k_{2} = 0.01\,\mathrm{min}^{-1}$ . Wat zijn het nieuwe tijdstip en het nieuwe maximum; hoe ziet het golgiapparaat er in de microscoop uit?
Leg uit waarom het maximale golgideel $k_{1}/k_{2}$ tot een macht is (geef de macht) en daarom altijd onder $1$ ligt.
Wat zou $B(t)$ naderen als de reticulumstap veel sneller was dan de golgistap? Geef de betekenis.

Deel III — Cholesterol.

Bereken $\theta$ bij de LDL-concentratie in het plasma, en de opname $J$ in deeltjes per minuut en per uur.
Hoeveel cholesterolmoleculen per uur? De membranen van de cel bevatten $5\times 10^{9}$ cholesterolmoleculen; hoe lang duurt het om ze alle uit LDL alleen te vervangen?
Bereken het deel van de receptoren aan het oppervlak en het aantal rondreizen dat elke receptor in zijn levensduur van $20\,\mathrm{h}$ maakt.
Een heterozygoot heeft $R = 25\,000$ : herbereken $J$ . Het LDL in het plasma stijgt tot de opname de aanmaak evenaart: met welke factor, als $\theta$ ruim onder de verzadiging ligt?
Een statine verdubbelt $R$ in de levercellen van de heterozygoot. Wat gebeurt er volgens dezelfde redenering met het LDL in het plasma?
Leg uit waarom de homozygoot zonder receptoren, met vijf keer het normale LDL in het plasma, er toch slechter aan toe is dan de rekenkunde van vraag 16 alleen doet vermoeden.

Deel IV — Zuur.

Bereken het volume van het lysosoom in liters en het aantal vrije protonen bij pH $7.2$ en bij pH $4.7$ .
Hoeveel protonen moeten er met de buffering in totaal worden gepompt? Hoe lang duurt dat met $50$ pompen?
De pomp verzet protonen tegen de gradiënt in. Welk elektrisch probleem ontstaat daarbij, en hoe wordt het opgelost (denk aan een tegenion)?
Waarom zijn de hydrolasen pas bij pH 5 werkzaam, en wat beschermt dat?
Waarom laat de LDL-receptor LDL los bij pH 6, terwijl de mannose-6-fosfaatreceptor zijn vracht bij dezelfde pH loslaat — wat moeten beide eiwitten gemeen hebben?
Chloroquine is een zwakke base die ongeladen membranen oversteekt en gevangen raakt zodra zij is geprotoneerd. Met welke factor hoopt zij zich op in een lysosoom bij pH $4.7$ ten opzichte van het cytosol bij pH $7.2$ (de verhouding van de protonconcentraties), en wat doet dat met het lysosoom?
Vat samen: het tijdstip van het golgimaximum (vraag 7), het aantal blaasjes dat per minuut het reticulum verlaat (vraag 2), en het aantal LDL-deeltjes dat per uur wordt opgenomen (vraag 13).

Oplossing

Oplossing van Probleem 8.1.

1. $10^{7}\times 25\,000\,\mathrm{Da}\times 1.66\times 10^{-24}$ g $= 0.42\,\mathrm{pg}$ per minuut, $600\,\mathrm{pg}$ per dag — tweemaal haar eigen eiwitgehalte. 2. Volume van een blaasje $\tfrac{4}{3}\pi\,35^{3} = 1.8\times 10^{5}$ nm $^{3}$ , waarvan $30\,\%$ $5.4\times 10^{4}$ is; één enzymmolecuul $\tfrac{4}{3}\pi\,2^{3} = 34$ nm $^{3}$ : ongeveer $1600$ moleculen per blaasje; $10^{7}/1600 \approx 6200$ blaasjes per minuut. 3. Oppervlak $4\pi\,35^{2} = 0.0154\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ elk, $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ per minuut: de $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ van het reticulum in ongeveer een uur als er niets terugkwam. 4. $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2} = 9.5\times 10^{7}$ nm $^{2}$ , twee lagen bij $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ : $2.7\times 10^{8}$ lipiden per minuut. De cel brengt membraan terug met COPI-blaasjes en recycling, en maakt lipide aan om te vervangen wat definitief in korrels vertrekt. 5. Volume van een korrel $5.2\times 10^{8}$ nm $^{3}$ , waarvan $30\,\%$ $1.6\times 10^{8}$ : $4.7\times 10^{6}$ moleculen per korrel; $6\times 10^{8}$ moleculen per uur vullen ongeveer $130$ korrels. 6. Elke korrel voegt $\pi d^{2} = 3.1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ toe; $300$ voegen $940\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ toe aan $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ : twintigvoudig. Het membraan moet binnen minuten door compenserende endocytose worden teruggehaald. 7. $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , $B = 0.50$ . 8. $A = e^{-3} = 0.05$ ; $B = 2(e^{-1.5} - e^{-3}) = 0.35$ ; $C = 0.60$ . 9. $10\,\mathrm{min}$ en $20\,\mathrm{min}$ ; gemiddeld totaal $30\,\mathrm{min}$ . 10. $t^{*} = \ln(0.1)/(-0.09) = 25.6\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.1/(-0.09))(e^{-2.56} - e^{-0.256}) = 0.77$ : het golgiapparaat zwelt op, volgepropt met drie kwart van de vracht. 11. Bij het maximum geldt $k_{1}e^{-k_{1}t^{*}} = k_{2}e^{-k_{2}t^{*}}$ ; invullen in $B$ geeft $B_{\max} = (k_{1}/k_{2})^{\,k_{2}/(k_{2} - k_{1})}$ : de macht is $k_{2}/(k_{2} - k_{1})$ . Voor $k_{1} > k_{2}$ is de exponent negatief en het grondtal boven $1$ ; voor $k_{1} < k_{2}$ is het grondtal onder $1$ en de exponent positief — in beide gevallen ligt de waarde onder $1$ (controle: hier $2^{-1} = 0.5$ ). 12. Voor $k_{1} \gg k_{2}$ nadert $B(t) \to e^{-k_{2}t}$ : het merkstof zit meteen in het golgiapparaat en vertrekt met $k_{2}$ — de reticulumstap is onzichtbaar en de golgicurve is een eenvoudig verval. 13. $\theta = 2/(2+2) = 0.5$ ; $J = 50\,000\times 0.2\times 0.1\times 0.5/(0.1 + 0.1) = 2500$ deeltjes per minuut, $150\,000$ per uur. 14. $1.5\times 10^{5}\times 1500 = 2.3\times 10^{8}$ cholesterolmoleculen per uur; $5\times 10^{9}/2.3\times 10^{8} \approx 22$ uur. 15. Deel aan het oppervlak $k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta) = 0.5$ ; één rondreis kost $1/(k_{i}\theta) + 1/k_{r} = 10 + 10 = 20\,\mathrm{min}$ : ongeveer $60$ reizen in twintig uur. 16. $J = 1250$ per minuut. Onder de verzadiging is $J \propto R\,[L]$ , dus moet het LDL in het plasma bij de helft van de receptoren verdubbelen voor dezelfde klaring. 17. $R$ terug op $50\,000$ : de klaring is hersteld, het LDL in het plasma zakt weer naar normaal — het effect van de statine. 18. Zonder receptoren wordt het LDL alleen langs trage niet-specifieke wegen geklaard, zodat het dagen in plaats van uren circuleert, wordt geoxideerd en wordt opgenomen door de opruimreceptoren van macrofagen, die de schuimcellen van atherosclerotische plaques worden; en statines, die werken door receptoren aan te zetten, hebben niets om aan te zetten. 19. $V = \tfrac{4}{3}\pi(0.25)^{3} = 0.065\,\text{µ}\mathrm{m}^{3} = 6.5\times 10^{-17}$ L. Bij pH $7.2$ : $6.3\times 10^{-8}\times 6.5\times 10^{-17} = 4\times 10^{-24}$ mol — ongeveer $2$ vrije protonen. Bij pH $4.7$ : $2\times 10^{-5}\times 6.5\times 10^{-17} = 1.3\times 10^{-21}$ mol, ongeveer $780$ . 20. $50\times 780 \approx 39\,000$ protonen; $50$ pompen die $200$ per seconde verzetten halen $10\,000$ per seconde: ongeveer $4\,\mathrm{s}$ . 21. Positieve lading naar binnen pompen maakt het lumen positief, en enkele duizenden ladingen zouden de pomp stilleggen; chloride komt door een kanaal naar binnen (of kationen gaan naar buiten) om de lading te neutraliseren. 22. Enzymen die bij neutrale pH inactief zijn richten geen schade aan als een lysosoom lekt of als zij verkeerd naar het cytosol of het oppervlak worden gestuurd: de eis van zuur houdt de vertering binnen het compartiment dat ervoor is gebouwd. 23. Beide moeten een pH-sensor dragen — histidines, waarvan de protonering rond pH 6 het bindingsoppervlak verandert: de LDL-receptor vouwt bij protonering een domein over zijn eigen bindingsplaats, en de mannose-6-fosfaatreceptor verliest evenzo haar affiniteit. 24. $10^{7.2 - 4.7} = 10^{2.5} \approx 300$ -voudige ophoping; de gevangen base verbruikt protonen, verhoogt de pH van het lysosoom en schakelt de hydrolasen uit — zo doodt chloroquine malariaparasieten in hun voedselvacuole en zo blokkeert het de autofagie in experimenten. 25. Het golgimaximum bij $14\,\mathrm{min}$ ; zo’n $6200$ blaasjes die per minuut het reticulum verlaten; $150\,000$ LDL-deeltjes opgenomen per uur.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst