Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

3Genoomstabiliteit: DNA-schade, herstel en recombinatie

Een middag op het strand brengt zo’n honderdduizend chemische laesies aan in het DNA van elke huidcel die aan de zon is blootgesteld: naburige thymines door ultraviolet licht tot dimeren aaneengesmeed, basen geoxideerd, strengen ingeknipt. Zelfs zonder een sprankje zon slaat het warme water van de cel elke dag ongeveer tienduizend purines van hun suikers af en maakt het van honderden cytosines uracil. Toch bedraagt de mutatiesnelheid van een menselijke cel ongeveer één verandering per tien miljard basenparen per deling — in een genoom van zes miljard minder dan één nieuwe mutatie per deling. Het gat tussen de schade die een genoom oploopt en de schade die het houdt wordt gedicht door herstel: een tiental enzymsystemen die de dubbele helix patrouilleren, herkennen wat er niet hoort te zijn, het uitknippen en het vanaf de onbeschadigde streng weer opbouwen, en die, wanneer beide strengen gebroken zijn, ze weer aaneenvoegen of het ontbrekende stuk van een zusterchromatide kopiëren. De kinderen die een van deze systemen missen — die bij de eerste aanraking van zonlicht verbranden, of die in hun dertiger jaren darmkanker krijgen — laten zien wat de systemen waard zijn. Dit hoofdstuk gaat over de schade, de herstelroutes, de recombinatiemachinerie die de ergste breuken herstelt en die de meiose te leen neemt, en over het besluit van de cel om, wanneer het herstel faalt, met delen te stoppen of te sterven.

3.1 Wat er misgaat met DNA

Definitie 3.1 (DNA-laesies)

Een laesie is elke chemische verandering van DNA weg van de vier normale basen, correct gepaard op een intacte ruggengraat. Spontane laesies ontstaan uit de chemie van water en zuurstof: depurinering, hydrolyse van de binding tussen een purine en zijn suiker, die een abasische plaats achterlaat (ongeveer $10^{4}$ per cel per dag); deaminering, die van cytosine uracil maakt, van 5-methylcytosine thymine en van adenine hypoxanthine (enkele honderden per dag); oxidatie door reactieve zuurstofsoorten, vooral tot 8-oxoguanine, dat even gemakkelijk met adenine als met cytosine paart; en replicatiefouten, een verkeerd ingebouwde of verschoven base. Laesies uit het milieu zijn onder meer de cyclobutaanpyrimidinedimeer en het 6-4-fotoproduct die ultraviolet licht tussen twee naburige pyrimidines maakt; gealkyleerde basen door alkylerende stoffen (O $^{6}$ -methylguanine paart met thymine); volumineuze adducten van aromatische koolwaterstoffen en aflatoxine; dwarsverbindingen tussen de strengen door cisplatine en stikstofmosterd; en de enkelstrengs- en dubbelstrengsbreuken die ioniserende straling maakt, ongeveer $1000$ enkelstrengs- en $30\text{ tot }40$ dubbelstrengsbreuken per cel per gray.

Propositie 3.2 (De getrouwheidsladder)

De replicatie haalt haar foutenpercentage van ongeveer $10^{-10}$ per basenpaar in drie vermenigvuldigende stappen. De baseselectie door het polymerase, op geometrie en waterstofbruggen, vergist zich ongeveer eens per $10^{5}$ ; het proeflezen door het 3 $'\to$ 5 $'$ -exonuclease van het polymerase, dat een verkeerd gepaarde eindbase verwijdert voordat er wordt verlengd, haalt daar $99\,\%$ van weg; het mismatchherstel, dat achter de vork op de nieuw gemaakte streng werkt, haalt $99.9\,\%$ van de rest weg. Het product $10^{-5}\times 10^{-2}\times 10^{-3} = 10^{-10}$ is de waargenomen snelheid, en een defect in een van beide correctiestappen verhoogt haar honderd- of duizendvoudig: zulke cellen zijn mutatoren.

Voorbeeld 3.3 (Laesies tegenover mutaties)

Een menselijke cel van $6.4\times 10^{9}$ basenparen die zich eens per dag deelt stapelt in de orde van $10^{4}$ – $10^{5}$ laesies per dag op en ongeveer $6.4\times 10^{9}\times 10^{-10} \approx 0.6$ nieuwe mutaties per deling: minder dan één laesie op tienduizend overleeft om een blijvende verandering te worden. De rest wordt hersteld voordat de replicatie ze afleest, en wat de selectie heeft geminimaliseerd is de kans dat een laesie tot mutatie uitgroeit, niet de hoeveelheid schade. Dezelfde rekensom laat zien waarom het aantal mutaties in een tumor of in het zaad van een oudere vader delingen telt: de mutaties die een cel draagt zijn in eerste benadering het aantal delingen dat zij heeft doorgemaakt maal de fout per deling.

3.2 Herstel van één beschadigde streng

Definitie 3.4 (Excisieherstel)

De meeste laesies treffen één streng en worden hersteld door het beschadigde stuk uit te knippen en de andere streng te kopiëren. Het base-excisieherstel (BER) doet kleine, niet vervormende laesies: een DNA-glycosylase dat specifiek is voor één soort verkeerde base (uracil-DNA-glycosylase, 8-oxoG-glycosylase en verscheidene andere) klapt de base uit de helix en knipt haar van haar suiker; een AP-endonuclease knipt de ruggengraat in bij de abasische plaats; een polymerase (Pol $\beta$ ) verwijdert de suiker en zet één nucleotide in; een ligase sluit. Het nucleotide-excisieherstel (NER) doet volumineuze laesies die de helix vervormen — pyrimidinedimeren, chemische adducten — zonder de chemie van de laesie zelf te herkennen: de vervorming wordt opgemerkt (door XPC dat het genoom afspeurt, of door een gestrand RNA-polymerase in de aan transcriptie gekoppelde tak), de helix wordt geopend door de helicase-subeenheden van TFIIH, de schade wordt geverifieerd (XPA), twee endonucleasen (XPF, XPG) knippen de beschadigde streng $24\text{ tot }32$ nucleotiden uit elkaar, het oligonucleotide komt vrij, en polymerase en ligase vullen het gat. Verlies van een van de zeven XP-eiwitten veroorzaakt xeroderma pigmentosum: extreme gevoeligheid voor zonlicht, sproeten, en een duizendvoudig verhoogde kans op huidkanker.

Bewijsmateriaal. Cleaver (1968) kweekte huidfibroblasten van patiënten met xeroderma pigmentosum, bestraalde ze met ultraviolet licht en gaf ze buiten de S-fase radioactief thymidine. Normale cellen bouwden het merkstof op vele kleine plaatsen in — de “ongeplande DNA-synthese” van de herstelplekken — terwijl de cellen van de patiënten er vrijwel niets van inbouwden en stierven bij doses die normale cellen overleefden: de ziekte is een onvermogen om de dimeren uit te snijden. Het versmelten van cellen van twee patiënten herstelde in de hybride vaak het herstel, waarbij elke cel leverde wat de andere miste; met die toets werden de patiënten in complementatiegroepen A tot G ingedeeld, één per gen van de route, jaren voordat de genen werden gekloneerd. ∎

Twee excisieroutes. Base-excisie (links) herkent met een eigen glycosylase één bepaalde verkeerde base en vervangt één nucleotide. Nucleotide-excisie (rechts) herkent de vervorming die elke volumineuze laesie veroorzaakt, knipt de streng aan weerszijden door en vervangt een plek van zo’n dertig nucleotiden (groen).

Definitie 3.5 (Mismatchherstel)

Het mismatchherstel (MMR) corrigeert de verkeerde paringen en kleine insertie-deletielussen die aan het proeflezen ontsnappen. Het MutS-eiwit (MSH2–MSH6 bij de mens) herkent de vervorming van een mismatch en geeft, met MutL (MLH1–PMS2), een exonuclease toestemming om de nieuw gemaakte streng vanaf een nabije inknip tot voorbij de mismatch af te breken; het gat wordt door het polymerase weer gevuld. De moeilijkheid is de strengonderscheiding: een mismatch heeft twee basen en maar één ervan is fout. Bij Escherichia coli wordt de nieuwe streng herkend doordat zij bij de GATC-plaatsen nog niet is gemethyleerd, wat het Dam-methylase enkele minuten na de synthese doet; MutH knipt de ongemethyleerde streng in. Bij eukaryoten wordt de nieuwe streng herkend aan de inknipjes tussen de Okazaki-fragmenten en aan het vrije 3 $'$ -uiteinde van de leidende streng. Verlies van MMR verhoogt de mutatiesnelheid honderd- tot duizendvoudig, het duidelijkst bij microsatellieten — reeksen van een korte herhaling waar het polymerase uitglijdt — waarvan de lengtes van cel tot cel verschillen: microsatellietinstabiliteit. Erfelijk verlies van één MMR-allel is het syndroom van Lynch, met darmkanker bij zo’n $70\,\%$ van de dragers, vaak vóór hun vijftigste.

Strengonderscheiding bij het bacteriële mismatchherstel. De matrijsstreng draagt methylgroepen op haar GATC-plaatsen; de nieuwe streng nog niet, en MutH knipt haar daar in. De verkeerde base wordt dus altijd van de nieuwe streng verwijderd.

Methode 3.6 (Een herstelziekte in genen indelen)

Om te vinden hoeveel genen bij een recessief fenotype betrokken zijn, nog voordat er één gen bekend is: (1) neem cellijnen van niet-verwante patiënten, elk mutant in een of ander gen van de route; (2) versmelt paren van lijnen tot hybride cellen; (3) toets de hybride op de functie (hier de ongeplande DNA-synthese na ultraviolet licht); (4) is de hybride hersteld, dan dragen de twee patiënten mutaties in verschillende genen (elk levert het eiwit dat de ander mist: zij complementeren); zo niet, dan in hetzelfde gen; (5) deel de patiënten in complementatiegroepen in — één per gen. Het aantal groepen is een ondergrens voor het aantal genen.

3.3 Herstel van een gebroken chromosoom

Definitie 3.7 (Herstel van dubbelstrengsbreuken)

Een dubbelstrengsbreuk doorsnijdt het chromosoom en laat geen intacte streng over om te kopiëren. Twee routes herstellen haar. De niet-homologe eindverbinding (NHEJ): de Ku70–Ku80-ring bindt elk uiteinde, trekt het kinase DNA-PKcs aan, nucleasen snoeien de overhangen bij, en ligase IV voegt de uiteinden samen; zij werkt in elk stadium van de cyclus en binnen minuten, maar verliest of voegt enkele nucleotiden toe bij de las en kan de verkeerde uiteinden samenvoegen. De homologe recombinatie (HR): het MRN-complex en nucleasen snoeien de 5 $'$ -strengen weg en laten lange enkelstrengs 3 $'$ -staarten achter, die door RPA en daarna, met hulp van BRCA2, door het recombinase Rad51 worden bekleed; het Rad51-filament zoekt een homologe duplex — de zusterchromatide, in S en G2 — dringt die binnen, en het binnendringende 3 $'$ -uiteinde start de synthese op de intacte kopie. De verbonden moleculen kunnen na een korte synthese worden losgemaakt (het meeste mitotische herstel, zonder uitwisseling van flankerend DNA) of uitgroeien tot twee vierarmige Holliday-juncties, waarvan de oplossing door endonucleasen ofwel een crossover ofwel een niet-crossoverproduct geeft. HR is nauwkeurig omdat zij een zuster kopieert, maar is alleen beschikbaar wanneer er een zuster is.

De twee lotgevallen van een dubbelstrengsbreuk. Links: het samenvoegen van uiteinden, snel en altijd beschikbaar, ten koste van een kleine verandering bij de las. Rechts: de homologe recombinatie, die de uiteinden wegsnoeit, met een Rad51-filament de zusterchromatide binnendringt en kopieert wat verloren ging.

Stelling 3.8 (Schadelast, herstelsnelheid en de vork)

Laat laesies van één soort met constante snelheid $D$ per cel per uur ontstaan en met eerste-ordeherstel met snelheidsconstante $k$ worden verwijderd (halveringstijd $t_{1/2} = \ln 2/k$ ). Het aantal laesies $L(t)$ voldoet aan $\mathrm{d}L/\mathrm{d}t = D - kL$ , zodat in evenwicht

L^{*} = \frac{D}{k},

en een puls van $N$ laesies die op $t = 0$ wordt toegediend laat $N e^{-kT}$ laesies over wanneer een replicatievork op tijdstip $T$ aankomt. Concurreren twee routes om dezelfde laesie met snelheidsconstanten $k_{1}$ en $k_{2}$ , dan wordt elke laesie door de eerste hersteld met kans $k_{1}/(k_{1} + k_{2})$ en is de totale halveringstijd $\ln 2/(k_{1} + k_{2})$ . Het aantal laesies dat de vork bereikt is poissonverdeeld met gemiddelde $N e^{-kT}$ , dus is de kans dat er geen enkele aankomt $\exp(-N e^{-kT})$ .

Bewijs. Het evenwicht ligt waar $D = kL$ . Voor de puls is $D = 0$ en integreert de vergelijking tot $L = N e^{-kt}$ . Met twee routes is de verliessnelheid $(k_{1} + k_{2})L$ ; in elk kort tijdsinterval wordt een gegeven laesie door route 1 verwijderd met kans $k_{1}\,\mathrm{d}t$ en door route 2 met $k_{2}\,\mathrm{d}t$ , dus is de voorwaardelijke kans dat haar verwijdering, wanneer die plaatsvindt, door route 1 gebeurt $k_{1}/(k_{1} + k_{2})$ . Onafhankelijke laesies die elk met kans $e^{-kT}$ overleven geven een binomiale telling, poisson in de limiet van veel laesies en kleine overleving, en de poissonkans op nul is $e^{-\text{gemiddelde}}$ . ∎

Voorbeeld 3.9 (Waarom xeroderma een ziekte van de vork is)

Een dosis zon laat $N = 10^{5}$ pyrimidinedimeren in een keratinocyt achter. Met een halveringstijd van het nucleotide-excisieherstel van $2\,\mathrm{h}$ ( $k = 0.35\,\mathrm{h}^{-1}$ ) en een vork die na $8\,\mathrm{h}$ aankomt, zijn er $N e^{-kT} = 10^{5}\times e^{-2.8} \approx 6000$ dimeren over om te worden gekopieerd; met het vrijwel afwezige herstel van een XP-cel ( $k \approx 0.01\,\mathrm{h}^{-1}$ ) zijn dat er $92\,000$ . Elke dimeer die de vork tegenkomt wordt overbrugd door translesiesynthese (hieronder), die foutgevoelig is: de mutatielast per deling van de patiënt is vijftien keer de normale, en de huidkankers volgen al in de kindertijd. De remedie die werkt is $N$ klein houden — ultraviolet licht volledig mijden.

Overgebleven dimeren na een puls van 105, op een logaritmische schaal, voor een normale cel en een cel zonder nucleotide-excisieherstel. De vork bij 8\, h treft in de cel van de patiënt vijftien keer meer laesies aan. — Overgebleven dimeren na een puls van $10^{5}$ , op een logaritmische schaal, voor een normale cel en een cel zonder nucleotide-excisieherstel. De vork bij $8\,\mathrm{h}$ treft in de cel van de patiënt vijftien keer meer laesies aan.

Bewijsmateriaal. Holliday (1964) stelde de vierarmige junctie voor om een raadsel uit de schimmelgenetica te verklaren: bij een kruising vertoonde een tetrade van sporen soms een splitsing $3{:}1$ in plaats van de mendeliaanse $2{:}2$ van een merker, altijd bij merkers vlak bij een crossover. Zijn model — de uitwisseling van enkele strengen tussen twee homologe duplexen, waarbij een heteroduplex ontstaat die het mismatchherstel daarna in de ene of de andere richting “corrigeert” (genconversie) — verklaarde zowel de vreemde verhoudingen als hun samengaan met crossing-over. De junctie zelf werd later in de elektronenmicroscoop gezien in recombinerende plasmiden en in de structuur van het resolvase RuvC dat eraan gebonden is. ∎

3.4 Tolerantie, alarm en het besluit om te stoppen

Definitie 3.10 (Translesiesynthese)

Wanneer een vork een laesie tegenkomt die niet is hersteld, strandt het replicatieve polymerase. De translesiesynthese (TLS) roept een gespecialiseerd polymerase met een ruimere actieve plaats en zonder proeflezen erbij — Pol $\eta$ voor pyrimidinedimeren, Pol $\iota$ , $\kappa$ , $\zeta$ en Rev1 voor andere laesies — dat enkele nucleotiden tegenover de laesie zet en daarna opzij gaat. Pol $\eta$ zet twee adenines tegenover een thyminedimeer, wat meestal juist is; de andere zitten er vaak naast. TLS ruilt nauwkeurigheid in voor het voortbestaan van de vork, en is de bron van de meeste mutaties die ultraviolet licht veroorzaakt. De variantvorm van xeroderma pigmentosum (XP-V) heeft een intact excisieherstel en mist Pol $\eta$ : de dimeren die aan de excisie ontsnappen worden door de foutgevoeliger polymerasen overbrugd, en de kankers volgen.

Propositie 3.11 (De bacteriële SOS-respons)

Bij E. coli wordt het recombinase RecA, gebonden aan het enkelstrengs DNA dat zich bij gestrande vorken en weggesnoeide breuken ophoopt, een co-protease dat de repressor LexA ertoe brengt zichzelf te knippen. LexA onderdrukt zo’n veertig genen; naarmate hij wegvalt gaan ze aan in de volgorde van de affiniteit van hun operatoren: eerst de excisieherstelgenen uvrA en uvrB, dan recA zelf en de celdelingsremmer sulA (de cellen stoppen met delen en groeien uit tot filamenten), en als laatste de foutgevoelige polymerasen Pol IV en Pol V, die laesies overbruggen ten koste van mutaties. De getrapte respons probeert eerst nauwkeurig herstel en pas mutagene tolerantie wanneer de schade aanhoudt; de mutaties die zij opwekt zijn het ruwe materiaal waarop antibioticaresistentie tijdens een behandeling evolueert.

Links: E. coli na bestraling met ultraviolet licht, uitgegroeid tot lange filamenten omdat de SOS-respons de celdeling heeft geblokkeerd terwijl het DNA wordt hersteld. Rechts: een comettest — afzonderlijke cellen ingebed in een gel en geëlektroforeerd; gefragmenteerd DNA stroomt de kern uit in een staart waarvan de lengte het aantal breuken meet. — Links: *E. coli* na bestraling met ultraviolet licht, uitgegroeid tot lange filamenten omdat de SOS-respons de celdeling heeft geblokkeerd terwijl het DNA wordt hersteld. Rechts: een comettest — afzonderlijke cellen ingebed in een gel en geëlektroforeerd; gefragmenteerd DNA stroomt de kern uit in een staart waarvan de lengte het aantal breuken meet.

Definitie 3.12 (De DNA-schaderespons)

Eukaryoten geven schade door via twee kinasen: ATM, dat door het MRN-complex naar dubbelstrengsbreuken wordt gebracht, en ATR, dat naar het enkelstrengs DNA van gestrande vorken wordt gebracht. Zij fosforyleren honderden doelwitten. Binnen enkele minuten wordt het histon H2AX gefosforyleerd ( $\gamma$ -H2AX) over megabasen rond elke breuk, wat een focus vormt die hersteleiwitten aantrekt en onder de microscoop kan worden geteld, één focus per breuk. De kinasen Chk1 en Chk2 leggen de celcyclus stil — de controlepunten van Hoofdstuk 10 — door de fosfatasen te inactiveren die de intrede in S of M zouden aandrijven; en de transcriptiefactor p53, gestabiliseerd door fosforylering, induceert de remmer p21 van cycline-afhankelijke kinasen (een duurzame stilstand in G1), herstelgenen en, als de schade zwaar is of aanhoudt, de apoptosegenen die de cel doden. De respons koopt tijd voor herstel, en wanneer het herstel faalt ruimt zij de cel op in plaats van haar met een gebroken genoom te laten delen.

$\gamma$ -H2AX-foci (groen) in kernen (blauw) een uur na bestraling. Elke focus markeert een dubbelstrengsbreuk; ze tellen meet de schade en, in de uren erna, het herstel ervan.

Voorbeeld 3.13 (Synthetische lethaliteit: BRCA en PARP)

Vrouwen die één defecte kopie van BRCA1 of BRCA2 erven hebben een levenslang risico op borstkanker van $50\text{ tot }80\,\%$ ; de tumoren ontstaan in cellen die de tweede kopie hebben verloren en geen homologe recombinatie meer kunnen doen. Zulke cellen herstellen hun dubbelstrengsbreuken alleen nog met eindverbinding en stapelen herschikkingen op. Zij verwerven ook een bijzondere zwakte. Enkelstrengsbreuken, zo’n $10\,000$ per dag, worden hersteld langs een route die het enzym PARP nodig heeft; wordt PARP door een geneesmiddel geremd, dan blijven enkelstrengsbreuken tot in de S-fase bestaan, waar een vork er elk in een dubbelstrengsbreuk met maar één uiteinde omzet — alleen door recombinatie te herstellen. Een normale cel, met één goed BRCA-allel, redt zich; de tumorcel sterft. Twee defecten, elk op zichzelf onschadelijk, zijn samen dodelijk: het geneesmiddel doodt door synthetische lethaliteit, en spaart de andere cellen van de patiënt.

Propositie 3.14 (Recombinatie als gereedschap)

Plaatsspecifieke recombinasen knippen DNA op korte, vastgelegde sequenties en voegen het weer samen, zonder zoektocht naar homologie of synthese: het enzym Cre van faag P1 werkt op loxP-plaatsen van $34\,\mathrm{bp}$ , het gistenzym Flp op FRT-plaatsen. Twee plaatsen in dezelfde richting op één molecuul snijden het DNA ertussen als een cirkel eruit; in tegengestelde richting draaien zij het om; plaatsen op twee moleculen wisselen hun flanken uit. Een gen dat door loxP-plaatsen wordt geflankeerd (“gefloxt”) wordt alleen verwijderd in de cellen waar Cre tot expressie komt, vanaf een promotor naar keuze van de onderzoeker, of op een tijdstip naar diens keuze wanneer Cre door een geneesmiddel actief wordt gemaakt: zo wordt een gen dat voor het embryo onmisbaar is toch in de volwassen lever bestudeerd, of alleen in een neuron (Hoofdstuk 6). De eigen homologe recombinatie van de cel is wat gerichte genmodificatie en CRISPR-gestuurd bewerken te leen nemen om een gekozen sequentie op een gekozen plaats te schrijven.

Opmerking 3.15 (Herstel en veroudering)

Cellen die niet herstellen stapelen mutaties op, gaan in senescentie of sterven; de erfelijke herstelgebreken (het syndroom van Werner, een helicase; het syndroom van Cockayne, het aan transcriptie gekoppelde herstel; ataxia teleangiëctasia, ATM) veroorzaken kenmerken van vroegtijdige veroudering, en het aantal somatische mutaties in normale weefsels stijgt lineair met de leeftijd, met enkele tientallen mutaties per cel per jaar. Of opgestapelde schade de gewone veroudering veroorzaakt, dan wel haar alleen vergezelt, is niet beslecht; dat het herstelvermogen tussen soorten een bepalende factor voor de levensduur is — langer levende soorten herstellen meer — is goed onderbouwd.

3.5 Opgaven

Oefening 3.1 ★

Deel deze laesies in als spontaan of uit het milieu en noem voor elk de herstelroute: een uracil in DNA; een thyminedimeer; een 8-oxoguanine; een G–T-mismatch achter de vork; een dubbelstrengsbreuk in G1.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.1.

Uracil: spontaan (deaminering van C), base-excisieherstel door het glycosylase voor uracil-DNA. Thyminedimeer: uit het milieu (UV), nucleotide-excisieherstel. 8-oxoguanine: spontaan (oxidatie), base-excisieherstel door het 8-oxoG-glycosylase. G–T-mismatch achter de vork: replicatiefout, mismatchherstel. Dubbelstrengsbreuk in G1: uit het milieu (straling) of spontaan; niet-homologe eindverbinding, omdat er geen zusterchromatide beschikbaar is.

Oefening 3.2 ★

Waarom heeft het nucleotide-excisieherstel geen enzym nodig dat specifiek is voor elke soort laesie, terwijl het base-excisieherstel voor elke soort een glycosylase nodig heeft?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.2.

De nucleotide-excisie herkent een fysische eigenschap die alle volumineuze laesies delen — de vervorming van de helix, of een gestrand RNA-polymerase — en haalt een plek weg met daarin wat haar ook veroorzaakte. Kleine laesies (uracil, 8-oxoG, gealkyleerde basen) vervormen de helix nauwelijks, dus moeten zij aan hun chemie worden herkend, met één glycosylase per soort verkeerde base.

Oefening 3.3 ★

Formuleer het probleem van de strengonderscheiding bij het mismatchherstel en hoe E. coli het oplost. Wat zou er gebeuren in een dam-mutant, die geen enkele GATC-plaats methyleert?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.3.

Een mismatch bestaat uit twee normale basen, en alleen die op de nieuwe streng is fout; het systeem moet weten welke streng nieuw is. E. coli merkt de ouderlijke streng met methylgroepen op GATC, die de nieuwe streng enkele minuten lang mist; MutH knipt de ongemethyleerde streng in. In een dam-mutant is geen van beide strengen gemethyleerd: MutH knipt willekeurig een van beide in, het herstel haalt de juiste base even vaak weg als de verkeerde — zodat de helft van de fouten als mutatie wordt vastgelegd (een mutator) — en inknipjes op beide strengen bij nabije GATC-plaatsen maken dubbelstrengsbreuken.

Oefening 3.4 ★

Een cel ontvangt $2\,\mathrm{Gy}$ röntgenstraling. Hoeveel dubbelstrengsbreuken loopt zij ruwweg op, en hoeveel $\gamma$ -H2AX-foci zijn een uur later te verwachten? Waarom minder na zes uur?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.4.

Ongeveer $35\times 2 = 70$ dubbelstrengsbreuken. Na een uur is het merendeel samengevoegd: met een halveringstijd van bijna $30\,\mathrm{min}$ ongeveer $70/4 \approx 18$ foci. Na zes uur is vrijwel alles hersteld ( $70/2^{12} < 1$ ) en blijven alleen enkele hardnekkige, complexe breuken over.

Oefening 3.5 ★★

Bereken met Propositie 3.2 de mutatiesnelheid per basenpaar en het aantal nieuwe mutaties per diploïd genoom per deling in (a) een normale cel, (b) een cel zonder mismatchherstel, (c) een cel waarvan het polymerase zijn exonuclease heeft verloren. Welke is de gevaarlijkste mutator?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.5.

(a) $10^{-5}\times 10^{-2}\times 10^{-3} = 10^{-10}$ ; $6.4\times 10^{9}\times 10^{-10} = 0.64$ mutaties per deling. (b) Zonder mismatchherstel $10^{-7}$ ; $640$ per deling. (c) Zonder proeflezen $10^{-8}$ ; $64$ per deling. De mutant zonder mismatchherstel is de gevaarlijkste, duizendvoudig boven normaal.

Oefening 3.6 ★★

Abasische plaatsen ontstaan met $10^{4}$ per cel per dag en worden hersteld met een halveringstijd van $15\,\mathrm{min}$ . Bepaal met Stelling 3.8 het evenwichtsaantal abasische plaatsen in een cel. Wat is het nieuwe evenwicht als een geneesmiddel het herstel tienvoudig vertraagt, en hoeveel plaatsen zou een vork tegenkomen die het genoom in $8\,\mathrm{h}$ kopieert?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.6.

$k = \ln 2/0.25\,\mathrm{h} = 2.8\,\mathrm{h}^{-1}$ ; $D = 10^{4}/24 = 420\,\mathrm{h}^{-1}$ ; $L^{*} = 420/2.8 \approx 150$ abasische plaatsen op enig moment aanwezig. Tienvoudig trager herstel: $L^{*} \approx 1500$ . De vork passeert elke locus eenmaal en treft daar de laesies aan die er op dat moment zijn; over het genoom gemiddeld komt zij er ongeveer $L^{*}$ tegen — zo’n $150$ normaal, $1500$ met het middel.

Oefening 3.7 ★★

In G2 kan een breuk worden hersteld door NHEJ (halveringstijd $30\,\mathrm{min}$ ) of door HR (halveringstijd $4\,\mathrm{h}$ ), beide beschikbaar. Welk deel van de breuken gaat via HR? Wat is de halveringstijd van de breuken? Waarom is HR toch de route die ertoe doet bij ingestorte replicatievorken?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.7.

$k_{\text{NHEJ}} = \ln 2/0.5 = 1.39\,\mathrm{h}^{-1}$ , $k_{\text{HR}} = \ln 2/4 = 0.17\,\mathrm{h}^{-1}$ ; deel via HR $0.17/1.56 = 0.11$ ; halveringstijd $\ln 2/1.56 = 27\,\mathrm{min}$ . Een ingestorte vork geeft een breuk met één uiteinde: er is geen tweede uiteinde dat NHEJ kan samenvoegen, dus kan alleen recombinatie met de zuster de vork herstellen — en zij is hoe dan ook de enige nauwkeurige route.

Oefening 3.8 ★★

Voorspel het gedrag van de microsatellieten, het tumorspectrum en de gevoeligheid voor zonlicht van een patiënt met (a) het syndroom van Lynch, (b) xeroderma pigmentosum groep A, (c) de variant XP-V die Pol $\eta$ mist.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.8.

(a) Lynch: instabiele microsatellieten (de lengtes verschillen tussen tumorcellen), kanker van dikke darm, baarmoederslijmvlies, maag en eierstok, normale reactie op zonlicht. (b) XP-A: stabiele microsatellieten, extreme zonnebrand bij minimale blootstelling, huid- en oogkanker in de kindertijd, en in deze groep voortschrijdende neurologische aftakeling. (c) XP-V: stabiele microsatellieten, normaal excisieherstel zodat de zonnebrand milder is, maar de dimeren die aan de excisie ontsnappen worden door foutgevoelige polymerasen overbrugd — huidkankers, die later beginnen dan in groep A.

Oefening 3.9 ★★

Twee loxP-plaatsen in dezelfde richting flankeren exon 3 van een gen; Cre komt tot expressie vanaf een promotor die vanaf de geboorte alleen in de lever actief is. Beschrijf het genotype van levercellen en van neuronen in het volwassen dier, en wat er gebeurt als de plaatsen in plaats daarvan in tegengestelde richting worden gelegd.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.9.

Levercellen: Cre heeft exon 3 uit beide allelen gesneden (als een cirkel die verloren gaat), zodat het gen vanaf de geboorte in elke hepatocyt inactief is — een leverspecifieke knockout. Neuronen: geen Cre, de gefloxte allelen zijn intact en werkzaam. Tegengestelde richting: Cre draait het exon om en weer terug, zonder ophouden, zodat op elk moment ongeveer de helft van de cellen het omgekeerde, niet-werkzame exon draagt — een mozaïek, geen zuivere deletie.

Oefening 3.10 ★★★

Leg met de affiniteiten van LexA voor hun operatoren uit waarom de SOS-respons de herstelgenen eerder aanzet dan de foutgevoelige polymerasen, en waarom een bacterie die de foutgevoelige polymerasen geheel zou missen toch in het nadeel kan zijn in een patiënt die met antibiotica wordt behandeld.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.10.

Naarmate LexA wordt geknipt daalt zijn concentratie geleidelijk. Operatoren die LexA zwak binden komen bij een kleine daling al vrij — uvrA, uvrB, recA — zodat het nauwkeurige herstel het eerst begint; de operatoren van sulA en van de foutgevoelige polymerasen binden LexA stevig en komen pas vrij wanneer hij bijna weg is, dat wil zeggen wanneer de schade lang heeft aangehouden. Een bacterie zonder de foutgevoelige polymerasen zou sterven bij vorken die worden geblokkeerd door laesies die zij niet kan overbruggen, en zou, zonder geïnduceerde mutagenese, veel trager resistentie tegen het antibioticum ontwikkelen — een nadeel voor de bacterie, een voordeel voor de patiënt; remmers van de SOS-respons worden om die reden onderzocht.

Oefening 3.11 ★★★

Een PARP-remmer doodt BRCA-deficiënte tumorcellen maar niet de normale cellen van de patiënt. Zet de causale keten uiteen, en voorspel daarna twee manieren waarop een tumor resistent zou kunnen worden en hoe elk daarvan aan te tonen is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.11.

Keten: PARP geremd $\to$ enkelstrengsbreuken blijven bestaan $\to$ een replicatievork zet elk daarvan om in een dubbelstrengsbreuk met één uiteinde $\to$ het herstel vereist homologe recombinatie $\to$ de tumorcel, zonder BRCA, kan dat niet $\to$ verkeerd samenvoegen, verlies van chromosomen, dood. Normale cellen, met één werkzaam allel, recombineren en overleven. Resistentie: (1) een tweede mutatie in BRCA die het leesraam en een werkend eiwit herstelt — aan te tonen door de tumor of het circulerende tumor-DNA in het bloed te sequencen, en door de terugkeer van Rad51-foci na bestraling; (2) verlies van de eiwitten die het wegsnoeien van uiteinden blokkeren (53BP1–shieldine), wat de recombinatie zonder BRCA1 deels herstelt — aan te tonen door hun afwezigheid bij kleuring en door herstelde Rad51-foci; verder ook mutaties van PARP1 die verhinderen dat het op het DNA blijft haken, of pompen die het middel uitscheiden, aan te tonen door respectievelijk sequencing en expressie.

Oefening 3.12 ★★★

Genconversie bij een crossover geeft tetraden $3{:}1$ . Teken (of beschrijf) een Holliday-junctie met een heteroduplex die een merker overspant, en laat zien hoe mismatchherstel van de heteroduplex in de ene richting $3{:}1$ oplevert, in de andere $1{:}3$ , en hoe zonder herstel een spore ontstaat die zelf heterozygoot is (een postmeiotische splitsing). Waarom blijft conversie beperkt tot merkers dicht bij de crossover?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.12.

Twee homologe duplexen, de ene met $A$ en de andere met $a$ , wisselen over de merker heen enkele strengen uit: elk heeft nu over dat traject één streng van elke ouder — een heteroduplex met een $A/a$ -mismatch. Zet het mismatchherstel de mismatch op de binnengedrongen duplex om naar $A$ , dan dragen drie chromatiden $A$ en één $a$ : $3{:}1$ ; omgezet naar $a$ : $1{:}3$ ; blijft zij onhersteld, dan splitst de chromatide $A$ en $a$ bij de eerste mitose na de meiose en ontstaan twee verschillende dochtersporen (postmeiotische splitsing, $5{:}3$ in een ascus met acht sporen). Het heteroduplextraject beslaat maar enkele honderden tot enkele duizenden basenparen rond de breuk die het initieerde, dus kunnen alleen merkers daarbinnen worden omgezet, en die liggen per constructie naast de crossover.

3.6 Vraagstuk: een dag uit het leven van een genoom

Probleem 3.1

Weekendvraagstuk — de dagelijkse schade van één menselijke cel geteld, de getrouwheidsladder vermenigvuldigd, een dosis zonlicht gevolgd tot aan de vork in een normale en in een herstelgebrekkige cel, een dosis röntgenstraling over twee herstelroutes verdeeld, en de zwakte van een tumor tot geneesmiddel gemaakt, met als besluit het aantal dimeren dat de vork tegenkomt, de mutatiesnelheid per base en het deel van de breuken dat de recombinatie herstelt

Gegevens: een diploïde menselijke cel heeft $6.4\times 10^{9}$ bp, waarvan $1.5\,\%$ eiwitcoderend. Spontane schade per dag: $10^{4}$ depurineringen, $400$ cytosinedeamineringen, $10^{4}$ enkelstrengsbreuken. Getrouwheid: polymerase $10^{-5}$ , proeflezen laat $10^{-2}$ van de fouten over, mismatchherstel $10^{-3}$ . Een zonnebad laat $10^{5}$ pyrimidinedimeren per huidcel achter; het excisieherstel heeft normaal een halveringstijd van $2\,\mathrm{h}$ en $70\,\mathrm{h}$ bij xeroderma pigmentosum; een vork komt $8\,\mathrm{h}$ later aan; translesie-overbrugging van een dimeer veroorzaakt een mutatie met kans $10^{-3}$ . Röntgenstraling geeft $35$ dubbelstrengsbreuken per gray; halveringstijd NHEJ $30\,\mathrm{min}$ , halveringstijd HR $4\,\mathrm{h}$ .

Deel I — Gewone dagen.

Hoeveel spontane laesies loopt de cel per dag op, en per jaar? Vergelijk met de omvang van het genoom.
Bereken de mutatiesnelheid per basenpaar per deling en het verwachte aantal nieuwe mutaties per deling.
Hoeveel daarvan vallen in eiwitcoderende sequentie? Hoeveel coderende mutaties draagt een huidcel na de ruwweg $50$ delingen van zygote tot volwassen huidcel, alleen uit de replicatie?
Een cel zonder mismatchherstel: mutatiesnelheid en mutaties per deling? Een microsatelliet glijdt zonder mismatchherstel eens per $10^{4}$ delingen uit en met mismatchherstel eens per $10^{7}$ . Hoeveel cellen dragen in een tumor van $10^{9}$ cellen die door $40$ delingen is ontstaan in elk van beide gevallen een uitgegleden allel op een gegeven microsatelliet? (Schat met snelheid $\times$ delingen $\times$ cellen.)
Deaminering van cytosine geeft uracil, die van 5-methylcytosine geeft thymine. Welke wordt hersteld, waardoor, en welke wordt een mutatie? Verbind dit met het CpG-tekort uit Hoofdstuk 1.
Een geoxideerd guanine (8-oxoG) paart tijdens de replicatie met A. De cel heeft een glycosylase voor 8-oxoG tegenover C, een tweede voor A tegenover 8-oxoG, en een hydrolase dat geoxideerd dGTP vernietigt. Leg uit wat elk daarvan voorkomt en welke mutatie het gevolg is wanneer alle drie falen.

Deel II — Een dag in de zon.

Bereken de snelheidsconstanten $k$ van de excisie voor de normale en voor de XP-cel.
Hoeveel dimeren blijven er in elk bij de vork over?
Hoeveel mutaties veroorzaakt het zonnebad per cel in elk van beide gevallen, en hoeveel daarvan liggen in coderende sequentie?
Hoeveel coderende mutaties per huidcel in elk geval na een jeugd met $500$ zulke blootstellingen? Vergelijk met het getal uit vraag 3, dat alleen van de replicatie komt.
Ongeveer $20$ genen, samen $40\,\mathrm{kb}$ coderende sequentie, kunnen bij mutatie een huidkanker aandrijven. Wat is bij het XP-kind de kans per cel dat minstens één door het zonnebad veroorzaakte mutatie in een van die genen belandt? (Gebruik een poissonverdeling met het juiste gemiddelde.) Hoeveel van $10^{9}$ blootgestelde cellen worden getroffen?
Leg uit waarom het probleem van de XP-cellen bij de vork ligt en niet bij de laesie zelf, en waarom de kankers alleen in de huid verschijnen.

Deel III — Een dosis röntgenstraling.

Een dosis van $2\,\mathrm{Gy}$ : hoeveel dubbelstrengsbreuken, en hoeveel $\gamma$ -H2AX-foci na één uur als NHEJ de enige route is (een cel in G1)?
In een cel in G2 werken beide routes. Bereken de snelheidsconstanten en het deel van de breuken dat door HR wordt hersteld.
Wat is de halveringstijd van de breuken in G2, en hoeveel blijven er na één uur over?
Elke NHEJ-gebeurtenis verandert enkele basenparen bij de las. Als een las met kans $0.015$ in coderende sequentie valt en de verandering het gen dan met kans $0.7$ verstoort, hoeveel genen verstoort de dosis van $2\,\mathrm{Gy}$ per cel in G1?
Bij $n$ gelijktijdige breuken kunnen de uiteinden verkeerd tot een translocatie worden samengevoegd. Stel dat elk van de $n(n-1)/2$ paren breuken met kans $3\times 10^{-4}$ verkeerd wordt samengevoegd. Hoeveel translocaties per cel zijn te verwachten bij $2\,\mathrm{Gy}$ ? En bij $0.2\,\mathrm{Gy}$ ? Waarom schaalt het risico met het kwadraat van de dosis terwijl het aantal breuken lineair schaalt?
Dezelfde $2\,\mathrm{Gy}$ gegeven over $10\,\mathrm{h}$ in plaats van in één flits: hoeveel breuken zijn er dan op enig moment aanwezig (evenwicht, NHEJ)? Wat betekent dit voor translocaties, en voor de praktijk om radiotherapie te fractioneren?
Een cel overleeft een dosis $D$ met kans $e^{-D/D_{0}}$ , met $D_{0} = 1.5\,\mathrm{Gy}$ voor een cel met intact herstel en $0.5\,\mathrm{Gy}$ voor een cel zonder NHEJ. Bereken de overleving van elk bij $2\,\mathrm{Gy}$ en bij $6\,\mathrm{Gy}$ , en geef de betekenis van $D_{0}$ .

Deel IV — De zwakte van de tumor.

Een tumorcel zonder BRCA2 herstelt breuken alleen met NHEJ. Welk deel van haar breuken in S/G2 wordt met vraag 14 nu onnauwkeurig hersteld dat een normale cel nauwkeurig zou hebben hersteld? Wat doet dat over de jaren met haar genoom?
Remming van PARP laat de $10^{4}$ dagelijkse enkelstrengsbreuken onhersteld; $1\,\%$ daarvan wordt door vorken omgezet in dubbelstrengsbreuken met één uiteinde. Hoeveel zulke breuken per dag per cel, en waarom kan NHEJ een breuk met één uiteinde niet goed herstellen?
Leg uit waarom de normale cellen van de patiënt, heterozygoot voor BRCA2, het geneesmiddel overleven.
Een tumor wordt resistent door een tweede mutatie die het leesraam van BRCA2 herstelt. Leg dat uit, en zeg hoe dat is aan te tonen.
Chemotherapie met een alkylerende stof doodt tumorcellen via het mismatchherstel: het enzym probeert de gealkyleerde basen te herstellen en zet zo de celdood in gang. Voorspel het effect van het middel op een tumor bij het syndroom van Lynch, die geen mismatchherstel heeft.
Noem de drie uitkomsten: de dimeren die de vork in de XP-cel tegenkomt (vraag 8), de normale mutatiesnelheid per basenpaar (vraag 2) en het deel van de breuken in G2 dat HR herstelt (vraag 14).

Oplossing

Oplossing van Probleem 3.1.

1. $10^{4} + 400 + 10^{4} \approx 2\times 10^{4}$ laesies per dag, $7\times 10^{6}$ per jaar — ruwweg één per kilobase van het genoom per jaar. 2. $10^{-5}\times 10^{-2}\times 10^{-3} = 10^{-10}$ per bp; $6.4\times 10^{9}\times 10^{-10} = 0.64$ mutaties per deling. 3. $0.64\times 0.015 \approx 0.01$ coderende mutaties per deling; over $50$ delingen ongeveer $0.5$ . 4. $10^{-7}$ per bp, $640$ mutaties per deling. Uitgegleden cellen: zonder herstel $10^{-4}\times 40\times 10^{9} = 4\times 10^{6}$ ; met herstel $10^{-7}\times 40\times 10^{9} = 4000$ — een duizendvoudig verschil, zichtbaar als microsatellietinstabiliteit. 5. Uracil hoort niet in DNA thuis, wordt herkend door het uracil-DNA-glycosylase en uitgesneden: hersteld. Thymine uit 5-methylcytosine is een normale base tegenover een G; buiten de replicatie markeert niets haar als fout, en zij wordt een C $\to$ T-mutatie — het mechanisme dat CpG uit het genoom heeft uitgedund. 6. Het 8-oxoG-glycosylase haalt de geoxideerde base weg zolang zij nog tegenover C staat (vóór de replicatie); het tweede glycosylase haalt een A weg die verkeerd tegenover 8-oxoG is ingebouwd (na de replicatie, wat een nieuwe kans geeft om de G te herstellen); het hydrolase vernietigt geoxideerd dGTP zodat het niet tegenover A wordt ingebouwd. Falen alle drie, dan paart 8-oxoG met A en legt de volgende ronde een transversie G $\cdot$ C $\to$ T $\cdot$ A vast. 7. Normaal $k = \ln 2/2 = 0.35\,\mathrm{h}^{-1}$ ; XP $k = \ln 2/70 = 0.0099\,\mathrm{h}^{-1}$ . 8. Normaal $10^{5} e^{-2.77} \approx 6200$ ; XP $10^{5} e^{-0.079} \approx 92\,000$ . 9. Mutaties $6.2$ en $92$ per cel; coderend $0.09$ en $1.4$ . 10. $500$ blootstellingen: $47$ coderende mutaties (normaal) en $690$ (XP), tegen $0.5$ uit de replicatie — zonlicht overheerst de mutatielast van de huid zelfs bij een normaal persoon. 11. Coderende sequentie $9.6\times 10^{7}$ bp; de aandrijvende genen zijn $4\times 10^{4}/9.6\times 10^{7} = 4.2\times 10^{-4}$ daarvan. Gemiddeld aantal treffers $690\times 4.2\times 10^{-4} = 0.29$ ; $P(\ge 1) = 1 - e^{-0.29} = 0.25$ . Van $10^{9}$ cellen dragen er $2.5\times 10^{8}$ een aandrijvende mutatie (normaal kind: gemiddeld $0.02$ , $2\,\%$ ). 12. Een dimeer is geen mutatie; hij wordt er pas een wanneer een vork hem met foutgevoelige overbrugging kopieert, dus zijn delende cellen met veel onherstelde dimeren degene die muteren. Ultraviolet licht bereikt alleen de huid en het oog; inwendige weefsels krijgen geen dimeren en zijn bij XP vrijwel normaal. 13. $70$ breuken; na $1\,\mathrm{h}$ met alleen NHEJ $70\times 2^{-2} \approx 18$ foci. 14. $k_{\text{NHEJ}} = 1.39\,\mathrm{h}^{-1}$ , $k_{\text{HR}} = 0.17\,\mathrm{h}^{-1}$ ; deel via HR $0.17/1.56 = 0.11$ . 15. Halveringstijd $\ln 2/1.56 = 27\,\mathrm{min}$ ; na $1\,\mathrm{h}$ $70\,e^{-1.56} \approx 15$ breuken. 16. $70\times 0.015\times 0.7 \approx 0.7$ verstoorde genen per cel. 17. $n = 70$ : $2415$ paren $\times 3\times 10^{-4} = 0.72$ translocaties. $n = 7$ : $21\times 3\times 10^{-4} = 0.006$ . Het aantal breuken is $\propto D$ , maar het aantal paren gelijktijdige breuken is $\propto n^{2} \propto D^{2}$ . 18. $D = 7\,\mathrm{h}^{-1}$ , $L^{*} = 7/1.39 \approx 5$ breuken tegelijk aanwezig: $10$ paren, $0.003$ translocaties — tweehonderd keer minder dan dezelfde dosis in één flits. Fractioneren laat normaal weefsel tussen de fracties herstellen en houdt het aantal gelijktijdige breuken klein. 19. Intact herstel: $e^{-2/1.5} = 0.26$ bij $2\,\mathrm{Gy}$ , $e^{-4} = 0.018$ bij $6\,\mathrm{Gy}$ . Zonder NHEJ: $e^{-4} = 0.018$ en $e^{-12} = 6\times 10^{-6}$ . $D_{0}$ is de dosis die gemiddeld één dodelijke onherstelde laesie per cel achterlaat (overleving $1/e$ ). 20. De $11\,\%$ van de tweezijdige breuken in G2 die HR nauwkeurig zou hebben hersteld gaat nu via NHEJ, en elke vorkbreuk met één uiteinde — die NHEJ in het geheel niet correct kan herstellen — wordt verkeerd samengevoegd: over de jaren stapelt het genoom deleties, translocaties en kopieaantalveranderingen op, de kenmerkende littekens van BRCA-tumoren. 21. $10^{4}\times 0.01 = 100$ breuken met één uiteinde per dag. Een breuk met één uiteinde heeft geen partner; NHEJ kan haar alleen laten liggen of aan een willekeurig ander uiteinde koppelen, wat een translocatie of een verlies oplevert. 22. Eén werkzaam BRCA2-allel maakt genoeg eiwit voor de recombinatie: de normale cellen herstellen hun vorkbreuken en overleven de remmer. 23. Een tweede leesraamverschuiving stroomafwaarts van de eerste herstelt het leesraam en levert een verkort maar deels werkzaam BRCA2 op, zodat de recombinatie terugkeert en het middel niet meer doodt. Aan te tonen door BRCA2 in de resistente tumor of in circulerend tumor-DNA te sequencen, en functioneel door het opnieuw verschijnen van Rad51-foci na bestraling. 24. Het doden vergt dat het mismatchherstel de gealkyleerde basen aanpakt; een Lynch-tumor die het mist is tolerant — het middel doodt haar niet (zulke tumoren worden in plaats daarvan anders behandeld, onder meer met immuuntherapie, waarvoor hun zware mutatielast hen gevoelig maakt). 25. Ongeveer $92\,000$ dimeren bij de vork in de XP-cel; $10^{-10}$ mutaties per basenpaar per deling; HR herstelt $11\,\%$ van de breuken in G2.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst