Universitaire biologie — jaar 3 · Bachelor Year 3

13Virologie

Er zijn zo’n $10^{31}$ virusdeeltjes op aarde, tien voor elke cel, en in zee doden zij elke dag een vijfde van alle bacteriën. Een virus is geen cel: het heeft geen stofwisseling, geen ribosomen, geen manier om zelf iets te maken. Het is een genoom — zo kort als twee genen, zo lang als tweeduizend — verpakt in een eiwitmantel, dat een cel binnengaat en de machinerie van die cel aan het kopiëren van zichzelf zet. De griep van 1918 doodde vijftig miljoen mensen; de pokken, die alleen al in de twintigste eeuw driehonderd miljoen mensen doodden, werden in 1980 uitgeroeid met een vaccin dat in 1796 voor het eerst was beproefd; en van een coronavirus dat in 2019 op de mens oversprong werd binnen weken het genoom gesequenced, binnen dagen daarna een vaccin ontworpen, en binnen twee jaar middelen tegen zijn protease. Dit hoofdstuk behandelt wat virussen zijn en hoe zij naar de chemie van hun genomen worden ingedeeld, hoe zij zich vermenigvuldigen, de kinetiek van een infectie binnen één gastheer — die een paar differentiaalvergelijkingen goed genoeg beschrijft om de behandeling van aids te hebben veranderd — hun evolutie, en hoe zij worden bestreden.

13.1 Wat een virus is

Definitie 13.1 (Virus)

Een virus is een verplichte intracellulaire parasiet die bestaat uit een genoom van nucleïnezuur — DNA of RNA, enkel- of dubbelstrengs, lineair of cirkelvormig, één molecuul of verscheidene — verpakt in een eiwit-capside, en in veel gevallen gewikkeld in een envelop die aan een gastheermembraan is ontleend en met virale glycoproteïnen is bezet. Het volledige besmettelijke deeltje is het virion, bij de meeste $20\text{ tot }300\,\mathrm{nm}$ groot (enkele reuzenvirussen halen een micrometer). Capsiden worden gebouwd uit vele kopieën van één of enkele eiwitten, geschikt met helicale symmetrie (een staafje, zoals bij het tabaksmozaïekvirus) of met icosaëdrische symmetrie (een schil van $60T$ subeenheden, $T = 1, 3, 4, 7,\dots$ ). De indeling van Baltimore groepeert virussen naar de weg van genoom naar boodschapper-RNA: I, dubbelstrengs DNA (herpes, pokken, adenovirus, de meeste fagen); II, enkelstrengs DNA (parvovirus); III, dubbelstrengs RNA (rotavirus); IV, RNA van de positieve streng, zelf een boodschapper (polio, hepatitis C, de coronavirussen); V, RNA van de negatieve streng, complementair aan de boodschapper (griep, mazelen, hondsdolheid, ebola); VI, RNA dat in DNA wordt teruggeschreven (de retrovirussen, hiv); VII, DNA dat via een RNA-tussenvorm wordt gerepliceerd (hepatitis B). Elke klasse behalve I moet een enzym meebrengen of coderen dat de cel mist — een RNA-afhankelijk RNA-polymerase, een reverse transcriptase — en die enzymen zijn het doelwit van de meeste antivirale middelen.

Bewijsmateriaal. Ivanovski (1892) en Beijerinck (1898) toonden aan dat de mozaïekziekte van de tabak werd overgedragen door sap dat door filters was gehaald die alle bacteriën tegenhielden — een contagium vivum fluidum, een levende besmettelijke vloeistof. Stanley (1935) kristalliseerde de verwekker, het tabaksmozaïekvirus, en toonde aan dat het eiwit was met (zoals Bawden en Pirie vonden) $5\,\%$ RNA. Hershey en Chase (1952) merkten het eiwit van een bacteriofaag met $^{35}$ S en zijn DNA met $^{32}$ P, lieten hem E. coli besmetten, sloegen de lege mantels in een mixer eraf, en vonden het $^{32}$ P in de cellen en het $^{35}$ S erbuiten: het DNA gaat naar binnen en het eiwit blijft achter, dus het DNA draagt de instructies. Fraenkel-Conrat (1955) haalde het tabaksmozaïekvirus uiteen in eiwit en RNA en bouwde besmettelijke deeltjes op uit het RNA van de ene stam en het eiwit van de andere; het nageslacht was van de stam van het RNA. ∎

Propositie 13.2 (Genetische zuinigheid: waarom capsiden symmetrisch zijn)

Een capside moet het genoom omsluiten dat ervoor codeert. Een eiwit met massa $m$ heeft ongeveer $m/110\,\mathrm{Da}$ codons nodig, dat is $3m/110$ nucleotiden, een stuk RNA met een massa van ongeveer $3m/110\times330\,\mathrm{Da} = 9m$ : elk eiwit wordt gecodeerd door een nucleïnezuur van negen keer zijn eigen massa. Een schil gemaakt van één enkel eiwitmolecuul dat een genoom omsluit zou een genoom van negen keer zijn eigen massa moeten omsluiten enkel om voor zichzelf te coderen, en een schil kan bij biologische dichtheid geen negen keer haar eigen massa aan nucleïnezuur bevatten. De uitweg, die Crick en Watson (1956) zagen, is de schil uit vele kopieën van één klein eiwit te bouwen: het tabaksmozaïekvirus codeert een manteleiwit van $17.5\,\mathrm{kDa}$ in $480\,\mathrm{nt}$ van zijn genoom van $6400\,\mathrm{nt}$ en gebruikt er $2130$ kopieën van. Gelijke subeenheden die gelijk pakken moeten symmetrisch geschikt zijn, dus zijn virale capsiden helices of icosaëders, en dezelfde zuinigheid geeft hun het vermogen zichzelf samen te stellen, omdat elke subeenheid alleen haar buren hoeft te herkennen.

Bewijs. De massaverhouding volgt eruit dat een codon drie nucleotiden van ongeveer $330\,\mathrm{Da}$ elk is en een residu ongeveer $110\,\mathrm{Da}$ : $3\times 330/110 = 9$ . Een capside van één eiwit van $40\,\mathrm{MDa}$ zou $360\,\mathrm{MDa}$ nucleïnezuur omsluiten, bij de dichtheid van nucleïnezuur een bol met een straal van ongeveer $50\,\mathrm{nm}$ , terwijl het eiwit zelf een schil van ongeveer $2\,\mathrm{nm}$ dik met dezelfde straal zou geven — meetkundig mogelijk, maar één polypeptide van $360\,000$ residuen dat zich juist vouwt is dat niet, en één mutatie zou het vernielen. Met $n$ gelijke subeenheden daalt de coderingskost met $n$ terwijl het omsloten volume gelijk blijft. ∎

De zeven klassen van Baltimore, geordend naar de weg van genoom naar boodschapper-RNA. Elke klasse behalve I heeft een enzym nodig dat de gastheercel niet levert — het natuurlijke doelwit van een antiviraal middel.

Links: bacteriofagen die met hun staartvezels aan een bacterie zijn gehecht, met elke kop een icosaëdrisch capside vol DNA. Rechts: griepvirionen, met envelop, waarvan het oppervlak een franje van hemagglutinine- en neuraminidasepieken draagt.

13.2 Hoe een virus zich vermenigvuldigt

Definitie 13.3 (De replicatiecyclus)

Elk virus doorloopt dezelfde stadia. De hechting aan een bepaalde gastheerreceptor — CD4 en een chemokinereceptor voor hiv, ACE2 voor de SARS-coronavirussen, siaalzuur voor de griep, een lipopolysacharide of een porine voor een faag — die bepaalt welke soorten en welke cellen het virus kan besmetten (zijn tropisme). De intrede: fusie van de envelop met het plasmamembraan, of endocytose gevolgd door fusie van binnenuit het zure endosoom, of, bij een faag, injectie van het genoom door de wand. Het ontmantelen, de expressie van de virale genen langs de weg van de klasse, en de replicatie van het genoom, vaak in een fabriek die het virus in het cytoplasma of de kern bouwt. De assemblage van nieuwe capsiden om nieuwe genomen heen, gedreven door het zelf samenstellen van de symmetrische subeenheden, en de vrijlating: door de cel te doen barsten, of door door een membraan naar buiten te knoppen, wat de envelop levert. Sommige virussen kunnen in plaats daarvan hun genoom in dat van de gastheer invoegen en wachten: de lysogenie van faag $\lambda$ , waarvan de repressor hem stil houdt tot de gastheer beschadigd raakt; de latentie van herpesvirussen in neuronen, een leven lang, en van hiv als provirus in rustende T-cellen, waaruit geen enkel middel dat op de replicatie werkt hem verwijdert.

De replicatiecyclus van een virus met envelop: hechting aan een receptor, intrede en ontmanteling, expressie en replicatie in de machinerie van de gastheer, assemblage, en vrijlating door knopvorming — of, bij een retrovirus, integratie in het gastheergenoom en stilte.

Methode 13.4 (Besmettelijke deeltjes tellen: de plaquetoets)

Om een virusvoorraad te meten: (1) verdun haar in stappen van tien; (2) meng elke verdunning met een overmaat gastheercellen — bacteriën in zachte agar voor een faag, een laag gekweekte cellen voor een diervirus; (3) laat groeien: elk besmettelijk deeltje besmet één cel, het nageslacht besmet de buren, en na een dag of twee markeert een helder gat, een plaque, de plek; (4) tel de plaques op een plaat met er $30\text{ tot }300$ en vermenigvuldig met de verdunning: de titer in plaquevormende eenheden (PVE) per milliliter. Omdat elke plaque een kloon van één deeltje is, levert haar oppikken een zuiver isolaat. De verhouding van fysieke deeltjes (geteld met de elektronenmicroscoop of met PCR) tot plaquevormende eenheden ligt meestal ver boven één — tien tot duizend voor veel diervirussen — omdat de meeste deeltjes gebrekkig zijn of er niet in slagen te besmetten.

Links: plaques in een bacterieveld, elk een heldere zone waar het nageslacht van één faag de cellen eromheen heeft doen barsten. Rechts: hiv-deeltjes die uit een T-lymfocyt knoppen en hun envelop aan het membraan van de cel ontlenen.

Stelling 13.5 (Infectiedynamiek binnen een gastheer)

Zij $T$ de dichtheid van vatbare doelcellen, $I$ die van besmette cellen en $V$ die van vrije virionen. Virionen besmetten doelcellen met snelheid $\beta TV$ , besmette cellen maken elk virionen met snelheid $p$ en sterven met snelheid $\delta$ , en vrije virionen worden geklaard met snelheid $c$ :

\frac{\mathrm{d}I}{\mathrm{d}t} = \beta TV - \delta I, \qquad \frac{\mathrm{d}V}{\mathrm{d}t} = pI - cV .

Met $T$ constant gehouden groeit de infectie wanneer het basale reproductiegetal $R_{0} = \beta Tp/(c\delta)$ groter is dan $1$ , en in evenwicht geldt $V^{*} = p I^{*}/c$ , waarbij de productie de klaring opheft. Stopt een geneesmiddel op $t = 0$ alle nieuwe besmettingen ( $\beta \to 0$ ), dan vervallen de virionen eerst met de klaringssnelheid $c$ en daarna, zodra het vrije virus is gezakt tot het niveau dat de overgebleven besmette cellen in stand houden, met de sterftesnelheid $\delta$ van die cellen:

V(t) \approx V_{0}\,\frac{c\,e^{-\delta t} - \delta\,e^{-ct}}{c - \delta} \;\longrightarrow\; V_{0}\,\frac{c}{c-\delta}\,e^{-\delta t} \quad (t \gg 1/c).

De twee hellingen van de virale last na de behandeling meten $c$ en $\delta$ , en $pI^{*} = cV^{*}$ geeft de dagelijkse productie van virionen vóór de behandeling.

Bewijs. Een besmette cel leeft gemiddeld $1/\delta$ en maakt $p/\delta$ virionen; elk virion leeft $1/c$ en besmet in die tijd $\beta T/c$ cellen; het product is het aantal besmette cellen dat één besmette cel voortbrengt, $R_{0}$ . In evenwicht geeft $\mathrm{d}V/\mathrm{d}t = 0$ dat $V^{*} = pI^{*}/c$ . Na de behandeling geldt $\mathrm{d}I/\mathrm{d}t = -\delta I$ , dus $I = I_{0}e^{-\delta t}$ , en is $\mathrm{d}V/\mathrm{d}t = pI_{0}e^{-\delta t} - cV$ een lineaire vergelijking waarvan de oplossing met $V(0) = V_{0} = pI_{0}/c$ de gegeven uitdrukking is (controle: bij $t = 0$ is zij gelijk aan $V_{0}$ , en zij voldoet term voor term aan de vergelijking). Voor $t \gg 1/c$ is de term $e^{-ct}$ verdwenen en volgt $V$ de besmette cellen met helling $-\delta$ ; voor $t \ll 1/\delta$ en $c \gg \delta$ is de vroege helling $-c$ . ∎

Voorbeeld 13.6 (Hiv vóór en na de vergelijkingen)

Tot 1995 werden de jaren van klinische latentie bij een hiv-infectie — een stabiele virale last van $10^{4}$ – $10^{6}$ kopieën per milliliter en een trage daling van de T-cellen — gelezen als een sluimerend virus. Ho, Perelson en collega’s gaven patiënten een proteaseremmer en pasten de daling van de virale last aan de stelling aan: de snelle fase gaf $c \approx 3\,\mathrm{d}^{-1}$ (een halveringstijd van een virion van ongeveer zes uur), de trage fase $\delta \approx 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ (een besmette cel leeft ongeveer anderhalve dag). Een stabiele last van $10^{5}$ per milliliter in $15\,\mathrm{L}$ lichaamsvocht, geklaard met $c$ , vergt dus de productie van ongeveer $10^{10}$ virionen per dag, elke dag, jarenlang: de “latente” periode is een razende evenwichtstoestand van besmetting en dood, waarbij de voorraad T-cellen dagelijks wordt vervangen tot zij het begeeft. De mutatierekenkunde van de volgende paragraaf volgt daar meteen uit, en daarmee de reden dat losse middelen faalden en drie niet.

De virale last nadat een middel nieuwe besmettingen heeft gestopt, volgens de stelling met c = 3\, d-1 en = 0.5\, d-1: een snelle daling terwijl vrije virionen worden geklaard, daarna een tragere daling op het tempo van het sterven van de reeds besmette cellen. — De virale last nadat een middel nieuwe besmettingen heeft gestopt, volgens de stelling met $c = 3\,\mathrm{d}^{-1}$ en $\delta = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ : een snelle daling terwijl vrije virionen worden geklaard, daarna een tragere daling op het tempo van het sterven van de reeds besmette cellen.

13.3 Hoe virussen evolueren

Definitie 13.7 (Mutatie, quasisoort, drift en shift)

RNA-afhankelijke polymerasen en reverse transcriptasen lezen hun werk niet na, en RNA-virussen muteren met $10^{-4}$ tot $10^{-6}$ per nucleotide per replicatie — duizend tot een miljoen keer de snelheid van hun gastheren — zodat een populatie van een RNA-virus een wolk verwante genomen is, een quasisoort, waarin elke afzonderlijke puntmutant altijd aanwezig is als de populatie groot is. De selectie door antilichamen drijft de antigene drift: de oppervlakte-eiwitten van het griepvirus stapelen jaar na jaar substituties op, en de afweer van vorig jaar beschermt elk seizoen minder. De antigene shift is een sprong: een genoom in segmenten (het griepvirus heeft acht RNA-segmenten) kan worden herschikt wanneer twee stammen één cel besmetten, en een segment dat codeert voor een hemagglutinine van een vogel- of varkensvirus, waartegen geen mens afweer heeft, brengt een pandemie voort — 1918, 1957, 1968, 2009. De recombinatie binnen een genoom doet hetzelfde voor virussen zonder segmenten, en de coronavirussen recombineren vrijelijk. De meeste nieuwe menselijke virussen zijn zoönosen die uit een dierlijk reservoir overspringen — vleermuizen voor de coronavirussen, ebola en hondsdolheid; vogels en varkens voor de griep; primaten voor hiv — en het overspringen is meestal een kwestie van enkele mutaties in een receptorbindend eiwit.

Propositie 13.8 (De foutendrempel)

Een genoom van $L$ nucleotiden dat met foutenpercentage $u$ per nucleotide wordt gekopieerd, wordt zonder enige fout gekopieerd met kans $(1-u)^{L} \approx e^{-uL}$ . Wil de fitste sequentie in de populatie standhouden tegen de vloed van haar mutanten, dan moet het deel foutloze kopieën ongeveer boven het omgekeerde van haar selectieve voordeel $\sigma$ liggen: $e^{-uL} \gtrsim 1/\sigma$ , dat wil zeggen $uL \lesssim \ln\sigma$ , een getal van de orde één. Het product van mutatiesnelheid en genoomlengte is dus begrensd: een RNA-virus met $u = 10^{-4}$ kan geen genoom hebben dat veel langer is dan $10^{4}$ nucleotiden, en dat is ongeveer wat RNA-virussen hebben; de coronavirussen, met $30\,\mathrm{kb}$ de langste bekende RNA-genomen, halen dat alleen door voor een nalezend exonuclease te coderen dat $u$ tienvoudig verlaagt. De drempel is ook een wapen: middelen die het foutenpercentage van het polymerase verhogen (ribavirine, molnupiravir) duwen een virus eroverheen tot in de foutencatastrofe, en de quasisoort stort in.

Bewijs. Onafhankelijke fouten op elk van $L$ plaatsen geven de kans op foutloosheid $(1-u)^{L}$ , en $\ln(1-u) \approx -u$ voor kleine $u$ . De populatiebalans is het gebruikelijke argument van de quasisoort (Eigen, 1971): de meestersequentie wordt ten opzichte van de gemiddelde mutant aangevuld met snelheid $\sigma e^{-uL}$ en gaat verder aan mutatie verloren; zij blijft alleen bestaan als het eerste groter is dan $1$ , waaruit de grens volgt. ∎

Twee manieren waarop een griepvirus aan de afweer ontsnapt. Drift: mutaties in de pieken hopen zich geleidelijk op. Shift: twee stammen in één cel wisselen hele genoomsegmenten uit, en er verschijnt in één keer een piekeiwit dat nieuw is voor de mens.

Voorbeeld 13.9 (Waarom hiv drie middelen nodig had)

Het reverse transcriptase van hiv vergist zich ongeveer eens per $10^{5}$ nucleotiden, zodat elk gekopieerd genoom van $9700\,\mathrm{nt}$ ongeveer $0.1$ mutaties draagt, en $10^{10}$ nieuwe genomen per dag samen $10^{9}$ mutaties dragen: elk van de $3\times 9700 \approx 30\,000$ mogelijke enkele puntmutaties ontstaat elke dag vele keren, nog voordat er een middel is gegeven. Een middel dat één enkele mutatie verslaat — zoals één mutatie de meeste remmers van het reverse transcriptase en van het protease verslaat — is daarom binnen weken verslagen, en dat is wat AZT in 1987 overkwam. Twee onafhankelijke mutaties ontstaan samen met $10^{-10}$ per genoom, ongeveer eens per dag; drie met $10^{-15}$ , eens per duizend dagen — en een patiënt op drie middelen wiens last duizendvoudig is gedaald maakt $10^{7}$ genomen per dag, zodat de drievoudige mutant nooit verschijnt. Dat, en het bewijs uit de stelling dat het virus op volle snelheid repliceerde, maakten de combinatietherapie vanaf 1996 tot de behandeling die van aids een chronische aandoening maakte.

13.4 Gastheren, afweer en geneesmiddelen

Propositie 13.10 (Ziekmakend vermogen en afweer)

Een virus richt schade aan door cellen te doen barsten (polio vernielt motorische neuronen, hiv doodt T-cellen), door cellen giftige producten te laten maken, door ze te transformeren (Hoofdstuk 11), en vaak vooral via de eigen reactie van de gastheer: de koorts, de weefselschade en, in het ergste geval, de cytokinestorm van de afweerreactie op de griep of de SARS-coronavirussen. De gastheer antwoordt met aangeboren afweer die de handtekeningen van virale replicatie herkent — dubbelstrengs RNA, RNA zonder kap, DNA in het cytosol — en met interferon reageert, dat elke buurcel in een antivirale toestand brengt (Hoofdstuk 15); met natuurlijke doodcellen die cellen vernietigen die hun MHC hebben verborgen; met antilichamen die virionen onschadelijk maken en cytotoxische T-cellen die besmette cellen doden voordat zij nageslacht vrijlaten (Hoofdstuk 16); en, bij bacteriën, met restrictie-enzymen die vreemd DNA knippen en het CRISPR-geheugen van Hoofdstuk 6. De virussen antwoorden terug: vrijwel elk groot virus codeert eiwitten die het interferon blokkeren, het MHC verbergen, cytokinen nabootsen of de apoptose remmen, en de wapenwedloop staat in beide genomen geschreven.

Definitie 13.11 (Antivirale middelen en vaccins)

Antivirale middelen vallen de virale enzymen aan of de stappen die een gastheercel niet uitvoert. Nucleoside-analogen zijn ketenafbrekers: aciclovir wordt alleen door het thymidinekinase van het herpesvirus gefosforyleerd en blokkeert daarna het virale DNA-polymerase, zodat het alleen in besmette cellen werkt; AZT, tenofovir en lamivudine stoppen het reverse transcriptase; remdesivir en molnupiravir werken op het polymerase van het coronavirus, het tweede door mutagenese. Proteaseremmers blokkeren het knippen van virale polyproteïnen (hiv, hepatitis C, het nirmatrelvir tegen SARS-CoV-2). Integraseremmers verhinderen dat het provirus van hiv ontstaat; neuraminidaseremmers beletten dat griepvirionen loslaten van de cel waaruit zij knoppen; intrederemmers blokkeren een receptor. Het hepatitis-C-virus wordt nu in twaalf weken genezen met combinaties van rechtstreeks werkende middelen, de eerste chronische virusinfectie die ooit met chemotherapie is genezen. Vaccins bieden de antigenen van het virus zonder zijn ziekte: een levend verzwakt virus (mazelen, polio via de mond, gele koorts), een geïnactiveerd virus (polio per injectie, griep), een subeenheid (het oppervlakteantigeen van hepatitis B gemaakt in gist, het capside-eiwit van het papillomavirus), een onschadelijke virale vector met een gen van het doelwit, of, sinds 2020, boodschapper-RNA dat voor het antigeen codeert, geleverd in lipidenanodeeltjes, dat de eigen cellen van de ontvanger vertalen. De immunologie van waarom zij werken, en van hoeveel mensen er moeten worden ingeënt om de rest te beschermen, is de stof van Hoofdstuk 16.

Opmerking 13.12 (Virussen in de huishouding van het leven)

De virussen die de mens schaden zijn een afrondingsfout in de viruspopulatie van de wereld, waarvan het meeste bacteriën en archaea besmet. Fagen doden dagelijks een vijfde tot een derde van de bacteriën in de oceaan en geven hun inhoud terug aan de opgeloste voorraad — de virale nevenweg van de koolstofkringloop uit het boek van jaar 2. Zij verplaatsen genen tussen bacteriën (Hoofdstuk 12), en hun toxinen zijn de toxinen van difterie, cholera en de ergste E. coli. Acht procent van het menselijk genoom bestaat uit de resten van oude retrovirussen (Hoofdstuk 4), en een van hun envelopgenen versmelt nu de cellen van de placenta. Virussen zijn het grootste reservoir van genetische nieuwigheid op de planeet, en de grens van wat als levend telt loopt dwars door hen heen.

13.5 Opgaven

Oefening 13.1 ★

Plaats polio, griep, hiv, herpes simplex, hepatitis B en rotavirus in hun klassen van Baltimore en zeg welk enzym elk moet meebrengen of maken dat de cel mist.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.1.

Polio: IV, RNA van de positieve streng — een RNA-afhankelijk RNA-polymerase. Griep: V, RNA van de negatieve streng — een eigen RNA-polymerase, meegedragen in het virion. Hiv: VI — reverse transcriptase (en integrase). Herpes simplex: I, dubbelstrengs DNA — de gastheer zou in beginsel alles kunnen leveren, maar het virus brengt een eigen DNA-polymerase en thymidinekinase mee. Hepatitis B: VII — een reverse transcriptase om zijn pregenomisch RNA in DNA te kopiëren. Rotavirus: III, dubbelstrengs RNA — een RNA-afhankelijk RNA-polymerase in het deeltje.

Oefening 13.2 ★

Wat toonde het experiment van Hershey en Chase aan, en wat zou er zijn gevonden als het eiwit de instructies had gedragen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.2.

Het DNA van de faag ( $^{32}$ P) ging de bacteriën binnen en het eiwit ( $^{35}$ S) bleef erbuiten en kon eraf worden geslagen; het nageslacht van de faag erfde het $^{32}$ P. Het DNA is dus wat de faag inspuit en wat het maken van nieuwe fagen stuurt. Had het eiwit de instructies gedragen, dan zou het $^{35}$ S binnen zijn gevonden en aan het nageslacht zijn doorgegeven.

Oefening 13.3 ★

Een faagvoorraad die $10^{-7}$ is verdund geeft $84$ plaques uit $0.1\,\mathrm{mL}$ . Wat is de titer? Waarom kan de elektronenmicroscoop tien keer meer deeltjes tellen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.3.

$84/(0.1\times 10^{-7}) = 8.4\times 10^{9}$ plaquevormende eenheden per mL. De microscoop telt elk deeltje, ook lege capsiden, deeltjes met gebrekkige genomen en deeltjes die er niet in slagen te hechten of in te spuiten; alleen deeltjes die een besmetting voltooien maken plaques.

Oefening 13.4 ★

Noem de zes stadia van een replicatiecyclus en bij elk één antiviraal middel of één afweermiddel van de gastheer dat erop ingrijpt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.4.

Hechting: intrederemmers (maraviroc), neutraliserende antilichamen. Intrede en fusie: fusieremmers, blokkers van de aanzuring van het endosoom. Ontmanteling: middelen die het capside binden (pleconaril; lenacapavir). Expressie en replicatie: nucleoside-analogen, remmers van het reverse transcriptase en van het integrase, interferon, RNA-interferentie. Assemblage: proteaseremmers (ongeknipte polyproteïnen kunnen niet worden samengesteld). Vrijlating: neuraminidaseremmers (griep), en cytotoxische T-cellen die de cel doden voordat zij vrijlaat.

Oefening 13.5 ★★

Bereken met Propositie 13.2 het nucleïnezuur dat nodig is om het capside te coderen van een virus dat uit $180$ kopieën van een eiwit van $30\,\mathrm{kDa}$ bestaat, en vergelijk met het genoom van $4.5\,\mathrm{kb}$ dat zo’n virus zou kunnen hebben. Welk deel van het genoom is het capsidegen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.5.

Eén eiwit van $30\,\mathrm{kDa}$ is $30\,000/110 = 273$ residuen, $818$ nucleotiden: $0.82\,\mathrm{kb}$ , $18\,\%$ van een genoom van $4.5\,\mathrm{kb}$ . De $180$ kopieën elk afzonderlijk coderen zou $147\,\mathrm{kb}$ kosten, drieëndertig keer het hele genoom; het capside-eiwit zelf ( $5.4\,\mathrm{MDa}$ ) weegt viermaal zoveel als het genoom ( $1.5\,\mathrm{MDa}$ ).

Oefening 13.6 ★★

Bereken met $c = 3\,\mathrm{d}^{-1}$ , $\delta = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ en $V_{0} = 10^{5}$ per mL de waarde van $V$ uit de stelling bij $t = 0.5$ , $2$ en $10$ dagen. Hoe lang duurt het voordat de last onder $50$ per mL zakt, de aantoonbaarheidsgrens?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.6.

$V = 10^{5}(3e^{-0.5t} - 0.5e^{-3t})/2.5$ : $t = 0.5$ : $8.9\times 10^{4}$ ; $t = 2$ : $4.4\times 10^{4}$ ; $t = 10$ : $8\times 10^{2}$ . Onder $50$ wanneer $1.2\times 10^{5}e^{-0.5t} = 50$ : $t = 2\ln(2400) \approx 16\,\mathrm{d}$ .

Oefening 13.7 ★★

Een RNA-virus heeft $u = 3\times 10^{-5}$ en $L = 12\,\mathrm{kb}$ . Welk deel van zijn nakomelingengenomen draagt geen enkele mutatie? Wat gebeurt er met dat deel als een mutageen middel $u$ verdrievoudigt? Leg uit waarom de coronavirussen een nalezend enzym nodig hadden.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.7.

$uL = 0.36$ ; foutloze fractie $e^{-0.36} = 0.70$ . Verdrievoudigd: $uL = 1.08$ , $e^{-1.08} = 0.34$ — het meeste nageslacht draagt nu mutaties en de fitste sequentie wordt naar de drempel toe verdund. Een coronavirus van $30\,\mathrm{kb}$ met $u = 10^{-4}$ zou $uL = 3$ hebben en maar $5\,\%$ foutloze kopieën, voorbij de drempel; zijn exonuclease brengt $u$ op $10^{-5}$ , $uL = 0.3$ , drie kwart foutloos.

Oefening 13.8 ★★

Leg de antigene drift en shift bij het griepvirus uit, en waarom een pandemische stam tot nu toe altijd een nieuw hemagglutinine droeg.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.8.

Drift: puntmutaties in het hemagglutinine en het neuraminidase hopen zich onder de selectie door antilichamen op, zodat de stam van elk seizoen deels nieuw is en de afweer van vorig jaar deels verouderd. Shift: een gelijktijdige besmetting van één cel door een menselijke en een dierlijke stam herschikt de acht segmenten, en er verschijnt een hemagglutininesubtype van vogels of varkens in een virus dat aan de mens is aangepast. Niemand heeft antilichamen tegen het nieuwe subtype, zodat de hele bevolking in één keer vatbaar is — de voorwaarde voor een pandemie, waaraan in 1918, 1957, 1968 en 2009 telkens door een nieuw hemagglutinine werd voldaan.

Oefening 13.9 ★★

Aciclovir is een guanosineanaloog dat moet worden gefosforyleerd om te werken. Leg uit waarom het cellen met herpes schaadt en andere niet, en voorspel de resistentiemutaties.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.9.

Het thymidinekinase van het herpesvirus fosforyleert aciclovir, dat de cellulaire kinasen nauwelijks aanraken; de cellulaire kinasen maken daarna het trifosfaat af, dat het virale DNA-polymerase inbouwt en dat, zonder 3 $'$ -hydroxylgroep, de keten beëindigt. Onbesmette cellen maken de werkzame vorm nooit, en het virale polymerase verkiest haar boven het cellulaire. Resistentie: verlies of verandering van het virale thymidinekinase (het meest voorkomend), of mutaties in het virale polymerase die het analoog uitsluiten.

Oefening 13.10 ★★★

Leid $R_{0} = \beta Tp/(c\delta)$ af uit de twee vergelijkingen van de stelling door de voorwaarde te zoeken waaronder een kleine infectie ( $I$ en $V$ bij nul, $T$ constant) groeit, en geef de betekenis van elke factor.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.10.

Met $T$ constant zijn de vergelijkingen lineair in $(I, V)$ met matrix $\begin{pmatrix} -\delta & \beta T \\ p & -c \end{pmatrix}$ , spoor $-(\delta + c) < 0$ en determinant $\delta c - \beta Tp$ . De eigenwaarden hebben een negatief spoor, dus is er precies één positief wanneer de determinant negatief is: $\beta Tp > c\delta$ , dat wil zeggen $R_{0} = \beta Tp/(c\delta) > 1$ . De factoren: $p/\delta$ is het aantal virionen dat een besmette cel in haar leven maakt; $\beta T/c$ is het aantal cellen dat een virion in zijn leven besmet; hun product is het aantal besmette cellen dat één besmette cel voortbrengt.

Oefening 13.11 ★★★

Een patiënt op werkzame therapie herbergt nog altijd $10^{6}$ latent besmette rustende T-cellen waarvan het provirus zwijgt, met een halveringstijd van $44$ maanden. Hoe lang zou de therapie moeten voortduren voordat het reservoir onder één cel zakt? Waarom maakt dit hiv ongeneeslijk met middelen die de replicatie blokkeren, en wat zou een genezing vergen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.11.

$10^{6} = 2^{20}$ : twintig halveringstijden, $880$ maanden, ongeveer $73$ jaar — langer dan een mensenleven. Middelen die de replicatie blokkeren raken een provirus dat niet wordt afgeschreven niet aan; het reservoir blijft bestaan, en zodra de therapie stopt hervat één cel die weer actief wordt de infectie. Een genezing moet het reservoir weghalen of blijvend tot zwijgen brengen: de latente cellen doden (ze onder therapie activeren zodat zij sterven of worden gedood), het provirus eruit snijden of uitschakelen, of het afweersysteem vervangen door een dat het virus niet kan besmetten.

Oefening 13.12 ★★★

Leg het argument van Voorbeeld 13.9 uit met eigen getallen voor een virus van $30\,\mathrm{kb}$ met $u = 10^{-6}$ dat $10^{9}$ genomen per dag maakt. Hoeveel middelen zouden er moeten worden gecombineerd, en waarom tellen middelen tegen twee plaatsen van hetzelfde enzym mogelijk niet als twee?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.12.

$uL = 0.03$ mutaties per genoom; $10^{9}$ genomen per dag dragen $3\times 10^{7}$ mutaties onder $9\times 10^{4}$ mogelijke enkele mutaties: elk ontstaat ongeveer $300$ keer per dag. Een bepaalde dubbele mutant ontstaat met $10^{-12}$ per genoom, $10^{-3}$ per dag — eens per drie jaar; een drievoudige met $10^{-18}$ , nooit. Twee middelen met onafhankelijke resistentiemutaties zouden in beginsel volstaan, en drie geven marge voor slechte therapietrouw. Twee middelen die hetzelfde enzym binden kunnen door één mutatie worden verslagen die de plaats of de conformatie van het enzym verandert, en hun resistentiemutaties zijn niet onafhankelijk; zij tellen als minder dan twee.

13.6 Vraagstuk: een virus in een patiënt

Probleem 13.1

Weekendvraagstuk — een hiv-infectie virion voor virion geteld, haar dynamiek aangepast aan een behandelcurve, haar mutaties tegen de middelen afgezet, en haar reservoir in de tijd gezet, met als besluit de dagelijkse productie van virionen, de dag waarop de last onaantoonbaar wordt en de kans dat er een drievoudige mutant bestaat

Gegevens: virale last $V^{*} = 2\times 10^{5}$ per mL in $15\,\mathrm{L}$ lichaamsvocht; $c = 3\,\mathrm{d}^{-1}$ , $\delta = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ ; elke besmette cel maakt $p = 500$ virionen per dag; genoom $9700\,\mathrm{nt}$ , $u = 10^{-5}$ per nucleotide per replicatie; enkele mutaties geven resistentie tegen elk van drie middelen; op drievoudige therapie daalt de productie tot $10^{7}$ genomen per dag; latent reservoir $10^{6}$ cellen, halveringstijd $44$ maanden; een virion is een bol van $120\,\mathrm{nm}$ met twee RNA-strengen van $9700\,\mathrm{nt}$ en ongeveer $2000$ eiwitmoleculen van $25\,\mathrm{kDa}$ .

Deel I — Tellen.

Hoeveel virionen zitten er in evenwicht in het lichaam?
Hoeveel worden er per dag geklaard, en dus per dag gemaakt?
Hoeveel besmette cellen maken ze, en hoeveel sterven er per dag?
Wat is de massa van één virion (RNA à $330\,\mathrm{Da}$ per nucleotide plus eiwit), en de totale massa van de virionen in het lichaam? Vergelijk met een zandkorrel ( $1\,\mathrm{mg}$ ).
Het lichaam heeft $10^{12}$ CD4-T-cellen en vervangt de besmette cellen. Welk deel van de voorraad is op enig moment besmet, en hoe doodt zo’n klein deel de voorraad in tien jaar?
Als elke besmette cel door apoptose sterft en binnen een uur wordt verzwolgen (Hoofdstuk 10), hoeveel worden er op enig moment opgeruimd?

Deel II — Behandeling.

De therapie stopt op $t = 0$ alle nieuwe besmettingen. Bereken $V$ met de stelling bij $t = 1$ , $3$ , $7$ en $14$ dagen.
Op welke dag zakt de last onder de aantoonbaarheidsgrens van $50$ per mL?
Hoe zou een arts uit de twee hellingen $c$ en $\delta$ schatten uit metingen op de dagen $0$ – $1$ en $3$ – $10$ ?
Na de twee fasen vlakt de last af op enkele kopieën per mL en blijft daar jarenlang. Welk compartiment van het model ontbreekt er, en wat is de vervalsnelheid ervan?
Bereken de halveringstijd van een vrij virion en van een besmette cel.
Leg uit waarom het plateau vóór de behandeling ten onrechte als latentie werd gelezen, en wat de vergelijkingen in plaats daarvan lieten zien.

Deel III — Mutatie.

Het aantal mutaties per genoom per replicatie, en het aantal mutaties dat bij de onbehandelde patiënt per dag ontstaat.
Hoeveel verschillende enkele puntmutaties zijn er in het genoom mogelijk? Hoe vaak per dag ontstaat elk daarvan?
De snelheid per genoom van een bepaalde dubbele mutant en van een bepaalde drievoudige mutant; hoeveel van elk ontstaan er per dag zonder behandeling?
Hoeveel drievoudige mutanten zijn er op drievoudige therapie, met $10^{7}$ genomen per dag, per jaar te verwachten?
De patiënt slaat doses over, zodat het niveau van één middel een week lang tot nul zakt terwijl de andere twee standhouden. Welke mutanten kunnen nu worden geselecteerd, en hoeveel van de betreffende dubbele mutanten zijn er in die week te verwachten bij $10^{7}$ genomen per dag?
Waarom geeft resistentie tegen het ene nucleoside-analoog vaak ook resistentie tegen het andere, en hoe verandert dat de telling van “onafhankelijke” middelen?

Deel IV — Het reservoir en de genezing.

Hoe lang duurt het bij een halveringstijd van $44$ maanden voordat de $10^{6}$ latente cellen tot één zijn gedaald? En tot $10^{4}$ ?
Wordt de therapie gestopt, dan volstaat één latente cel die weer actief wordt om de infectie te hervatten. Hoe lang na het stoppen keert de last terug op $10^{5}$ per mL, als zij vanuit één virion met $R_{0} = 8$ per generatie van $2$ dagen groeit?
Stel twee strategieën voor een genezing voor die uit het model volgen, en geef bij elk de hindernis.
Het $R_{0}$ van de stelling geldt binnen één gastheer. Een $R_{0}$ voor hiv tussen mensen is ongeveer $3$ – $5$ . Welk deel van de overdrachten moet worden voorkomen om de epidemie te beëindigen ( $1 - 1/R_{0}$ )?
Een behandeling verlaagt de besmettelijkheid van een patiënt vrijwel tot nul. Leg uit hoe “behandeling als preventie” uit de stelling binnen de gastheer volgt.
Een vaccin met werkzaamheid $E$ (het deel van de gevaccineerde mensen dat is beschermd) dat aan een deel $f$ van de bevolking wordt gegeven beschermt $Ef$ daarvan. Welke dekking $f$ is er nodig om de drempel van de vorige vraag te halen bij $E = 0.7$ ? En bij $E = 0.9$ ? Wat betekent het eerste antwoord?
Vat samen: het aantal virionen dat per dag wordt gemaakt (vraag 2), de dag waarop de last onaantoonbaar wordt (vraag 8), en het verwachte aantal drievoudige mutanten per jaar onder therapie (vraag 16).

Oplossing

Oplossing van Probleem 13.1.

1. $2\times 10^{5}\times 1.5\times 10^{4} = 3\times 10^{9}$ virionen. 2. Geklaard $cV = 3\times 3\times 10^{9} \approx 10^{10}$ per dag; evenveel gemaakt. 3. $I^{*} = cV^{*}/p = 9\times 10^{9}/500 = 1.8\times 10^{7}$ besmette cellen; er sterven er $\delta I^{*} = 9\times 10^{6}$ per dag. 4. RNA $2\times 9700\times 330 = 6.4\times 10^{6}$ Da; eiwit $2000\times 25\,000 = 5\times 10^{7}$ Da; samen $5.6\times 10^{7}$ Da $\approx 10^{-16}$ g. Alle virionen samen: $3\times 10^{9}\times 10^{-16} = 3\times 10^{-7}$ g, een derde van een microgram — drieduizend keer minder dan een zandkorrel. 5. $1.8\times 10^{7}/10^{12} = 2\times 10^{-5}$ van de voorraad. Tien jaar van $9\times 10^{6}$ sterfgevallen per dag is $3\times 10^{10}$ cellen, drie procent van de voorraad: de voorraad begeeft het niet door een rekenkundige aftrekking maar omdat een decennium van gedwongen aanvulling en chronische activering het vermogen om ze te vervangen uitput. 6. $9\times 10^{6}/24 \approx 4\times 10^{5}$ lijken die op enig moment worden opgeruimd. 7. $V = 2\times 10^{5}(3e^{-0.5t} - 0.5e^{-3t})/2.5$ : $t = 1$ : $1.4\times 10^{5}$ ; $t = 3$ : $5.4\times 10^{4}$ ; $t = 7$ : $7\times 10^{3}$ ; $t = 14$ : $2\times 10^{2}$ . 8. $2.4\times 10^{5}e^{-0.5t} = 50$ : $t = 2\ln(4800) \approx 17$ dagen. 9. De dagen 3–10 liggen op de trage fase: de helling van $\ln V$ daar is $-\delta$ (van $5.4\times 10^{4}$ naar $1.6\times 10^{3}$ in zeven dagen, $\delta = 0.50$ ). De snelle fase duurt maar uren ( $1/c$ ), dus vergt $c$ monsters om de paar uur op de eerste dag, aan de formule met twee exponentiëlen aangepast. 10. De latent besmette cellen, die virus vrijlaten zodra zij weer actief worden; hun vervalsnelheid is $\ln 2/44$ per maand, ongeveer $5\times 10^{-4}$ per dag. 11. Virion $\ln 2/3 = 0.23\,\mathrm{d}$ , ongeveer $5.5\,\mathrm{h}$ ; besmette cel $\ln 2/0.5 = 1.4\,\mathrm{d}$ . 12. Een constante last leek op een virus dat niets deed; de vergelijkingen tonen haar als een evenwichtstoestand waarin elke dag $10^{10}$ virionen worden gemaakt en geklaard en $10^{7}$ T-cellen worden besmet en gedood. 13. $9700\times 10^{-5} \approx 0.1$ mutaties per genoom; $10^{10}\times 0.1 = 10^{9}$ mutaties per dag. 14. $3\times 9700 \approx 29\,000$ mogelijke enkele mutaties; elk ontstaat $10^{9}/29\,000 \approx 3\times 10^{4}$ keer per dag. 15. Een bepaalde dubbele: $10^{-10}$ per genoom, ongeveer één per dag zonder behandeling; een bepaalde drievoudige: $10^{-15}$ , $10^{-5}$ per dag — eens per drie eeuwen. 16. $10^{7}\times 10^{-15} = 10^{-8}$ per dag, $4\times 10^{-6}$ per jaar. 17. Met één middel weg volstaan mutanten die tegen de andere twee bestand zijn: een bepaalde dubbele met $10^{-10}$ ; $7\times 10^{7}$ genomen in de week geven $7\times 10^{-3}$ te verwachten — nog altijd onwaarschijnlijk, tenzij de last tijdens de onderbreking naar $10^{10}$ per dag terugveert, waarbij het er één per dag worden en de ontsnapping waarschijnlijk is. Gemiste doses zijn de manier waarop de resistentie komt. 18. De analogen delen de actieve plaats van het reverse transcriptase, en één mutatie daar (of een stel mutaties voor thymidine-analogen) verandert hoe het enzym met verscheidene ervan omgaat: kruisresistentie. Twee nucleosiden tellen als minder dan twee onafhankelijke middelen, zodat de schema’s klassen combineren — een nucleoside, een integraseremmer, een proteaseremmer of een niet-nucleoside. 19. $20$ halveringstijden, $880$ maanden, $73$ jaar; tot $10^{4}$ , $\log_{2}100 = 6.6$ halveringstijden, $290$ maanden, $24$ jaar. 20. Van één virion tot $3\times 10^{9}$ bij $R_{0} = 8$ per generatie: $\ln(3\times 10^{9})/\ln 8 = 10.5$ generaties, drie weken. 21. Schok en dood: de latente cellen onder therapie weer activeren zodat zij sterven of worden gedood — hindernis: geen enkel middel activeert ze alle, en de geactiveerde cellen worden niet betrouwbaar gedood. Genbewerking: het provirus eruit snijden of de receptor CCR5 in de cellen van de patiënt vernietigen — hindernis: elke cel bereiken. (Het beenmerg vervangen door donorcellen zonder CCR5 heeft een handvol patiënten genezen, tegen een risico dat alleen aanvaardbaar is wanneer er toch al een transplantatie nodig was.) 22. $1 - 1/R_{0}$ : $67\,\%$ voor $R_{0} = 3$ , $80\,\%$ voor $5$ . 23. De therapie zet $\beta \to 0$ in de patiënt, de last daalt volgens de stelling tot bijna niets, en de overdracht, die met de last evenredig is, houdt op; elke besmette persoon behandelen drijft het $R_{0}$ van de bevolking onder één. 24. $f = (1 - 1/R_{0})/E$ : met $R_{0} = 4$ en $E = 0.7$ is $f = 0.75/0.7 = 1.07$ — meer dan iedereen: het vaccin alleen kan de drempel niet halen; met $E = 0.9$ is $f = 0.83$ . 25. Ongeveer $10^{10}$ virionen per dag gemaakt; onaantoonbaar rond dag $17$ ; zo’n $4\times 10^{-6}$ drievoudige mutanten per jaar onder therapie.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst