Biologi Universitas — Tahun 3 · Bachelor Year 3

6Rekayasa Genetika dan Bioteknologi

Sampai tahun 1982 setiap penyandang diabetes di dunia dipertahankan hidup oleh insulin yang diekstraksi dari pankreas babi dan sapi — sekitar delapan ribu kilogram kelenjar bagi satu kilogram hormon — dan sebagian pasiennya bereaksi terhadap protein asing itu. Pada tahun itu obat pertama yang dibuat organisme hasil rekayasa genetika sampai ke pasar: insulin manusia, yang disintesis Escherichia coli yang membawa gen manusia itu pada sebuah plasmid. Perkakas yang memungkinkannya telah dirakit sepanjang dasawarsa sebelumnya — enzim yang memotong DNA pada urutan pilihan, enzim yang menyambungkan kepingannya, plasmid yang mengusungnya masuk ke dalam sebuah sel lalu menyalinnya di situ — dan pada dasawarsa berikutnya bergabunglah reaksi berantai polimerase, penyuntikan gen ke dalam embrio, dan, sejak tahun 2012, sebuah sistem kekebalan bakteri yang diubah menjadi gunting terprogram yang sanggup menulis ulang satu huruf sebuah genom di dalam sel hidup. Bab ini membahas perkakas tersebut, aritmetika yang mengatur pemakaiannya, dan apa yang telah dibangun dengannya, dari seekor mencit yang berpendar sampai ke penyembuhan penyakit sel sabit.

6.1 Memotong, menyambungkan, dan menyalin DNA

Definisi 6.1 (Enzim restriksi, ligase, dan vektor)

Sebuah enzim restriksi tipe II adalah endonuklease bakteri yang memotong DNA beruntai ganda pada urutan tertentu sepanjang $4\text{ sampai }8$ pasangan basa, yang lazimnya palindrom: EcoRI memotong G $^{\downarrow}$ AATTC, lalu meninggalkan tonjolan beruntai tunggal berbasa empat (ujung lengket) yang komplementer dengan ujung EcoRI mana pun; enzim lain meninggalkan ujung tumpul. Ligase DNA menutup dua fragmen yang ujungnya berjodohan. Sebuah vektor adalah molekul DNA yang bereplikasi di dalam sebuah inang dan sanggup mengusung fragmen sisipan: sebuah plasmid sepanjang beberapa kilobasa dengan sebuah titik asal replikasi, sebuah penanda terpilih (gen kekebalan antibiotik, sehingga hanya sel yang menyerap plasmidnya yang tumbuh pada antibiotik itu), dan sekelompok tapak restriksi tunggal bagi sisipannya; bakteriofag $\lambda$ , kosmid, serta kromosom buatan bakteri atau khamir bagi sisipan $20\text{ sampai }1000\,\mathrm{kb}$ . DNA masuk ke dalam sebuah bakteri lewat transformasi, sesudah kejutan kimia atau listrik yang membuat membrannya sejenak dapat ditembus, dengan daya guna $10^{6}$ sampai $10^{9}$ transforman tiap mikrogram plasmid. Sebuah molekul rekombinan adalah molekul yang menyambungkan DNA dari dua sumber.

Bukti eksperimental. Cohen, Chang, Boyer, dan Helling (1973) memotong plasmid pSC101 dan plasmid kedua yang membawa gen kekebalan yang berbeda dengan EcoRI, mencampur lalu meligasikan fragmennya, mentransformasi E. coli, dan memperoleh koloni yang kebal terhadap kedua antibiotiknya sambil membawa satu plasmid yang terbuat dari keduanya — DNA rekombinan pertama yang bereplikasi di dalam sel. Tahun berikutnya mereka menyisipkan gen RNA ribosom seekor kodok ke dalam pSC101 lalu menunjukkan bahwa DNA kodok itu direplikasi, dan ditranskripsi, di dalam bakterinya: gen melintasi batas antarkerajaan tanpa berubah, dan sebuah bakteri akan menyalin DNA apa pun yang diberikan kepadanya. ∎

Sebuah vektor pengklonan dan kimianya. Plasmidnya mengusung sebuah titik asal, sebuah penanda terpilih, dan sebuah tapak restriksi tunggal, dan ke dalam tapak itu sebuah fragmen yang dipotong enzim yang sama diligasikan; ujung lengket membuat dua fragmen mana pun yang dipotong enzim yang sama saling jodoh.

Metode 6.2 (Mengklon sebuah gen)

(1) Perolehlah sisipannya: potonglah DNA genom dengan sebuah enzim restriksi, atau salinlah RNA duta menjadi DNA komplementer (cDNA, yang tak berintron sehingga dapat diekspresikan di dalam bakteri), atau perbanyaklah gennya dengan PCR memakai primer yang membawa tapak restriksi. (2) Potonglah vektor dan sisipannya dengan enzim yang sama — dua enzim yang berbeda memaksakan orientasi sisipannya — lalu ligasikan. (3) Transformasikanlah bakterinya lalu tebarkan pada antibiotiknya: hanya sel berplasmid yang tumbuh. (4) Bedakanlah plasmid bersisipan dari plasmid yang menutup sendiri: sebuah gen penanda yang terpotong tapak pengklonannya (lacZ: koloni putih bersisipan, koloni biru tidak). (5) Tapislah koloninya untuk mencari sisipan yang diinginkan: lewat hibridisasi dengan pelacak berlabel, lewat PCR, atau lewat pencernaan restriksi dan elektroforesis gel. (6) Urutkanlah sisipannya. Sebuah pustaka adalah kumpulan klon dari sebuah genom atau transkriptom utuh, dan dari situ gen mana pun dapat dipancing dengan penapisan yang sama.

Sebuah gel agarosa di bawah cahaya ultraungu: fragmen DNA bermigrasi menuju anode dengan laju yang turun seiring panjangnya, sehingga tiap pitanya adalah sekumpulan molekul berukuran satu, yang dibandingkan dengan tangga ukuran yang telah diketahui pada jalur terluarnya.

Definisi 6.3 (Reaksi berantai polimerase)

Reaksi berantai polimerase (PCR) memperbanyak bentangan DNA pilihan di antara dua primer — oligonukleotida sintetik sepanjang kira-kira dua puluh basa yang komplementer dengan kedua untai pada ujung sasarannya — lewat daur tiga suhu: $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ untuk memisahkan untainya, $50\text{ sampai }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ agar primernya menempel, $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ agar polimerase tahan panas (Taq, dari bakteri sumber air panas Thermus aquaticus) memanjangkannya. Tiap daur melipatduakan cacah salinan segmen di antara primernya, sehingga tiga puluh daur mengubah satu molekul menjadi semiliar. PCR transkripsi balik mula-mula menyalin RNA menjadi DNA sehingga mengukur transkrip atau virus RNA; PCR kuantitatif (qPCR) mengikuti perbanyakannya secara waktu nyata dengan zat warna berpendar lalu membaca kuantitas awalnya dari daur ketika isyaratnya melewati sebuah ambang.

Teorema 6.4 (Aritmetika perbanyakan)

Dengan daya guna $E$ tiap daur ( $E = 1$ bagi pelipatduaan sempurna), $N_{0}$ salinan awal menjadi

N_{n} = N_{0}\,(1 + E)^{n}

sesudah $n$ daur. Bila pendarannya melewati sebuah ambang tetap ketika cacah salinannya mencapai $N_{T}$ , daur ambangnya adalah

C_{T} = \frac{\log N_{T} - \log N_{0}}{\log(1 + E)},

yakni sebuah garis lurus dalam $\log N_{0}$ dengan kemiringan $-1/\log(1+E)$ : bagi $E = 1$ , tiap kenaikan sepuluh kali lipat kuantitas awalnya menurunkan $C_{T}$ sebesar $\log_{2} 10 = 3.32$ daur, dan dua contoh yang daur ambangnya berselisih $\Delta C_{T}$ berselisih salinan awal sebesar faktor $(1 + E)^{\Delta C_{T}}$ .

Bukti. Tiap daur mengalikan cacah salinannya dengan $1 + E$ , sehingga $N_{n}$ merupakan barisan geometrik. Menetapkan $N_{n} = N_{T}$ lalu menyelesaikannya bagi $n$ memberi $C_{T}$ ; kemiringannya adalah koefisien $\log N_{0}$ . Bagi dua contoh, $C_{T,1} - C_{T,2} = (\log N_{0,2} - \log N_{0,1})/\log(1+E)$ , sehingga $N_{0,2}/N_{0,1} = (1+E)^{\Delta C_{T}}$ . ∎

Contoh 6.5 (Membaca sebuah pelat qPCR)

Sebuah uji RNA virus melewati ambangnya pada daur $22$ bagi seorang pasien dan pada daur $32$ bagi pasien yang lain; dengan $E \approx 1$ yang pertama mengusung virus $2^{10} \approx 1000$ kali lebih banyak. Sebuah contoh berisi sepuluh salinan melewati ambangnya kira-kira pada daur $37$ ketika ambangnya $10^{12}$ salinan ( $\log_{2} 10^{11} = 36.5$ ); sekali jalan berisi $40$ daur karena itu mendeteksi beberapa molekul, dan satu molekul cemaran dari amplikon sebelumnya pun terdeteksi, dan itulah sebabnya laboratorium memisahkan ruang tempat PCR disiapkan dari ruang tempat hasilnya ditangani.

Kurva perbanyakan bagi N_0 = 107 (biru), 104 (merah), dan 10 salinan (hijau), E = 1, dengan dataran tinggi yang dipaksakan pereaksinya. Selisih seribu kali lipat pada N_0 menggeser daur ambangnya sebesar 10; dataran tingginya serupa semua, dan itulah sebabnya hasil akhirnya tak mengatakan apa pun tentang awalnya. — Kurva perbanyakan bagi $N_{0} = 10^{7}$ (biru), $10^{4}$ (merah), dan $10$ salinan (hijau), $E = 1$ , dengan dataran tinggi yang dipaksakan pereaksinya. Selisih seribu kali lipat pada $N_{0}$ menggeser daur ambangnya sebesar $10$ ; dataran tingginya serupa semua, dan itulah sebabnya hasil akhirnya tak mengatakan apa pun tentang awalnya.

6.2 Membuat protein

Definisi 6.6 (Sistem ekspresi)

Sebuah vektor ekspresi menempatkan urutan penyandi yang telah diklon di bawah promotor inangnya yang kuat dan terkendali (promotor lac atau T7 pada E. coli, yang diimbas sebuah analog gula), dengan sebuah tapak pengikat ribosom, sebuah terminator, dan kerap sebuah tanda — enam histidina, sebuah protein kecil — yang difusikan pada hasilnya demi pemurnian pada sebuah kolom. Bakteri membuat beberapa gram tiap liter protein sederhana (insulin, hormon pertumbuhan, enzim) tetapi tak dapat mengglikosilasi atau melipat protein mamalia yang rumit; khamir menambahkan gula jenisnya sendiri; sel serangga dan sel mamalia (sel ovarium hamster Cina adalah baku industrinya) membuat antibodi dan faktor pembekuan yang terlipat dan terglikosilasi seperti pada manusia. Sebuah antibodi monoklonal dibuat sebuah hibridoma — sel B penghasil antibodi yang difusikan dengan sel mieloma yang baka (Köhler dan Milstein, 1975) — atau, kini, dengan mengklon gen antibodinya ke dalam galur ekspresi mamalia, dan di situ kerangka mencitnya dapat diganti urutan manusia demi menghindari penolakan kekebalan (Bab 16).

Contoh 6.7 (Insulin)

Insulin manusia terdiri atas dua rantai, A (21 residu) dan B (30), yang disambungkan ikatan disulfida, dan dipotong di dalam sel $\beta$ dari satu pendahulu proinsulin. Proses pertamanya mengekspresikan kedua rantai itu terpisah di dalam E. coli, masing-masing difusikan pada $\beta$ -galaktosidase, lalu memotongnya secara kimia dan menyambungkannya di luar sel; proses yang kemudian mengekspresikan proinsulin lalu memotongnya dengan enzim yang dipakai pankreas. Sejak tahun 1996 urutannya sendiri telah diubah: menukar atau menambahkan satu dua residu memberi analog yang terurai lebih cepat (bagi sekali makan) atau mengendap di tempat suntikan lalu dilepaskan sepanjang sehari. Sebuah protein yang dahulu menuntut delapan ton kelenjar tiap kilogram kini dibuat di dalam fermenter, identik dengan protein manusia atau lebih baik daripadanya.

6.3 Organisme transgenik

Definisi 6.8 (Transgenesis dan penyasaran gen)

Sebuah organisme transgenik mengusung gen yang dimasukkan ke dalam garis nutfahnya, sehingga tiap selnya memilikinya dan gen itu diwariskan. Pada mencit rute klasiknya adalah mikroinjeksi DNA-nya ke dalam salah satu pronukleus telur yang telah dibuahi (Gordon dan Ruddle, 1980), yang terpadu pada tapak acak di dalam sebagian embrionya; Palmiter dan Brinster (1982) membuat mencit berukuran dua kali normal dengan menyuntikkan gen hormon pertumbuhan tikus di belakang promotor metalotionein. Penyasaran gen justru mengganti atau merusak gen pilihan: sebuah konstruk berlengan panjang yang homolog dengan sasarannya dimasukkan ke dalam sel punca embrio, sel langka yang di dalamnya rekombinasi homolog telah menaruhnya di tempat yang benar lalu dipilih dan disuntikkan ke dalam sebuah blastosista, dan mencit kimeris yang dihasilkannya meneruskan gen yang telah diubah itu (Capecchi, Smithies, dan Evans, dasawarsa 1980-an). Sebuah penidakaktifan kehilangan gennya; sebuah penyisipan mengusung versi yang telah diubah; sebuah alel bersyarat, yang diapit tapak loxP, dihapus hanya di tempat dan pada waktu Cre diekspresikan (Bab 3). Sekitar sepuluh ribu gen mencit telah dinonaktifkan, dan bagi sebagian besarnya fenotipenya menjadi petunjuk pertama tentang apa yang dikerjakan gen itu.

Kiri: sebuah telur mencit yang telah dibuahi ditahan dengan isapan sementara sebuah jarum kaca menyuntikkan DNA ke dalam salah satu pronukleusnya. Kanan: seekor mencit transgenik yang mengekspresikan protein berpendar hijau milik ubur-ubur di setiap selnya, di samping saudara seperindukannya yang biasa, di bawah cahaya ultraungu.

Definisi 6.9 (Tumbuhan transgenik)

Tumbuhan ditransformasi oleh Agrobacterium tumefaciens, bakteri tanah yang secara alami menyisipkan sepotong plasmid pengimbas tumornya, yaitu T-DNA, ke dalam genom tumbuhan yang terluka agar tumbuhan itu menumbuhkan puru lalu menyuapi bakterinya. Mengganti gen milik T-DNA itu sendiri dengan gen pilihan mana pun, di antara urutan batas yang dikenali bakterinya, mengubah patogennya menjadi sebuah vektor; sel yang telah ditransformasi dipilih lalu diregenerasi menjadi tumbuhan utuh, yang dapat dikerjakan setiap sel tumbuhan. Spesies yang tak diinfeksi bakteri itu (serealia, untuk waktu yang lama) ditransformasi dengan menembakkan butiran emas berlapis DNA ke dalam jaringannya. Tanaman termodifikasi genetik yang ditanam secara luas mengusung gen toksin bakteri (Bt) yang melawan larva serangga, atau enzim bakteri yang memberi toleransi terhadap herbisida, atau keduanya; adapun Padi Emas mengusung dua gen jalur karotenoid (fitoena sintase tumbuhan dan sebuah desaturase bakteri) sehingga endospermanya membuat $\beta$ -karotena, pendahulu vitamin A, yang kekurangannya membutakan dan membunuh beberapa ratus ribu anak tiap tahun.

Padi biasa dan Padi Emas. Butir yang kuning membuat -karotena di dalam endospermanya dari dua gen tambahan jalur karotenoidnya. Kanan: kedua padi itu dibandingkan di International Rice Research Institute (IRRI, CC BY 2.0). — Padi biasa dan Padi Emas. Butir yang kuning membuat $\beta$ -karotena di dalam endospermanya dari dua gen tambahan jalur karotenoidnya. Kanan: kedua padi itu dibandingkan di International Rice Research Institute (IRRI, CC BY 2.0).

Catatan 6.10 (Perdebatannya)

Tiga puluh tahun penanaman pada ratusan juta hektar, dan setiap tinjauan sistematis oleh akademi ilmu pengetahuan, tidak menemukan pengaruh kesehatan tanaman transgenik yang telah disetujui yang berbeda dari tanaman padanannya yang konvensional; transgennya hanya satu gen di antara empat puluh ribu, dan protein yang dibuatnya diuji sebagaimana zat tambahan pangan mana pun diuji. Pertanyaan yang sungguhan bersifat ekologis dan ekonomis: menyebarnya kekebalan pada hama dan gulma di bawah seleksi yang seragam, aliran gen ke kerabat liar, memusatnya pasar benih, dan siapa yang diuntungkan. Itulah pertanyaan yang ditimbulkan teknologi pertanian yang perkasa mana pun, dan jawabannya bergantung pada sifat dan latarnya, bukan pada cara gennya dipindahkan.

6.4 Menyunting genom

Definisi 6.11 (CRISPR–Cas9)

Bakteri menyimpan fragmen genom fag yang telah menginfeksi moyangnya di dalam sebuah larik ulangan (CRISPR), mentranskripsinya menjadi RNA pemandu yang pendek, lalu memakainya untuk mengarahkan sebuah nuklease agar memotong DNA mana pun yang cocok dan masuk ke dalam selnya: sebuah sistem kekebalan adaptif dengan ingatan genetik. Pada Streptococcus pyogenes nukleasenya adalah protein tunggal Cas9, yang mengikat sebuah RNA pemandu dan sebuah RNA kecil kedua, menelusuri DNA untuk mencari motif bersebelahan protospacer berbasa tiga (PAM, 5 $'$ -NGG), membuka pilinan DNA di sebelahnya, dan, bila kedua puluh basa di samping PAM berpasangan dengan pemandunya, memotong kedua untai pada jarak tiga basa dari PAM. Jinek, Charpentier, Doudna, dan rekan (2012) memfusikan kedua RNA itu menjadi satu RNA pemandu tunggal lalu menunjukkan bahwa Cas9 dengan pemandu berurutan pilihan mana pun memotong DNA pada urutan itu di dalam tabung reaksi; dalam setahun pasangan itu terbukti bekerja di dalam sel manusia, mencit, ikan zebra, tumbuhan, dan khamir. Penyuntingan genom adalah apa yang dikerjakan sel dengan potongan itu: penyambungan ujung meninggalkan sisipan atau delesi kecil yang merusak gennya (sebuah penidakaktifan dalam satu langkah, pada organisme mana pun, dalam hitungan minggu), dan rekombinasi homolog dengan cetakan yang dipasok menuliskan urutan pilihan ke dalamnya.

Cas9 dan pemandunya. Proteinnya mengikat sebuah PAM, membuka pilinan DNA di sebelahnya, lalu memotong bila kedua puluh basanya berpasangan dengan RNA pemandunya. Putusnya diperbaiki entah oleh penyambungan ujung, yang merusak gennya, entah oleh rekombinasi dengan sebuah cetakan, yang menulis ulang gennya.

Proposisi 6.12 (Menyunting tanpa memutus)

Memotong kedua untai adalah suntingan yang paling kasar: hasil penyambungan ujungnya acak, dan sebuah putus di tempat lain — tapak luar sasaran yang berbeda dari pemandunya pada beberapa kedudukan, yang masih ditoleransi Cas9 — adalah mutasi yang tak diminta siapa pun. Cas9 yang satu domain nukleasenya dinonaktifkan menakik satu untai saja; bila keduanya dinonaktifkan ia sekadar mengikat, dan dapat mengusung enzim lain ke sebuah urutan. Penyunting basa memfusikan Cas9 penakik pada sebuah deaminase yang mengubah C menjadi U (terbaca sebagai T) atau A menjadi I (terbaca sebagai G) pada untai yang terbuka pilinannya, sehingga mengubah satu basa tanpa putus dan tanpa cetakan; penyunting prima mengusung sebuah transkriptase balik dan sebuah pemandu yang diperpanjang dengan urutan yang diinginkan, lalu menyalin urutan itu ke dalam untai yang tertakik, sehingga membolehkan substitusi apa pun serta sisipan dan delesi kecil. Keaktifan luar sasarannya dikurangi dengan varian Cas9 berkesetiaan tinggi hasil rekayasa, dengan mengantarkan enzimnya sejenak sebagai protein alih-alih sebagai gen, dan dengan memilih pemandu yang kerabat genomik terdekatnya berbeda pada beberapa kedudukan; keaktifan itu diukur dengan mengurutkan tapak yang diramalkan, dan dengan metode tak bias yang menangkap setiap putus di dalam genomnya.

Contoh 6.13 (Sebuah penyembuhan)

Penyakit sel sabit adalah perubahan satu basa pada $\beta$ -globin. Hemoglobin janin, yang dibuat dari $\gamma$ -globin, dapat menggantikannya, tetapi gen $\gamma$ -nya dimatikan sesudah lahir oleh penekan BCL11A. Terapi CRISPR pertama yang disetujui (2023) mengambil sel punca darah pasien itu sendiri, memotong penguat eritroid BCL11A dengan Cas9 sehingga penyambungan ujung melumpuhkannya di sebagian besar selnya, lalu mengembalikan selnya sesudah sumsum pasiennya dikosongkan: sel darah merah yang dibuatnya kaya hemoglobin janin, tidak menyabit, dan krisisnya berhenti. Suntingannya bersifat somatik — garis nutfahnya tak tersentuh dan perubahannya tak diwariskan — dan suntingan itu memakai hasil yang “kasar”, yaitu perusakan, di tempat perusakan justru yang diinginkan.

Teorema 6.14 (Penyebaran super-Mendel sebuah penggerak gen)

Sebuah penggerak gen adalah konstruk yang menyandikan Cas9 dan sebuah pemandu yang memotong alel tipe liar pada lokusnya sendiri di dalam sebuah heterozigot; perbaikan lewat rekombinasi menyalin penggeraknya ke dalam kromosom yang terpotong, sehingga sebagian $c$ gamet heterozigot itu mengusung penggeraknya alih-alih separuh menurut Mendel. Bila penggeraknya berfrekuensi $p$ di dalam populasi besar yang kawin secara acak dan tanpa ongkos kebugaran, frekuensinya pada generasi berikutnya adalah

p' = p + c\,p\,(1 - p),

sehingga penggeraknya menyebar dari kelangkaan dengan laju sebanding dengan $c$ , dan mencapai separuh populasinya dalam kira-kira $\ln(1/p_{0})/\ln(1 + c)$ generasi dari frekuensi awal $p_{0}$ .

Bukti. Kawin acak memberi homozigot bagi penggeraknya pada frekuensi $p^{2}$ , heterozigot pada $2p(1-p)$ , dan homozigot tipe liar pada $(1-p)^{2}$ . Homozigotnya meneruskan penggeraknya ke seluruh gametnya, heterozigotnya ke bagian $(1 + c)/2$ (separuh menurut Mendel, ditambah $c$ kali separuh tipe liar yang terkonversi), dan tipe liarnya tidak sama sekali. Jadi $p' = p^{2} + 2p(1-p)(1+c)/2 = p^{2} + p(1-p) + c\,p(1-p) = p + c\,p(1-p)$ . Bagi $p$ kecil hal ini menjadi $p' \approx (1+c)p$ , yakni pertumbuhan geometrik berasio $1 + c$ , yang mencapai $1/2$ dari $p_{0}$ sesudah kira-kira $\ln(1/2p_{0})/\ln(1+c)$ generasi; suku logistiknya hanya memperlambatnya menjelang akhir. ∎

Sebuah penggerak gen yang dilepaskan pada satu persen, dengan daya guna konversi 0.9 atau 0.5 dan tanpa ongkos kebugaran. Alel Mendel tanpa keunggulan akan tetap pada satu persen; penggeraknya menguasai populasinya dalam sepuluh atau dua puluh generasi. — Sebuah penggerak gen yang dilepaskan pada satu persen, dengan daya guna konversi $0.9$ atau $0.5$ dan tanpa ongkos kebugaran. Alel Mendel tanpa keunggulan akan tetap pada satu persen; penggeraknya menguasai populasinya dalam sepuluh atau dua puluh generasi.

Catatan 6.15 (Apa yang boleh disunting)

Menyunting sel somatik seorang pasien yang menyetujuinya adalah pengobatan, yang dinilai seperti perawatan mana pun menurut risiko dan manfaatnya. Menyunting garis nutfah — sebuah embrio, yang setiap keturunannya akan mengusung perubahan itu — berbeda jenisnya: orang yang terkena tak dapat menyetujuinya, perubahannya diwariskan, dan hasil luar sasaran serta mozaik tekniknya belum terkendali; sesudah seorang ilmuwan Cina mengumumkan pada tahun 2018 bahwa ia telah melakukannya pada sepasang bayi kembar, akademi ilmu pengetahuan sebagian besar negara menyerukan moratorium dan beberapa negara menjadikannya kejahatan. Sebuah penggerak gen yang dilepaskan ke dalam populasi liar adalah keputusan yang diambil bagi semua orang di hilirnya, dan itulah sebabnya usulan bidang ini sendiri bagi pembasmian nyamuk malaria menggandengkan penggeraknya pada pengaman — penggerak pembalik, rancangan yang membatasi diri — dan pada persetujuan publik di negara yang bersangkutan.

6.5 Latihan

Latihan 6.1 ★

Sebutkanlah ketiga komponen yang harus dimiliki sebuah plasmid pengklonan lalu jelaskan tujuan masing-masing.

Solusi

Solusi Latihan 6.1.

Sebuah titik asal replikasi, sehingga inangnya menyalin plasmidnya lalu meneruskannya kepada sel anaknya; sebuah penanda terpilih, yang lazimnya kekebalan antibiotik, sehingga hanya sel pembawa plasmidnya yang tumbuh; dan sebuah tapak restriksi tunggal (atau sekelompok tapak) tempat sisipannya diligasikan tanpa memotong plasmidnya di tempat lain.

Latihan 6.2 ★

EcoRI mengenali GAATTC. Berapa sering tapaknya muncul, rata-rata, di dalam DNA acak, dan berapa fragmen yang dibuatnya dari genom E. coli $4.6\,\mathrm{Mb}$ ? Mengapa cacah yang sesungguhnya agak berbeda?

Solusi

Solusi Latihan 6.2.

Sebuah urutan berbasa enam tertentu muncul sekali tiap $4^{6} = 4096$ bp di dalam DNA acak: sekitar $4.6\times 10^{6}/4096 \approx 1100$ fragmen yang rata-rata $4.1\,\mathrm{kb}$ . Genom yang sungguhan tidak acak — komposisi basa, pemakaian kodon, dan penghindaran sebagian urutan menggeser cacahnya (cacah tapak EcoRI yang sesungguhnya pada E. coli beberapa ratus).

Latihan 6.3 ★

Nyatakanlah ketiga langkah suhu sebuah daur PCR dan apa yang terjadi pada masing-masing. Mengapa polimerasenya harus tahan panas?

Solusi

Solusi Latihan 6.3.

Denaturasi pada $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ memisahkan untainya; penempelan pada $50\text{ sampai }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ membiarkan primernya berpasangan dengan tapaknya; pemanjangan pada $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ membiarkan polimerasenya menyalin dari tiap primer. Polimerase biasa akan musnah pada $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ pada daur pertamanya dan harus ditambahkan lagi tiga puluh kali; Taq bertahan sepanjang seluruh daurnya.

Latihan 6.4 ★

Apa yang dibutuhkan Cas9 agar dapat memotong sebuah urutan tertentu, dan dua hasil apa yang dapat menyusul potongan itu?

Solusi

Solusi Latihan 6.4.

Sebuah RNA pemandu yang kedua puluh basanya cocok dengan sasarannya, dan sebuah PAM (NGG) tepat di sisi 3 $'$ sasarannya pada untai bukan sasaran. Sesudah putus untai gandanya: penyambungan ujung, yang meninggalkan sisipan atau delesi kecil dan biasanya merusak kerangka baca gennya; atau rekombinasi homolog dengan cetakan yang membawa urutan yang diinginkan, yang menuliskannya ke dalamnya.

Latihan 6.5 ★★

Sebuah PCR berjalan $35$ daur pada daya guna $E = 0.9$ dari $50$ salinan. Berapa salinan yang dihasilkannya? Sebuah qPCR atas dua contoh memberi $C_{T} = 18.2$ dan $25.5$ ; dengan $E = 0.95$ , berapa nisbah kuantitas awalnya?

Solusi

Solusi Latihan 6.5.

$50\times 1.9^{35} = 50\times 5.7\times 10^{9} \approx 3\times 10^{11}$ salinan. $\Delta C_{T} = 7.3$ ; nisbahnya $1.95^{7.3} = e^{7.3\ln 1.95} \approx 130$ : contoh pertamanya bercetakan kira-kira $130$ kali lebih banyak.

Latihan 6.6 ★★

Mengapa pustaka cDNA, dan bukan pustaka genom, yang dipakai untuk mengekspresikan protein manusia di dalam bakteri? Sebutkanlah dua rintangan lain bagi pembuatan protein manusia di dalam E. coli lalu katakan cara mengatasi masing-masing.

Solusi

Solusi Latihan 6.6.

Bakteri tak dapat menyambung: salinan genom yang berintron akan ditranskripsi menjadi pesan yang tak terpakai, sehingga cDNA yang bebas intron, yang disalin dari mRNA matangnya, itulah yang dipakai. Rintangan lain: promotor manusianya tidak dikenali polimerase bakteri (pasoklah promotor bakteri dan tapak pengikat ribosom); pemakaian kodon manusia berbeda (sintesislah gennya dengan kodon kegemaran inangnya); proteinnya mungkin tak melipat atau menggumpal (turunkan suhunya, fusikan pada mitra yang larut, atau lipatlah ulang dari badan inklusinya); glikosilasinya tak ada (pakailah khamir atau sel mamalia bila hal itu penting); disulfidanya menuntut periplasma yang mengoksidasi.

Latihan 6.7 ★★

Seekor mencit dengan gen yang dinonaktifkan dibuat lewat penyasaran gen pada sel punca embrio. Jelaskanlah mengapa mencit pertama yang lahir adalah sebuah kimera, mengapa ia harus dikawinkan, dan berapa bagian cucu seekor kimera yang separuh garis nutfahnya tersasar yang menjadi homozigot tanpa gen itu bila cucu heterozigotnya disilangkan satu sama lain.

Solusi

Solusi Latihan 6.7.

Sel punca yang tersasar disuntikkan ke dalam blastosista inang lalu bercampur dengan sel inangnya sendiri, sehingga mencitnya terbangun dari dua genotipe — sebuah kimera — dan hanya bila sebagian sel nutfahnya berasal dari sel yang tersasar barulah ia meneruskan alel itu. Mengawinkan kimeranya dengan mencit tipe liar memberi heterozigot (dari separuh gametnya bila separuh garis nutfahnya tersasar); menyilangkan heterozigotnya satu sama lain memberi seperempat homozigot tanpa gen itu.

Latihan 6.8 ★★

Sebuah RNA pemandu berbasa 20 dengan PAM berupa NGG dipilih. Berapa tapak di dalam genom berisi $3.2\times 10^{9}$ bp (kedua untainya) yang cocok persis dengan pemandunya secara kebetulan? Berapa yang cocok dengan paling banyak dua ketakcocokan, bila Cas9 mentoleransinya? (Hitunglah urutan yang berada dalam dua ketakcocokan sebagai $1 + 3\binom{20}{1} + 9\binom{20}{2}$ .)

Solusi

Solusi Latihan 6.8.

Persis: $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}\times (1/16) \approx 4\times 10^{-4}$ tapak (GG milik PAM-nya memakan faktor $16$ ) — tak satu pun, dalam praktiknya. Dalam dua ketakcocokan terdapat $1 + 60 + 1710 = 1771$ urutan: $1771\times 4\times 10^{-4} \approx 0.7$ tapak kebetulan. Genom yang sungguhan tidak acak, dan sebuah pemandu diperiksa langsung terhadapnya.

Latihan 6.9 ★★

Dengan Teorema 6.14, hitunglah frekuensi sebuah penggerak dengan $c = 0.8$ sesudah tiga generasi dari $p_{0} = 0.05$ , lalu taksirlah cacah generasi untuk mencapai $0.5$ .

Solusi

Solusi Latihan 6.9.

$p_{1} = 0.05 + 0.8\times 0.05\times 0.95 = 0.088$ ; $p_{2} = 0.152$ ; $p_{3} = 0.255$ ; lalu $0.41$ , $0.60$ : kira-kira lima generasi untuk melewati $0.5$ , terhadap taksiran $\ln(1/(2\times 0.05))/\ln 1.8 \approx 4$ .

Latihan 6.10 ★★★

Terapi sel sabit merusak sebuah penguat alih-alih membetulkan mutasi $\beta$ -globinnya. Berikanlah dua alasan mengapa perusakan lewat penyambungan ujung dipilih daripada pembetulan lewat rekombinasi homolog pada sel punca darah, dan satu kelemahannya.

Solusi

Solusi Latihan 6.10.

Penyambungan ujung bekerja di setiap sel, termasuk sel punca yang mendiam, yang di dalamnya rekombinasi homolog, sebuah proses S/G2, tak berdaya guna; penyambungan itu tak menuntut cetakan untuk diantarkan dan hasilnya — perusakan penguatnya dengan cara apa pun — sudah mengerjakan tugasnya, sedangkan pembetulan menuntut urutan yang persis dan hanya memberi sebagian kecil selnya. Lagi pula, suntingan yang sama berhasil bagi setiap mutasi $\beta$ -globin, sabit maupun talasemik. Kelemahannya: suntingan itu membuang sebuah unsur pengatur (beserta peran lain apa pun yang dimilikinya), meninggalkan alel sabitnya tetap di situ, dan campuran indelnya tak terkendali.

Latihan 6.11 ★★★

Sebuah penggerak gen melawan nyamuk mengusung ongkos kebugaran $s$ pada homozigotnya. Ubahlah rekursinya agar memuat seleksi terhadap homozigot penggeraknya lalu carilah syarat pada $c$ dan $s$ agar penggeraknya menyebar dari kelangkaan. Lalu jelaskanlah mengapa alel kekebalan — hasil penyambungan ujung pada sasarannya yang tak lagi dikenali pemandunya — menjadi rintangan utama dalam praktiknya.

Solusi

Solusi Latihan 6.11.

Dengan kebugaran homozigot $1 - s$ : $p' = \bigl[p^{2}(1-s) + p(1-p)(1+c) \bigr]/(1 - sp^{2})$ . Dari kelangkaan, homozigotnya dapat diabaikan dan penggeraknya tumbuh sebagai $(1+c)p$ berapa pun $s$ ; apakah ia mencapai pemancangan diputuskan di dekat $p = 1$ , tempat alel tipe liar yang langka berfrekuensi $q$ kembali sebagai $q' \approx q(1-c)/(1-s)$ : terpancang bila $c > s$ , kesetimbangan antara bila tidak. Kekebalannya: tiap konversi yang gagal (penyambungan ujung alih-alih rekombinasi) meninggalkan alel yang tak lagi dikenali pemandunya; bila alel semacam itu bugar — sebuah indel sekerangka di daerah yang tak esensial — alel itu tak berongkos sedangkan penggeraknya berongkos, sehingga seleksi memihaknya dan alel itu menggantikan penggeraknya. Penawarnya adalah menyasar urutan esensial yang indelnya mematikan, dan memakai beberapa pemandu sekaligus.

Latihan 6.12 ★★★

Kemukakanlah, dengan mekanisme bab ini dan Bab 3, mengapa penyuntingan garis nutfah embrio manusia belum dapat menjamin hasil yang dituju pada tiap selnya, dan bukti apa yang dibutuhkan sebelum seorang yang berakal sehat dapat menganggapnya aman.

Solusi

Solusi Latihan 6.12.

Cas9 yang disuntikkan ke dalam sebuah zigot mungkin bekerja sesudah pembelahan pertamanya, sehingga sel yang berbeda menerima perbaikan yang berbeda — mozaikisme; perbaikan tiap putusnya dipilih selnya sendiri, dan penyambungan ujung memberi indel yang tak terduga serta delesi besar atau hilangnya heterozigositas pada potongannya; hasil rekombinasi homolognya hanya sebagian kecil; putus luar sasaran terjadi pada tapak yang tak semuanya dapat diramalkan; dan embrionya hanya dapat diperiksa dengan mengurutkan beberapa sel biopsi, yang tak dapat mewakili sisanya. Bukti yang dibutuhkan: metode yang menyunting tiap selnya secara sama persis (sebelum fase S pertamanya) dengan daya guna mendekati $100\,\%$ , pengurutan seluruh genom tiap sel embrio hewan yang disunting yang memperlihatkan tak ada perubahan yang tak disengaja, dan pemantauan jangka panjang hewan yang disunting sepanjang beberapa generasi — dan tak satu pun dari semua itu yang sudah ada.

6.6 Soal: Dari Sebuah Gen ke Sebuah Obat dan Sebuah Tanaman

Soal 6.1

Soal akhir pekan — sebuah gen yang diklon dengan aritmetika tapak restriksi dan transformasi, sebuah virus yang dicacah dengan qPCR, sebuah hormon yang diproduksi berton-ton di dalam fermenter, sebuah genom yang disunting dengan luar sasarannya dicacah, dan sebuah penggerak gen yang ditakar waktunya, berakhir pada salinan virus di dalam sebuah contoh, volume fermenter tahunan bagi insulin dunia, dan cacah generasi yang dibutuhkan sebuah penggerak

Data: sebuah gen $1.5\,\mathrm{kb}$ ; sebuah tapak restriksi berbasa enam; sebuah plasmid $4\,\mathrm{kb}$ ; daya guna transformasi $2\times 10^{7}$ koloni tiap mikrogram plasmid; ligasinya memberi $10\,\%$ plasmid sebuah sisipan. Daya guna qPCR $E = 1$ , ambangnya $N_{T} = 10^{12}$ . Insulin: $5.8\,\mathrm{kDa}$ , seorang pasien memakai $40$ satuan tiap hari, satu satuan sebesar $35\,\text{µ}\mathrm{g}$ ; $10^{7}$ pasien; sebuah fermenter menghasilkan $2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ produk tiap gelombang, sepuluh gelombang tiap tahun. Genom $3.2\times 10^{9}$ bp. Konversi penggeraknya $c = 0.9$ , dilepas pada $p_{0} = 0.001$ .

Bagian I — Pengklonan.

Berapa sering sebuah tapak berbasa enam tertentu muncul di dalam DNA acak? Berapa peluang bahwa gen $1.5\,\mathrm{kb}$ itu tak memuat tapak semacam itu, sehingga enzimnya dapat dipakai mengklonnya utuh?
Bila gennya memang memuat sebuah tapak, bagaimana Anda akan tetap mengklonnya? (Dua cara.)
$100\,\mathrm{ng}$ plasmid yang telah diligasi ditransformasikan. Berapa koloninya, dan berapa yang membawa sisipannya?
Penapisan biru–putih dipakai. Berapa bagian koloninya yang putih, dan berapa koloni putih yang harus dipungut agar berpeluang $99\,\%$ bahwa sedikitnya satu membawa gennya pada orientasi yang benar (separuh sisipannya)?
Plasmid rekombinannya $5.5\,\mathrm{kb}$ . Sebuah sel memuat $50$ salinan dan membelah tiap $30\,\mathrm{min}$ . Sesudah tumbuh semalam ( $16\,\mathrm{h}$ ) dari satu sel, berapa molekul plasmidnya, dan berapa massa DNA plasmidnya ( $650\,\mathrm{Da}$ tiap pasangan basa)?
Mengapa plasmidnya menuntut titik asal bakteri sedangkan gen manusia yang disisipkan tak menuntut promotor bakteri untuk pengklonan, padahal menuntutnya untuk ekspresi?

Bagian II — Mencacah sebuah virus.

Contoh seorang pasien melewati ambangnya pada $C_{T} = 28$ . Berapa salinan yang ada di dalam reaksinya? Contoh lain pada $C_{T} = 35$ ?
Kepekaannya: berapa daur yang dibutuhkan untuk membawa satu salinan sampai ke ambangnya?
Ambang batas ujinya ditetapkan pada $C_{T} = 38$ . Berapa cacah salinan yang sepadan dengan itu, dan mengapa tidak memakai $45$ daur?
Sebuah molekul cemaran dari hasil jalan sebelumnya masuk ke sebuah contoh negatif. Pada daur berapa ia melewati ambangnya? Kebiasaan laboratorium apa yang mencegahnya?
Transkripsi balik mengubah $40\,\%$ RNA virusnya menjadi DNA. Betulkanlah cacahan pertanyaan 7 bagi contoh yang pertama.
Dua contoh berselisih $\Delta C_{T} = 3.3$ dengan $E = 1$ , tetapi daya gunanya sebenarnya $0.9$ . Selisih berapa kali lipat yang dilaporkan analisnya, dan berapa yang sesungguhnya?

Bagian III — Insulin berton-ton.

Hitunglah massa insulin harian tiap pasien dan kebutuhan dunia tiap tahun bagi $10^{7}$ pasien, dalam kilogram.
Berapa mol insulin jumlahnya, dan berapa molekulnya?
Berapa volume fermenter, yang dijalankan sepuluh gelombang tiap tahun, yang menghasilkannya? Bandingkanlah dengan sebuah kolam renang $2500\,\mathrm{m}^{3}$ .
Ekstraksi dari kelenjar memberi $1\,\mathrm{kg}$ insulin tiap $8000\,\mathrm{kg}$ pankreas; sebuah pankreas babi berbobot $100\,\mathrm{g}$ . Berapa ekor babi tiap tahun yang dibutuhkan dunia?
Mengapa hormon rekombinannya lebih disukai bahkan di tempat insulin hewan murah? Berikanlah dua alasan.
Analog insulin berbeda dari urutan manusia sebanyak satu atau dua residu. Jelaskanlah mengapa sebuah analog tetap menjadi obat yang bekerja pada reseptor manusia, dan mengapa perubahan satu residu dapat mengubah waktu penguraiannya.

Bagian IV — Menyunting dan menggerakkan.

Berapa kecocokan persis sebuah pemandu berbasa 20 ditambah NGG yang dimuat genomnya secara kebetulan (kedua untainya: $6.4\times 10^{9}$ kedudukan)?
Bila Cas9 mentoleransi sampai tiga ketakcocokan, berapa urutan yang berada dalam tiga ketakcocokan dari pemandunya, dan berapa tapak luar sasaran kebetulan yang dihasilkannya?
Sel punca darah yang disunting berjumlah $10^{7}$ ; $80\,\%$ mengusung perusakan yang dituju. Berapa sel yang mengusung putus luar sasaran pada sebuah tapak tertentu bila tapak itu terpotong pada satu sel tiap $10^{4}$ , dan mengapa sebuah putus pada gen penekan tumor di dalam satu sel punca menjadi kekhawatiran?
Hitunglah frekuensi penggeraknya sesudah $1, 2, 3$ generasi dari $p_{0} = 0.001$ , lalu taksirlah generasi sampai $0.5$ .
Seekor nyamuk memiliki sepuluh generasi tiap tahun. Berapa tahun sampai menguasai populasinya? Bagaimana ongkos kebugaran $20\,\%$ pada homozigotnya mengubah gambarannya secara kualitatif?
Sebuah alel kekebalan timbul ketika penyambungan ujung, bukan rekombinasi, memperbaiki potongannya, dengan peluang $1 - c = 0.1$ tiap upaya konversi. Taksirlah cacah alel kekebalan yang tercipta di dalam populasi berisi $10^{6}$ heterozigot dalam satu generasi, lalu jelaskan apa yang terjadi pada penggeraknya bila alel itu bugar.
Ringkaskanlah: salinan di dalam contoh pertama (pertanyaan 7), volume fermenter insulin dunia tiap tahun (pertanyaan 15), dan cacah generasi yang dibutuhkan penggeraknya untuk mencapai separuh populasinya (pertanyaan 22).

Solusi

Solusi Soal 6.1.

1. Sekali tiap $4096$ bp. $P(\text{tanpa tapak}) = (1 - 1/4096)^{1500} = e^{-0.37} = 0.69$ . 2. Pilihlah enzim yang tak bertapak di dalam gennya; atau perbanyaklah gennya dengan PCR memakai primer yang membawa tapak restriksi baru pada ujung 5 $'$ -nya (atau pakailah pengklonan tumpul atau pengklonan tanpa ligasi). 3. $0.1\,\text{µ}\mathrm{g}$ $\times 2\times 10^{7} = 2\times 10^{6}$ koloni; $10\,\%$ -nya, $2\times 10^{5}$ , membawa sisipannya. 4. Putih: $10\,\%$ . Separuh sisipannya berada pada orientasi yang benar, sehingga $P(\text{tak satu pun dari } n \text{ koloni putih}) = 0.5^{n} \le 0.01$ memberi $n \ge 6.6$ : pungutlah tujuh. 5. $32$ pelipatduaan, $2^{32} = 4.3\times 10^{9}$ sel, $2.1\times 10^{11}$ plasmid; masing-masing $5500\times 650 = 3.6\times 10^{6}$ Da $= 5.9\times 10^{-18}$ g: $1.3\,\text{µ}\mathrm{g}$ plasmid. 6. Pengklonan hanya menuntut replikasi, yang dipasok titik asal plasmidnya; promotor manusianya tak dibaca RNA polimerase bakteri, sehingga bagi ekspresi sebuah promotor bakteri dan tapak pengikat ribosom harus ditaruh di depan urutan penyandinya (yang bebas intron). 7. $N_{0} = N_{T}/2^{C_{T}}$ : $10^{12}/2^{28} \approx 3700$ salinan; pada $C_{T} = 35$ , $10^{12}/2^{35} \approx 29$ salinan. 8. $2^{n} = 10^{12}$ : $n = 39.9$ , empat puluh daur. 9. $10^{12}/2^{38} \approx 3.6$ salinan. Di atas kira-kira $40$ daur, satu molekul cemaran, atau artefak primer, mencapai ambangnya, dan sebuah contoh yang kurang dari satu salinan tak bermakna. 10. Satu molekul melewatinya pada daur $40$ : sebuah positif. Cegahlah dengan ruang dan peralatan terpisah bagi penyiapan dan bagi penanganan hasilnya, alur kerja satu arah, kendali negatif pada tiap jalan, serta pemusnahan enzimatik amplikon yang terbawa. 11. $3700/0.4 \approx 9000$ salinan RNA. 12. Dilaporkan $2^{3.3} \approx 10$ kali lipat; sesungguhnya $1.9^{3.3} = e^{3.3\ln 1.9} \approx 8.3$ kali lipat. 13. $40\times 35\,\text{µ}\mathrm{g} = 1.4\,\mathrm{mg}$ tiap hari, $0.51\,\mathrm{g}$ tiap tahun; $\times 10^{7}$ : $5100\,\mathrm{kg}$ tiap tahun. 14. $5.1\times 10^{6}/5800 \approx 880$ mol; $5.3\times 10^{26}$ molekul. 15. $5.1\times 10^{6}$ g $/ (20$ g/L $) = 2.6\times 10^{5}$ L $= 260\,\mathrm{m}^{3}$ — sepersepuluh kolamnya. 16. $5100\times 8000 = 4.1\times 10^{7}$ kg pankreas, pada $0.1\,\mathrm{kg}$ tiap ekor: $4\times 10^{8}$ ekor babi tiap tahun. 17. Hormon rekombinannya identik dengan hormon manusia, sehingga tidak membangkitkan antibodi dan tidak menimbulkan reaksi alergi; hormon itu tidak mengusung patogen hewan (virus, prion); pasokannya tidak bergantung pada penyembelihan; dan urutannya dapat diperbaiki. 18. Residu yang menyentuh reseptornya tak berubah, sehingga pengikatan dan pengisyaratannya adalah pengikatan dan pengisyaratan insulin; residu yang diubah terletak di permukaan tempat molekul insulin berhimpun menjadi dimer dan heksamer, dan mengubahnya mengubah kecepatan terurainya depot suntikan itu menjadi monomer yang dapat diserap. 19. $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}/16 \approx 3.6\times 10^{-4}$ : tak ada kecocokan kebetulan yang persis. 20. $1 + 60 + 1710 + 27\times 1140 = 32\,551$ urutan; $32\,551\times 3.6\times 10^{-4} \approx 12$ tapak luar sasaran kebetulan. 21. $10^{7}\times 10^{-4} = 1000$ sel. Sebuah sel punca hidup dan membelah seumur hidup pasiennya; sel yang telah kehilangan penekan tumor, atau memperoleh sebuah translokasi, dapat mendirikan klon yang menjadi leukemia. 22. $p_{1} = 0.0019$ , $p_{2} = 0.0036$ , $p_{3} = 0.0069$ ; pertumbuhan geometrik sebesar $1.9$ tiap generasi memberi $\ln 500/\ln 1.9 \approx 10$ ; dengan mengiterasi rekursinya, frekuensinya melewati $0.5$ pada generasi $11$ ( $0.45 \to 0.68$ ). 23. Kira-kira setahun. Ongkos $20\,\%$ pada homozigotnya lebih kecil daripada $c = 0.9$ , sehingga penggeraknya tetap terpancang, lebih lambat, sementara kebugaran rata-rata populasinya turun — dan itulah tujuan sebuah penggerak penekan; ongkos di atas $c$ akan menghentikannya pada frekuensi antara. 24. $10^{6}\times 0.1 = 10^{5}$ alel kekebalan dalam satu generasi. Karena tak dapat dipotong dan, bila bugar, tak berongkos sedangkan penggeraknya berongkos, alel itu dipihak seleksi lalu menyebar, dan penggeraknya tersingkir — sehingga penggerak menyasar tapak yang hasil penyambungan ujungnya mematikan, dengan beberapa pemandu sekaligus. 25. Sekitar $3700$ salinan di dalam contoh pertama; sekitar $260\,\mathrm{m}^{3}$ fermenter tiap tahun bagi insulin dunia; sekitar $11$ generasi, yakni setahun nyamuk, bagi penggeraknya.

Istilah yang didefinisikan dalam bab ini

Lihat semua 479 istilah di glosarium