Biologie universitaire — 2e année · Bachelor Year 2

3Mutations et diversification des génomes

Étalez un milliard de bactéries sur une boîte contenant un antibiotique : le lendemain matin, une poignée de colonies ont poussé. Le médicament a-t-il appris à ces cellules à lui résister, ou étaient-elles déjà résistantes avant de le rencontrer ? La question paraît philosophique ; elle fut tranchée en 1943 par une expérience d’une grande élégance : les cellules résistantes étaient là auparavant, produites par des mutations survenues au hasard, sans égard à leur utilité. Ce chapitre traite des sources de cette variation — les erreurs de copie, les accidents chimiques, les gènes sauteurs, les gènes échangés entre cellules, les duplications de gènes et de génomes entiers — et de leur vitesse. La sélection, qui trie la variation, fait l’objet du Chapitre 22 ; il s’agit ici de savoir d’où vient la matière première.

3.1 Les mutations

Définition 3.1 (La mutation et ses types)

Une mutation est une modification héréditaire de la séquence du génome. Les mutations ponctuelles changent une ou quelques bases : une substitution remplace une base par une autre (une transition échange une purine contre une purine ou une pyrimidine contre une pyrimidine, A $\leftrightarrow$ G ou C $\leftrightarrow$ T ; une transversion échange les classes) ; une insertion ou une délétion ajoute ou retire des bases. Dans une séquence codante, une substitution est silencieuse si le nouveau codon code le même acide aminé, faux-sens s’il en code un autre, non-sens s’il crée un codon stop ; une insertion ou une délétion dont la taille n’est pas un multiple de trois décale le cadre de lecture (décalage du cadre de lecture) et brouille tous les codons en aval. Les remaniements chromosomiques déplacent de grands segments : délétion, duplication, inversion, translocation entre chromosomes. Les mutations génomiques changent le nombre de chromosomes : aneuploïdie (un chromosome en trop ou en moins, comme dans la trisomie 21) et polyploïdie (des jeux entiers supplémentaires). Une mutation dans une cellule somatique n’est transmise qu’aux descendantes de cette cellule ; une mutation dans la lignée germinale est transmise aux descendants de l’organisme, et seules ces dernières comptent pour l’évolution.

Mutations ponctuelles dans une courte séquence codante (le changement en rouge). Une substitution silencieuse conserve la protéine ; une mutation faux-sens change un résidu ; une mutation non-sens la tronque ; une seule base insérée décale le cadre et réécrit tout ce qui suit.

Proposition 3.2 (D’où viennent les mutations)

Trois sources. Les erreurs de réplication : l’ADN polymérase place une base erronée environ une fois sur $10^{5}$ ; son activité exonucléase de relecture en élimine la plupart, n’en laissant qu’une sur $10^{7}$ ; la réparation des mésappariements, qui suit la fourche de réplication et corrige le brin néosynthétisé d’après l’ancien, amène le taux d’erreur final à environ $10^{-9}$ à $10^{-10}$ par base et par réplication. La chimie spontanée : chaque jour, dans chaque cellule humaine, quelque $10\,000$ purines se détachent de leur sucre (dépurination) et une centaine de cytosines perdent un groupement amine (désamination, qui change C en U, lequel s’apparie avec A) ; les deux lésions sont réparées, mais pas toujours. Les agents mutagènes : les ultraviolets soudent des thymines adjacentes en dimères ; les rayonnements ionisants cassent les brins ; les agents alkylants et l’acide nitreux modifient les bases ; les colorants intercalants se glissent entre les paires de bases et provoquent des décalages du cadre ; les radicaux oxygénés issus de la respiration oxydent la guanine. Le taux par base est minuscule ; multiplié par la taille d’un génome et par le nombre de cellules, il ne l’est plus.

Théorème 3.3 (Mutations par génome et par population)

Si le taux de mutation est $u$ par paire de bases et par réplication et que le génome compte $G$ paires de bases, chaque réplication produit en moyenne $U = uG$ mutations nouvelles, et une population de $N$ cellules en produit $UN$ par génération. Pour E. coli ( $u \approx 5 \times 10^{-10}\,$ , $G = 4.6 \times 10^{6}\,$ ) : $U \approx 0.002$ , si bien qu’une cellule sur cinq cents porte une mutation nouvelle — mais une culture de $10^{9}$ cellules en produit deux millions par génération, et chacun des $3G \approx 1.4\times 10^{7}$ changements possibles d’une seule base y apparaît quelque part en quelques générations. Pour l’être humain ( $u \approx 1.2 \times 10^{-8}\,$ par génération, $G = 3.2 \times 10^{9}\,$ par jeu haploïde, deux jeux) : chaque enfant porte environ $75$ mutations nouvelles, dont une ou deux dans une séquence codante.

Démonstration. Chaque base est copiée indépendamment avec une probabilité d’erreur $u$ ; le nombre d’erreurs par copie du génome est donc la somme de $G$ événements rares indépendants, de moyenne $uG$ (et approximativement distribuée selon une loi de Poisson). $N$ cellules font $N$ copies. Le chiffre humain multiplie $u$ par $2G$ pour le génome diploïde ; le taux est exprimé par génération et non par réplication, car les cellules germinales subissent de nombreuses réplications entre une fécondation et la suivante. ∎

Théorème 3.4 (Les mutants dans une culture en croissance)

Une culture qui passe de $N_0$ à $N$ cellules, dans laquelle une mutation donnée survient avec une probabilité $m$ à chaque division cellulaire, contient à la fin un nombre moyen d’événements mutationnels $m(N - N_0)$ , et un nombre moyen de cellules mutantes

\langle M\rangle = m\,N\,\ln\frac{N}{N_0},

supérieur au nombre d’événements, car une mutation précoce fonde un clone. Le nombre de cellules mutantes varie énormément d’une culture à l’autre (de rares événements précoces donnent des « jackpots »), alors que si les mutations étaient induites à l’étalement, il suivrait une loi de Poisson de variance égale à sa moyenne. La proportion de cultures sans aucun mutant vaut $p_0 = e^{-m(N - N_0)}$ , ce qui donne directement $m$ .

Démonstration. La croissance de $n$ à $n + \mathrm{d}n$ cellules demande $\mathrm{d}n$ divisions, autant d’occasions de mutation, si bien que $m\,\mathrm{d}n$ événements surviennent dans cet intervalle ; en sommant, $m(N - N_0)$ événements au total. Une mutation survenue lorsque la culture compte $n$ cellules fonde un clone qui croît au même rythme que la culture et compte $N/n$ cellules à la fin ; le nombre attendu de cellules mutantes est donc $\int_{N_0}^{N} m\,(N/n)\,\mathrm{d}n = mN\ln(N/N_0)$ . Les événements sont rares et indépendants ; leur nombre suit donc une loi de Poisson de moyenne $m(N - N_0)$ , et la probabilité qu’il n’y en ait aucun vaut $e^{-m(N - N_0)}$ . ∎

Faits expérimentaux. Luria et Delbrück (1943) firent pousser vingt petites cultures d’E. coli à partir de quelques cellules chacune et prélevèrent en parallèle vingt échantillons d’une grande culture unique ; ils étalèrent les quarante avec un bactériophage qui tue toute cellule sensible et comptèrent les colonies résistantes. Les échantillons de la culture unique donnèrent des nombres proches de leur moyenne, comme le prévoit une loi de Poisson ; les cultures indépendantes donnèrent 0, 0, 1, 0, 3, 0, 107, 0, 5… — une variance bien supérieure à la moyenne. Les mutations de résistance étaient survenues à des moments aléatoires avant que les cellules ne rencontrent le phage, les plus précoces produisant des jackpots. Lederberg et Lederberg (1952) le confirmèrent sans jamais exposer les cellules sélectionnées à l’agent : en pressant un tampon de velours sur une boîte pour en imprimer des copies, ils trouvèrent des colonies résistantes aux mêmes positions sur toutes les répliques, et les isolèrent à partir de la boîte mère non traitée. ∎

Le test de fluctuation. Si les mutations (en rouge) surviennent au hasard pendant la croissance, le nombre de mutants dépend du moment où la mutation s’est produite, et des cultures indépendantes diffèrent énormément ; si l’agent sélectif les induisait à l’étalement, toutes les cultures montreraient un petit nombre comparable. — Le test de fluctuation. Si les mutations (en rouge) surviennent au hasard pendant la croissance, le nombre de mutants dépend du *moment* où la mutation s’est produite, et des cultures indépendantes diffèrent énormément ; si l’agent sélectif les induisait à l’étalement, toutes les cultures montreraient un petit nombre comparable.

Un disque d’antibiotique sur un tapis bactérien : la zone claire est celle où le médicament diffusant du disque a tué les cellules sensibles, et les colonies qui s’y trouvent sont issues de mutants résistants présents avant la pose du disque.

Proposition 3.5 (La réparation et ses limites)

Une cellule corrige la plupart des lésions avant qu’elles ne deviennent des mutations. La réparation des mésappariements retire la base erronée du brin néosynthétisé. La réparation par excision de base découpe une seule base endommagée (un uracile, une guanine oxydée) et comble la brèche ; c’est pourquoi l’ADN utilise la thymine plutôt que l’uracile : un uracile dans l’ADN ne peut être qu’une cytosine désaminée, et il est reconnu comme étranger. La réparation par excision de nucléotides retire un segment d’une douzaine de bases autour d’une lésion volumineuse comme un dimère de thymines ; les personnes qui en sont dépourvues (xeroderma pigmentosum) développent des cancers de la peau sous un ensoleillement ordinaire. La réparation par recombinaison reconstruit un chromosome cassé à partir de sa copie sœur. Ce qui échappe à la réparation, ou est mal réparé, est une mutation — et une cellule qui a perdu un système de réparation (un mutateur) mute cent fois plus vite, ce qui est un avantage à court terme sous stress et un fardeau à long terme. Les mécanismes de réparation sont traités en détail dans le volume de troisième année.

3.2 Les gènes qui se déplacent

Définition 3.6 (Les éléments transposables)

Un élément transposable est un segment d’ADN capable de se déplacer vers une nouvelle position du génome. Les transposons à ADN codent une transposase qui excise l’élément et le colle ailleurs (ou l’y copie) ; les séquences d’insertion bactériennes sont les plus simples (un gène de transposase entre deux répétitions inversées), et les transposons composites portent des gènes supplémentaires — souvent des résistances aux antibiotiques — entre deux d’entre elles. Les rétrotransposons se déplacent par une voie de type copier-coller qui passe par un intermédiaire ARN, recopié en ADN par une transcriptase inverse ; ils ne quittent jamais leur ancien site et s’accumulent donc. Un élément qui s’insère dans un gène l’interrompt ; inséré à proximité, il peut en modifier l’expression ; deux copies sur un même chromosome offrent des sites de crossing-over inégal. Les transposons et leurs vestiges forment la moitié du génome humain et quatre-vingts pour cent du génome du maïs ; la plupart sont aujourd’hui immobiles.

Faits expérimentaux. McClintock (années 1940–1950) étudia des grains de maïs dont le pigment pourpre était perdu dans certaines cellules et restauré dans d’autres, ce qui donnait des grains tachetés. Elle montra par des croisements et par l’observation des chromosomes que cette instabilité était due à un élément (Dissociation) qui cassait le chromosome là où il se trouvait et se déplaçait d’une position à l’autre sous le contrôle d’un second élément (Activator), et qu’un gène était réduit au silence quand l’élément s’y trouvait et réactivé quand il en partait. Les gènes, conclut-elle, pouvaient changer de position ; l’idée ne fut acceptée que vingt ans plus tard, lorsqu’on découvrit les séquences d’insertion bactériennes, et lui valut le prix Nobel en 1983. ∎

Barbara McClintock, et les grains qui la conduisirent aux éléments transposables : un gène de pigment pourpre éteint par un élément inséré, puis rallumé, cellule par cellule, lorsque l’élément s’échappe, laissant des taches et des secteurs.

Deux manières de se déplacer. Un transposon à ADN est excisé puis réinséré ; un rétrotransposon est transcrit, recopié en ADN et inséré ailleurs, si bien que ses copies s’accumulent.

Définition 3.7 (Le transfert horizontal de gènes)

Les procaryotes acquièrent des gènes de cellules qui ne sont pas leurs parents par trois voies. La transformation : une cellule absorbe de l’ADN nu présent dans son milieu (libéré par des cellules mortes) et l’intègre par recombinaison à son chromosome ; certaines espèces sont naturellement compétentes, et c’est par cette voie que les pneumocoques échangent leurs gènes de capsule. La conjugaison : un donneur portant un plasmide conjugatif (le facteur F d’E. coli) construit un pilus, attire un receveur contre lui et lui transmet un simple brin du plasmide à travers un pore tout en le répliquant selon le cercle roulant ; si le plasmide s’est intégré au chromosome (souche Hfr), des gènes chromosomiques sont transférés à sa suite dans un ordre fixe, et le moment où chacun entre permet de cartographier le chromosome. La transduction : un bactériophage empaquette par erreur un fragment d’ADN de l’hôte et l’injecte dans la cellule suivante qu’il infecte. Ensemble, ces voies font passer des gènes de résistance d’une espèce à l’autre dans les hôpitaux en quelques années, et ont déplacé des gènes métaboliques à travers tout l’arbre bactérien au cours des temps géologiques, si bien que l’ascendance d’un procaryote est un réseau autant qu’un arbre (Chapitre 24).

Faits expérimentaux. Lederberg et Tatum (1946) mélangèrent deux souches d’E. coli, chacune incapable de fabriquer deux nutriments différents, et étalèrent le mélange sur un milieu minimum sur lequel aucune ne pouvait pousser seule : des colonies apparurent, à raison d’environ une pour dix millions de cellules, capables de fabriquer les quatre — des recombinants. Davis (1950) répéta l’expérience en séparant les souches par un filtre qui laissait passer les molécules mais pas les cellules : aucun recombinant, le contact était donc nécessaire. Hayes montra ensuite que le transfert était à sens unique, d’un donneur vers un receveur, et Wollman et Jacob (1956) interrompirent les conjugaisons dans un mixeur à intervalles réguliers et virent les gènes du donneur entrer dans le receveur dans un ordre fixe, l’un après l’autre, en une centaine de minutes environ. ∎

À gauche : la conjugaison — le donneur transmet un brin de son plasmide F à travers la jonction du pilus tout en le copiant. À droite : l’expérience de conjugaison interrompue avec un donneur Hfr : chaque gène chromosomique commence à apparaître parmi les recombinants à un moment caractéristique, ce qui cartographie le chromosome en minutes.

Deux bactéries reliées par un pilus conjugatif, observées en microscopie électronique à transmission : le pont par lequel passe le plasmide.

Exemple 3.8 (La résistance en mouvement)

Un gène de résistance apparaît typiquement une seule fois, par mutation ou chez la bactérie du sol qui fabrique l’antibiotique, puis il voyage : d’un chromosome vers un transposon, du transposon vers un plasmide conjugatif, du plasmide d’une espèce à l’autre par conjugaison et d’une souche à l’autre par transduction, puis de nouveau dans un chromosome par transformation. Des plasmides portant cinq ou six résistances à la fois (assemblées dans des intégrons, qui capturent des cassettes de gènes) furent découverts au Japon dans les années 1950, quelques années après l’entrée en usage des médicaments ; le gène de la carbapénémase NDM-1, observé pour la première fois en 2008, avait atteint tous les continents trois ans plus tard, porté par un plasmide. L’évolution de la résistance est surtout, non l’évolution de gènes nouveaux, mais le déplacement de gènes anciens.

3.3 La duplication : gènes et génomes

Proposition 3.9 (Duplication génique et familles multigéniques)

Lorsque deux séquences semblables se suivent en tandem sur un chromosome, les homologues peuvent s’apparier en décalé à la méiose et effectuer un crossing-over inégal, si bien qu’un produit porte trois copies et l’autre une seule. Un gène dupliqué est redondant : une copie peut conserver l’ancienne fonction tandis que l’autre accumule librement les mutations — le plus souvent en dégénérant en pseudogène, parfois en acquérant une fonction nouvelle (néofonctionnalisation) ou une part de l’ancienne (sous-fonctionnalisation). Répété pendant des centaines de millions d’années, ce processus construit des familles multigéniques : les globines (un seul gène ancestral est devenu la myoglobine, le groupe $\alpha$ et le groupe $\beta$ , dont les membres embryonnaires, fœtaux et adultes s’expriment successivement), les récepteurs olfactifs (un millier de gènes chez la souris), les gènes à homéoboîte, les cristallines du cristallin. La plupart des gènes d’un génome appartiennent à une famille, et la duplication est la principale source de gènes nouveaux.

Faits expérimentaux. Le groupe de la $\beta$ -globine humaine, sur le chromosome 11, compte cinq gènes fonctionnels ( $\varepsilon$ , $^{G}\gamma$ , $^{A}\gamma$ , $\delta$ , $\beta$ ) et un pseudogène, dans l’ordre où ils s’activent au cours du développement, tous avec la même structure exon–intron, et des séquences d’autant plus semblables qu’ils ont divergé plus récemment ; le groupe $\alpha$ , sur le chromosome 16, a la même architecture. Les délétions d’un ou plusieurs gènes $\alpha$ , produites par crossing-over inégal entre les copies presque identiques, sont fréquentes et causent l’ $\alpha$ -thalassémie ; le produit réciproque, un chromosome portant trois gènes $\alpha$ , se rencontre dans les mêmes populations. ∎

En haut : un crossing-over inégal entre copies en tandem mal appariées produit un chromosome à trois copies et un chromosome à une seule copie. En bas : la famille des globines, construite par duplications et divergences successives.

Définition 3.10 (La polyploïdie)

Un polyploïde porte plus de deux jeux complets de chromosomes. Un autopolyploïde possède plusieurs jeux issus d’une même espèce (une méiose ratée donne un gamète diploïde ; deux gamètes de ce type donnent un tétraploïde) ; un allopolyploïde associe les jeux de deux espèces après une hybridation. L’hybride diploïde AB, où aucun chromosome n’a d’homologue, ne peut pas les apparier à la méiose et il est stérile ; si son génome double pour donner AABB, chaque chromosome retrouve un partenaire, la méiose fonctionne et la nouvelle plante est fertile — mais elle ne peut plus se croiser avec aucun des deux parents (un descendant AAB est stérile). La polyploïdie crée ainsi une espèce nouvelle en une seule étape, et environ un tiers des espèces de plantes à fleurs sont apparues de cette façon : le blé tendre est un hexaploïde AABBDD issu de trois graminées, le fraisier cultivé un octoploïde, le cotonnier et le tabac des allotétraploïdes, et la lignée des vertébrés elle-même a doublé deux fois son génome près de son origine. Les polyploïdes sont en général plus grands que leurs ancêtres diploïdes (plus d’ADN, des cellules plus grosses) et très recherchés par les sélectionneurs.

L’origine du blé tendre : deux hybridations, chacune suivie d’un doublement du génome, ont construit un hexaploïde à partir de trois graminées diploïdes en une dizaine de milliers d’années.

Un fraisier sauvage diploïde et le fraisier cultivé octoploïde : le polyploïde, qui a quatre fois plus d’ADN dans chaque cellule, est la plante la plus grande, aux fruits les plus gros.

3.4 Hasard et vitesse

Proposition 3.11 (La mutation est aléatoire au regard du besoin)

Le test de fluctuation et l’étalement sur répliques montrent qu’une mutation utile dans un nouvel environnement apparaît à la même fréquence, que cet environnement soit présent ou non : l’environnement sélectionne parmi les mutations, il ne les suscite pas. La mutation n’est pas aléatoire en tous les sens — les transitions sont plus nombreuses que les transversions, les dinucléotides CpG mutent dix fois plus vite que les autres sites (leur cytosine méthylée se désamine en thymine, que la réparation ne reconnaît pas comme étrangère), certaines régions sont des points chauds, et le stress peut élever le taux global — mais elle est aveugle à ses conséquences. Le taux de mutation lui-même est un caractère héréditaire, que la sélection ajuste : trop élevé, chaque génération hérite de changements nuisibles ; trop faible, la population ne peut pas suivre un monde qui change. Les souches mutatrices l’emportent brièvement à l’hôpital et perdent à la longue, et le taux de $10^{-9}$ par base auquel se fixent la plupart des cellules est un compromis entre le coût des erreurs et le coût de la relecture.

3.5 Exercices

Exercice 3.1 ★

Classer chacune des modifications suivantes du codon GAA (glutamate) : GAG ; GTA ; TAA ; insertion d’un C après la première base. Laquelle est une transition, laquelle une transversion ?

Solution

Solution de Exercice 3.1.

GAG : silencieuse (toujours du glutamate), une transition (A $\to$ G). GTA : faux-sens (valine), une transversion (A $\to$ T). TAA : non-sens (stop), une transversion (G $\to$ T). Insertion d’une base : un décalage du cadre de lecture, qui réécrit tous les codons situés après elle.

Exercice 3.2 ★

Avec $u = 5 \times 10^{-10}\,$ par paire de bases et par réplication et $G = 4.6 \times 10^{6}\,$ , combien de mutations nouvelles une division d’E. coli produit-elle en moyenne ? Combien par génération dans une culture de $10^{9}$ cellules ?

Solution

Solution de Exercice 3.2.

$U = 5\times 10^{-10}\times 4.6\times 10^{6} = 2.3\times 10^{-3}$ : une division sur 430 environ produit une mutation. Dans $10^{9}$ cellules : $2.3\times 10^{6}$ mutations nouvelles par génération.

Exercice 3.3 ★

Nommer les trois voies du transfert horizontal de gènes et dire, pour chacune, ce qu’elle exige (un contact, un virus, de l’ADN libre) et ce qu’elle transfère typiquement.

Solution

Solution de Exercice 3.3.

Transformation : absorption d’ADN libre issu de cellules lysées ; exige un receveur compétent ; transfère des fragments chromosomiques (gènes de capsule chez les pneumocoques). Conjugaison : contact de cellule à cellule par un pilus ; exige un plasmide conjugatif chez le donneur ; transfère des plasmides (gènes de résistance) et, depuis une souche Hfr, des gènes chromosomiques. Transduction : un bactériophage ayant empaqueté de l’ADN de l’hôte ; transfère un fragment quelconque (transduction généralisée) ou les gènes voisins du site du prophage (transduction spécialisée).

Exercice 3.4 ★

Distinguer autopolyploïdie et allopolyploïdie, avec un exemple de chacune, et expliquer pourquoi un hybride diploïde de deux espèces est en général stérile.

Solution

Solution de Exercice 3.4.

Autopolyploïde : jeux supplémentaires issus d’une même espèce, par un gamète diploïde (pomme de terre tétraploïde, nombreux trèfles autotétraploïdes). Allopolyploïde : jeux de deux espèces réunis par hybridation puis doublés (blé tendre, cotonnier, tabac). L’hybride diploïde AB ne possède pas deux chromosomes semblables : aucun ne peut s’apparier en méiose I, les chromosomes ségrègent au hasard et les gamètes sont déséquilibrés et non viables.

Exercice 3.5 ★★

Une lignée germinale humaine accumule $u = 1.2 \times 10^{-8}\,$ mutation par paire de bases et par génération, sur un génome haploïde de $3.2 \times 10^{9}\,$ paires de bases. Combien de mutations nouvelles un enfant porte-t-il ? Si $1.5\,\%$ du génome code des protéines et que $70\,\%$ des substitutions codantes changent un acide aminé, combien de changements d’acides aminés nouveaux l’enfant porte-t-il ?

Solution

Solution de Exercice 3.5.

$2\times 3.2\times 10^{9}\times 1.2\times 10^{-8} = 77$ mutations nouvelles. Dans les séquences codantes : $77\times 0.015 = 1.2$ ; changeant un acide aminé : $1.2\times 0.7 = 0.8$ — la plupart des enfants portent environ une substitution d’acide aminé nouvelle.

Exercice 3.6 ★★

Une culture passe de $10^{3}$ à $10^{9}$ cellules ; une mutation donnée survient avec $m = 2 \times 10^{-8}\,$ par division. Calculer le nombre attendu d’événements mutationnels et de cellules mutantes. Pourquoi la proportion de cultures sans mutant est-elle ici inutilisable pour mesurer $m$ , et quelle taille de culture la rendrait utilisable ?

Solution

Solution de Exercice 3.6.

Événements : $m(N - N_0) = 2\times 10^{-8}\times 10^{9} = 20$ . Cellules mutantes : $mN\ln(N/N_0) = 20\times \ln 10^{6} = 20\times 13.8 = 276$ . $p_0 = e^{-20} \approx 2\times 10^{-9}$ : toutes les cultures ont des mutants, si bien que compter les cultures qui n’en ont pas ne mesure rien. Il faut $m(N - N_0) \approx 1$ , c’est-à-dire $N \approx 5\times 10^{7}$ , où $p_0 \approx 0.37$ , et quelques dizaines de cultures donnent $m$ à un facteur deux près.

Exercice 3.7 ★★

La cytosine se désamine en uracile ; la 5-méthylcytosine se désamine en thymine. Expliquer pourquoi la première lésion est efficacement réparée et la seconde non, et en déduire pourquoi les sites CpG (où la cytosine est méthylée) sont des points chauds de mutation et sont plus rares dans le génome que ne le prédirait le hasard.

Solution

Solution de Exercice 3.7.

L’uracile n’a pas sa place dans l’ADN : une uracile-ADN glycosylase peut donc retirer sans ambiguïté tout uracile qu’elle rencontre. La thymine est une base normale : après la désamination d’une 5-méthylcytosine, le mésappariement G $\cdot$ T est détecté, mais la machinerie de réparation n’a aucun moyen de savoir quel brin est erroné et, une fois sur deux, elle « corrige » le G, ce qui fixe une transition C $\to$ T. Les sites CpG méthylés mutent donc environ dix fois plus vite que les autres sites, et au cours de l’évolution ils ont été convertis en TpG et en CpA : les génomes de mammifères ne contiennent qu’environ un cinquième des CpG que prédit leur composition en bases.

Exercice 3.8 ★★

Dans une expérience de conjugaison interrompue, quatre gènes entrent dans le receveur à 8, 17, 25 et $40\,\mathrm{min}$ ; le chromosome entier ( $4.6\,\mathrm{Mb}$ ) mettrait $100\,\mathrm{min}$ . Convertir les temps en positions en kilobases et calculer les distances entre gènes consécutifs.

Solution

Solution de Exercice 3.8.

$46\,\mathrm{kb}$ par minute. Positions : 368, 782, 1150 et $1840\,\mathrm{kb}$ ; distances 414, 368 et $690\,\mathrm{kb}$ .

Exercice 3.9 ★★

Schématiser l’appariement et le crossing-over qui transforment deux chromosomes portant chacun deux gènes d’ $\alpha$ -globine en tandem en un chromosome à trois gènes et un chromosome à un gène. Une personne hérite d’un chromosome à un gène de chacun de ses parents : combien de gènes $\alpha$ possède-t-elle, et que peut-on attendre de son hémoglobine ?

Solution

Solution de Exercice 3.9.

La deuxième copie d’un chromosome s’apparie avec la première copie de l’autre ; un crossing-over entre elles donne une chromatide portant la copie 1, la copie 2 et la copie 2 $'$ (trois gènes) et une chromatide ne portant que la copie 1 $'$ . Une personne ayant reçu un chromosome à un gène de chacun de ses parents possède deux gènes $\alpha$ au lieu de quatre ( $-\alpha/-\alpha$ ) : les chaînes $\alpha$ sont produites à moitié du rythme normal, les hématies sont petites et pâles, avec une anémie légère ou absente — c’est le trait $\alpha$ -thalassémique.

Exercice 3.10 ★★★

Le blé tendre est AABBDD avec $2n = 42$ . Donner le nombre de chromosomes de ses gamètes, des hybrides stériles à chaque étape de son origine, et d’un croisement entre blé tendre et amidonnier (AABB). Expliquer, en termes d’appariement méiotique, pourquoi chaque doublement a rétabli la fertilité et pourquoi l’hexaploïde ne peut pas se recroiser avec ses parents.

Solution

Solution de Exercice 3.10.

Gamètes : $n = 21$ (un jeu de chacun de A, B, D). Hybrides : AB, 14 chromosomes ; ABD, 21. Blé tendre $\times$ amidonnier : AABBD, 35 chromosomes — les jeux A et B s’apparient, le jeu D n’a pas de partenaires, et la plante est largement stérile. Chaque doublement a donné à chaque chromosome un homologue identique : des bivalents se forment et les gamètes sont équilibrés ; un croisement en retour avec un parent produit des plantes dont un jeu reste non apparié et dont les gamètes sont déséquilibrés, si bien que l’hexaploïde est isolé reproductivement de ses ancêtres — une espèce en une seule étape.

Exercice 3.11 ★★★

Dans une population intestinale de $N = 10^{9}$ bactéries, un plasmide de résistance se propage par conjugaison à une vitesse proportionnelle aux rencontres entre porteurs $R$ et non-porteurs $N - R$ : $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma R (N - R)$ avec $\gamma N = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ . Résoudre à partir d’un seul porteur, et calculer le temps au bout duquel la moitié de la population porte le plasmide. Que se passe-t-il si l’antibiotique est alors retiré et que le plasmide coûte $5\,\%$ de taux de croissance à son hôte ?

Solution

Solution de Exercice 3.11.

Croissance logistique : $R(t) = N/\bigl(1 + (N - 1)e^{-\gamma Nt}\bigr)$ . La moitié de la population est atteinte quand $(N - 1)e^{-\gamma Nt} = 1$ : $t = \ln(N - 1)/\gamma N = 20.7/0.5 = 41\,\mathrm{h}$ . Sans l’antibiotique, les cellules sans plasmide croissent $5\,\%$ plus vite ; le rapport des porteurs aux non-porteurs décroît donc comme $e^{-st}$ avec $s = 0.05\ln 2 = 0.035\,\mathrm{h}^{-1}$ (temps de génération $1\,\mathrm{h}$ ) : passer de $99\,\%$ à $1\,\%$ prend $\ln(99^2)/0.035 = 260\,\mathrm{h}$ , onze jours — et la poursuite des transferts peut maintenir indéfiniment le plasmide à basse fréquence, prêt pour la prochaine cure du médicament.

Exercice 3.12 ★★★

« La mutation est aléatoire ; l’évolution ne l’est pas. » Discuter, à l’aide du test de fluctuation, de l’étalement sur répliques et du fait que le taux de mutation est lui-même soumis à la sélection.

Solution

Solution de Exercice 3.12.

Le test de fluctuation a montré que les mutations de résistance apparaissent avant l’agent sélectif et sans lui, à des moments aléatoires : la mutation est donc aveugle à ce qui serait utile ; l’étalement sur répliques a montré la même chose sans jamais exposer les cellules sélectionnées. L’évolution n’est pas aléatoire, car la sélection trie ces variants aveugles selon leurs conséquences, de manière constante et cumulative. Le seul endroit où le hasard est lui-même façonné est le taux : les lignées qui commettent trop ou trop peu d’erreurs perdent, si bien que le taux de mutation est un compromis adapté — mais ce que fait chaque mutation reste imprévisible et non choisi.

3.6 Problème : un test de fluctuation

Problème 3.1

Problème du week-end — un test de fluctuation est réalisé et analysé ; le taux de mutation d’une souche en est extrait et rapporté à son génome et à sa population, la propagation d’un plasmide de résistance est modélisée et le coût d’un mutateur est évalué, jusqu’au taux de mutation de la souche par base et au temps que met le plasmide à envahir la population

Vingt cultures d’E. coli sont lancées chacune à partir de $100$ cellules dans $0.2\,\mathrm{mL}$ et amenées à $N = 2 \times 10^{8}\,$ cellules ; chacune est ensuite étalée sur une boîte avec un bactériophage, et l’on compte les colonies résistantes : 0, 0, 0, 1, 0, 0, 3, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 107, 0, 2, 0, 0, 5. En parallèle, vingt échantillons de $0.2\,\mathrm{mL}$ sont prélevés dans une grande culture de même densité et étalés de la même manière : 14, 15, 13, 21, 15, 14, 26, 16, 20, 13, 17, 12, 18, 14, 16, 19, 15, 13, 17, 16. Génome : $4.6 \times 10^{6}\,$ paires de bases, $88\,\%$ codantes. La résistance au phage peut résulter de n’importe lequel de $20$ changements distincts d’une seule base dans un gène de récepteur.

Partie I — Le test.

Calculer la moyenne et la variance des vingt cultures indépendantes.
Calculer la moyenne et la variance des vingt échantillons.
Pour une loi de Poisson, la variance est égale à la moyenne. Quelle série suit une loi de Poisson, et que dit la distribution de chaque série sur le moment où les mutations se sont produites ?
Expliquer le nombre 107.
Combien de cultures indépendantes ne contiennent aucun mutant ? Utiliser $p_0 = e^{-m(N - N_0)}$ pour estimer $m$ , le taux de mutation vers la résistance par division cellulaire.
Calculer le nombre attendu de cellules mutantes par culture à partir de $mN\ln(N/N_0)$ et le comparer à la moyenne observée.
Pourquoi les échantillons de la culture unique auraient-ils été inutilisables pour estimer $m$ par la méthode de $p_0$ ?

Partie II — Du gène au génome.

En déduire le taux de mutation $u$ par paire de bases et par réplication, à partir de $m$ et du nombre de changements conférant la résistance.
Calculer le nombre moyen de mutations nouvelles par génome et par réplication, $U$ .
Une culture d’un litre à $10^{9}$ cellules par millilitre double une fois. Combien de mutations nouvelles apparaissent dans la population ?
Combien de changements distincts d’une seule base sont possibles dans ce génome ? En moyenne, combien de fois chacun apparaît-il au cours de ce seul doublement ?
Expliquer pourquoi, dans une telle population, la résistance à tout antibiotique qu’une seule mutation peut mettre en échec est pratiquement assurée d’être présente.
Expliquer pourquoi l’association de deux antibiotiques exigeant deux mutations indépendantes change la situation, chiffre à l’appui.

Partie III — Un plasmide se propage. Dans un intestin contenant $N = 10^{9}$ cellules, une cellule acquiert un plasmide conjugatif de résistance. Les porteurs $R$ le transmettent par contact : $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma R(N - R)$ , avec $\gamma N = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Montrer que $R(t) = N/\bigl(1 + (N - 1)e^{-\gamma N t}\bigr)$ est solution de l’équation avec $R(0) = 1$ .
Calculer le temps au bout duquel la moitié des cellules portent le plasmide.
Calculer le temps au bout duquel $99\,\%$ le portent.
Combien d’événements de conjugaison ont lieu par heure au moment où la moitié des cellules sont porteuses ?
Comparer avec le temps qu’il faut à un mutant résistant pour atteindre la moitié de la population en croissant $10\,\%$ plus vite que les autres sous antibiotique (temps de génération $1\,\mathrm{h}$ pour les cellules sensibles) : combien de temps faut-il à partir d’une seule cellule ?
Conclure sur la raison pour laquelle la résistance se propage surtout par transfert plutôt que par descendance.

Partie IV — Un mutateur. Une souche dépourvue de réparation des mésappariements mute $100$ fois plus vite. On suppose que $30\,\%$ des mutations dans une séquence codante sont nuisibles.

Calculer son $U$ et le nombre moyen de mutations nuisibles par cellule et par génération.
Au bout de $200$ générations, quelle fraction des descendants d’une lignée ne porte aucune mutation nuisible (loi de Poisson) ?
Calculer la même fraction pour le type sauvage.
Dans le test de fluctuation ci-dessus, quel nombre moyen le mutateur aurait-il donné, et quelle proportion de cultures sans mutant ?
Expliquer en deux phrases pourquoi on trouve des mutateurs parmi les isolats hospitaliers et pourquoi ils sont rares dans la nature.
Énoncer le résultat : $m$ , $u$ , $U$ pour la souche, et les temps au bout desquels le plasmide atteint la moitié et $99\,\%$ de l’intestin.

Solution

Solution de Problème 3.1.

1. Somme 119, moyenne $5.95$ ; moyenne des carrés $11489/20 = 574$ ; variance $574 - 35 = 540$ . 2. Somme 324, moyenne $16.2$ ; moyenne des carrés $5462/20 = 273$ ; variance $273 - 262 = 11$ . 3. Les échantillons d’une même culture suivent une loi de Poisson (variance proche de la moyenne) : ce sont des tirages au hasard dans une même fraction fixe de mutants. Les cultures indépendantes ont une variance quatre-vingt-dix fois supérieure à la moyenne : leurs mutants sont apparus à des moments différents et aléatoires de la croissance, et plus la mutation est précoce, plus son clone est grand. 4. Un jackpot : une mutation survenue au cours de l’une des toutes premières divisions, dont le clone a ensuite crû avec la culture jusqu’à une centaine de cellules. 5. Quatorze sur vingt : $p_0 = 0.70$ ; $m(N - N_0) = -\ln 0.70 = 0.36$ ; $m = 0.36/2\times 10^{8} = 1.8 \times 10^{-9}\,$ par division. 6. $1.8\times 10^{-9}\times 2\times 10^{8}\times \ln(2\times 10^{6}) = 0.36\times 14.5 = 5.2$ cellules mutantes ; observé : $5.95$ — accord compatible avec le bruit de vingt cultures. 7. Aucun échantillon n’était vide (tous partagent les mutants de la culture mère) : $p_0 = 0$ ne donne aucune estimation ; les échantillons mesurent la fraction de mutants d’une seule culture, qui dépend du moment où ses mutations se sont trouvées survenir. 8. $u = m/20 = 9 \times 10^{-11}\,$ par paire de bases et par réplication. 9. $U = 9\times 10^{-11}\times 4.6\times 10^{6} = 4.1 \times 10^{-4}\,$ . 10. $10^{12}$ cellules $\times$ $4.1\times 10^{-4}$ $= 4.1\times 10^{8}$ mutations nouvelles. 11. $3\times 4.6\times 10^{6} = 1.4\times 10^{7}$ changements possibles ; chacun apparaît $4.1\times 10^{8}/1.4\times 10^{7} \approx 30$ fois. 12. Tout changement d’une seule base, y compris chacun de ceux qui confèrent la résistance à un médicament mis en échec par une seule mutation, est présent dans des dizaines de cellules avant l’ajout du médicament ; celui-ci ne fait que les sélectionner. 13. Deux mutations indépendantes dans une même cellule surviennent avec une probabilité $m^2 \approx (2\times 10^{-9})^2 = 4\times 10^{-18}$ par division : dans $10^{12}$ cellules, $4\times 10^{-6}$ par génération — une cellule doublement résistante ne préexiste pratiquement jamais, et c’est pourquoi la tuberculose se traite par plusieurs médicaments à la fois. 14. Avec $a = N - 1$ et $E = e^{-\gamma Nt}$ : $R = N/(1 + aE)$ , $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma N\cdot NaE/(1 + aE)^2$ ; et $\gamma R(N - R) = \gamma\,\frac{N}{1 + aE}\cdot\frac{NaE}{1 + aE}$ , qui est identique ; $R(0) = N/(1 + N - 1) = 1$ . 15. $(N - 1)E = 1$ : $t = \ln(N - 1)/\gamma N = 20.7/0.5 = 41\,\mathrm{h}$ . 16. $1 + aE = 1/0.99$ , $aE = 0.0101$ : $t = \ln(10^{9}/0.0101) /0.5 = (20.7 + 4.6)/0.5 = 51\,\mathrm{h}$ . 17. $\gamma (N/2)^2 = \gamma N\cdot N/4 = 0.5\times 2.5\times 10^{8} = 1.25\times 10^{8}$ transferts par heure. 18. Taux de croissance $\ln 2 = 0.693\,\mathrm{h}^{-1}$ et $0.762\,\mathrm{h}^{-1}$ ; le rapport mutants/sensibles croît comme $e^{st}$ avec $s = 0.069\,\mathrm{h}^{-1}$ ; passer de $1/N$ à 1 prend $\ln N/s = 20.7/0.069 = 300\,\mathrm{h}$ , douze jours. 19. Le transfert est proportionnel au produit du nombre de porteurs par celui des non-porteurs et va au rythme des rencontres, non des divisions ; la descendance est limitée par l’avantage de croissance du mutant, qui est faible. Un plasmide traverse la population en deux jours, un mutant favorisé en deux semaines. 20. $U = 4.1\times 10^{-2}$ ; mutations nuisibles : $0.041\times 0.88\times 0.3 = 0.011$ par génération. 21. Moyenne $2.2$ : $e^{-2.2} = 0.11$ , un descendant sur neuf indemne. 22. Type sauvage : $1.1\times 10^{-4}$ par génération, $0.022$ en 200 : $e^{-0.022} = 0.98$ . 23. Moyenne $520$ cellules mutantes ; $p_0 = e^{-36} \approx 10^{-16}$ : aucune culture vide. 24. Sous une sélection intense et changeante (la rotation des antibiotiques d’un hôpital), l’apport centuplé de variants nouveaux l’emporte sur le fardeau, et les mutateurs sont entraînés en auto-stop avec les résistances qu’ils engendrent. Dans un environnement stable, il n’y a rien à gagner et une mutation nuisible par centaine de générations à perdre : les lignées mutatrices sont éliminées. 25. $m = 1.8 \times 10^{-9}\,$ par division vers la résistance, $u = 9 \times 10^{-11}\,$ par paire de bases et par réplication, $U = 4.1 \times 10^{-4}\,$ mutation par génome et par réplication ; le plasmide atteint la moitié de l’intestin en $41\,\mathrm{h}$ et $99\,\%$ de celui-ci en $51\,\mathrm{h}$ .

Termes définis dans ce chapitre

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