Biologie universitaire — 3e année · Bachelor Year 3

8Trafic membranaire et adressage des protéines

Une cellule du pancréas fabrique quelque dix millions de molécules d’enzyme digestive par minute, les emballe en granules et les libère dans un canal sur un signal venu de l’intestin — sans jamais laisser une molécule de trypsine en liberté dans son propre cytoplasme. Une cellule du foie retire le cholestérol du sang en avalant tout entières les particules qui le transportent, à raison de quelques milliers par minute, et renvoie chaque récepteur à la surface pour la suivante. Une protéine fraîchement produite et destinée à la mitochondrie, au noyau, au lysosome, à la membrane ou au monde extérieur atteint son adresse parmi une douzaine de compartiments avec un taux d’erreur qui ferait honte à un service postal. Ce chapitre traite de cet adressage : les signaux inscrits dans les protéines, les machines qui les lisent, les vésicules qui portent membrane et cargaison d’un compartiment à l’autre, les manteaux qui façonnent les vésicules et les protéines qui les font fusionner avec la bonne cible, et le trafic à double sens — la sécrétion vers l’extérieur, l’endocytose vers l’intérieur — qu’une cellule eucaryote entretient à chaque seconde de sa vie.

8.1 Signaux et adresses

Définition 8.1 (Les signaux d’adressage)

Un signal d’adressage est un segment d’une protéine, ou une modification de celle-ci, que lit un récepteur qui livre la protéine à un compartiment. Le peptide signal, suite de $15\text{ à }30$ résidus à l’extrémité aminée dotée d’un cœur hydrophobe, envoie une protéine dans le réticulum endoplasmique pendant qu’elle se fait ; de là, la voie par défaut passe par le Golgi et mène à la membrane plasmique ou à l’extérieur, et d’autres signaux détournent vers le lysosome (un sucre phosphorylé) ou en arrière vers le réticulum (la séquence carboxy-terminale KDEL). Un signal de localisation nucléaire, court îlot basique tel que PKKKRKV, est reconnu par des importines qui font passer la protéine repliée par le pore nucléaire ; une préséquence mitochondriale, hélice amphipathique de $20\text{ à }50$ résidus, est reconnue par des récepteurs de la membrane externe et enfilée, dépliée, à travers les translocases des deux membranes ; les enzymes peroxysomales se terminent par SKL. Les protéines qui n’ont aucun de ces signaux restent dans le cytosol. Chaque signal a été trouvé de la même manière : le supprimer laisse la protéine dans le cytosol, le greffer sur une protéine cytosolique envoie celle-ci dans le compartiment.

Faits expérimentaux. Blobel et Dobberstein (1975) ont traduit l’ARN messager d’une chaîne légère d’anticorps dans un système acellulaire. Sans membranes, le produit était plus long d’une vingtaine de résidus que la protéine sécrétée ; avec des fragments de réticulum endoplasmique ajoutés pendant la traduction, le produit avait la taille de la protéine sécrétée et était protégé d’une protéase ajoutée — il était à l’intérieur des vésicules — alors que des membranes ajoutées après la traduction ne changeaient rien. Le segment amino-terminal supplémentaire, le peptide signal, est nécessaire pour entrer dans le réticulum, y est retiré, et ne fonctionne que pendant que la chaîne se fait : c’est l’hypothèse du signal, confirmée dans le moindre détail lorsque le récepteur (la particule de reconnaissance du signal, Walter et Blobel 1981) et le canal (Sec61) ont été purifiés. ∎

L’hypothèse du signal. Un peptide signal en tête de la chaîne naissante est reconnu par la particule de reconnaissance du signal, qui met la traduction en pause et amarre le ribosome sur le canal Sec61 ; la chaîne traverse alors la membrane à mesure qu’elle est synthétisée, le signal est coupé dans la lumière, et des sucres sont ajoutés.

Proposition 8.2 (Protéines membranaires et topologie)

Un tronçon hydrophobe d’une vingtaine de résidus au milieu d’une chaîne en cours de translocation agit comme une séquence d’arrêt de transfert : le canal s’ouvre latéralement et la libère dans la bicouche sous forme d’hélice transmembranaire, la part déjà transloquée restant dans la lumière et le reste se faisant dans le cytosol. Un second tronçon de ce genre relance la translocation, et une protéine munie de $n$ signaux alternés finit avec $n$ hélices transmembranaires. L’orientation fixée dans le réticulum n’est jamais changée : ce qui fait face à la lumière du réticulum fait face à la lumière du Golgi et de toute vésicule ensuite, et à l’extérieur de la cellule après fusion avec la membrane plasmique. Les sucres, ajoutés seulement dans la lumière, sont donc toujours sur la face extracellulaire d’une protéine de surface, et la topologie d’un récepteur se lit à l’emplacement de ses sites de glycosylation.

Méthode 8.3 (Marquage et chasse)

Pour suivre à travers la cellule une population de molécules fraîchement produites : (1) exposer brièvement les cellules (le marquage, quelques minutes) à un précurseur radioactif ou autrement marqué — de la leucine tritiée pour les protéines ; (2) le remplacer par un excès de précurseur non marqué (la chasse), de sorte qu’aucun marqueur neuf ne soit incorporé ; (3) fixer des échantillons de cellules à intervalles réguliers et localiser le marqueur par autoradiographie sur des micrographies électroniques, ou en isolant les compartiments et en comptant ; (4) porter la fraction de marqueur de chaque compartiment en fonction du temps. L’ordre dans lequel les compartiments se remplissent et se vident est la route ; la chronologie donne le temps de séjour dans chacun. Le laboratoire de Palade (années 1960) l’a appliqué à la cellule acineuse du pancréas et a trouvé le marqueur dans le réticulum rugueux à $3\,\mathrm{min}$ , dans le Golgi à $20\,\mathrm{min}$ , dans les vacuoles de condensation et les granules à $40\,\mathrm{min}$ , et dans le canal après une heure et sur un signal : la voie de sécrétion, déployée dans le temps.

Théorème 8.4 (Compartiments successifs et courbes de marquage–chasse)

Soit une impulsion de protéine marquée qui quitte le compartiment $A$ pour $B$ à la vitesse du premier ordre $k_{1}$ et quitte $B$ pour $C$ à la vitesse $k_{2}$ , $C$ la retenant. Tout le marqueur étant dans $A$ en $t = 0$ ,

A(t) = e^{-k_{1}t},\qquad B(t) = \frac{k_{1}}{k_{2} - k_{1}}\bigl(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t}\bigr), \qquad C(t) = 1 - A - B,

et le marqueur présent dans $B$ passe par un maximum en $t^{*} = \ln(k_{2}/k_{1})/(k_{2} - k_{1})$ . Le temps de séjour moyen dans $A$ vaut $1/k_{1}$ et dans $B$ vaut $1/k_{2}$ , quel que soit l’ordre des deux vitesses.

Démonstration. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = -k_{1}A$ donne l’exponentielle. Pour $B$ , $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k_{1}A - k_{2}B = k_{1}e^{-k_{1}t} - k_{2}B$ ; essayons $B = \beta(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t})$ : la dérivée vaut $\beta(-k_{1}e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ et $-k_{2}B = \beta(-k_{2} e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ , de sorte que l’équation exige $\beta(k_{2} - k_{1})e^{-k_{1}t} = k_{1}e^{-k_{1}t}$ , $\beta = k_{1}/(k_{2} - k_{1})$ , et $B(0) = 0$ comme il se doit. En posant $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = 0$ : $k_{1}e^{-k_{1}t} = k_{2}e^{-k_{2}t}$ , d’où $t^{*}$ . Le temps moyen qu’une molécule passe dans un compartiment qu’elle quitte à la vitesse $k$ vaut $\int_{0}^{ \infty} t\,k e^{-kt}\,\mathrm{d}t = 1/k$ . ∎

Exemple 8.5 (La cellule de Palade en chiffres)

Prenons $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ (dix minutes dans le réticulum) et $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ (vingt dans le Golgi). Le Golgi passe par son maximum en $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , retenant alors $B = 2(e^{-1.39} - e^{-0.69}) = 2(0.25 - 0.50)\cdot(-1) = 0.50$ : la moitié du marqueur. À $40\,\mathrm{min}$ , $A = 0.018$ , $B = 2(0.018 - 0.135) \to 0.23$ , $C = 0.75$ : les trois quarts de la protéine ont atteint les granules. Les courbes observées par le laboratoire de Palade ont cette allure, et c’est en les ajustant que les temps de séjour ont été mesurés pour la première fois.

Courbes de marquage–chasse données par le modèle à deux vitesses avec k_1 = 0.1\, min-1 et k_2 = 0.05\, min-1 : le marqueur quitte le réticulum exponentiellement, traverse le Golgi avec un maximum à 14\, min, et s’accumule dans les granules. — Courbes de marquage–chasse données par le modèle à deux vitesses avec $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ et $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ : le marqueur quitte le réticulum exponentiellement, traverse le Golgi avec un maximum à $14\,\mathrm{min}$ , et s’accumule dans les granules.

8.2 Le réticulum endoplasmique : repliement, sucres et qualité

Définition 8.6 (N-glycosylation et contrôle qualité)

À mesure que la chaîne entre dans la lumière, un oligosaccharide préassemblé de quatorze sucres (deux N-acétylglucosamines, neuf mannoses, trois glucoses) est transféré depuis un porteur lipidique sur des asparagines de la séquence Asn-X-Ser/Thr — la N-glycosylation. Les trois glucoses sont ensuite retirés un à un, et ce retrait est une horloge du repliement : une protéine qui porte encore un glucose est retenue par le chaperon calnexine ; une protéine dont le dernier glucose a été retiré mais qui n’est pas encore repliée est reglucosylée par une enzyme qui reconnaît les zones hydrophobes exposées, et retourne à la calnexine — c’est le cycle de la calnexine. Les protéines qui échouent à répétition sont ramenées dans le cytosol, ubiquitinylées et détruites par le protéasome : c’est la dégradation associée au réticulum (ERAD). Quand les protéines mal repliées s’accumulent plus vite qu’on ne peut les replier ou les détruire, des capteurs de la membrane du réticulum déclenchent la réponse aux protéines mal repliées : la traduction est ralentie, les gènes de chaperons induits, le réticulum étendu et, si la contrainte persiste, la cellule tuée. La mutation la plus fréquente de la mucoviscidose ( $\Delta$ F508 dans CFTR) donne un canal qui fonctionnerait mais se replie trop lentement, est attrapé par l’ERAD et n’atteint jamais la surface ; des médicaments qui l’aident à se replier sont aujourd’hui un traitement.

Une cellule acineuse du pancréas au microscope électronique : des empilements de réticulum endoplasmique rugueux hérissé de ribosomes remplissent la base, le Golgi se tient au-dessus du noyau, et des granules de sécrétion denses, pleins d’enzymes digestives, sont tassés sous la surface apicale, attendant un signal.

8.3 Les vésicules : bourgeonnement, adressage, fusion

Définition 8.7 (Manteaux et bourgeonnement des vésicules)

Une vésicule de transport est façonnée par un manteau de protéines assemblé sur la face cytosolique d’une membrane, qui courbe celle-ci en un bourgeon de $60\text{ à }100\,\mathrm{nm}$ , rassemble la cargaison grâce à des récepteurs qui traversent la membrane, et se défait une fois la vésicule détachée. Trois manteaux desservent les routes principales : COPII pour les vésicules qui quittent le réticulum vers le Golgi, COPI pour le trafic de retour du Golgi vers le réticulum et entre citernes golgiennes, et la clathrine — protéine à trois pieds qui polymérise en une cage d’hexagones et de pentagones — pour les vésicules qui quittent le Golgi trans vers les endosomes et pour l’endocytose à la membrane plasmique, où des protéines adaptatrices relient la cage aux récepteurs à internaliser. Chaque manteau est recruté par une petite GTPase (Sar1 pour COPII, Arf1 pour COPI et la clathrine) qui s’insère dans la membrane sous sa forme GTP et, en hydrolysant le GTP après le bourgeonnement, laisse tomber le manteau. Des signaux de récupération maintiennent les compartiments distincts : les protéines du réticulum échappées et porteuses de KDEL sont reconnues dans le Golgi par un récepteur et ramenées dans des vésicules COPI.

À gauche : une cage de clathrine, le réseau polyédrique d’unités à trois pieds qui façonne une vésicule d’endocytose (écorchée pour montrer la membrane à l’intérieur). À droite : un dictyosome au microscope électronique, une pile de citernes aplaties d’où bourgeonnent des vésicules sur les bords.

Définition 8.8 (Adressage et fusion)

Une vésicule trouve sa cible par deux couches de reconnaissance. Les GTPases Rab — une soixantaine dans une cellule humaine, chacune sur les membranes d’un compartiment — recrutent de longues protéines d’amarrage qui attrapent une vésicule entrante porteuse de la Rab correspondante. Puis les SNARE agissent : une v-SNARE sur la vésicule et des t-SNARE sur la cible, protéines hélicoïdales ancrées dans leurs membranes, s’enroulent l’une autour de l’autre depuis leurs extrémités distales vers les membranes, et l’énergie du faisceau à quatre hélices qu’elles forment tire les deux bicouches l’une contre l’autre jusqu’à la fusion. Chaque appariement de SNARE est spécifique, seconde vérification de l’adresse. Après la fusion, le faisceau est défait par l’ATPase NSF pour être réemployé. On peut faire attendre la fusion jusqu’à un signal : dans la terminaison nerveuse, les SNARE sont tenues à demi fermées par la complexine jusqu’à ce que la synaptotagmine, en fixant le calcium qui entre à l’arrivée d’un potentiel d’action, achève la fermeture éclair en moins d’une milliseconde — la libération du neurotransmetteur, traitée dans le volume de deuxième année. Les neurotoxines du tétanos et du botulisme sont des protéases qui clivent des SNARE.

Faits expérimentaux. Novick et Schekman (1980) ont isolé des mutants de levure thermosensibles qui cessaient de sécréter à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ et accumulaient de la protéine dans le compartiment que bloquait leur défaut — réticulum, Golgi ou vésicules entassées sous la surface ; les $23$ gènes sec ont défini les étapes et, une fois clonés, se sont révélés coder les manteaux, les GTPases et les SNARE. Rothman a reconstitué le transport entre citernes golgiennes dans un tube à essai, avec des membranes purifiées, du cytosol et de l’ATP, et en a purifié NSF et les SNARE ; les deux approches ont convergé vers les mêmes protéines, et les machines de levure et de mammifère se sont révélées être les mêmes. ∎

La fusion en trois temps. Une Rab sur la vésicule et une amarre sur la cible rapprochent les deux membranes ; les SNARE de la vésicule et de la cible (rouge et vert) se ferment en un faisceau à quatre hélices qui tire les bicouches l’une contre l’autre ; elles fusionnent et la cargaison entre dans le compartiment cible.

Proposition 8.9 (Le Golgi)

Le Golgi est une pile de quatre à huit citernes aplaties, face cis vers le réticulum, face trans vers la membrane plasmique, chaque citerne abritant un jeu d’enzymes différent qui rogne et reconstruit les sucres des glycoprotéines de passage et ajoute des sucres O-liés, du sulfate et du phosphate. La cargaison avance surtout par maturation des citernes : une nouvelle citerne se forme à la face cis à partir des vésicules qui arrivent, progresse à travers la pile comme l’ont fait celles qui la précèdent, et mûrit à mesure que des vésicules COPI rapportent les enzymes de chaque citerne à la plus jeune derrière elle ; à la face trans elle se fragmente en vésicules destinées à leurs adresses. C’est là que se décide l’adressage : les hydrolases lysosomales, marquées dans le Golgi cis d’un mannose-6-phosphate, sont reconnues par leur récepteur et emballées dans des vésicules à clathrine à destination de l’endosome ; les protéines de sécrétion régulée s’agrègent au pH légèrement acide en granules de condensation ; tout le reste part dans le flux constitutif vers la surface. Dans la maladie des cellules à inclusions, l’enzyme phosphorylante manque, les hydrolases sont sécrétées au lieu d’être livrées, et les lysosomes se remplissent de matériel non digéré.

La carte du trafic membranaire. Vers l’extérieur (vert) : du réticulum au Golgi dans des vésicules COPII, du Golgi à la surface soit de façon constitutive, soit par des granules qui attendent un signal. Vers l’arrière (rouge) : des vésicules COPI ramènent les protéines échappées du réticulum. Vers le bas (orange) : les enzymes lysosomales marquées au mannose-6-phosphate gagnent l’endosome et le lysosome. Vers l’intérieur (bleu) : l’endocytose depuis la surface, la plupart des récepteurs étant recyclés.

8.4 L’endocytose et le lysosome

Définition 8.10 (L’endocytose)

L’endocytose par récepteurs interposés concentre un ligand fixé sur des récepteurs de surface dans des puits recouverts de clathrine, qui se détachent (la GTPase dynamine en étrangle le col) sous forme de vésicules d’environ $100\,\mathrm{nm}$ — un millier par minute dans un fibroblaste, ce qui renouvelle toute la membrane de surface en une heure. Les vésicules fusionnent en endosomes précoces, dont la lumière est acidifiée à pH 6 par une pompe à protons ; la plupart des ligands y lâchent leurs récepteurs, les récepteurs retournent à la surface dans des vésicules de recyclage, et le ligand poursuit sa route à mesure que l’endosome mûrit en endosome tardif (pH 5,5) et fusionne avec un lysosome : un compartiment à pH 4,5–5 contenant une soixantaine d’hydrolases — protéases, nucléases, lipases, glycosidases — actives à ce seul pH, de sorte qu’une fuite dans le cytosol neutre ne fait guère de mal. Le lysosome digère aussi le matériel propre de la cellule que lui livre l’autophagie : une double membrane croît autour d’une portion de cytoplasme ou d’un organite usé, se referme en autophagosome, et fusionne avec le lysosome ; les produits sont rendus au cytosol. L’autophagie est induite par le jeûne (elle recycle la substance propre de la cellule pour en tirer de l’énergie) et élimine agrégats et mitochondries endommagées ; sa défaillance est mise en cause dans la neurodégénérescence.

Faits expérimentaux. Brown et Goldstein (années 1970) ont suivi la lipoprotéine de basse densité (LDL), la particule qui transporte le cholestérol dans le sang, jusque dans des fibroblastes en culture. La LDL se fixait de façon saturable sur quelque $20\,000$ sites de surface par cellule, était internalisée en quelques minutes dans des puits à manteau, et son cholestérol était libéré dans les lysosomes et éteignait la synthèse de cholestérol propre à la cellule. Les fibroblastes de patients atteints d’hypercholestérolémie familiale ne fixaient pas la LDL (récepteur absent) ou la fixaient sans l’internaliser (une mutation de la queue cytosolique du récepteur qui empêche sa capture par les adaptateurs de la clathrine) : la maladie était un défaut d’endocytose, la queue du récepteur contenait le signal d’internalisation, et le récepteur recyclé — chacun faisant des centaines d’allers-retours — s’imposait comme le mécanisme général de capture. ∎

Proposition 8.11 (Capture par des récepteurs recyclés)

Soit une cellule munie de $R$ récepteurs en tout, dont $S$ sont à la surface et $R - S$ à l’intérieur, sur le chemin du retour. Un récepteur de surface est occupé avec la probabilité $\theta = [L]/(K_{d} + [L])$ , un récepteur occupé est internalisé à la vitesse $k_{i}$ , et un récepteur internalisé revient à la vitesse $k_{r}$ . À l’état stationnaire le flux de ligand vers l’intérieur vaut

J = \frac{R\,k_{i}k_{r}\,\theta}{k_{r} + k_{i}\theta},

qui sature, à mesure que la concentration de ligand croît, à $J_{\max} = R\,k_{i}k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ : la capture d’une cellule est limitée non par ses seuls récepteurs, mais par la vitesse à laquelle elle peut les ramener.

Démonstration. Les récepteurs de surface sont perdus à la vitesse $k_{i}\theta S$ et regagnés à la vitesse $k_{r}(R - S)$ ; à l’état stationnaire ces deux vitesses s’équilibrent, donc $S = R\,k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta)$ . Chaque internalisation emporte un ligand, donc $J = k_{i}\theta S$ , ce qui donne la formule. Lorsque $\theta \to 1$ le flux tend vers $R\,k_{i}k_{r}/(k_{r} + k_{i})$ — les récepteurs tournent aussi vite que les deux vitesses le permettent, une fraction $k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ d’entre eux se trouvant à la surface à tout instant. ∎

Exemple 8.12 (Le cholestérol à la particule)

Un fibroblaste muni de $R = 20\,000$ récepteurs de LDL, d’un temps d’internalisation de $5\,\mathrm{min}$ ( $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ ) et d’un temps de retour de $10\,\mathrm{min}$ ( $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ ) capte, à LDL saturante, $J_{\max} = 20\,000\times 0.2\times 0.1/0.3 \approx 1300$ particules par minute, un tiers de ses récepteurs se trouvant à la surface à tout instant ; chaque particule apporte quelque $1500$ molécules de cholestérol, deux millions par minute, de quoi bâtir environ un dixième de micromètre carré de membrane. Un hétérozygote pour l’hypercholestérolémie familiale, avec la moitié des récepteurs, en capte deux fois moins ; le cholestérol sanguin double, et la maladie cardiaque arrive vingt ans plus tôt. Les statines élèvent $R$ en privant la cellule hépatique de son propre cholestérol.

Capture de LDL par des récepteurs recyclés, d’après la formule de la proposition avec k_i = 0.2\, min-1 et k_r = 0.1\, min-1 : elle sature avec le ligand, et elle est divisée par deux quand la moitié des récepteurs manque. — Capture de LDL par des récepteurs recyclés, d’après la formule de la proposition avec $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ et $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ : elle sature avec le ligand, et elle est divisée par deux quand la moitié des récepteurs manque.

Remarque 8.13 (Une seule membrane, bien des compartiments)

Toute membrane du système de sécrétion et d’endocytose est, topologiquement, une seule membrane : la lumière du réticulum est continue, par les vésicules, avec l’extérieur de la cellule, et un lipide ou une protéine fabriqués dans le réticulum peuvent atteindre la surface sans jamais traverser une bicouche. Ce qui garde les compartiments distincts n’est pas des murs mais le trafic — l’emballage sélectif à l’aller, la récupération sélective au retour, et un couple précis de molécules de reconnaissance à chaque fusion. Les compartiments sont des états stationnaires de flux, comme les biefs d’une rivière, et une cellule qui cesse de trafiquer perd sa géographie en quelques heures.

8.5 Exercices

Exercice 8.1 ★

Donner le signal et la destination de chacun : un tronçon de vingt résidus hydrophobes à l’extrémité aminée ; PKKKRKV ; une hélice amphipathique amino-terminale ; KDEL à l’extrémité carboxylée ; un mannose-6-phosphate sur les sucres.

Solution

Solution de Exercice 8.1.

Tronçon hydrophobe amino-terminal : peptide signal, vers le réticulum endoplasmique (et par défaut jusqu’à la surface). PKKKRKV : signal de localisation nucléaire, vers le noyau par le pore. Hélice amphipathique amino-terminale : préséquence mitochondriale, vers la matrice mitochondriale. KDEL : récupération depuis le Golgi vers le réticulum. Mannose-6-phosphate : du Golgi trans vers l’endosome et le lysosome.

Exercice 8.2 ★

Décrire les trois observations clés de l’expérience de Blobel–Dobberstein et ce que chacune a montré.

Solution

Solution de Exercice 8.2.

(1) Sans membranes, la chaîne traduite était plus longue d’une vingtaine de résidus que la protéine sécrétée : un segment est retiré au cours de la sécrétion. (2) Avec des membranes présentes pendant la traduction, le produit avait la taille mature et était protégé de la protéase : il était entré dans les vésicules et y avait perdu le segment. (3) Des membranes ajoutées après la traduction ne faisaient ni l’un ni l’autre : l’entrée est couplée à la synthèse — cotraductionnelle — et le segment, le peptide signal, n’agit que sur une chaîne naissante.

Exercice 8.3 ★

Nommer le manteau et le sens du transport pour : réticulum vers Golgi ; Golgi vers réticulum ; Golgi trans vers endosome ; membrane plasmique vers endosome.

Solution

Solution de Exercice 8.3.

Réticulum vers Golgi : COPII, vers l’avant. Golgi vers réticulum : COPI, rétrograde. Golgi trans vers endosome : clathrine et ses adaptateurs, vers l’avant, en direction du lysosome. Membrane plasmique vers endosome : clathrine, vers l’intérieur (endocytose).

Exercice 8.4 ★

Pourquoi les sucres d’une protéine de la membrane plasmique sont-ils toujours du côté extérieur de la cellule ?

Solution

Solution de Exercice 8.4.

Les sucres ne sont ajoutés que dans la lumière du réticulum et du Golgi. La face luminale de chaque vésicule reste luminale au bourgeonnement comme à la fusion, et lorsqu’une vésicule fusionne avec la membrane plasmique sa face luminale devient l’extérieur de la cellule ; l’orientation n’est jamais inversée, de sorte que ce qui a été glycosylé dedans se retrouve dehors.

Exercice 8.5 ★★

Dans le modèle du Théorème 8.4 avec $k_{1} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ et $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ , trouver quand le marqueur du Golgi passe par son maximum et combien il y en a au maximum ; puis la fraction présente dans les granules à $60\,\mathrm{min}$ .

Solution

Solution de Exercice 8.5.

$t^{*} = \ln(0.05/0.2)/(0.05 - 0.2) = \ln 4/0.15 = 9.2\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.2/(-0.15))(e^{-1.85} - e^{-0.46}) = 0.63$ . À $60\,\mathrm{min}$ , $A \approx 0$ , $B = 1.33\,(e^{-3} - e^{-12}) = 0.066$ , donc $C = 0.93$ .

Exercice 8.6 ★★

Une protéine membranaire a des tronçons hydrophobes de $22$ résidus aux positions 30, 90, 150 et 210 et un peptide signal amino-terminal. Dessiner ou décrire sa topologie : combien d’hélices, et de quel côté fait face chaque segment intermédiaire. Où peut-elle être glycosylée ?

Solution

Solution de Exercice 8.6.

Le peptide signal met l’extrémité aminée dans la lumière ; chaque tronçon hydrophobe est tour à tour un signal d’arrêt et un signal de reprise de transfert, de sorte qu’il y a quatre hélices transmembranaires (environ les résidus 30–52, 90–112, 150–172, 210–232). Segments : extrémité aminée luminale ; 52–90 cytosolique ; 112–150 luminale ; 172–210 cytosolique ; extrémité carboxylée luminale. Glycosylation sur les seuls segments luminaux — l’extrémité aminée, 112–150 et l’extrémité carboxylée — qui deviennent extracellulaires à la surface.

Exercice 8.7 ★★

À l’aide de la Proposition 8.11 avec $R = 30\,000$ , $k_{i} = 0.25\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ , calculer $J_{\max}$ et la fraction de récepteurs à la surface à saturation. Quel changement unique doublerait la capture ?

Solution

Solution de Exercice 8.7.

$J_{\max} = 30\,000\times 0.25\times 0.05/0.30 = 1250$ par minute ; fraction de surface $k_{r}/(k_{i} + k_{r}) = 0.05/0.30 = 0.17$ . Doubler $R$ double exactement $J$ ; c’est la vitesse de retour qui est le goulot (la plupart des récepteurs sont à l’intérieur), et doubler $k_{r}$ donnerait $30\,000\times 0.25 \times 0.1/0.35 \approx 2140$ , un facteur $1.7$ .

Exercice 8.8 ★★

Prévoir le sort des hydrolases lysosomales, et le phénotype, dans (a) une cellule dépourvue du récepteur du mannose-6-phosphate, (b) une cellule dépourvue de la phosphotransférase qui pose la marque, (c) une cellule traitée par un médicament qui neutralise le pH endosomal.

Solution

Solution de Exercice 8.8.

(a) Pas de récepteur : les hydrolases marquées suivent la voie par défaut et sont sécrétées ; les lysosomes manquent d’enzymes et se remplissent de matériel non digéré — une maladie de surcharge. (b) Pas de phosphotransférase : le même phénotype par une autre lésion (maladie des cellules à inclusions), les enzymes non marquées et sécrétées. (c) Endosomes neutralisés : le récepteur ne peut pas lâcher sa cargaison, il n’est donc pas recyclé et les hydrolases sont mal livrées ou sécrétées ; la LDL et d’autres récepteurs cessent aussi de tourner.

Exercice 8.9 ★★

La mutation JD du récepteur de la LDL change une tyrosine de la queue cytosolique. Des cellules qui fixent normalement la LDL ne parviennent pas à la capter. Expliquer le mécanisme, et prévoir où se trouvent les récepteurs à la surface de la cellule par rapport aux puits à manteau.

Solution

Solution de Exercice 8.9.

La tyrosine appartient au motif de la queue que reconnaît l’adaptateur de la clathrine ; sans elle le récepteur n’est pas rassemblé dans les puits à manteau. Les récepteurs fixent normalement la LDL mais sont répartis uniformément sur la surface, exclus des puits, et le ligand reste dehors — une maladie de l’adressage, non de la fixation.

Exercice 8.10 ★★★

Résoudre le modèle de marquage–chasse dans le cas $k_{1} = k_{2} = k$ (la formule du théorème y est singulière) : montrer que $B(t) = kt\,e^{-kt}$ et trouver le maximum. Expliquer ensuite pourquoi mesurer la seule fraction granulaire $C(t)$ ne permet pas de déterminer séparément les deux vitesses.

Solution

Solution de Exercice 8.10.

Avec $k_{1} = k_{2} = k$ , essayons $B = kt\,e^{-kt}$ : $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k e^{-kt} - k^{2}t e^{-kt} = kA - kB$ , comme il se doit, avec $B(0) = 0$ . Maximum là où $1 - kt = 0$ : $t^{*} = 1/k$ , $B = e^{-1} = 0.37$ . En général $C(t) = 1 - (k_{2}e^{-k_{1}t} - k_{1}e^{-k_{2}t})/(k_{2} - k_{1})$ , qui est symétrique en échangeant $k_{1}$ et $k_{2}$ : la seule courbe granulaire ne peut pas dire lequel des deux compartiments est le rapide.

Exercice 8.11 ★★★

Un fibroblaste internalise $1000$ vésicules à clathrine de $100\,\mathrm{nm}$ de diamètre par minute et possède une surface de $3000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Combien de temps pour internaliser l’équivalent de toute la surface ? Pourquoi la cellule ne rétrécit-elle pas, et qu’implique cet équilibre quant à la vitesse d’exocytose et au volume de liquide capté par heure ?

Solution

Solution de Exercice 8.11.

Chaque vésicule a pour aire $4\pi(50\,\text{nm})^{2} = 0.031\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; un millier par minute fait $31\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{min}$ , donc toute la surface en $3000/31 \approx 95\,\mathrm{min}$ . La cellule ne rétrécit pas parce que la membrane revient par exocytose (vésicules de recyclage) à la même vitesse — un équilibre de flux. Chaque vésicule contient $5\times 10^{-19}$ L ; un millier par minute pendant une heure fait $3\times 10^{-14}$ L, soit environ $1.5\,\%$ du volume d’une cellule de $2\,\mathrm{pL}$ par heure.

Exercice 8.12 ★★★

La toxine botulique clive une SNARE des terminaisons nerveuses motrices ; la toxine tétanique clive la même SNARE dans les interneurones inhibiteurs de la moelle épinière. Expliquer pourquoi la première cause une paralysie flasque et la seconde une paralysie spastique, et pourquoi une toxine qui bloque la fusion est utile en médecine à doses infimes.

Solution

Solution de Exercice 8.12.

La toxine botulique agit dans la terminaison motrice : aucune acétylcholine n’est libérée, le muscle ne reçoit aucun ordre et reste mou — paralysie flasque. La toxine tétanique est remontée le long de l’axone moteur puis passe dans les interneurones inhibiteurs qui retiennent normalement les motoneurones ; leur SNARE clivée, ni glycine ni GABA n’est libéré, les motoneurones déchargent sans frein et tous les muscles se contractent — paralysie spastique. Quelques nanogrammes de toxine botulique injectés dans un muscle trop actif le font taire localement pendant des mois (jusqu’à ce que de la SNARE neuve soit produite et que la terminaison récupère) : un traitement des dystonies, de la spasticité, du strabisme et des rides.

8.6 Problème : la journée d’une cellule pancréatique

Problème 8.1

Problème du week-end — le débit d’une cellule sécrétrice compté en molécules, en vésicules et en micromètres carrés, ses courbes de marquage–chasse résolues, la capture de cholestérol d’une cellule hépatique calculée par des récepteurs recyclés et un lysosome acidifié proton par proton, pour finir sur l’instant du maximum golgien, les vésicules qui bourgeonnent par minute et les particules de LDL captées par heure

Données : une cellule acineuse fabrique $10^{7}$ molécules d’enzyme par minute, de $25\,\mathrm{kDa}$ et $4\,\mathrm{nm}$ de diamètre chacune. Les vésicules de transport sont des sphères de $70\,\mathrm{nm}$ de diamètre ; un granule est une sphère de $1\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Aire membranaire par molécule de lipide $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ , deux feuillets. Le réticulum de la cellule a une aire de $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Marquage–chasse : $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ . Une cellule hépatique : $R = 50\,000$ récepteurs de LDL, $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $K_{d} = 2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ , concentration plasmatique des particules de LDL $2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ; $1500$ molécules de cholestérol par particule. Un lysosome : sphère de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , pH de $7.2$ à $4.7$ , capacité tampon telle qu’il faille pomper $50$ protons pour chacun qui reste libre ; une pompe à protons en déplace $200$ par seconde.

Partie I — Le débit.

Quelle masse d’enzyme la cellule fabrique-t-elle par minute, et par jour ? Comparer à son propre contenu en protéines, environ $300\,\mathrm{pg}$ .
Combien de molécules d’enzyme tiennent dans une vésicule si elles en remplissent $30\,\%$ du volume (sphère de $4\,\mathrm{nm}$ ) ? Combien de vésicules par minute quittent le réticulum ?
Quelle aire membranaire ces vésicules emportent-elles par minute, et en combien de temps consommeraient-elles tout le réticulum si rien ne revenait ?
Combien de molécules de lipide cela fait-il par minute ? Que doit faire la cellule pour garder son réticulum ?
Combien de molécules d’enzyme tiennent dans un granule au même tassement, et combien de granules la cellule remplit-elle par heure ?
Un repas vide $300$ granules en dix minutes par fusion avec la membrane apicale, en ajoutant leur membrane à une surface de $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . De quel facteur la surface apicale croît-elle, et que doit-il s’ensuivre ?

Partie II — La chronologie.

Avec les vitesses données, quand le marqueur du Golgi passe-t-il par son maximum, et quelle fraction s’y trouve ?
Quelle fraction d’une impulsion se trouve dans le réticulum, le Golgi et les granules à $30\,\mathrm{min}$ ?
Temps de séjour moyens dans les deux compartiments ? Quel est le temps total moyen de la synthèse au granule ?
Un médicament ralentit la sortie du Golgi à $k_{2} = 0.01\,\mathrm{min}^{-1}$ . Nouvel instant du maximum et nouvelle fraction maximale ; de quoi le Golgi a-t-il l’air au microscope ?
Expliquer pourquoi la fraction maximale golgienne est $k_{1}/k_{2}$ élevé à une puissance (donner la puissance) et donc toujours inférieure à $1$ .
Si l’étape du réticulum était bien plus rapide que celle du Golgi, vers quoi tendrait $B(t)$ ? Interpréter.

Partie III — Le cholestérol.

Calculer $\theta$ à la concentration plasmatique de LDL, et la capture $J$ en particules par minute et par heure.
Combien de molécules de cholestérol par heure ? Les membranes de la cellule en contiennent $5\times 10^{9}$ ; en combien de temps les remplacer toutes à partir de la seule LDL ?
Calculer la fraction de récepteurs à la surface, et le nombre d’allers-retours que fait chaque récepteur au cours de ses $20\,\mathrm{h}$ de vie.
Un hétérozygote a $R = 25\,000$ : recalculer $J$ . La LDL plasmatique monte jusqu’à ce que la capture égale la production : de quel facteur, si $\theta$ est bien en deçà de la saturation ?
Une statine double $R$ dans les cellules hépatiques de l’hétérozygote. Qu’advient-il de la LDL plasmatique, au même raisonnement ?
Expliquer pourquoi l’homozygote sans récepteur, dont la LDL plasmatique est cinq fois la normale, est plus mal loti encore que ne le suggère la seule arithmétique de la question 16.

Partie IV — L’acide.

Calculer le volume du lysosome en litres et le nombre de protons libres à pH $7.2$ et à pH $4.7$ .
Combien de protons faut-il pomper en tout, compte tenu du tampon ? Combien de temps cela prend-il avec $50$ pompes ?
La pompe fait entrer des protons contre le gradient. Quel problème électrique se pose, et comment est-il résolu (penser à un contre-ion) ?
Pourquoi les hydrolases ne sont-elles actives qu’à pH 5, et que cela protège-t-il ?
Pourquoi le récepteur de la LDL lâche-t-il la LDL à pH 6 alors que le récepteur du mannose-6-phosphate lâche sa cargaison au même pH — qu’ont forcément en commun les deux protéines ?
La chloroquine est une base faible qui traverse les membranes sous forme neutre et s’y trouve piégée une fois protonée. De quel facteur se concentre-t-elle dans un lysosome à pH $4.7$ par rapport au cytosol à pH $7.2$ (le rapport des concentrations en protons), et qu’est-ce que cela fait au lysosome ?
Résumer : l’instant du maximum golgien (question 7), les vésicules qui quittent le réticulum par minute (question 2) et les particules de LDL captées par heure (question 13).

Solution

Solution de Problème 8.1.

1. $10^{7}\times 25\,000\,\mathrm{Da}\times 1.66\times 10^{-24}$ g $= 0.42\,\mathrm{pg}$ par minute, $600\,\mathrm{pg}$ par jour — le double de son propre contenu en protéines. 2. Volume d’une vésicule $\tfrac{4}{3}\pi\,35^{3} = 1.8\times 10^{5}$ nm $^{3}$ , dont $30\,\%$ font $5.4\times 10^{4}$ ; une molécule d’enzyme $\tfrac{4}{3}\pi\,2^{3} = 34$ nm $^{3}$ : environ $1600$ molécules par vésicule ; $10^{7}/1600 \approx 6200$ vésicules par minute. 3. Aire $4\pi\,35^{2} = 0.0154\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ chacune, soit $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ par minute : les $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ du réticulum en une heure environ si rien ne revenait. 4. $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2} = 9.5\times 10^{7}$ nm $^{2}$ , deux feuillets à $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ : $2.7\times 10^{8}$ lipides par minute. La cellule ramène de la membrane par les vésicules COPI et le recyclage, et synthétise du lipide pour remplacer ce qui part définitivement dans les granules. 5. Volume d’un granule $5.2\times 10^{8}$ nm $^{3}$ , dont $30\,\%$ font $1.6\times 10^{8}$ : $4.7\times 10^{6}$ molécules par granule ; $6\times 10^{8}$ molécules par heure remplissent environ $130$ granules. 6. Chaque granule ajoute $\pi d^{2} = 3.1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; $300$ ajoutent $940\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ à $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ : un facteur vingt. La membrane doit être récupérée par une endocytose compensatrice en quelques minutes. 7. $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , $B = 0.50$ . 8. $A = e^{-3} = 0.05$ ; $B = 2(e^{-1.5} - e^{-3}) = 0.35$ ; $C = 0.60$ . 9. $10\,\mathrm{min}$ et $20\,\mathrm{min}$ ; total moyen $30\,\mathrm{min}$ . 10. $t^{*} = \ln(0.1)/(-0.09) = 25.6\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.1/(-0.09))(e^{-2.56} - e^{-0.256}) = 0.77$ : le Golgi enfle, gorgé des trois quarts de la cargaison. 11. Au maximum $k_{1}e^{-k_{1}t^{*}} = k_{2}e^{-k_{2}t^{*}}$ ; en reportant dans $B$ on obtient $B_{\max} = (k_{1}/k_{2})^{\,k_{2}/(k_{2} - k_{1})}$ : la puissance est $k_{2}/(k_{2} - k_{1})$ . Pour $k_{1} > k_{2}$ l’exposant est négatif et la base supérieure à $1$ ; pour $k_{1} < k_{2}$ la base est inférieure à $1$ et l’exposant positif — dans les deux cas la valeur est inférieure à $1$ (vérification : $2^{-1} = 0.5$ ici). 12. Pour $k_{1} \gg k_{2}$ , $B(t) \to e^{-k_{2}t}$ : le marqueur est dans le Golgi d’emblée et en sort à $k_{2}$ — l’étape du réticulum est invisible et la courbe golgienne est une simple décroissance. 13. $\theta = 2/(2+2) = 0.5$ ; $J = 50\,000\times 0.2\times 0.1\times 0.5/(0.1 + 0.1) = 2500$ particules par minute, $150\,000$ par heure. 14. $1.5\times 10^{5}\times 1500 = 2.3\times 10^{8}$ molécules de cholestérol par heure ; $5\times 10^{9}/2.3\times 10^{8} \approx 22$ heures. 15. Fraction de surface $k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta) = 0.5$ ; un aller-retour prend $1/(k_{i}\theta) + 1/k_{r} = 10 + 10 = 20\,\mathrm{min}$ : environ $60$ voyages en vingt heures. 16. $J = 1250$ par minute. En deçà de la saturation $J \propto R\,[L]$ , de sorte qu’avec la moitié des récepteurs la LDL plasmatique doit doubler pour la même épuration. 17. $R$ revenu à $50\,000$ : l’épuration est rétablie, la LDL plasmatique retombe vers la normale — l’effet des statines. 18. Sans récepteurs, la LDL n’est épurée que par des voies non spécifiques et lentes, de sorte qu’elle circule des jours au lieu d’heures, s’oxyde, et est captée par les récepteurs éboueurs des macrophages, qui deviennent les cellules spumeuses des plaques d’athérome ; et les statines, qui agissent en induisant des récepteurs, n’ont rien à induire. 19. $V = \tfrac{4}{3}\pi(0.25)^{3} = 0.065\,\text{µ}\mathrm{m}^{3} = 6.5\times 10^{-17}$ L. À pH $7.2$ : $6.3\times 10^{-8}\times 6.5\times 10^{-17} = 4\times 10^{-24}$ mol — environ $2$ protons libres. À pH $4.7$ : $2\times 10^{-5}\times 6.5\times 10^{-17} = 1.3\times 10^{-21}$ mol, soit environ $780$ . 20. $50\times 780 \approx 39\,000$ protons ; $50$ pompes à $200$ par seconde en déplacent $10\,000$ par seconde : environ $4\,\mathrm{s}$ . 21. Faire entrer de la charge positive rend la lumière positive, et quelques milliers de charges arrêteraient la pompe ; du chlorure entre par un canal (ou des cations sortent) pour neutraliser la charge. 22. Des enzymes inactives à pH neutre ne font aucun mal si un lysosome fuit ou si elles sont mal adressées au cytosol ou à la surface : l’exigence d’acidité confine la digestion au compartiment bâti pour elle. 23. Les deux doivent porter un capteur de pH — des histidines, dont la protonation vers pH 6 change la surface de fixation : le récepteur de la LDL rabat un domaine sur son propre site de fixation une fois protoné, le récepteur du mannose-6-phosphate perd son affinité de la même façon. 24. $10^{7.2 - 4.7} = 10^{2.5} \approx 300$ fois plus concentrée ; la base piégée consomme des protons, élève le pH lysosomal et inactive les hydrolases — c’est ainsi que la chloroquine tue le parasite du paludisme dans sa vacuole digestive et qu’elle bloque l’autophagie dans les expériences. 25. Maximum golgien à $14\,\mathrm{min}$ ; quelque $6200$ vésicules quittent le réticulum par minute ; $150\,000$ particules de LDL captées par heure.

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