Biologie universitaire — 3e année · Bachelor Year 3

6Génie génétique et biotechnologies

Jusqu’en 1982, tout diabétique du monde était maintenu en vie par de l’insuline extraite du pancréas de porcs et de bovins — quelque huit mille kilogrammes de glandes pour un kilogramme d’hormone — et une fraction des patients réagissait contre la protéine étrangère. Cette année-là, le premier médicament produit par un organisme génétiquement modifié arrivait sur le marché : de l’insuline humaine, synthétisée par Escherichia coli portant le gène humain sur un plasmide. Les outils qui l’avaient rendue possible avaient été rassemblés au cours de la décennie précédente — des enzymes qui coupent l’ADN à des séquences choisies, des enzymes qui recollent les morceaux, des plasmides qui les emportent dans une cellule et les y recopient — et les décennies suivantes y ont ajouté la réaction de polymérisation en chaîne, l’injection de gènes dans des embryons et, depuis 2012, un système immunitaire bactérien transformé en ciseaux programmables capables de réécrire une lettre d’un génome dans une cellule vivante. Ce chapitre traite de ces outils, de l’arithmétique qui gouverne leur emploi, et de ce qu’on a bâti avec eux, d’une souris luminescente à la guérison de la drépanocytose.

6.1 Couper, recoller et recopier l’ADN

Définition 6.1 (Enzymes de restriction, ligase et vecteurs)

Une enzyme de restriction de type II est une endonucléase bactérienne qui coupe l’ADN double brin à une séquence précise de $4\text{ à }8$ paires de bases, le plus souvent palindromique : EcoRI coupe G $^{\downarrow}$ AATTC, laissant des extrémités simple brin sortantes de quatre bases (des extrémités cohésives) complémentaires de toute autre extrémité EcoRI ; d’autres enzymes laissent des extrémités franches. L’ADN ligase scelle deux fragments dont les extrémités s’ajustent. Un vecteur est une molécule d’ADN qui se réplique dans un hôte et peut porter un fragment inséré : un plasmide de quelques kilobases muni d’une origine de réplication, d’un marqueur de sélection (un gène de résistance à un antibiotique, de sorte que seules les cellules ayant capté le plasmide poussent sur l’antibiotique) et d’un groupe de sites de restriction uniques pour l’insert ; le bactériophage $\lambda$ , les cosmides, et les chromosomes artificiels bactériens ou de levure pour des inserts de $20\text{ à }1000\,\mathrm{kb}$ . L’ADN entre dans une bactérie par transformation, après un choc chimique ou électrique qui rend la membrane transitoirement perméable, avec une efficacité de $10^{6}$ à $10^{9}$ transformants par microgramme de plasmide. Une molécule recombinante est une molécule qui réunit de l’ADN de deux provenances.

Faits expérimentaux. Cohen, Chang, Boyer et Helling (1973) ont coupé par EcoRI le plasmide pSC101 et un second plasmide portant un autre gène de résistance, mélangé et ligaturé les fragments, transformé E. coli et obtenu des colonies résistantes aux deux antibiotiques, porteuses d’un unique plasmide fait des deux — le premier ADN recombinant à se répliquer dans une cellule. L’année suivante ils ont inséré dans pSC101 des gènes d’ARN ribosomique de crapaud et montré que cet ADN d’amphibien était répliqué, et transcrit, dans la bactérie : les gènes franchissent la frontière entre règnes sans changer, et une bactérie recopie l’ADN qu’on lui donne, quel qu’il soit. ∎

Un vecteur de clonage et sa chimie. Le plasmide porte une origine, un marqueur de sélection et un site de restriction unique dans lequel on ligature un fragment coupé par la même enzyme ; les extrémités cohésives rendent compatibles deux fragments quelconques coupés par la même enzyme.

Méthode 6.2 (Cloner un gène)

(1) Se procurer l’insert : couper l’ADN génomique par une enzyme de restriction, ou recopier un ARN messager en ADN complémentaire (ADNc, dépourvu d’introns et donc exprimable dans une bactérie), ou amplifier le gène par PCR avec des amorces portant des sites de restriction. (2) Couper le vecteur et l’insert par la ou les mêmes enzymes — deux enzymes différentes imposent l’orientation de l’insert — et ligaturer. (3) Transformer des bactéries et les étaler sur l’antibiotique : seules les cellules munies d’un plasmide poussent. (4) Distinguer les plasmides porteurs d’un insert de ceux qui se sont refermés sur eux-mêmes : un gène marqueur interrompu par le site de clonage (lacZ : les colonies blanches ont un insert, les bleues non). (5) Cribler les colonies pour l’insert voulu : par hybridation avec une sonde marquée, par PCR, ou par digestion de restriction et électrophorèse en gel. (6) Séquencer l’insert. Une banque est l’ensemble des clones issus d’un génome ou d’un transcriptome entier, dans lequel on pêche n’importe quel gène par le même criblage.

Un gel d’agarose sous lumière ultraviolette : les fragments d’ADN migrent vers l’anode à une vitesse qui décroît avec leur longueur, de sorte que chaque bande est une population de molécules d’une même taille, comparée à l’échelle de tailles connues des pistes extérieures.

Définition 6.3 (La réaction de polymérisation en chaîne)

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) amplifie un tronçon d’ADN choisi entre deux amorces — oligonucléotides de synthèse d’une vingtaine de bases, complémentaires des deux brins aux extrémités de la cible — par des cycles de trois températures : $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ pour séparer les brins, $50\text{ à }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ pour que les amorces s’apparient, $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ pour qu’une polymérase thermostable (la Taq, tirée de la bactérie des sources chaudes Thermus aquaticus) les prolonge. Chaque cycle double le nombre de copies du segment compris entre les amorces, de sorte que trente cycles font d’une molécule unique un milliard. La PCR après transcription inverse recopie d’abord l’ARN en ADN et mesure donc des transcrits ou des virus à ARN ; la PCR quantitative (qPCR) suit l’amplification en temps réel grâce à un colorant fluorescent et lit la quantité de départ au cycle où le signal franchit un seuil.

Théorème 6.4 (L’arithmétique de l’amplification)

Avec une efficacité $E$ par cycle ( $E = 1$ pour un doublement parfait), $N_{0}$ copies de départ deviennent

N_{n} = N_{0}\,(1 + E)^{n}

après $n$ cycles. Si la fluorescence franchit un seuil fixe lorsque le nombre de copies atteint $N_{T}$ , le cycle seuil vaut

C_{T} = \frac{\log N_{T} - \log N_{0}}{\log(1 + E)},

droite en $\log N_{0}$ de pente $-1/\log(1+E)$ : pour $E = 1$ , chaque augmentation d’un facteur dix de la quantité de départ abaisse $C_{T}$ de $\log_{2} 10 = 3.32$ cycles, et deux échantillons dont les cycles seuils diffèrent de $\Delta C_{T}$ diffèrent en copies de départ du facteur $(1 + E)^{\Delta C_{T}}$ .

Démonstration. Chaque cycle multiplie le nombre de copies par $1 + E$ , donc $N_{n}$ est une suite géométrique. En posant $N_{n} = N_{T}$ et en résolvant en $n$ on obtient $C_{T}$ ; la pente est le coefficient de $\log N_{0}$ . Pour deux échantillons, $C_{T,1} - C_{T,2} = (\log N_{0,2} - \log N_{0,1})/\log(1+E)$ , d’où $N_{0,2}/N_{0,1} = (1+E)^{\Delta C_{T}}$ . ∎

Exemple 6.5 (Lire une plaque de qPCR)

Un test d’ARN viral franchit le seuil au cycle $22$ chez un patient et au cycle $32$ chez un autre ; avec $E \approx 1$ le premier porte $2^{10} \approx 1000$ fois plus de virus. Un échantillon de dix copies franchit le seuil vers le cycle $37$ quand celui-ci vaut $10^{12}$ copies ( $\log_{2} 10^{11} = 36.5$ ) ; une course de $40$ cycles détecte donc quelques molécules — et une seule molécule contaminante d’un amplicon antérieur aussi, ce qui explique que les laboratoires séparent les salles où l’on prépare une PCR de celles où l’on manipule les produits.

Courbes d’amplification pour N_0 = 107 (bleu), 104 (rouge) et 10 copies (vert), E = 1, avec le plateau qu’imposent les réactifs. Une différence d’un facteur mille sur N_0 décale le cycle seuil de 10 ; les plateaux se ressemblent tous, ce qui explique que le produit final ne dise rien du départ. — Courbes d’amplification pour $N_{0} = 10^{7}$ (bleu), $10^{4}$ (rouge) et $10$ copies (vert), $E = 1$ , avec le plateau qu’imposent les réactifs. Une différence d’un facteur mille sur $N_{0}$ décale le cycle seuil de $10$ ; les plateaux se ressemblent tous, ce qui explique que le produit final ne dise rien du départ.

6.2 Fabriquer des protéines

Définition 6.6 (Systèmes d’expression)

Un vecteur d’expression place la séquence codante clonée sous un promoteur fort et contrôlable de l’hôte (le promoteur lac ou T7 chez E. coli, induit par un analogue de sucre), avec un site de fixation du ribosome, un terminateur, et souvent une étiquette — six histidines, une petite protéine — fusionnée au produit pour sa purification sur colonne. Les bactéries fabriquent des grammes par litre d’une protéine simple (insuline, hormone de croissance, enzymes) mais ne savent ni glycosyler ni replier les protéines complexes de mammifère ; la levure ajoute des sucres qui lui sont propres ; les cellules d’insecte et de mammifère (les cellules d’ovaire de hamster chinois sont la norme industrielle) fabriquent des anticorps et des facteurs de coagulation repliés et glycosylés comme chez l’homme. Un anticorps monoclonal est produit par un hybridome — un lymphocyte B producteur d’anticorps fusionné à une cellule de myélome immortelle (Köhler et Milstein, 1975) — ou, aujourd’hui, en clonant les gènes de l’anticorps dans une lignée d’expression de mammifère, où la charpente murine peut être remplacée par de la séquence humaine pour éviter le rejet immunitaire (Chapitre 16).

Exemple 6.7 (L’insuline)

L’insuline humaine est faite de deux chaînes, A (21 résidus) et B (30), unies par des ponts disulfure et découpées dans la cellule $\beta$ à partir d’un unique précurseur, la proinsuline. Le premier procédé exprimait les deux chaînes séparément chez E. coli, chacune fusionnée à la $\beta$ -galactosidase, les en détachait chimiquement et les unissait in vitro ; les procédés ultérieurs expriment la proinsuline et la clivent par les enzymes qu’emploie le pancréas. Depuis 1996 la séquence elle-même est modifiée : échanger ou ajouter un résidu ou deux donne des analogues qui se dissocient plus vite (pour un repas) ou précipitent au point d’injection et se libèrent sur une journée. Une protéine qui coûtait huit tonnes de glandes par kilogramme se fabrique aujourd’hui dans un fermenteur, identique à l’humaine ou meilleure qu’elle.

6.3 Organismes transgéniques

Définition 6.8 (Transgenèse et ciblage de gènes)

Un organisme transgénique porte un gène introduit dans sa lignée germinale, de sorte que toutes ses cellules l’ont et qu’il est hérité. Chez la souris la voie classique est la microinjection de l’ADN dans un pronucléus d’un œuf fécondé (Gordon et Ruddle, 1980), qui l’intègre en un site au hasard chez une fraction des embryons ; Palmiter et Brinster (1982) ont obtenu des souris de taille double en injectant le gène de l’hormone de croissance de rat derrière un promoteur de métallothionéine. Le ciblage de gènes remplace ou interrompt plutôt un gène choisi : une construction munie de longs bras homologues de la cible est introduite dans des cellules souches embryonnaires, les rares cellules où la recombinaison homologue l’a mise au bon endroit sont sélectionnées et injectées dans un blastocyste, et la souris chimère qui en résulte transmet le gène modifié (Capecchi, Smithies et Evans, années 1980). Un knock-out n’a plus le gène ; un knock-in en porte une version modifiée ; un allèle conditionnel, encadré de sites loxP, n’est supprimé que là et quand Cre est exprimée (Chapitre 3). Une dizaine de milliers de gènes de souris ont été invalidés, et pour la plupart le phénotype a été le premier indice de ce que fait le gène.

À gauche : un œuf de souris fécondé, maintenu par aspiration pendant qu’une aiguille de verre injecte de l’ADN dans un pronucléus. À droite : une souris transgénique exprimant dans chaque cellule la protéine fluorescente verte d’une méduse, à côté d’une sœur de portée ordinaire, sous lumière ultraviolette.

Définition 6.9 (Plantes transgéniques)

Les plantes sont transformées par Agrobacterium tumefaciens, bactérie du sol qui insère naturellement un segment de son plasmide inducteur de tumeur, l’ADN-T, dans le génome d’une plante blessée pour lui faire produire une galle qui la nourrit. Remplacer les gènes propres de l’ADN-T par le gène de son choix, entre les séquences de bordure que la bactérie reconnaît, fait du pathogène un vecteur ; les cellules transformées sont sélectionnées puis régénérées en plantes entières, ce que sait faire toute cellule végétale. Les espèces que la bactérie n’infecte pas (les céréales, longtemps) sont transformées en tirant dans le tissu des particules d’or enrobées d’ADN. Les cultures génétiquement modifiées exploitées à grande échelle portent un gène de toxine bactérienne (Bt) contre les larves d’insectes, ou une enzyme bactérienne conférant la tolérance à un herbicide, ou les deux ; le riz doré porte deux gènes de la voie des caroténoïdes (une phytoène synthase végétale et une désaturase bactérienne) de sorte que son albumen fabrique du $\beta$ -carotène, précurseur de la vitamine A, dont la carence rend aveugle et tue plusieurs centaines de milliers d’enfants par an.

Du riz ordinaire et du riz doré. Le grain jaune fabrique du -carotène dans son albumen grâce à deux gènes ajoutés de la voie des caroténoïdes. À droite : les deux riz comparés à l’Institut international de recherche sur le riz (IRRI, CC BY 2.0). — Du riz ordinaire et du riz doré. Le grain jaune fabrique du $\beta$ -carotène dans son albumen grâce à deux gènes ajoutés de la voie des caroténoïdes. À droite : les deux riz comparés à l’Institut international de recherche sur le riz (IRRI, CC BY 2.0).

Remarque 6.10 (Le débat)

Trente ans de culture sur des centaines de millions d’hectares, et toutes les revues systématiques des académies scientifiques, n’ont trouvé aux cultures transgéniques autorisées aucun effet sanitaire qui les distingue de leurs équivalents conventionnels ; le transgène est un gène de plus parmi quarante mille, et la protéine qu’il fabrique est testée comme l’est tout additif alimentaire. Les vraies questions sont écologiques et économiques : l’installation de résistances chez les ravageurs et les adventices sous une sélection uniforme, le flux de gènes vers les parents sauvages, la concentration du marché des semences, et à qui profite l’affaire. Ce sont les questions que pose toute technique agricole puissante, et les réponses dépendent du caractère et du contexte, non de la méthode par laquelle le gène a été déplacé.

6.4 Éditer les génomes

Définition 6.11 (CRISPR–Cas9)

Les bactéries conservent dans un réseau de répétitions (CRISPR) des fragments des génomes de phages qui ont infecté leurs ancêtres, les transcrivent en courts ARN guides et s’en servent pour diriger une nucléase sur tout ADN correspondant qui entre dans la cellule : un système immunitaire adaptatif doté d’une mémoire génétique. Chez Streptococcus pyogenes la nucléase est la protéine unique Cas9, qui fixe un ARN guide et un second petit ARN, cherche dans l’ADN un motif adjacent au protospaceur de trois bases (PAM, 5 $'$ -NGG), déroule l’ADN voisin et, si les vingt bases qui jouxtent le PAM s’apparient au guide, coupe les deux brins à trois bases du PAM. Jinek, Charpentier, Doudna et leurs collègues (2012) ont fusionné les deux ARN en un unique ARN guide simple et montré que Cas9, munie d’un guide de séquence quelconque, coupe l’ADN à cette séquence dans un tube à essai ; en un an on avait montré que le couple fonctionne dans des cellules humaines, murines, de poisson-zèbre, de plante et de levure. L’édition du génome est ce que la cellule fait de la coupure : la jonction d’extrémités laisse une petite insertion ou délétion qui interrompt le gène (une invalidation en une étape, chez n’importe quel organisme, en quelques semaines), et la recombinaison homologue avec une matrice fournie y écrit une séquence choisie.

Cas9 et son guide. La protéine se fixe à un PAM, déroule l’ADN qui le jouxte et coupe si les vingt bases s’apparient à l’ARN guide. La cassure est réparée soit par jonction d’extrémités, qui interrompt le gène, soit par recombinaison avec une matrice, qui le réécrit.

Proposition 6.12 (Éditer sans cassure)

Couper les deux brins est l’édition la plus grossière : l’issue de la jonction d’extrémités est aléatoire, et une cassure ailleurs — à un site hors cible qui diffère du guide en quelques positions, ce que Cas9 tolère — est une mutation dont personne n’a voulu. Une Cas9 dont un domaine nucléase est inactivé n’entaille qu’un brin ; les deux inactivés, elle se contente de se fixer et peut porter d’autres enzymes jusqu’à une séquence. Les éditeurs de bases fusionnent une Cas9 entaillante à une désaminase qui convertit C en U (lu T) ou A en I (lu G) dans le brin déroulé, changeant une base sans cassure ni matrice ; les éditeurs prime portent une transcriptase inverse et un guide prolongé par la séquence désirée, et recopient cette séquence dans le brin entaillé, ce qui autorise toute substitution ainsi que de petites insertions ou délétions. L’activité hors cible se réduit par des variantes de Cas9 de haute fidélité, en apportant l’enzyme brièvement sous forme de protéine plutôt que de gène, et en choisissant des guides dont les plus proches parents génomiques diffèrent en plusieurs positions ; elle se mesure en séquençant les sites prédits et par des méthodes non biaisées qui attrapent toute cassure du génome.

Exemple 6.13 (Une guérison)

La drépanocytose est un changement d’une seule base de la $\beta$ -globine. L’hémoglobine fœtale, faite de $\gamma$ -globine, y suppléerait, mais les gènes $\gamma$ sont éteints après la naissance par le répresseur BCL11A. La première thérapie CRISPR autorisée (2023) prélève les cellules souches sanguines du patient, coupe par Cas9 l’amplificateur érythroïde de BCL11A de sorte que la jonction d’extrémités le désactive dans la plupart des cellules, et rend les cellules après que la moelle du patient a été vidée : les globules rouges qu’elles produisent sont riches en hémoglobine fœtale, ne falciforment pas, et les crises cessent. L’édition est somatique — la lignée germinale n’est pas touchée et le changement ne s’hérite pas — et elle emploie l’issue « grossière », l’interruption, là où l’interruption est ce que l’on veut.

Théorème 6.14 (Propagation supra-mendélienne d’un forçage génétique)

Un forçage génétique est une construction codant Cas9 et un guide qui coupe l’allèle sauvage à son propre locus chez un hétérozygote ; la réparation par recombinaison recopie le forçage dans le chromosome coupé, de sorte qu’une fraction $c$ des gamètes de l’hétérozygote porte le forçage au lieu de la moitié mendélienne. Si le forçage a la fréquence $p$ dans une grande population à panmixie et n’entraîne aucun coût de valeur sélective, sa fréquence à la génération suivante vaut

p' = p + c\,p\,(1 - p),

de sorte qu’il se propage depuis la rareté à une vitesse proportionnelle à $c$ , et atteint la moitié de la population en environ $\ln(1/p_{0})/\ln(1 + c)$ générations à partir d’une fréquence initiale $p_{0}$ .

Démonstration. La panmixie donne des homozygotes pour le forçage à la fréquence $p^{2}$ , des hétérozygotes à $2p(1-p)$ , des homozygotes sauvages à $(1-p)^{2}$ . Les homozygotes transmettent le forçage à tous leurs gamètes, les hétérozygotes à une fraction $(1 + c)/2$ (la moitié par Mendel, plus $c$ fois la moitié sauvage convertie), les sauvages à aucun. D’où $p' = p^{2} + 2p(1-p)(1+c)/2 = p^{2} + p(1-p) + c\,p(1-p) = p + c\,p(1-p)$ . Pour $p$ petit cela vaut $p' \approx (1+c)p$ , une croissance géométrique de raison $1 + c$ , qui atteint $1/2$ depuis $p_{0}$ après environ $\ln(1/2p_{0})/\ln(1+c)$ générations ; le terme logistique ne la ralentit qu’à la toute fin. ∎

Un forçage génétique lâché à un pour cent, avec une efficacité de conversion de 0.9 ou de 0.5 et sans coût de valeur sélective. Un allèle mendélien sans avantage resterait à un pour cent ; le forçage s’impose en dix ou vingt générations. — Un forçage génétique lâché à un pour cent, avec une efficacité de conversion de $0.9$ ou de $0.5$ et sans coût de valeur sélective. Un allèle mendélien sans avantage resterait à un pour cent ; le forçage s’impose en dix ou vingt générations.

Remarque 6.15 (Ce qu’il est permis d’éditer)

Éditer les cellules somatiques d’un patient consentant est de la médecine, jugée comme tout traitement à ses risques et à ses bénéfices. Éditer la lignée germinale — un embryon, dont toute la descendance porterait le changement — est d’une autre nature : la personne concernée ne peut pas consentir, le changement est hérité, et les issues hors cible et en mosaïque de la technique ne sont pas encore maîtrisées ; après qu’un scientifique chinois eut annoncé en 2018 l’avoir fait sur des jumelles, les académies scientifiques de la plupart des pays ont réclamé un moratoire et plusieurs États en ont fait un délit. Un forçage génétique lâché dans une population sauvage est une décision prise pour tout le monde en aval, ce qui explique que les propositions du domaine lui-même pour éliminer les moustiques du paludisme couplent les forçages à des sécurités — forçages d’annulation, conceptions autolimitées — et au consentement public des pays concernés.

6.5 Exercices

Exercice 6.1 ★

Énumérer les trois éléments que doit posséder un plasmide de clonage et expliquer à quoi sert chacun.

Solution

Solution de Exercice 6.1.

Une origine de réplication, pour que l’hôte recopie le plasmide et le transmette à ses cellules filles ; un marqueur de sélection, d’ordinaire une résistance à un antibiotique, pour que seules les cellules porteuses du plasmide poussent ; et un site de restriction unique (ou un groupe de sites) où l’insert est ligaturé sans couper le plasmide ailleurs.

Exercice 6.2 ★

EcoRI reconnaît GAATTC. À quelle fréquence le site apparaît-il, en moyenne, dans un ADN aléatoire, et combien de fragments fait-il du génome d’E. coli de $4.6\,\mathrm{Mb}$ ? Pourquoi le nombre réel diffère-t-il quelque peu ?

Solution

Solution de Exercice 6.2.

Une séquence donnée de six bases apparaît une fois tous les $4^{6} = 4096$ bp dans un ADN aléatoire : environ $4.6\times 10^{6}/4096 \approx 1100$ fragments de $4.1\,\mathrm{kb}$ en moyenne. Les génomes réels ne sont pas aléatoires — la composition en bases, l’usage des codons et l’évitement de certaines séquences déplacent le compte (le nombre réel de sites EcoRI chez E. coli est de quelques centaines).

Exercice 6.3 ★

Énoncer les trois paliers de température d’un cycle de PCR et ce qui se passe à chacun. Pourquoi la polymérase doit-elle être thermostable ?

Solution

Solution de Exercice 6.3.

La dénaturation à $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ sépare les brins ; l’appariement à $50\text{ à }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ laisse les amorces s’apparier à leurs sites ; l’élongation à $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ laisse la polymérase copier depuis chaque amorce. Une polymérase ordinaire serait détruite à $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ dès le premier cycle et devrait être ajoutée à neuf trente fois ; la Taq survit à tous les cycles.

Exercice 6.4 ★

De quoi Cas9 a-t-elle besoin pour couper une séquence donnée, et quelles deux issues peuvent suivre la coupure ?

Solution

Solution de Exercice 6.4.

Un ARN guide dont les vingt bases correspondent à la cible, et un PAM (NGG) immédiatement en 3 $'$ de la cible sur le brin non ciblé. Après la cassure double brin : la jonction d’extrémités, qui laisse une petite insertion ou délétion et détruit en général le cadre de lecture du gène ; ou la recombinaison homologue avec une matrice portant la séquence désirée, qui l’y écrit.

Exercice 6.5 ★★

Une PCR fait $35$ cycles à l’efficacité $E = 0.9$ à partir de $50$ copies. Combien de copies en résultent ? Une qPCR de deux échantillons donne $C_{T} = 18.2$ et $25.5$ ; avec $E = 0.95$ , quel est le rapport de leurs quantités de départ ?

Solution

Solution de Exercice 6.5.

$50\times 1.9^{35} = 50\times 5.7\times 10^{9} \approx 3\times 10^{11}$ copies. $\Delta C_{T} = 7.3$ ; rapport $1.95^{7.3} = e^{7.3\ln 1.95} \approx 130$ : le premier échantillon avait environ $130$ fois plus de matrice.

Exercice 6.6 ★★

Pourquoi emploie-t-on une banque d’ADNc, et non une banque génomique, pour exprimer une protéine humaine dans une bactérie ? Nommer deux autres obstacles à la production d’une protéine humaine chez E. coli et dire comment on surmonte chacun.

Solution

Solution de Exercice 6.6.

Les bactéries ne savent pas épisser : une copie génomique avec ses introns serait transcrite en un message inutilisable, on emploie donc l’ADNc sans intron, recopié sur l’ARNm mature. Autres obstacles : le promoteur humain n’est pas reconnu par la polymérase bactérienne (fournir un promoteur bactérien et un site de fixation du ribosome) ; l’usage des codons humains diffère (synthétiser le gène avec les codons préférés de l’hôte) ; la protéine peut ne pas se replier ou s’agréger (abaisser la température, la fusionner à un partenaire soluble, ou la replier depuis les corps d’inclusion) ; la glycosylation manque (employer la levure ou des cellules de mammifère si elle compte) ; les ponts disulfure exigent le périplasme oxydant.

Exercice 6.7 ★★

On fabrique une souris knock-out par ciblage de gènes dans des cellules souches embryonnaires. Expliquer pourquoi la première souris née est une chimère, pourquoi il faut la croiser, et quelle fraction des petits-enfants d’une chimère dont la lignée germinale est à moitié ciblée sont homozygotes knock-out si l’on intercroise des grands-parents hétérozygotes.

Solution

Solution de Exercice 6.7.

Les cellules souches ciblées sont injectées dans un blastocyste hôte et se mêlent à ses propres cellules, de sorte que la souris est bâtie de deux génotypes — une chimère — et elle ne transmet l’allèle que si une partie de ses cellules germinales dérive des cellules ciblées. Croiser la chimère avec une souris sauvage donne des hétérozygotes (à partir de la moitié de ses gamètes si la lignée germinale est à moitié ciblée) ; l’intercroisement d’hétérozygotes donne un quart d’homozygotes knock-out.

Exercice 6.8 ★★

On choisit un ARN guide de 20 bases avec un PAM NGG. Combien de sites d’un génome de $3.2\times 10^{9}$ bp (les deux brins) correspondent exactement au guide par hasard ? Combien y correspondent à deux mésappariements près, si Cas9 les tolère ? (Compter les séquences à deux mésappariements près comme $1 + 3\binom{20}{1} + 9\binom{20}{2}$ .)

Solution

Solution de Exercice 6.8.

Exact : $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}\times (1/16) \approx 4\times 10^{-4}$ site (le GG du PAM coûte un facteur $16$ ) — aucun, en pratique. À deux mésappariements près il y a $1 + 60 + 1710 = 1771$ séquences : $1771\times 4\times 10^{-4} \approx 0.7$ site fortuit. Le génome réel n’est pas aléatoire, et l’on vérifie un guide contre lui directement.

Exercice 6.9 ★★

À l’aide du Théorème 6.14, calculer la fréquence d’un forçage de $c = 0.8$ après trois générations à partir de $p_{0} = 0.05$ , et estimer le nombre de générations pour atteindre $0.5$ .

Solution

Solution de Exercice 6.9.

$p_{1} = 0.05 + 0.8\times 0.05\times 0.95 = 0.088$ ; $p_{2} = 0.152$ ; $p_{3} = 0.255$ ; puis $0.41$ , $0.60$ : environ cinq générations pour dépasser $0.5$ , contre l’estimation $\ln(1/(2\times 0.05))/\ln 1.8 \approx 4$ .

Exercice 6.10 ★★★

La thérapie de la drépanocytose interrompt un amplificateur au lieu de corriger la mutation de la $\beta$ -globine. Donner deux raisons pour lesquelles l’interruption par jonction d’extrémités a été préférée à la correction par recombinaison homologue dans des cellules souches sanguines, et un inconvénient.

Solution

Solution de Exercice 6.10.

La jonction d’extrémités agit dans toute cellule, y compris les cellules souches quiescentes où la recombinaison homologue, propre aux phases S et G2, est inefficace ; elle n’exige la livraison d’aucune matrice et son produit — n’importe quelle interruption de l’amplificateur — fait l’affaire, alors que la correction exige la séquence exacte et ne réussit que dans une minorité de cellules. De plus, la même édition vaut pour toute mutation de la $\beta$ -globine, drépanocytaire ou thalassémique. Inconvénient : elle supprime un élément régulateur (avec tous les autres rôles qu’il peut avoir), elle laisse l’allèle drépanocytaire en place, et le mélange d’insertions et de délétions n’est pas maîtrisé.

Exercice 6.11 ★★★

Un forçage génétique dirigé contre un moustique entraîne un coût de valeur sélective $s$ chez les homozygotes. Modifier la récurrence pour y inclure la sélection contre les homozygotes porteurs du forçage et trouver la condition sur $c$ et $s$ pour que le forçage se propage depuis la rareté. Expliquer ensuite pourquoi les allèles de résistance — produits de jonction d’extrémités à la cible, que le guide ne reconnaît plus — sont en pratique le principal obstacle.

Solution

Solution de Exercice 6.11.

Avec une valeur sélective $1 - s$ chez l’homozygote : $p' = \bigl[p^{2}(1-s) + p(1-p)(1+c) \bigr]/(1 - sp^{2})$ . Depuis la rareté les homozygotes sont négligeables et le forçage croît comme $(1+c)p$ quel que soit $s$ ; sa fixation se décide près de $p = 1$ , où un allèle sauvage rare de fréquence $q$ revient comme $q' \approx q(1-c)/(1-s)$ : fixation si $c > s$ , équilibre intermédiaire sinon. Résistance : chaque conversion manquée (jonction d’extrémités au lieu de recombinaison) laisse un allèle que le guide ne reconnaît plus ; si de tels allèles ne coûtent rien — une insertion ou délétion en phase dans une région non essentielle — ils n’ont aucun coût là où le forçage en a un, de sorte que la sélection les favorise et qu’ils le remplacent. Les remèdes sont de viser des séquences essentielles où toute insertion ou délétion est létale, et d’employer plusieurs guides à la fois.

Exercice 6.12 ★★★

Soutenir, avec les mécanismes de ce chapitre et du Chapitre 3, que l’édition germinale d’un embryon humain ne peut pas aujourd’hui garantir l’issue voulue dans chaque cellule, et dire quelles preuves seraient nécessaires avant qu’une personne raisonnable puisse la juger sûre.

Solution

Solution de Exercice 6.12.

Une Cas9 injectée dans un zygote peut agir après les premières divisions, de sorte que des cellules différentes reçoivent des réparations différentes — le mosaïcisme ; la réparation de chaque cassure est choisie par la cellule, la jonction d’extrémités donnant des insertions et délétions imprévisibles, de grandes délétions ou une perte d’hétérozygotie au point de coupure ; l’issue par recombinaison homologue reste minoritaire ; des cassures hors cible surviennent en des sites qu’on ne peut pas tous prédire ; et l’embryon ne peut être vérifié qu’en séquençant quelques cellules biopsiées, qui ne parlent pas pour les autres. Preuves nécessaires : des méthodes qui éditent toutes les cellules à l’identique (avant la première phase S) avec des rendements proches de $100\,\%$ , le séquençage du génome entier de chaque cellule d’embryons animaux édités montrant l’absence de tout changement non voulu, et le suivi à long terme d’animaux édités sur plusieurs générations — dont rien n’existe.

6.6 Problème : d’un gène à un médicament et à une culture

Problème 6.1

Problème du week-end — un gène cloné avec l’arithmétique des sites de restriction et de la transformation, un virus compté par qPCR, une hormone produite à la tonne dans un fermenteur, un génome édité avec ses sites hors cible dénombrés et un forçage génétique chronométré, pour finir sur les copies d’un virus dans un échantillon, le volume annuel de fermenteur pour l’insuline du monde et le nombre de générations qu’exige un forçage

Données : un gène de $1.5\,\mathrm{kb}$ ; un site de restriction de six bases ; un plasmide de $4\,\mathrm{kb}$ ; efficacité de transformation $2\times 10^{7}$ colonies par microgramme de plasmide ; la ligature donne un insert à $10\,\%$ des plasmides. Efficacité de qPCR $E = 1$ , seuil $N_{T} = 10^{12}$ . Insuline : $5.8\,\mathrm{kDa}$ , un patient en emploie $40$ unités par jour, une unité valant $35\,\text{µ}\mathrm{g}$ ; $10^{7}$ patients ; un fermenteur livre $2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de produit par lot, dix lots par an. Génome $3.2\times 10^{9}$ bp. Conversion du forçage $c = 0.9$ , lâché à $p_{0} = 0.001$ .

Partie I — Le clonage.

À quelle fréquence un site donné de six bases apparaît-il dans un ADN aléatoire ? Quelle est la probabilité que le gène de $1.5\,\mathrm{kb}$ n’en contienne aucun, de sorte que l’enzyme puisse servir à le cloner entier ?
S’il en contient un, comment le cloner malgré tout ? (Deux méthodes.)
On transforme $100\,\mathrm{ng}$ de plasmide ligaturé. Combien de colonies, et combien portent l’insert ?
On emploie le criblage blanc–bleu. Quelle fraction des colonies est blanche, et combien de colonies blanches faut-il prélever pour avoir $99\,\%$ de chances qu’au moins une porte le gène dans le bon sens (la moitié des inserts) ?
Le plasmide recombinant fait $5.5\,\mathrm{kb}$ . Une cellule en contient $50$ copies et se divise toutes les $30\,\mathrm{min}$ . Après une culture d’une nuit ( $16\,\mathrm{h}$ ) à partir d’une cellule, combien de molécules de plasmide, et quelle masse d’ADN plasmidique ( $650\,\mathrm{Da}$ par paire de bases) ?
Pourquoi le plasmide a-t-il besoin d’une origine bactérienne alors que le gène humain inséré n’a besoin d’aucun promoteur bactérien pour le clonage, mais en a besoin pour l’expression ?

Partie II — Compter un virus.

L’échantillon d’un patient franchit le seuil à $C_{T} = 28$ . Combien de copies y avait-il dans la réaction ? Et un autre à $C_{T} = 35$ ?
Sensibilité : combien de cycles faut-il pour amener une copie unique au seuil ?
Le seuil de décision du test est fixé à $C_{T} = 38$ . À quel nombre de copies cela correspond-il, et pourquoi ne pas faire $45$ cycles ?
Une molécule contaminante issue du produit d’une course antérieure entre dans un échantillon négatif. À quel cycle franchit-elle le seuil ? Quelle pratique de laboratoire l’empêche ?
La transcription inverse convertit $40\,\%$ de l’ARN viral en ADN. Corriger en conséquence le compte de la question 7 pour le premier échantillon.
Deux échantillons diffèrent de $\Delta C_{T} = 3.3$ avec $E = 1$ , mais l’efficacité vaut en réalité $0.9$ . Quel facteur l’analyste rapporte-t-il, et quel est le vrai ?

Partie III — De l’insuline à la tonne.

Calculer la masse quotidienne d’insuline par patient et le besoin mondial annuel pour $10^{7}$ patients, en kilogrammes.
Combien de moles d’insuline cela fait-il, et combien de molécules ?
Quel volume de fermenteur, exploité en dix lots par an, la produit ? Comparer à une piscine de $2500\,\mathrm{m}^{3}$ .
L’extraction à partir de glandes donnait $1\,\mathrm{kg}$ d’insuline pour $8000\,\mathrm{kg}$ de pancréas ; un pancréas de porc pèse $100\,\mathrm{g}$ . Combien de porcs par an faudrait-il au monde ?
Pourquoi l’hormone recombinante est-elle préférée même là où l’insuline animale est bon marché ? Donner deux raisons.
Les analogues de l’insuline diffèrent de la séquence humaine par un ou deux résidus. Expliquer pourquoi un analogue reste un médicament qui agit sur le récepteur humain, et pourquoi le changement d’un seul résidu peut modifier son temps de dissociation.

Partie IV — Éditer et forcer.

Combien de correspondances exactes d’un guide de 20 bases suivi d’un NGG le génome contient-il par hasard (les deux brins : $6.4\times 10^{9}$ positions) ?
Si Cas9 tolère jusqu’à trois mésappariements, combien de séquences se trouvent à trois mésappariements du guide, et combien de sites hors cible fortuits en résultent ?
Les cellules souches sanguines éditées sont au nombre de $10^{7}$ ; $80\,\%$ portent l’interruption voulue. Combien de cellules portent une cassure hors cible à un site donné s’il est coupé dans une cellule sur $10^{4}$ , et pourquoi une cassure dans un gène suppresseur de tumeur d’une seule cellule souche est-elle préoccupante ?
Calculer la fréquence du forçage après $1, 2, 3$ générations à partir de $p_{0} = 0.001$ , et estimer le nombre de générations pour atteindre $0.5$ .
Un moustique a dix générations par an. Combien d’années pour s’imposer ? En quoi un coût de valeur sélective de $20\,\%$ chez les homozygotes change-t-il qualitativement le tableau ?
Un allèle de résistance apparaît lorsque la coupure est réparée par jonction d’extrémités et non par recombinaison, avec la probabilité $1 - c = 0.1$ par tentative de conversion. Estimer le nombre d’allèles de résistance créés dans une population de $10^{6}$ hétérozygotes en une génération, et expliquer ce qu’il advient du forçage s’ils ne coûtent rien.
Résumer : les copies du premier échantillon (question 7), le volume annuel de fermenteur pour l’insuline du monde (question 15) et le nombre de générations pour que le forçage atteigne la moitié de la population (question 22).

Solution

Solution de Problème 6.1.

1. Une fois tous les $4096$ bp. $P(\text{aucun site}) = (1 - 1/4096)^{1500} = e^{-0.37} = 0.69$ . 2. Choisir une enzyme dont le site est absent du gène ; ou amplifier le gène par PCR avec des amorces portant de nouveaux sites de restriction à leur extrémité 5 $'$ (ou recourir au clonage à extrémités franches ou indépendant de la ligature). 3. $0.1\,\text{µ}\mathrm{g}$ $\times 2\times 10^{7} = 2\times 10^{6}$ colonies ; $10\,\%$ , soit $2\times 10^{5}$ , portent l’insert. 4. Blanches : $10\,\%$ . La moitié des inserts est dans le bon sens, donc $P(\text{aucun parmi } n \text{ blanches}) = 0.5^{n} \le 0.01$ donne $n \ge 6.6$ : en prélever sept. 5. $32$ doublements, $2^{32} = 4.3\times 10^{9}$ cellules, $2.1\times 10^{11}$ plasmides ; chacun $5500\times 650 = 3.6\times 10^{6}$ Da $= 5.9\times 10^{-18}$ g : $1.3\,\text{µ}\mathrm{g}$ de plasmide. 6. Le clonage n’exige que la réplication, assurée par l’origine du plasmide ; le promoteur humain n’est pas lu par l’ARN polymérase bactérienne, de sorte que pour l’expression il faut placer devant la séquence codante (sans intron) un promoteur bactérien et un site de fixation du ribosome. 7. $N_{0} = N_{T}/2^{C_{T}}$ : $10^{12}/2^{28} \approx 3700$ copies ; à $C_{T} = 35$ , $10^{12}/2^{35} \approx 29$ copies. 8. $2^{n} = 10^{12}$ : $n = 39.9$ , quarante cycles. 9. $10^{12}/2^{38} \approx 3.6$ copies. Au-delà d’environ $40$ cycles, une seule molécule contaminante, ou des artefacts d’amorces, atteignent le seuil, et un échantillon de moins d’une copie n’a aucun sens. 10. Une molécule franchit le seuil au cycle $40$ : un positif. On l’empêche par des salles et du matériel séparés pour la préparation et pour la manipulation des produits, un flux à sens unique, des témoins négatifs dans chaque course, et la destruction enzymatique des amplicons reportés. 11. $3700/0.4 \approx 9000$ copies d’ARN. 12. Rapporté $2^{3.3} \approx 10$ fois ; vrai $1.9^{3.3} = e^{3.3\ln 1.9} \approx 8.3$ fois. 13. $40\times 35\,\text{µ}\mathrm{g} = 1.4\,\mathrm{mg}$ par jour, $0.51\,\mathrm{g}$ par an ; $\times 10^{7}$ : $5100\,\mathrm{kg}$ par an. 14. $5.1\times 10^{6}/5800 \approx 880$ mol ; $5.3\times 10^{26}$ molécules. 15. $5.1\times 10^{6}$ g $/ (20$ g/L $) = 2.6\times 10^{5}$ L $= 260\,\mathrm{m}^{3}$ — le dixième de la piscine. 16. $5100\times 8000 = 4.1\times 10^{7}$ kg de pancréas, à $0.1\,\mathrm{kg}$ l’un : $4\times 10^{8}$ porcs par an. 17. L’hormone recombinante est identique à l’humaine, donc elle ne suscite pas d’anticorps et ne cause pas de réaction allergique ; elle ne véhicule aucun pathogène animal (virus, prions) ; l’approvisionnement ne dépend pas de l’abattage ; et la séquence peut être améliorée. 18. Les résidus qui touchent le récepteur sont inchangés, donc la fixation et la signalisation sont celles de l’insuline ; les résidus modifiés se trouvent à la surface où les molécules d’insuline s’associent en dimères et en hexamères, et les changer change la vitesse à laquelle le dépôt injecté se défait en monomères absorbables. 19. $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}/16 \approx 3.6\times 10^{-4}$ : aucune correspondance exacte fortuite. 20. $1 + 60 + 1710 + 27\times 1140 = 32\,551$ séquences ; $32\,551\times 3.6\times 10^{-4} \approx 12$ sites hors cible fortuits. 21. $10^{7}\times 10^{-4} = 1000$ cellules. Une cellule souche vit et se divise pendant toute la vie du patient ; l’une d’elles qui a perdu un suppresseur de tumeur, ou acquis une translocation, peut fonder un clone qui devient une leucémie. 22. $p_{1} = 0.0019$ , $p_{2} = 0.0036$ , $p_{3} = 0.0069$ ; une croissance géométrique de $1.9$ par génération donne $\ln 500/\ln 1.9 \approx 10$ ; en itérant la récurrence, la fréquence dépasse $0.5$ à la génération $11$ ( $0.45 \to 0.68$ ). 23. Environ un an. Un coût de $20\,\%$ chez les homozygotes est inférieur à $c = 0.9$ , de sorte que le forçage se fixe tout de même, plus lentement, tandis que la valeur sélective moyenne de la population baisse — ce qui est le but d’un forçage de suppression ; un coût supérieur à $c$ le bloquerait à une fréquence intermédiaire. 24. $10^{6}\times 0.1 = 10^{5}$ allèles de résistance en une génération. Incoupables et, s’ils ne coûtent rien là où le forçage coûte, ils sont favorisés et se propagent, et le forçage est éliminé — d’où le choix de cibles où les produits de jonction d’extrémités sont létaux, avec plusieurs guides à la fois. 25. Environ $3700$ copies dans le premier échantillon ; quelque $260\,\mathrm{m}^{3}$ de fermenteur par an pour l’insuline du monde ; environ $11$ générations, soit une année de moustique, pour le forçage.

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