Biologie universitaire — 3e année · Bachelor Year 3

12Bactériologie : croissance, physiologie et génétique

Une seule cellule d’Escherichia coli dans un bouillon tiède se divise toutes les vingt minutes. Sans frein, sa descendance pèserait plus que la Terre en deux jours ; en réalité elle s’arrête en quelques heures, quand le sucre vient à manquer, et demeure des semaines dans un état qui survit à la famine. Une bactérie voisine, dans une plaie et en quelques heures, devient cent millions de cellules et une fièvre ; il y a cent ans elle tuait un tiers des patients qu’elle infectait, et depuis 1941 le poison d’une moisissure contre elle a sauvé plus de vies que n’importe quel autre médicament — tandis que les bactéries, pendant ces quatre-vingts mêmes années, ont trouvé le moyen de contourner tous les antibiotiques fabriqués. Les bactéries sont les organismes chez qui l’on a montré pour la première fois que les gènes sont de l’ADN, chez qui la régulation des gènes a été comprise pour la première fois, et auxquels on a pris les outils du Chapitre 6. Ce chapitre les traite en tant qu’organismes : leur enveloppe, l’arithmétique de leur croissance dans un flacon et en culture continue, la façon dont une population perçoit sa propre densité, le trafic des gènes entre cellules, et la chimie et l’évolution des antibiotiques et des résistances.

12.1 La cellule bactérienne

Définition 12.1 (L’enveloppe)

Toute bactérie, à quelques exceptions près, est enfermée dans une paroi de peptidoglycane : des chaînes alternant N-acétylglucosamine et acide N-acétylmuramique, réticulées par de courts peptides en une seule molécule qui entoure la cellule et résiste à la pression de turgescence — plusieurs atmosphères — du cytoplasme. Les bactéries à Gram positif ont une paroi épaisse de $20\text{ à }80\,\mathrm{nm}$ , à nombreuses couches, traversée d’acides téichoïques ; les bactéries à Gram négatif ont une paroi mince d’une ou deux couches et, à l’extérieur, une seconde bicouche lipidique, la membrane externe, dont le feuillet externe est du lipopolysaccharide (LPS, endotoxine — la molécule que reconnaît le système immunitaire inné du Chapitre 15 et qui cause le choc septique), et qui enferme un périplasme. Des porines de la membrane externe laissent entrer les petites molécules et excluent bien des antibiotiques. À l’extérieur peuvent se trouver une capsule polysaccharidique contre les phagocytes, des flagelles pour nager (Chapitre 9) et des pili pour l’attachement et la conjugaison. À l’intérieur, le chromosome — une molécule circulaire de $1\text{ à }10\,\mathrm{Mb}$ chez la plupart des espèces — est replié en un nucléoïde dépourvu de membrane, à côté de plasmides. Certains genres (Bacillus, Clostridium) savent enfermer une copie du chromosome dans une enveloppe épaisse, en endospore, déshydratée et métaboliquement inerte, qui survit à l’ébullition, aux rayonnements et à des siècles de sécheresse et germe au retour des nutriments.

Méthode 12.2 (La coloration de Gram)

Le plus vieux test du laboratoire de bactériologie (Gram, 1884) décide encore du premier choix d’antibiotique. (1) Étaler l’échantillon et le fixer à la chaleur ; (2) colorer au violet de gentiane, puis à l’iode, qui forme avec le colorant un gros complexe insoluble à l’intérieur des cellules ; (3) laver à l’alcool : l’épais peptidoglycane des Gram positifs, déshydraté par l’alcool, retient le complexe et les cellules restent violettes, alors que la paroi mince des Gram négatifs le laisse sortir ; (4) contre-colorer à la safranine, qui rose les Gram négatifs devenus incolores. La forme et la disposition — coques en amas (staphylocoques) ou en chaînes (streptocoques), bâtonnets, spirales — resserrent encore l’identification, et un coque violet en amas provenant d’un abcès est un staphylocoque avant toute culture.

À gauche : une coloration de Gram — coques à Gram positif violets en amas, bâtonnets à Gram négatif roses. À droite : des cellules de Bacillus colorées pour les endospores, ovales vert vif à l’intérieur de cellules roses et spores libres à côté d’elles. — À gauche : une coloration de Gram — coques à Gram positif violets en amas, bâtonnets à Gram négatif roses. À droite : des cellules de *Bacillus* colorées pour les endospores, ovales vert vif à l’intérieur de cellules roses et spores libres à côté d’elles.

Les deux enveloppes. Les Gram positifs enveloppent la membrane de nombreuses couches de peptidoglycane ; les Gram négatifs ont une couche mince et une membrane externe de lipopolysaccharide percée de porines, qui tient bien des antibiotiques à l’écart et fournit l’endotoxine qui cause le choc septique.

12.2 La croissance

Théorème 12.3 (Croissance exponentielle, loi de Monod et chémostat)

Une population de $N$ cellules qui se divisent avec le temps de génération $T$ croît comme $N(t) = N_{0}\,2^{t/T} = N_{0}e^{\mu t}$ , avec le taux de croissance spécifique $\mu = \ln 2/T$ . Ce taux dépend du nutriment limitant $S$ par la loi de Monod

\mu(S) = \mu_{\max}\,\frac{S}{K_{S} + S},

qui sature à $\mu_{\max}$ et vaut la moitié du maximum en $S = K_{S}$ . Dans un chémostat — une cuve de volume $V$ où entre un milieu neuf de concentration en nutriment $S_{0}$ à la vitesse $F$ , et d’où la culture sort à la même vitesse, avec le taux de dilution $D = F/V$ — l’état stationnaire vérifie

\mu(S^{*}) = D,\qquad S^{*} = \frac{K_{S}D}{\mu_{\max} - D},\qquad X^{*} = Y\,(S_{0} - S^{*}),

où $X$ est la densité cellulaire et $Y$ le rendement (cellules produites par unité de nutriment). L’expérimentateur fixe le taux de croissance en réglant une pompe ; la culture répond en ajustant le nutriment qu’elle laisse derrière elle. Si $D$ dépasse $\mu(S_{0})$ les cellules ne peuvent plus suivre et sont lessivées.

Démonstration. Cellules : $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t = \mu(S)X - DX$ , croissance moins sortie ; à l’état stationnaire avec $X^{*} > 0$ , $\mu(S^{*}) = D$ , et inverser la loi de Monod donne $S^{*}$ . Nutriment : $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = D(S_{0} - S) - \mu(S)X/Y$ , entrée moins sortie moins consommation ; à l’état stationnaire, avec $\mu = D$ , $D(S_{0} - S^{*}) = DX^{*}/Y$ , d’où $X^{*}$ . L’état stationnaire n’existe que si $S^{*} < S_{0}$ , c’est-à-dire $D < \mu(S_{0})$ ; au-delà, le seul état stationnaire est $X = 0$ , le lessivage. Stabilité : si $X$ monte au-dessus de $X^{*}$ il consomme davantage, $S$ tombe sous $S^{*}$ , $\mu$ tombe sous $D$ et $X$ décline — une rétroaction négative par le nutriment. ∎

Exemple 12.4 (Une culture en chiffres)

E. coli en milieu riche à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $T = 20\,\mathrm{min}$ , $\mu = 2.1\,\mathrm{h}^{-1}$ . À partir d’une cellule, $2^{36}$ après douze heures — $7\times 10^{10}$ cellules, soit environ $70\,\mathrm{mg}$ , ce qui est le point où un flacon de $100\,\mathrm{mL}$ s’arrête faute de dioxygène et de sucre ; la « masse de la Terre en deux jours » fait $2^{144}\approx 10^{43}$ cellules, et l’arithmétique ne montre qu’une chose : la croissance exponentielle ne dure jamais. Dans un chémostat sur glucose avec $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ et $Y = 0.5\,\mathrm{g}$ de cellules par gramme de glucose, un taux de dilution de $0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ laisse $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de glucose et maintient $X^{*} = 0.495\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de cellules, qui se divisent toutes les $83\,\mathrm{min}$ , indéfiniment. Le chémostat est la façon d’étudier la physiologie à taux de croissance fixé, et de faire tourner des milliers de générations d’évolution dans une bouteille.

À gauche : une culture en flacon — une latence pendant que les enzymes sont induites, une croissance exponentielle, une phase stationnaire quand le nutriment est épuisé, puis une mort lente. À droite : la loi de Monod, taux de croissance en fonction du nutriment limitant, K_S étant la concentration donnant la moitié du maximum. — À gauche : une culture en flacon — une latence pendant que les enzymes sont induites, une croissance exponentielle, une phase stationnaire quand le nutriment est épuisé, puis une mort lente. À droite : la loi de Monod, taux de croissance en fonction du nutriment limitant, $K_{S}$ étant la concentration donnant la moitié du maximum.

Définition 12.5 (Phases et états)

Dans un flacon neuf (une culture discontinue) les cellules marquent d’abord une pause — la phase de latence, le temps d’induire les enzymes qu’exige le nouveau milieu — puis croissent exponentiellement, puis s’arrêtent quand un nutriment est épuisé ou qu’un déchet s’accumule : c’est la phase stationnaire, où les cellules rapetissent, épaississent leur enveloppe, condensent leur nucléoïde autour de protéines protectrices, allument des gènes de stress par le facteur sigma de rechange RpoS, et peuvent survivre des mois ; suit une phase de mort où la plupart des cellules se lysent et où quelques-unes vivent sur les restes. Certaines espèces répondent à la famine par un programme de développement : Bacillus subtilis se divise de façon asymétrique et la grande cellule englobe la petite et bâtit la spore autour d’elle, une séquence de huit heures commandée par une cascade de facteurs sigma — les sous-unités qui dirigent l’ARN polymérase vers un jeu de promoteurs — alternant entre les deux compartiments, premier exemple bactérien de différenciation et de signalisation de cellule à cellule au travers d’une paroi.

12.3 Se percevoir les unes les autres

Définition 12.6 (Détection du quorum)

Les bactéries détectent leur propre densité par la détection du quorum : chaque cellule sécrète à vitesse constante une petite molécule de signal, un auto-inducteur — des lactones d’homosérine acylées chez les Gram négatifs, de courts peptides chez les Gram positifs ; la concentration dans le milieu croît avec le nombre de cellules et, lorsqu’elle franchit un seuil, elle se fixe sur un récepteur qui allume un jeu de gènes, dont la synthase de l’auto-inducteur lui-même (d’où le nom). Les gènes ainsi commandés sont ceux qui ne paient qu’en nombre : la lumière chez Vibrio fischeri, les facteurs de virulence chez Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa, la matrice des biofilms, la compétence pour capter de l’ADN, et l’élimination des voisines. L’essentiel de la perception bactérienne passe par des systèmes à deux composants : une histidine kinase membranaire qui détecte un stimulus et phosphoryle un régulateur de réponse cytoplasmique, lequel se fixe sur l’ADN — une cellule en a des dizaines, pour le phosphate, l’osmolarité, le dioxygène et les auto-inducteurs d’autres espèces.

Faits expérimentaux. Nealson, Platt et Hastings (1970) ont cultivé la bactérie marine lumineuse Vibrio fischeri à partir d’un inoculum dilué et ont trouvé que les cellules ne faisaient aucune lumière avant d’atteindre une densité de quelque $10^{7}$ par millilitre, puis s’allumaient toutes ensemble ; un milieu où une culture dense avait poussé, stérilisé et ajouté à une culture diluée, allumait la lumière aussitôt. Les cellules comptaient une substance sécrétée, non le temps ni le nutriment. La substance a été identifiée comme une lactone d’acyl-homosérine (Eberhard, 1981), et les gènes — luxI pour la synthase, luxR pour le récepteur, et l’opéron de la luciférase qu’ils commandent — ont été clonés dans E. coli, qui s’est mise à briller quand elle était à l’étroit. Dans le calmar qui héberge la bactérie à $10^{10}$ par millilitre, l’organe lumineux brille ; en mer, où les bactéries sont diluées, elles sont sombres et économisent la dépense. ∎

Proposition 12.7 (Un seuil de densité)

Soit $N$ cellules dans un volume $V$ , chacune sécrétant l’auto-inducteur à raison de $p$ molécules par seconde, et la molécule étant perdue (dégradée ou diluée) avec la constante de vitesse du premier ordre $k$ . La concentration tend vers $A^{*} = pN/(kV)$ , proportionnelle à la densité cellulaire $N/V$ , avec la constante de temps $1/k$ ; le récepteur s’allume quand $A^{*}$ atteint son seuil $A_{\text{seuil}}$ , c’est-à-dire à la densité

\left(\frac{N}{V}\right)_{\text{seuil}} = \frac{k\,A_{\text{seuil}}}{p}.

Dans un espace clos — l’organe lumineux d’un calmar, un abcès, le mucus d’un poumon — $k$ est petit parce que le signal n’est pas emporté, de sorte que la densité seuil est atteinte par moins de cellules ; en eau libre elle ne l’est jamais. La cellule ne mesure donc pas son nombre mais son nombre par unité du volume qu’elle partage, ce qui est ce qui compte pour tout acte coopératif, et la rétroaction positive de l’auto-inducteur sur sa propre synthase rend l’interrupteur net : dès que quelques cellules franchissent le seuil, leur production supplémentaire y fait passer les autres.

Démonstration. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = pN/V - kA$ a pour état stationnaire $A^{*} = pN/(kV)$ et y relaxe comme $e^{-kt}$ . Poser $A^{*} = A_{\text{seuil}}$ et résoudre en $N/V$ donne la densité seuil. ∎

À gauche : une culture dense de Vibrio fischeri qui brille, à côté d’une culture diluée qui reste sombre — les mêmes cellules, au-dessus et au-dessous de leur quorum. À droite : un test de diffusion en disque ; le diamètre de chaque zone claire mesure la sensibilité de la bactérie à l’antibiotique du disque, et le disque sans zone marque une résistance. — À gauche : une culture dense de *Vibrio fischeri* qui brille, à côté d’une culture diluée qui reste sombre — les mêmes cellules, au-dessus et au-dessous de leur quorum. À droite : un test de diffusion en disque ; le diamètre de chaque zone claire mesure la sensibilité de la bactérie à l’antibiotique du disque, et le disque sans zone marque une résistance.

12.4 Le trafic des gènes

Définition 12.8 (Transfert horizontal de gènes)

Les bactéries se reproduisent clonalement mais échangent des gènes par trois routes. La transformation : la capture d’ADN nu du milieu par une cellule compétente — la route par laquelle les pneumocoques de Griffith ont acquis leur capsule et par laquelle Avery a montré que le principe transformant était de l’ADN (1944). La transduction : un phage qui emballe un morceau d’ADN de son hôte et l’injecte dans le suivant (Chapitre 13). La conjugaison : le transfert d’un plasmide par un pilus et un pont de conjugaison, d’un donneur qui le porte à un receveur, démontré par Lederberg et Tatum (1946) avec des souches auxotrophes d’E. coli qui ne donnaient de recombinants prototrophes qu’une fois mélangées. Les plasmides conjugatifs portent leurs propres gènes de transfert ; beaucoup portent aussi des gènes de résistance, souvent groupés en intégrons et encadrés de transposons, de sorte qu’un seul accouplement peut transférer la résistance à cinq antibiotiques à la fois, par-delà les espèces. Il en résulte qu’une espèce bactérienne a un génome cœur partagé par toutes ses souches et un génome accessoire qui varie — un pangénome : deux souches d’E. coli peuvent différer par un cinquième de leurs gènes, et les souches pathogènes diffèrent des souches inoffensives surtout par des îlots acquis de gènes de virulence. Les gènes du chapitre des mutations du volume de deuxième année naissent par mutation ; ceux de ce chapitre-ci, pour la plupart, arrivent.

Les trois routes du transfert horizontal. Des gènes de résistance, de virulence et de métabolisme passent de cellule à cellule — et d’espèce à espèce — plus vite que la mutation ne saurait les fabriquer.

Faits expérimentaux. Robert Koch (1876–1884) a établi qu’une bactérie précise cause une maladie précise : il a isolé Bacillus anthracis chez des animaux malades, l’a cultivé en culture pure sur milieu solide (la boîte de gélose et la colonie isolée sont des inventions de son laboratoire), a montré que la culture reproduisait le charbon chez des animaux sains et pouvait en être réisolée — les postulats qui définissent encore un pathogène — puis est passé au bacille de la tuberculose et au vibrion du choléra. Alexander Fleming (1928) a remarqué qu’une moisissure contaminant une boîte de staphylocoques y avait dégagé une zone autour d’elle ; la substance, la pénicilline, a été purifiée et s’est montrée capable de guérir des infections chez Florey et Chain (1940–1941), et en une décennie des staphylocoques résistants porteurs d’une enzyme qui détruit la pénicilline étaient courants dans les hôpitaux — un avertissement que Fleming lui-même avait donné dans sa conférence Nobel. ∎

Robert Koch, qui a prouvé que des bactéries précises causent des maladies précises et a inventé les méthodes pour les cultiver (Wellcome Collection, CC BY 4.0). À droite : Alexander Fleming dans son laboratoire, avec des boîtes de la moisissure dont le produit est devenu la pénicilline (archives de l’U.S. Navy, domaine public).

12.5 Antibiotiques et résistances

Définition 12.9 (Les antibiotiques)

Un antibiotique est une molécule qui tue les bactéries ou arrête leur croissance à des concentrations inoffensives pour l’hôte, en agissant sur une cible que l’hôte n’a pas ou qu’il a sous une autre forme — la toxicité sélective. Les cibles sont peu nombreuses. La paroi : les $\beta$ -lactamines (pénicillines, céphalosporines, carbapénèmes) imitent le D-Ala-D-Ala terminal du peptide du peptidoglycane et acylent les enzymes qui le réticulent, de sorte que la paroi en croissance est faible et que la cellule éclate sous sa propre turgescence ; la vancomycine se fixe sur le D-Ala-D-Ala lui-même. Le ribosome, dont la forme bactérienne diffère de l’eucaryote : les aminosides (la petite sous-unité, d’où des erreurs de lecture), les tétracyclines (qui bloquent l’entrée des ARNt), les macrolides et le chloramphénicol (le tunnel de sortie et la peptidyl-transférase de la grande sous-unité). L’ADN gyrase et la topo-isomérase IV : les quinolones. L’ARN polymérase : la rifampicine. La synthèse des folates, que les animaux ne font pas : les sulfamides et le triméthoprime. La membrane : les polymyxines, en dernier recours. La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la plus faible concentration d’un médicament qui empêche la croissance visible d’une souche ; une souche est dite résistante quand sa CMI dépasse la concentration que le médicament atteint chez le patient.

Méthode 12.10 (Mesurer la sensibilité)

Deux tests. La dilution en bouillon : ensemencer un nombre fixe de cellules (environ $5\times 10^{5}$ par millilitre) dans une rangée de tubes ou de puits contenant l’antibiotique par paliers de facteur deux, incuber une nuit, et lire le premier puits clair : cette concentration est la CMI. La diffusion en disque : étaler la souche sur une boîte de gélose, poser des disques de papier chargés de quantités connues de plusieurs antibiotiques, incuber ; le médicament diffuse vers l’extérieur, sa concentration décroissant avec la distance, et la croissance est inhibée jusqu’au rayon où la concentration égale la CMI, de sorte que le diamètre de la zone claire — lu sur des tables étalonnées — donne la sensibilité à chaque disque sur une seule boîte. Les deux tests prennent un jour ; séquencer le génome à la recherche des gènes et des mutations de résistance connus prend le même jour et commence à les remplacer.

Définition 12.11 (La résistance)

Une bactérie résiste à un antibiotique par l’un de cinq moyens. Elle détruit le médicament : les $\beta$ -lactamases hydrolysent le cycle $\beta$ -lactame, et les variantes à spectre étendu et les carbapénémases détruisent aujourd’hui les plus récentes. Elle modifie la cible : une mutation de la protéine ribosomique ou de la gyrase que le médicament fixe, ou bien, chez le SARM (Staphylococcus aureus résistant à la méticilline), un gène acquis codant une enzyme de réticulation que les $\beta$ -lactamines ne fixent pas ; la résistance à la vancomycine remplace le D-Ala terminal par un D-lactate, que le médicament ne reconnaît pas. Elle chasse le médicament par des pompes d’efflux, souvent de spécificité large. Elle empêche le médicament d’entrer, en perdant une porine. Ou elle contourne l’étape bloquée par une autre enzyme. Les mutations de cible apparaissent par hasard chez le patient à des taux de $10^{-8}$ à $10^{-6}$ par division et sont sélectionnées pendant le traitement ; les enzymes et les pompes sont surtout acquises sur des plasmides venus de l’immense réservoir des bactéries du sol et de l’intestin, où elles ont évolué depuis des âges contre les antibiotiques que fabriquent les champignons et d’autres bactéries. Les persistantes — cellules dormantes qui survivent à un médicament sans être génétiquement résistantes — expliquent les rechutes après un traitement qui aurait dû réussir.

Proposition 12.12 (Pourquoi la résistance est inévitable et l’association la réponse)

Une infection de $10^{9}$ cellules traitée par un médicament contre lequel les mutations de résistance apparaissent à $10^{-8}$ par division contient déjà une dizaine de cellules résistantes ; le médicament tue le reste et les dix prennent la place — exactement l’arithmétique du Chapitre 11, puisqu’une population bactérienne et une tumeur sont l’une comme l’autre des clones qui évoluent sous sélection. Deux médicaments à cibles indépendantes affrontent une cellule doublement résistante à $10^{-16}$ par division, qu’un milliard de cellules ne contient pas. C’est pourquoi la tuberculose, dont les lésions abritent $10^{8}$ – $10^{9}$ bacilles, est traitée par trois ou quatre médicaments à la fois depuis les années 1950 et pourquoi sa monothérapie a produit des résistances en quelques mois ; c’est aussi pourquoi chaque emploi d’un antibiotique, chez un patient ou dans un élevage, sélectionne de la résistance quelque part, et pourquoi le rythme des antibiotiques nouveaux — aucune classe nouvelle contre les Gram négatifs depuis les années 1960 — est la mesure à laquelle on compte les pertes. Les remèdes sont ceux de tout affrontement évolutif : en employer moins, associer, terminer la cure pour que des cellules partiellement résistantes ne survivent pas à se reproduire, et trouver de nouvelles cibles.

Exemple 12.13 (La fenêtre de sélection des mutants)

Une souche a une CMI de $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; ses mutants résistants de premier rang, présents à raison d’un sur $10^{7}$ , ont une CMI de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ . Une dose qui maintient le médicament à $4\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ tue le type sauvage et laisse les mutants croître sans concurrence : l’intervalle de concentration compris entre la CMI du type sauvage et celle des mutants est la fenêtre de sélection des mutants, et un traitement qui s’y installe fabrique de la résistance. Une dose au-dessus de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ tue les deux ; une dose trop faible, ou une cure arrêtée quand le patient se sent mieux et que la concentration redescend à travers la fenêtre, voilà comment se fabrique une population résistante. La même logique fixe les protocoles du traitement de la tuberculose : six mois, quatre médicaments, à des doses supérieures à la CMI de tout mutant en un pas.

La fenêtre de sélection des mutants. Une concentration supérieure à la CMI des mutants tue tout ; entre les deux CMI (zone grisée) elle tue le type sauvage et sélectionne les mutants. Une dose dont la concentration traverse la fenêtre pendant des heures, ou une cure arrêtée trop tôt, fabrique de la résistance.

Remarque 12.14 (La plupart des bactéries ne sont pas des pathogènes)

Les bactéries de la clinique de ce chapitre sont une infime minorité. Sur le million d’espèces estimées, quelques centaines causent des maladies humaines ; les autres font tourner les cycles de l’azote, du soufre et du carbone (le volume de deuxième année), fixent l’azote de chaque légumineuse, digèrent la cellulose de chaque ruminant, et composent les microbiotes du Chapitre 14, dont la perte sous antibiotique est un coût de chaque cure. Les antibiotiques eux-mêmes sont leurs molécules — armes et signaux évolués parmi les bactéries et les champignons du sol bien avant qu’il y ait des hôpitaux — et la plupart des gènes de résistance aussi.

12.6 Exercices

Exercice 12.1 ★

Décrire les enveloppes à Gram positif et à Gram négatif et expliquer pourquoi la coloration de Gram les distingue.

Solution

Solution de Exercice 12.1.

Gram positif : membrane cytoplasmique enveloppée d’une paroi de peptidoglycane épaisse et multicouche, traversée d’acides téichoïques. Gram négatif : une couche mince de peptidoglycane dans un périplasme, puis une membrane externe dont le feuillet externe est du lipopolysaccharide, avec des porines. Le complexe violet de gentiane–iode est retenu dans la paroi épaisse et déshydratée par l’alcool du Gram positif (violet) mais lessivé hors du Gram négatif au travers de sa paroi mince et de sa membrane externe désorganisée, qui prend alors la contre-coloration rose.

Exercice 12.2 ★

Une culture de $10^{3}$ cellules par millilitre atteint $10^{9}$ en $8\,\mathrm{h}$ de croissance exponentielle. Trouver le nombre de générations, le temps de génération et $\mu$ .

Solution

Solution de Exercice 12.2.

Un facteur $10^{6}$ $= 2^{19.9}$ : environ $20$ générations ; $T = 8\,\mathrm{h}/20 = 24\,\mathrm{min}$ ; $\mu = \ln 2/0.4\,\mathrm{h} = 1.7\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Exercice 12.3 ★

Nommer les trois routes du transfert horizontal de gènes et donner l’expérience classique qui a démontré chacune.

Solution

Solution de Exercice 12.3.

Transformation — Griffith (1928) puis Avery, MacLeod et McCarty (1944) : des pneumocoques virulents tués par la chaleur transforment des pneumocoques vivants avirulents, et l’agent est de l’ADN. Transduction — Zinder et Lederberg (1952) : le phage P22 porte des gènes de Salmonella d’une souche à l’autre au travers d’un filtre qui arrête les cellules. Conjugaison — Lederberg et Tatum (1946) : deux souches auxotrophes d’E. coli ne donnent de recombinants prototrophes qu’une fois mélangées, le contact entre cellules étant requis (le tube en U de Davis).

Exercice 12.4 ★

Donner la cible de la pénicilline, de la streptomycine, de la ciprofloxacine et de la rifampicine, et dire pourquoi chacune est sélectivement toxique.

Solution

Solution de Exercice 12.4.

Pénicilline : les transpeptidases qui réticulent le peptidoglycane, que les cellules animales n’ont pas. Streptomycine : la petite sous-unité ribosomique, dont la forme bactérienne diffère de l’eucaryote. Ciprofloxacine : l’ADN gyrase, topo-isomérase bactérienne absente chez l’homme. Rifampicine : la sous-unité $\beta$ de l’ARN polymérase bactérienne, que l’enzyme eucaryote ne partage pas.

Exercice 12.5 ★★

Un chémostat a $\mu_{\max} = 0.8\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $Y = 0.4$ . Calculer $S^{*}$ et $X^{*}$ en $D = 0.2$ , $0.6$ et $0.79$ h $^{-1}$ , ainsi que le taux de dilution auquel commence le lessivage.

Solution

Solution de Exercice 12.5.

$S^{*} = K_{S}D/(\mu_{\max} - D)$ , $X^{*} = Y(S_{0} - S^{*})$ . $D = 0.2$ : $S^{*} = 0.0067\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.80\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . $D = 0.6$ : $S^{*} = 0.06$ , $X^{*} = 0.78$ . $D = 0.79$ : $S^{*} = 1.58$ , $X^{*} = 0.17$ . Lessivage quand $D = \mu(S_{0}) = 0.8\times 2/2.02 = 0.79\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Exercice 12.6 ★★

À l’aide de la Proposition 12.7, comparer la densité seuil de la détection du quorum dans l’organe lumineux d’un calmar ( $k = 0.01\,\mathrm{h}^{-1}$ ) et dans une eau de mer courante ( $k = 10\,\mathrm{h}^{-1}$ ), avec $p = 100$ molécules par cellule et par heure et $A_{\text{seuil}} = 10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ( $6\times 10^{12}$ molécules par litre).

Solution

Solution de Exercice 12.6.

$(N/V)_{\text{seuil}} = kA_{\text{seuil}}/p$ . Organe lumineux : $0.01\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{8}$ par litre $= 6\times 10^{5}$ par mL. Eau de mer : $10\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{11}$ par litre $= 6\times 10^{8}$ par mL — mille fois plus, jamais atteint en mer.

Exercice 12.7 ★★

Une boîte de diffusion en disque montre des zones de $25$ , $12$ et $0\,\mathrm{mm}$ pour trois médicaments. Interpréter chacune, et expliquer pourquoi un diamètre de zone peut être converti en CMI.

Solution

Solution de Exercice 12.7.

$25\,\mathrm{mm}$ : sensible, CMI basse. $12\,\mathrm{mm}$ : sensibilité réduite, intermédiaire — peut échouer aux doses ordinaires. $0\,\mathrm{mm}$ : résistante, croissance jusqu’au disque. Le médicament diffuse depuis le disque de sorte que sa concentration décroît avec la distance de façon reproductible ; la croissance s’arrête là où la concentration égale la CMI, si bien que le rayon de la zone et la CMI sont liés par une courbe d’étalonnage établie avec des souches de CMI connue.

Exercice 12.8 ★★

Expliquer comment un seul événement de conjugaison peut rendre une Klebsiella sensible résistante à cinq antibiotiques, et pourquoi les gènes de résistance se trouvent si souvent groupés sur des plasmides.

Solution

Solution de Exercice 12.8.

Le plasmide conjugatif porte un intégron dont le jeu de cassettes contient plusieurs gènes de résistance, plus des transposons qui en portent d’autres ; le plasmide passe en un seul accouplement et les exprime tous. Ils se groupent parce que la sélection par l’un quelconque des médicaments maintient le plasmide entier, de sorte que les gènes qui y font du stop persistent (cosélection) ; les intégrons capturent des cassettes ; les transposons sautent sur les plasmides ; et c’est le plasmide, non le gène, qui est l’unité de transfert.

Exercice 12.9 ★★

Un patient porte $10^{9}$ bactéries et prend un médicament contre lequel la résistance apparaît à $10^{-7}$ par division. Calculer le nombre attendu de cellules résistantes au départ ; puis avec deux médicaments indépendants. Pourquoi les persistantes sont-elles un problème différent ?

Solution

Solution de Exercice 12.9.

Le médicament seul : $10^{-7}\times 10^{9} = 100$ cellules résistantes attendues. Deux médicaments indépendants : $10^{-14}\times 10^{9} = 10^{-5}$ . Les persistantes ne sont pas des mutantes : une petite fraction de cellules dormantes survit à n’importe quel médicament et repeuple une population entièrement sensible une fois le médicament parti, de sorte qu’un second médicament n’y change rien ; seul un traitement assez long pour les attraper à leur réveil, ou un médicament actif sur les cellules dormantes, y parvient.

Exercice 12.10 ★★★

Montrer que l’état stationnaire du chémostat est stable : perturber $X$ légèrement au-dessus de $X^{*}$ et suivre les signes de $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t$ et de $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t$ . Expliquer ensuite pourquoi deux espèces qui se disputent un même nutriment dans un chémostat ne peuvent pas coexister à l’état stationnaire, et laquelle l’emporte à un $D$ donné.

Solution

Solution de Exercice 12.10.

$X > X^{*}$ : la consommation $\mu X/Y$ dépasse l’apport, donc $S$ tombe sous $S^{*}$ ; alors $\mu(S) < D$ et $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t < 0$ , $X$ redescend ; à mesure que $X$ baisse, $S$ remonte. Les deux écarts sont corrigés : l’état stationnaire est stable. Deux espèces : chacune a besoin de $\mu_{i}(S) = D$ pour persister, ce qui fixe son propre $S_{i}^{*}$ ; le nutriment ne peut prendre qu’une valeur, donc une espèce au plus persiste. Celle dont le $S^{*}(D)$ est le plus bas fait tomber $S$ sous ce dont l’autre a besoin, et l’autre est lessivée ; laquelle c’est peut changer avec $D$ si leurs courbes de Monod se croisent.

Exercice 12.11 ★★★

L’auto-inducteur induit sa propre synthase. Modifier le modèle de la Proposition 12.7 de sorte que $p$ saute de $p_{0}$ à $p_{1} \gg p_{0}$ quand $A > A_{\text{seuil}}$ , et montrer que le système peut avoir deux états stables sur une plage de densités (hystérésis) : une population qui s’est allumée reste allumée à une densité où une population naïve serait éteinte. Quelle en est l’utilité biologique ?

Solution

Solution de Exercice 12.11.

Avec la densité $\rho = N/V$ , l’état éteint $A = p_{0}\rho/k$ existe tant qu’il reste sous $A_{\text{seuil}}$ , c’est-à-dire $\rho < kA_{\text{seuil}}/p_{0}$ ; l’état allumé $A = p_{1}\rho/k$ existe tant qu’il reste au-dessus, c’est-à-dire $\rho > kA_{\text{seuil}}/p_{1}$ . Pour $kA_{\text{seuil}}/p_{1} < \rho < kA_{\text{seuil}}/p_{0}$ les deux sont cohérents : une population qui s’est allumée se maintient allumée par sa production plus forte, une population qui ne l’a pas fait reste éteinte. Usage : l’engagement — une fois qu’une colonie a décidé de bâtir un biofilm ou de libérer une toxine, un creux de densité ne défait pas la décision, et l’interrupteur est net et synchrone plutôt que progressif.

Exercice 12.12 ★★★

Expliquer la fenêtre de sélection des mutants et s’en servir pour plaider pour ou contre chacun de ces choix : (a) de fortes doses en cures courtes ; (b) de faibles doses en cures longues ; (c) arrêter quand les symptômes cèdent ; (d) l’association de médicaments.

Solution

Solution de Exercice 12.12.

(a) Fortes doses en cures courtes : la concentration reste au-dessus de la CMI des mutants et tue également le type sauvage et les mutants de premier rang — à retenir, dans la limite de la toxicité. (b) Faibles doses en cures longues : la concentration séjourne des jours dans la fenêtre et fabrique de la résistance — contre. (c) Arrêter quand les symptômes cèdent : les survivantes sont les cellules les moins sensibles et la concentration qui redescend traverse la fenêtre — contre. (d) Association : une cellule doit résister aux deux, ce qu’un milliard de cellules ne contient pas — pour.

12.7 Problème : un chémostat et une clinique

Problème 12.1

Problème du week-end — une culture menée en flacon puis maintenue dans un chémostat, une bactérie lumineuse comptée jusqu’à son quorum, et une infection traitée contre l’arithmétique de la résistance, pour finir sur les cellules du chémostat, la densité à laquelle la lumière s’allume et les chances qu’une cure à deux médicaments rencontre une cellule résistante

Données : E. coli à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $T = 20\,\mathrm{min}$ ; une cellule pèse $1\,\mathrm{pg}$ . Chémostat : $V = 1\,\mathrm{L}$ , $F = 0.5\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de glucose, $Y = 0.5$ . Vibrio : $p = 500$ molécules d’auto-inducteur par cellule et par heure, $A_{\text{seuil}} = 6\times 10^{12}$ molécules par litre ( $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ), $k = 0.05\,\mathrm{h}^{-1}$ dans l’organe lumineux. Infection : $10^{9}$ cellules ; résistance au médicament A à $10^{-8}$ par division, au médicament B à $10^{-7}$ ; CMI du type sauvage pour A $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , mutant de premier rang $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; une dose donne $16\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ qui décroît avec une demi-vie de $4\,\mathrm{h}$ .

Partie I — Le flacon.

Une cellule dans $100\,\mathrm{mL}$ de bouillon. Combien de cellules après $6\,\mathrm{h}$ de croissance exponentielle, et quelle densité par mL ?
Le bouillon ne supporte au plus que $2\times 10^{9}$ cellules par mL. Quand la croissance s’arrête-t-elle, et quelle est la masse de cellules de la culture ?
Combien de temps faudrait-il à la descendance d’une cellule pour atteindre la masse de la Terre ( $6\times 10^{27}$ g) ? Commenter.
La phase de latence dure $1\,\mathrm{h}$ quand on ensemence du milieu neuf avec des cellules de phase stationnaire, et presque rien avec des cellules exponentielles. Expliquer.
Calculer $\mu$ à partir de $T$ . Si l’on passe à un sucre sur lequel $T = 60\,\mathrm{min}$ , que vaut $\mu$ , et de quel facteur le nombre de cellules après $6\,\mathrm{h}$ diminue-t-il ?
Un échantillon de la culture stationnaire est étalé sur une boîte et donne $200$ colonies à partir de $0.1\,\mathrm{mL}$ d’une dilution au $10^{-6}$ . Quel est le compte de cellules viables, et pourquoi peut-il différer d’un comptage au microscope ?

Partie II — Le chémostat.

Calculer le taux de dilution $D$ et le temps de génération que la culture est forcée d’adopter.
Calculer $S^{*}$ et $X^{*}$ (en g/L et en cellules par mL).
Combien de cellules quittent la cuve par heure ? Combien de générations la culture traverse-t-elle en un mois ?
On monte la pompe à $F = 0.95\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ . Nouveaux $S^{*}$ et $X^{*}$ ? Que se passe-t-il à $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ ?
Un mutant apparaît avec $\mu_{\max} = 1.2\,\mathrm{h}^{-1}$ et le même $K_{S}$ . À $D = 0.5$ , de quel $S^{*}$ a-t-il besoin, et qu’advient-il de la souche d’origine ? (Utiliser l’Exercice 12.10.)
Un mois de fonctionnement fait $700$ générations. Si une mutation avantageuse apparaît à $10^{-9}$ par division et que la cuve contient $10^{12}$ cellules, combien de mutations avantageuses apparaissent par génération ? Que dit cela de l’évolution dans un chémostat ?

Partie III — Le quorum.

Calculer la densité cellulaire seuil pour la lumière dans l’organe lumineux, en cellules par mL.
L’organe lumineux contient $1\,\text{µ}\mathrm{L}$ de bactéries à $10^{10}$ par mL. De quel facteur l’auto-inducteur dépasse-t-il le seuil ?
En mer, le signal est emporté avec $k = 20\,\mathrm{h}^{-1}$ . Densité seuil ? Comparer aux $10^{2}$ cellules par mL du large.
Après que le calmar a expulsé $90\,\%$ des bactéries à l’aube, combien de temps faut-il aux $10^{9}$ par mL restantes, qui se divisent toutes les $2\,\mathrm{h}$ , pour rétablir $10^{10}$ par mL ? La lumière s’éteint-elle entre-temps ?
Chaque cellule qui brille dépense environ $20\,\%$ de son énergie en lumière. Pourquoi une cellule sombre est-elle favorisée en mer, et pourquoi pas dans l’organe ?
Un pathogène emploie le même système pour retarder ses toxines jusqu’à ce qu’il soit nombreux. Proposer une stratégie médicamenteuse qui l’exploite et dire pourquoi elle sélectionnerait la résistance plus lentement qu’un antibiotique.

Partie IV — La clinique.

Nombre attendu de cellules résistantes à A au début du traitement ; à B ; aux deux.
Probabilité qu’aucune cellule résistante à A n’existe ; aux deux.
Après la dose, quand la concentration tombe-t-elle à $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , puis à $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ? Combien de temps par dose passe-t-elle dans la fenêtre de sélection des mutants ?
Si le médicament est donné toutes les $12\,\mathrm{h}$ , quelle fraction du temps la concentration est-elle dans la fenêtre, et que cela prédit-il au cours d’une cure de dix jours avec A seul ?
Proposer un changement de posologie qui maintienne la concentration au-dessus de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ en permanence (calculer l’intervalle ou la dose nécessaire), et en dire le coût.
Une cellule sur $10^{4}$ est une persistante, dormante et insensible à toute concentration de l’un ou l’autre médicament. Combien en survivent à la cure, que se passe-t-il au retrait du médicament, et qu’est-ce que cela implique pour la durée du traitement ?
Résumer : les cellules par mL du chémostat (question 8), la densité seuil de la lumière (question 13) et la probabilité que la cure à deux médicaments ne rencontre aucune cellule résistante (question 20).

Solution

Solution de Problème 12.1.

1. $18$ générations : $2^{18} = 2.6\times 10^{5}$ cellules, $2.6\times 10^{3}$ par mL. 2. $2\times 10^{9}\times 100 = 2\times 10^{11}$ cellules $= 2^{37.5}$ : au bout de $12.5\,\mathrm{h}$ ; masse $0.2\,\mathrm{g}$ . 3. $6\times 10^{27}/10^{-12} = 6\times 10^{39} = 2^{132}$ cellules : $132$ générations, $44\,\mathrm{h}$ . Les nutriments, le dioxygène et les déchets l’arrêtent en moins d’un jour ; la croissance exponentielle est toujours brève. 4. Les cellules stationnaires ont démonté leurs ribosomes et réprimé leurs enzymes métaboliques ; il leur faut les rebâtir avant de se diviser. Les cellules exponentielles arrivent tout équipées. 5. $\mu = \ln 2/0.333\,\mathrm{h} = 2.08\,\mathrm{h}^{-1}$ ; à $T = 60\,\mathrm{min}$ , $0.69\,\mathrm{h}^{-1}$ ; après $6\,\mathrm{h}$ $2^{6} = 64$ au lieu de $2^{18}$ : un facteur $2^{12} \approx 4000$ de moins. 6. $200/(0.1\times 10^{-6}) = 2\times 10^{9}$ cellules viables par mL. Le microscope compte aussi les cellules mortes et celles qui ne pousseront pas sur la boîte, et un amas ne donne qu’une colonie. 7. $D = 0.5/1 = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ ; $T = \ln 2/0.5 = 1.39\,\mathrm{h} = 83\,\mathrm{min}$ . 8. $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; $X^{*} = 0.5\times 1.99 \approx 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 10^{12}$ cellules par litre, soit $10^{9}$ par mL. 9. $0.5\times 10^{12} = 5\times 10^{11}$ cellules par heure ; $720/1.39 \approx 520$ générations par mois. 10. $D = 0.95$ : $S^{*} = 0.01\times 0.95/0.05 = 0.19\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.5\times 1.81 = 0.9\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . À $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $D > \mu_{\max}$ : lessivage. 11. Le mutant se contente de $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.7 = 0.0071\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; à ce glucose la souche d’origine croît à $1.0\times 0.0071/0.0171 = 0.42\,\mathrm{h}^{-1} < D$ et décline comme $e^{-0.08t}$ : lessivée en quelques semaines. Le mutant prend la place. 12. $10^{-9}\times 10^{12} = 1000$ mutations avantageuses par génération : l’adaptation est continue, un nouveau clone avantageux balayant la cuve toutes les quelques centaines de générations — le chémostat est une machine à évoluer. 13. $kA_{\text{seuil}}/p = 0.05\times 6\times 10^{12}/500 = 6\times 10^{8}$ par litre $= 6\times 10^{5}$ cellules par mL. 14. $10^{10}/6\times 10^{5} \approx 1.7\times 10^{4}$ fois. 15. $20\times 6\times 10^{12}/500 = 2.4\times 10^{11}$ par litre, $2.4\times 10^{8}$ par mL — six ordres de grandeur au-dessus des $10^{2}$ par mL de la mer : sombres. 16. Un facteur dix fait $3.3$ doublements, $6.6\,\mathrm{h}$ . À $10^{9}$ par mL la population est encore $1700$ fois au-dessus du seuil : la lumière reste allumée. 17. En mer personne ne voit la lumière et elle ne nourrit aucun hôte : un mutant sombre économise $20\,\%$ et dépasse les lumineuses. Dans l’organe, le calmar sélectionne la lumière — il expulse les tricheuses sombres ou cesse de les nourrir — de sorte que le coût achète un logis. 18. Bloquer le récepteur ou détruire l’auto-inducteur (l’extinction du quorum) : les bactéries vivent mais ne déploient jamais leurs toxines, et le système immunitaire les élimine. Puisque bactéries sensibles et « résistantes » croissent également — rien n’est tué — l’avantage sélectif d’échapper au médicament est faible, et la résistance devrait se répandre plus lentement que face à un médicament qui tue. 19. A : $10^{-8}\times 10^{9} = 10$ ; B : $100$ ; les deux : $10^{-15}\times 10^{9} = 10^{-6}$ . 20. $P_{0}(\text{A}) = e^{-10} = 5\times 10^{-5}$ ; $P_{0}(\text{les deux}) = e^{-10^{-6}} = 0.999999$ . 21. $16 \to 8$ : une demi-vie, $4\,\mathrm{h}$ ; $16 \to 1$ : quatre, $16\,\mathrm{h}$ ; dans la fenêtre de $4\,\mathrm{h}$ à $16\,\mathrm{h}$ , soit $12\,\mathrm{h}$ par dose. 22. Une dose toutes les $12\,\mathrm{h}$ : dans la fenêtre de l’heure $4$ à l’heure $12$ , les deux tiers du temps ; sur dix jours les mutants de premier rang de A — une dizaine au départ — sont sélectionnés et A seul échoue. 23. Au-dessus de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ en permanence : une dose à chaque demi-vie ( $4\,\mathrm{h}$ ), ou une dose atteignant un pic de $64\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ toutes les $12\,\mathrm{h}$ ( $64 \to 8$ en trois demi-vies), ou une perfusion continue. Coûts : la toxicité de pics élevés, ou six prises par jour que les patients ne tiendront pas. 24. $10^{-4}\times 10^{9} = 10^{5}$ persistantes survivent quoi qu’il arrive ; à l’arrêt du traitement elles se réveillent et reconstituent une population entièrement sensible — une rechute. Le traitement doit durer assez pour les attraper à leur sortie de dormance, ce qui explique que la tuberculose demande six mois. 25. $10^{9}$ cellules par mL dans le chémostat ; la lumière s’allume à $6\times 10^{5}$ cellules par mL ; $P_{0} = 0.999999$ que la cure à deux médicaments ne rencontre aucune cellule résistante.

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