Biologie universitaire — 3e année · Bachelor Year 3

2ARN non codants et régulation post-transcriptionnelle

En 1990, deux botanistes ont voulu rendre des pétunias d’un pourpre plus soutenu en leur donnant des copies supplémentaires du gène de l’enzyme du pigment. Près de la moitié des plantes transgéniques sont sorties blanches, ou pourpres avec des secteurs blancs : le gène ajouté avait éteint la copie propre de la plante en même temps que lui-même. Huit ans plus tard, deux généticiens du ver, en injectant de l’ARN dans Caenorhabditis elegans, ont trouvé qu’un ARN double brin correspondant à un gène musculaire éteignait ce gène, chez le ver injecté et dans sa descendance, bien plus puissamment que l’un ou l’autre brin seul. Les deux énigmes avaient une même réponse : la cellule possède une machinerie qui se sert de courts ARN pour trouver et réduire au silence les ARN de séquence complémentaire. Cette machinerie, et plus largement tout ce qui advient à un ARN messager après sa transcription — comment il est épissé, où il est envoyé, combien de temps il vit, s’il est traduit — font l’objet de ce chapitre. Le volume de première année traitait le gène comme une unité allumée ou éteinte à son promoteur ; ici c’est le transcrit lui-même qui devient l’objet du contrôle.

2.1 Le recensement des ARN d’une cellule

Définition 2.1 (ARN non codant)

Un ARN non codant (ncARN) est un transcrit qui fonctionne en tant qu’ARN et non comme matrice d’une protéine. Outre les ARN ribosomiques et de transfert de la traduction et les petits ARN nucléaires (snARN) du spliceosome, une cellule eucaryote contient : des microARN (miARN) de $21\text{ à }23$ nucléotides, découpés dans des tiges-boucles portées par ses propres transcrits et qui guident la répression de messagers partiellement complémentaires ; des petits ARN interférents (siARN), de même longueur, découpés dans de longs ARN double brin et qui guident le clivage de cibles parfaitement appariées ; des ARN interagissant avec Piwi (piARN), de $26\text{ à }31$ nucléotides, actifs dans la lignée germinale contre les transposons ; de petits ARN nucléolaires qui guident la modification des ARN ribosomiques ; et de longs ARN non codants (lncARN), transcrits de plus de $200\,\mathrm{nt}$ sans cadre de lecture ouvert digne de ce nom, dont Xist du Chapitre 1 est le mieux compris. Les exons codants représentent environ $1.5\,\%$ du génome humain ; une grande partie du reste est transcrite à un moment ou un autre dans une cellule ou une autre, mais quelle part de cette transcription est fonctionnelle reste une question ouverte.

Remarque 2.2 (L’abondance n’est pas la fonction)

Un transcrit peut être détecté parce que la polymérase fuit, et non parce que l’ARN fait quelque chose ; la plupart des lncARN sont présents à moins d’une copie par cellule, mal conservés et sans conséquence lorsqu’on les supprime. Le critère de fonction est génétique : un phénotype lorsque l’ARN, et non seulement son ADN, est retiré. Xist, les miARN et les piARN le passent haut la main ; des dizaines de milliers de lncARN annotés, quelques centaines l’ont passé à ce jour.

2.2 L’interférence par ARN et les microARN

Définition 2.3 (Interférence par ARN)

L’interférence par ARN (ARNi) est la répression d’un gène, spécifique de sa séquence, par un petit ARN dérivé d’un ARN double brin. L’enzyme Dicer, une RNase III, découpe le long ARN double brin en duplex de $21\text{ à }23$ nucléotides à extrémités 3 $'$ sortantes de deux nucléotides ; un brin de chaque duplex, le brin guide, est chargé dans une protéine Argonaute pour former le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC). Le guide s’apparie à un ARN cible complémentaire, et le domaine endonucléase d’Argonaute coupe la cible en face des nucléotides 10 et 11 du guide ; l’ARN coupé est ensuite dégradé et le RISC libéré pour en trouver un autre. Chez les plantes, les vers et les champignons, une ARN polymérase ARN-dépendante recopie la cible en un nouvel ARN double brin, si bien que le signal est amplifié et se propage ; les mammifères n’ont pas cette étape.

Faits expérimentaux. Napoli, Lemieux et Jorgensen (1990) ont introduit dans le pétunia une copie supplémentaire du gène de la chalcone synthase pour intensifier la couleur des fleurs ; $42\,\%$ des transformants sont sortis blancs ou panachés, le transgène et le gène endogène étant tous deux éteints — la « cosuppression ». Guo et Kemphues (1995) ont trouvé qu’un ARN antisens dirigé contre un gène de C. elegans l’éteignait, mais que le témoin sens le faisait aussi. Fire, Mello et leurs collègues (1998) ont levé le paradoxe : leurs préparations de brins isolés étaient contaminées par des doubles brins, et l’ARN double brin purifié d’unc-22 injecté à un ver donnait le phénotype tremblant unc-22 à des concentrations de quelques molécules par cellule, alors que l’ARN sens ou antisens pur ne donnait presque rien ; la répression gagnait des tissus éloignés du point d’injection et passait à la descendance. Hamilton et Baulcombe (1999) ont détecté les ARN de $25\,\mathrm{nt}$ dans les plantes éteintes, et Zamore et ses collègues (2000) ont montré, dans un extrait de mouche, que l’ARN double brin y est découpé et que la cible est clivée à intervalles de $21\,\mathrm{nt}$ . ∎

À gauche : des pétunias porteurs d’un gène de pigment supplémentaire, avec les secteurs blancs de la cosuppression. À droite : le nématode Caenorhabditis elegans, long d’environ un millimètre et transparent, chez qui un ARN double brin injecté a éteint le gène correspondant dans l’animal entier et chez sa descendance. — À gauche : des pétunias porteurs d’un gène de pigment supplémentaire, avec les secteurs blancs de la cosuppression. À droite : le nématode *Caenorhabditis elegans*, long d’environ un millimètre et transparent, chez qui un ARN double brin injecté a éteint le gène correspondant dans l’animal entier et chez sa descendance.

Définition 2.4 (Les microARN)

Un microARN est codé dans le génome — par un gène propre ou par un intron d’un gène codant — et transcrit par l’ARN polymérase II sous forme d’un long transcrit primaire (pri-miARN) contenant une tige-boucle d’environ $70\,\mathrm{nt}$ . Dans le noyau, la RNase III Drosha, avec son partenaire DGCR8, découpe la tige-boucle (le pré-miARN) ; l’exportine-5 la transporte dans le cytoplasme, où Dicer retire la boucle et laisse un duplex de $22\,\mathrm{nt}$ . Un brin est chargé dans Argonaute. Le miARN mature reconnaît ses cibles surtout par sa graine, les nucléotides 2 à 8, qui s’apparie à des sites situés le plus souvent dans la région 3 $'$ non traduite d’un messager ; le reste du miARN s’apparie imparfaitement, de sorte que la cible n’est pas clivée mais réprimée : le RISC recrute des protéines qui raccourcissent la queue poly(A), retirent la coiffe et inhibent la traduction, et le messager est dégradé plus vite. Une graine ne faisant que sept nucléotides, un miARN a des centaines de cibles, et plus de la moitié des gènes codants humains portent des sites conservés pour au moins l’un des quelques centaines de miARN humains bien établis.

Faits expérimentaux. lin-4, un gène nécessaire au passage du ver de son premier stade larvaire au second, s’est révélé chez Lee, Feinbaum et Ambros (1993) coder non pas une protéine mais un ARN de $22\,\mathrm{nt}$ , complémentaire de sept sites de la région 3 $'$ non traduite du messager de lin-14, le gène qu’il était connu pour réprimer. Lorsque la larve entre dans le second stade, la protéine LIN-14 disparaît alors que son ARNm demeure : la répression est post-transcriptionnelle. Reinhart et ses collègues (2000) ont trouvé un second ARN de ce type, let-7, qui commande les transitions larvaires suivantes ; Pasquinelli (2000) a trouvé let-7 chez la mouche et chez l’homme, avec la même séquence, ce qui a fait d’une curiosité du ver un mécanisme général. ∎

Biogenèse d’un microARN. La tige-boucle est découpée dans le transcrit primaire par Drosha dans le noyau, exportée, taillée par Dicer en un duplex de 22\, nt, et un brin est chargé dans Argonaute. La graine s’apparie à un site de la région 3' non traduite d’un messager, et le messager est désadénylé, dégradé et moins traduit. — Biogenèse d’un microARN. La tige-boucle est découpée dans le transcrit primaire par Drosha dans le noyau, exportée, taillée par Dicer en un duplex de $22\,\mathrm{nt}$ , et un brin est chargé dans Argonaute. La graine s’apparie à un site de la région 3 $'$ non traduite d’un messager, et le messager est désadénylé, dégradé et moins traduit.

Théorème 2.5 (Ce qu’un microARN fait au niveau et à la vitesse d’un messager)

Un messager est synthétisé à la vitesse constante $k$ et dégradé avec la constante de vitesse du premier ordre $\gamma$ ; un microARN présent au niveau $R$ ajoute un terme de dégradation $\gamma' R\, m$ . Le niveau d’ARNm $m(t)$ obéit alors à

\frac{\mathrm{d}m}{\mathrm{d}t} = k - (\gamma + \gamma' R)\, m, \qquad m^{*} = \frac{k}{\gamma + \gamma' R}, \qquad m(t) = m^{*} + (m_{0} - m^{*})\,e^{-(\gamma + \gamma' R)t}.

Le microARN abaisse l’état stationnaire d’un facteur $1 + \gamma' R/ \gamma$ et raccourcit du même facteur la constante de temps de toute variation de $m$ , qui passe de $1/\gamma$ à $1/(\gamma + \gamma' R)$ . Un gène réglé par un microARN est donc à la fois plus discret et plus rapide : il atteint plus tôt un nouvel état stationnaire après un changement de son promoteur, et les fluctuations de sa transcription sont amorties.

Démonstration. L’équation est linéaire à coefficients constants ; son point fixe est $m^{*}$ , où le membre de droite s’annule, et le changement de variable $u = m - m^{*}$ donne $\mathrm{d}u/\mathrm{d}t = -(\gamma + \gamma' R)\,u$ , d’où l’exponentielle. Le temps de demi-approche vaut $\ln 2/(\gamma + \gamma' R)$ , et $\gamma = \ln 2 / t_{1/2}$ où $t_{1/2}$ est la demi-vie naturelle du messager. ∎

Exemple 2.6 (Une répression d’un facteur quatre)

Un messager de demi-vie naturelle $30\,\mathrm{min}$ ( $\gamma = 0.023\,\mathrm{min}^{-1}$ ), transcrit à $k = 2$ molécules par minute, se tient à $m^{*} = 2/0.023 \approx 87$ copies par cellule et met $30\,\mathrm{min}$ à parcourir la moitié du chemin vers un nouveau niveau après un changement de son promoteur. Un microARN qui triple sa constante de dégradation ( $\gamma' R = 3\gamma$ ) le ramène à $22$ copies et ramène le temps de demi-approche à $7.5\,\mathrm{min}$ . Les mêmes nombres, lus à l’envers, montrent pourquoi l’invalidation d’un miARN donne souvent des phénotypes discrets : un facteur quatre sur un messager lui-même tamponné en aval peut laisser l’organisme presque normal, et l’effet ne se voit que sous contrainte ou dans la chronologie.

Montée d’un messager après l’allumage de son promoteur, avec les nombres de l’. Le microARN abaisse le plateau d’un facteur quatre et l’atteint quatre fois plus tôt. — Montée d’un messager après l’allumage de son promoteur, avec les nombres de l’Exemple 2.6. Le microARN abaisse le plateau d’un facteur quatre et l’atteint quatre fois plus tôt.

Méthode 2.7 (Éteindre un gène par ARN interférence)

Pour réduire un gène au silence sans toucher à son ADN : (1) choisir une séquence de $21\,\mathrm{nt}$ propre à son messager, en évitant les correspondances de graine avec d’autres gènes ; (2) l’apporter sous forme d’un duplex de siARN de synthèse (transitoire, quelques jours) ou d’un ARN en épingle à cheveux court (shARN) exprimé par un vecteur, que Dicer traite en continu ; chez le ver, nourrir les animaux de bactéries exprimant l’ARN double brin ; (3) mesurer le messager par PCR quantitative et la protéine par immunoempreinte, en attendant une perte de $70\text{ à }95\,\%$ plutôt que l’absence complète d’une invalidation ; (4) contrôler les effets hors cible par un second siARN non chevauchant et par un sauvetage à l’aide d’une version du gène résistante à l’ARNi. Une extinction est une perte de fonction partielle et réversible ; les thérapies géniques aujourd’hui autorisées sur ce principe apportent des siARN dirigés contre des messagers hépatiques (transthyrétine, PCSK9) couplés à un sucre que l’hépatocyte capte.

2.3 Les petits ARN qui gardent le génome

Définition 2.8 (piARN et répression des transposons)

Les piARN sont des ARN de $26\text{ à }31$ nucléotides, produits sans Dicer à partir de longs transcrits simple brin d’amas de piARN génomiques — des cimetières de copies défectueuses de transposons — et chargés sur la sous-famille PIWI des protéines Argonaute, dans la lignée germinale. Un piARN antisens d’un transposon guide le clivage des transcrits de ce transposon ; le fragment clivé devient un nouveau piARN sens, qui à son tour coupe les transcrits de l’amas pour fabriquer d’autres piARN antisens — le cycle ping-pong, amplification qui vise précisément le transposon actif du moment. Des protéines PIWI nucléaires dirigent en outre la méthylation de H3K9 et la méthylation de l’ADN sur les copies génomiques du transposon, reliant l’ARN aux marques de chromatine du Chapitre 1. Une mère dépose ses piARN dans l’ovocyte ; une femelle dont la lignée n’a jamais rencontré un transposon n’a pas de piARN contre lui, et sa descendance issue d’un mâle porteur est stérile — c’est la dysgénésie hybride, vue d’abord dans des croisements de drosophiles entre souches de laboratoire et souches sauvages.

Proposition 2.9 (Répression de la chromatine dirigée par l’ARN)

Chez les plantes, une voie dédiée — l’ARN polymérase IV transcrit un locus, une ARN polymérase ARN-dépendante en fait un double brin, un Dicer découpe des siARN de $24\,\mathrm{nt}$ , Argonaute 4 les ramène sur les transcrits naissants de la polymérase V au même locus et recrute la méthyltransférase DRM2 — méthyle l’ADN des transposons et des séquences répétées ; c’est le mécanisme de la paramutation. Chez la levure à fission, des siARN issus des répétitions centromériques recrutent la méthyltransférase de H3K9 et bâtissent l’hétérochromatine dont le centromère a besoin. Dans les deux cas un ARN trouve une place du génome par complémentarité et une marque de chromatine y est écrite : spécifique de la séquence, auto-entretenue, et héritable au travers des divisions.

2.4 La vie d’un messager

Définition 2.10 (Épissage régulé)

L’épissage alternatif produit des messagers différents à partir d’un seul gène, par saut d’exon, par le choix entre des exons mutuellement exclusifs, par la rétention d’un intron ou par l’emploi de sites d’épissage 5 $'$ ou 3 $'$ de rechange. Il est réglé par des protéines de liaison à l’ARN qui reconnaissent des éléments de séquence dans les exons et les introns voisins d’un site d’épissage : les protéines SR fixées sur des amplificateurs exoniques recrutent le spliceosome et favorisent l’inclusion de l’exon, les protéines hnRNP fixées sur des silenceurs la bloquent, et l’issue dans une cellule donnée est fixée par les quantités relatives des deux familles. Plus de $90\,\%$ des gènes humains à plusieurs exons subissent un épissage alternatif ; le gène Dscam de la drosophile, avec ses quatre blocs d’exons mutuellement exclusifs (12, 48, 33 et 2 possibilités), peut produire $38\,016$ protéines distinctes, chaque neurone en exprimant un jeu différent qui permet à ses branches de se reconnaître et de s’éviter.

Faits expérimentaux. Le sexe d’une mouche est décidé par une cascade d’épissages. Chez la femelle, le gène Sex-lethal (Sxl) fabrique une protéine fonctionnelle ; SXL est une protéine de liaison à l’ARN qui bloque un site d’épissage dans son propre transcrit (de sorte qu’un exon porteur d’un codon stop est sauté et que la protéine continue d’être produite) et dans le transcrit de transformer, ce qui impose l’épissage femelle ; TRA, avec TRA-2, se fixe ensuite sur un amplificateur exonique du transcrit de doublesex et dirige la forme femelle du facteur de transcription DSX. Chez le mâle, faute de SXL, chacun de ces transcrits prend l’épissage par défaut, transformer contient un codon stop, et DSX sort sous la forme mâle. Tout caractère sexuellement dimorphe de la mouche découle du DSX produit ; une femelle dont tra est muté se développe en mâle. ∎

Définition 2.11 (Stabilité et localisation des ARNm)

La demi-vie d’un messager va de la minute au jour et est fixée par des éléments de sa région 3 $'$ non traduite. Les éléments riches en AU (répétitions AUUUA) des messagers de cytokines, de facteurs de croissance et de proto-oncogènes sont reconnus par des protéines qui recrutent des désadénylases et donnent des demi-vies de $10\text{ à }30\,\mathrm{min}$ , si bien qu’une bouffée de transcription produit une bouffée de protéine et rien de plus ; les mutations qui les suppriment causent une surexpression et, pour certains proto-oncogènes, un cancer. Les éléments de localisation, souvent structurés, sont reconnus par des adaptateurs qui relient le messager à un moteur : les messagers de bicoid et d’oskar sont portés aux deux pôles de l’œuf de mouche par la dynéine et la kinésine sur les microtubules, le messager de la $\beta$ -actine au bord avant d’un fibroblaste, et les messagers des protéines synaptiques dans les dendrites, où ils sont traduits à la demande. L’élément de réponse au fer (IRE), une tige-boucle reconnue par les protéines régulatrices du fer IRP1 et IRP2 quand le fer est rare, fait deux travaux opposés depuis deux positions : dans la région 5 $'$ non traduite du messager de la ferritine, l’IRP fixée bloque le ribosome ; dans la région 3 $'$ non traduite du messager du récepteur de la transferrine, l’IRP fixée protège le transcrit d’une nucléase.

Exemple 2.12 (Le fer, lu par une seule tige-boucle)

Quand le fer est bas, l’IRP se fixe sur les deux messagers : la ferritine, protéine de stockage, n’est pas traduite, et le récepteur de la transferrine, qui importe le fer, est stabilisé et abondant — la cellule stocke moins et importe plus. Quand le fer est haut, il convertit IRP1 en aconitase (elle acquiert un centre fer–soufre et perd son affinité pour l’ARN) et déclenche la dégradation d’IRP2 : la ferritine est traduite, le messager du récepteur se dégrade en quelques minutes, et la cellule stocke plus et importe moins. Aucun changement de transcription n’est nécessaire. Une mutation ponctuelle de l’IRE de la ferritine qui empêche la fixation de l’IRP cause une synthèse constitutive de ferritine et le syndrome héréditaire hyperferritinémie–cataracte.

L’élément de réponse au fer. Quand le fer est bas, la protéine régulatrice du fer se fixe sur les tiges-boucles IRE : à l’extrémité 5' du messager de la ferritine elle bloque la traduction, à l’extrémité 3' du messager du récepteur de la transferrine elle bloque une nucléase. Quand le fer est haut la protéine les libère tous deux : la ferritine est produite, le messager du récepteur se dégrade. — L’élément de réponse au fer. Quand le fer est bas, la protéine régulatrice du fer se fixe sur les tiges-boucles IRE : à l’extrémité 5 $'$ du messager de la ferritine elle bloque la traduction, à l’extrémité 3 $'$ du messager du récepteur de la transferrine elle bloque une nucléase. Quand le fer est haut la protéine les libère tous deux : la ferritine est produite, le messager du récepteur se dégrade.

Proposition 2.13 (Contrôle traductionnel)

L’initiation est le point de contrôle habituel de la traduction. La phosphorylation du facteur d’initiation eIF2 par des kinases qui détectent une carence en acides aminés, des protéines mal repliées, un ARN double brin viral ou un manque d’hème arrête l’initiation générale en quelques minutes, en épargnant quelques messagers dotés de particularités — notamment ceux qui portent des cadres de lecture ouverts en amont, courts cadres de lecture de la région 5 $'$ non traduite, qui piègent normalement les ribosomes et que la contrainte fait contourner, de sorte que les facteurs de réponse au stress (GCN4 chez la levure, ATF4 chez les mammifères) sont produits précisément quand tout le reste ne l’est pas. Le facteur de liaison à la coiffe eIF4E est maintenu inactif par les protéines 4E-BP jusqu’à ce que la kinase de signalisation de croissance mTOR les phosphoryle : une cellule ne traduit à plein régime que si les nutriments et les facteurs de croissance le lui disent. Chez les bactéries, les riborégulateurs y parviennent sans aucune protéine : une région 5 $'$ structurée fixe un métabolite (pyrophosphate de thiamine, S-adénosylméthionine, une purine) et, en le fixant, se replie autrement pour enfouir le site de fixation du ribosome ou former un terminateur de transcription, de sorte qu’un opéron de biosynthèse s’éteint quand son produit est abondant.

Un long ARN non codant à l’œuvre : le transcrit Xist (rouge), détecté par hybridation fluorescente, recouvre le territoire d’un chromosome X dans un noyau de femelle (ADN en bleu). — Un long ARN non codant à l’œuvre : le transcrit *Xist* (rouge), détecté par hybridation fluorescente, recouvre le territoire d’un chromosome X dans un noyau de femelle (ADN en bleu).

Remarque 2.14 (Ce que rapporte le contrôle post-transcriptionnel)

Le contrôle transcriptionnel passe par le noyau, avec un délai de quelques minutes à quelques heures avant qu’un nouveau messager soit produit, exporté et traduit. Le contrôle du messager lui-même agit là où la protéine est nécessaire, en quelques secondes à quelques minutes, et il peut être local : une seule dendrite traduisant un messager à une seule synapse, le bord avant d’un fibroblaste fabriquant de l’actine là où il rampe. Il fait en outre d’un gène plusieurs protéines, et permet à un seul signal — le fer, un acide aminé, un microARN — de coordonner des centaines de messagers à la fois sans toucher au moindre promoteur.

2.5 Exercices

Exercice 2.1 ★

Distinguer miARN, siARN et piARN par leur origine, leur longueur, leur dépendance à Dicer et ce qu’ils font à leurs cibles.

Solution

Solution de Exercice 2.1.

miARN : codé dans le génome sous forme de tige-boucle, $22\,\mathrm{nt}$ , découpé par Drosha puis par Dicer, s’apparie imparfaitement par sa graine et réprime la traduction et la stabilité de nombreux messagers. siARN : issu d’un long ARN double brin (viral, transgénique, expérimental), $21\,\mathrm{nt}$ , dépendant de Dicer, s’apparie parfaitement et dirige le clivage de la cible par Argonaute. piARN : issu de transcrits simple brin d’amas de piARN, $26\text{ à }31\,\mathrm{nt}$ , indépendant de Dicer, chargé sur les protéines PIWI dans la lignée germinale, clive les transcrits de transposons (ping-pong) et dirige la répression chromatinienne de l’ADN des transposons.

Exercice 2.2 ★

Retracer la biogenèse d’un microARN depuis son gène jusqu’à un messager réprimé, en nommant l’enzyme de chaque coupure.

Solution

Solution de Exercice 2.2.

La Pol II transcrit le pri-miARN ; Drosha (avec DGCR8) découpe la tige-boucle dans le noyau ; l’exportine-5 exporte le pré-miARN ; Dicer retire la boucle et laisse un duplex de $22\,\mathrm{nt}$ ; un brin est chargé dans Argonaute ; la graine (nucléotides 2–8) s’apparie à un site de la 3 $'$ UTR ; Argonaute recrute la machinerie de désadénylation et de décoiffage et bloque l’initiation — le messager est moins traduit et se dégrade plus vite.

Exercice 2.3 ★

Pourquoi l’injection d’ARN sens d’unc-22 à des vers éteignait-elle le gène dans les premières expériences, et qu’ont changé Fire et Mello ?

Solution

Solution de Exercice 2.3.

L’ARN fabriqué in vitro par une polymérase de phage contenait des contaminants double brin (la polymérase copie aussi l’autre brin de la matrice et déborde des extrémités), de sorte que les préparations « sens » portaient le vrai déclencheur. Fire et Mello ont purifié chaque brin, montré que chacun seul faisait peu, puis les ont appariés délibérément : l’ARN double brin était au moins cent fois plus puissant, quelques molécules par cellule suffisant.

Exercice 2.4 ★

Qu’advient-il de la ferritine et du récepteur de la transferrine lorsqu’une cellule est privée de fer ? Quelle étape de l’expression est contrôlée dans chaque cas ?

Solution

Solution de Exercice 2.4.

Privée de fer : l’IRP se fixe sur les IRE. Ferritine : l’initiation de la traduction est bloquée, aucune protéine de stockage n’est produite (contrôle de la traduction). Récepteur de la transferrine : le messager est protégé de sa nucléase et s’accumule, donc plus de récepteur est produit et plus de fer importé (contrôle de la stabilité du messager).

Exercice 2.5 ★★

Un messager a une demi-vie de $2\,\mathrm{h}$ et est produit à $5$ molécules par minute. Calculer son niveau stationnaire, puis le niveau et le temps de demi-approche lorsqu’un microARN double sa constante de dégradation.

Solution

Solution de Exercice 2.5.

$\gamma = \ln 2/120\,\mathrm{min} = 0.0058\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $m^{*} = 5/0.0058 \approx 870$ molécules. Dégradation doublée : $m^{*} \approx 430$ , temps de demi-approche $120\,\mathrm{min}/2 = 60\,\mathrm{min}$ .

Exercice 2.6 ★★

Une graine de sept nucléotides s’apparie à une séquence aléatoire avec la probabilité $4^{-7}$ . Dans un jeu de $20\,000$ messagers dont les régions 3 $'$ non traduites mesurent en moyenne $1000\,\mathrm{nt}$ , combien de sites une graine de microARN rencontre-t-elle par hasard ? Qu’est-ce qui distingue alors une vraie cible ?

Solution

Solution de Exercice 2.6.

Séquence 3 $'$ UTR totale $2\times 10^{7}$ nt ; correspondances dues au hasard $2\times 10^{7}/4^{7} = 2\times 10^{7}/16\,384 \approx 1200$ sites. Une vraie cible se reconnaît à la conservation du site entre espèces, à un contexte favorable (voisinage riche en AU, site éloigné du codon stop, appariement supplémentaire à l’extrémité 3 $'$ du miARN), à la coexpression du miARN et de la cible dans la même cellule, et à l’expérience : le messager baisse quand le miARN est présent et ne baisse plus quand le site est muté.

Exercice 2.7 ★★

Prévoir le sexe d’une mouche (a) porteuse d’une mutation de perte de fonction de tra et de deux chromosomes X ; (b) exprimant TRA depuis un transgène constitutif, avec un seul X ; (c) totalement dépourvue de dsx.

Solution

Solution de Exercice 2.7.

(a) XX, tra nul : SXL est produite mais pas TRA, dsx prend l’épissage mâle par défaut — un mâle somatique (stérile). (b) XY avec TRA constitutive : TRA-2 est présente dans les deux sexes, donc DSX est produite sous la forme femelle — développement somatique femelle (une « pseudo-femelle » stérile, la lignée germinale suivant d’autres indices). (c) Pas de dsx : aucune des deux formes de DSX, donc aucun des deux programmes de différenciation terminale n’est imposé — un intersexué aux caractères mixtes ou incomplets.

Exercice 2.8 ★★

Le messager d’un proto-oncogène a normalement une demi-vie de $15\,\mathrm{min}$ à cause d’un élément riche en AU. Une translocation chromosomique enlève l’élément et la demi-vie passe à $3\,\mathrm{h}$ . De quel facteur le niveau de protéine monte-t-il, si la traduction et la dégradation des protéines sont inchangées ? Pourquoi est-ce oncogène alors que la protéine est normale ?

Solution

Solution de Exercice 2.8.

À l’état stationnaire le messager, et donc la protéine, est proportionnel à la demi-vie du messager : $180\,\mathrm{min}/15\,\mathrm{min} = 12$ fois plus de protéine. La protéine est un signal de croissance normal censé être transitoire, une impulsion après chaque stimulus ; produite douze fois plus et en continu, elle entraîne la prolifération sans stimulus. C’est la dose et la chronologie, non la séquence, qui la rendent oncogène.

Exercice 2.9 ★★

Une souche de laboratoire de drosophile est dépourvue d’éléments P ; une souche sauvage en porte. Prévoir la fertilité de la descendance de (a) femelles de laboratoire $\times$ mâles sauvages, (b) femelles sauvages $\times$ mâles de laboratoire, et expliquer l’asymétrie par les piARN.

Solution

Solution de Exercice 2.9.

(a) Mère de laboratoire, père sauvage : les œufs ne portent pas de piARN contre les éléments P (la lignée de la mère ne les a jamais rencontrés), les éléments P paternels transposent librement dans la lignée germinale de la descendance — stérile (dysgénésique). (b) Mère sauvage : ses œufs contiennent des piARN d’éléments P, qui répriment les éléments chez la descendance — fertile. L’asymétrie tient au dépôt maternel des piARN, hérédité d’un ARN et non de gènes.

Exercice 2.10 ★★★

À l’aide du Théorème 2.5, montrer que la protéine issue d’un messager fluctue moins, en valeur relative, lorsque le messager est sous contrôle d’un microARN, à niveau moyen de messager égal. (La protéine moyenne le messager sur sa propre durée de vie, et le messager se renouvelle plus vite.) Pourquoi une cellule paierait-elle un microARN et une transcription plus forte pour obtenir la même moyenne ?

Solution

Solution de Exercice 2.10.

La protéine intègre son messager sur sa propre durée de vie $\tau_{p}$ . Les messagers vivent $\tau_{m} = 1/(\gamma + \gamma' R)$ ; pendant $\tau_{p}$ la protéine voit donc environ $\tau_{p}/\tau_{m}$ durées de vie de messager indépendantes, chacune un événement aléatoire de naissance et de mort. La fluctuation relative d’une moyenne sur $N$ événements indépendants décroît en $1/\sqrt{N}$ , de sorte qu’un $\tau_{m}$ plus court sous contrôle d’un microARN — à messager moyen égal, ce qui exige un $k$ proportionnellement plus élevé — donne une protéine plus lisse. La cellule paie le microARN et la transcription supplémentaire pour acheter de la précision et de la vitesse : un niveau fixé par un équilibre entre synthèse rapide et dégradation rapide est à la fois moins bruité et plus prompt à se réajuster que le même niveau fixé par une synthèse lente et une dégradation lente.

Exercice 2.11 ★★★

Chez le ver, une ARN polymérase ARN-dépendante fabrique des siARN secondaires à partir du messager cible ; chez les mammifères, il n’y en a pas. Prévoir, pour chacun, si la répression obtenue par une seule injection d’ARN double brin dure au travers de nombreuses divisions cellulaires et si elle se propage à d’autres tissus, et expliquer la conséquence médicale pour les médicaments à siARN.

Solution

Solution de Exercice 2.11.

Ver : l’ARN polymérase ARN-dépendante fabrique de nouveaux siARN à partir du messager cible lui-même, de sorte que le signal est renouvelé tant que la cible est transcrite, survit à la dilution par les divisions et, grâce à un canal à ARN double brin entre cellules, gagne d’autres tissus et la lignée germinale pour quelques générations. Mammifère : pas d’amplification, donc les siARN sont consommés et dilués à chaque division, n’agissent que dans les cellules qui les ont reçus, et s’estompent en quelques jours dans des cellules qui se divisent. Conséquence : un médicament à siARN doit être porté dans chaque cellule cible, agit au mieux dans des cellules qui ne se divisent pas (hépatocytes, d’où les médicaments hépatiques) et demande des administrations répétées.

Exercice 2.12 ★★★

Un lncARN nouvellement annoté est exprimé dans le cœur. Concevoir les expériences qui distingueraient (a) un ARN fonctionnel, (b) un acte de transcription fonctionnel dont l’ARN est sans importance, et (c) du bruit, et dire ce que chacune prédit dans les trois cas.

Solution

Solution de Exercice 2.12.

(a) ARN fonctionnel : détruire le transcrit après sa production (siARN, oligonucléotide antisens) donne un phénotype, et exprimer l’ARN depuis un transgène placé ailleurs dans le génome le corrige. (b) Transcription fonctionnelle : insérer un signal de polyadénylation précoce qui arrête la transcription (ou supprimer le promoteur) donne le phénotype, alors que détruire l’ARN après coup ne le donne pas, et un transgène ectopique ne corrige rien — c’est l’acte de transcription (ou l’élément d’ADN) qui compte, comme pour bien des ARN associés aux amplificateurs. (c) Bruit : aucune manipulation ne change rien, l’ARN est à moins d’une copie par cellule, sa séquence et son expression ne sont pas conservées.

2.6 Problème : l’horloge d’un ver

Problème 2.1

Problème du week-end — l’interrupteur lin-4/lin-14 du ver chronométré par la cinétique du messager, un ARN injecté puis dilué par les divisions d’un embryon et sauvé par l’amplification, le régulon du fer quantifié et un dénombrement d’épissages, pour finir sur le facteur de répression, le temps de demi-basculement et le nombre de divisions que survit un signal non amplifié

Données : le messager de lin-14 est produit à $k = 3$ molécules par minute et par cellule et a une demi-vie de $40\,\mathrm{min}$ . La protéine LIN-14 est produite à $\beta = 2$ par messager et par minute et a une demi-vie de $3\,\mathrm{h}$ . À partir du début du second stade larvaire, l’ARN lin-4 s’accumule et ajoute au messager un terme de dégradation $\gamma' R = 3\gamma$ et, en bloquant l’initiation, divise $\beta$ par deux. Un embryon de ver passe d’une cellule à environ $550$ cellules à l’éclosion ; un adulte a $959$ cellules somatiques.

Partie I — Le messager.

Calculer $\gamma$ et le niveau stationnaire du messager lin-14 avant l’apparition de lin-4.
Calculer la constante de dégradation de la protéine et le niveau stationnaire de la protéine LIN-14.
Une fois lin-4 présent, calculer le nouveau niveau de messager et la nouvelle constante de temps du messager.
Calculer le nouvel état stationnaire de la protéine, et le facteur global de répression sur la protéine.
Combien de temps après l’apparition de lin-4 le messager parcourt-il la moitié du chemin vers son nouveau niveau ? Et la protéine ? Quelle étape limite la vitesse du basculement ?
Les expériences d’origine trouvaient la protéine disparue alors que l’ARNm était encore détectable. Est-ce compatible avec vos nombres ? Quelle fraction du messager subsiste ?

Partie II — Dilution et amplification.

On injecte dans la gonade d’un ver $10^{6}$ molécules d’ARN double brin, qui se répartissent également entre $250$ œufs. Combien de molécules par œuf ?
Si les molécules étaient simplement réparties à chaque division, combien chaque cellule du jeune ver de $550$ cellules en garderait-elle ? Au bout de combien de divisions supplémentaires la moyenne passerait-elle sous une par cellule ?
Fire et Mello ont vu la répression dans l’animal entier et dans sa descendance, à quelques molécules par cellule. Expliquer ce qu’une ARN polymérase ARN-dépendante ajoute à ce compte, et pourquoi l’effet s’estompe malgré tout au bout de quelques générations.
Dans une cellule de mammifère, dépourvue d’une telle polymérase, une transfection de siARN dépose $5000$ duplex dans une cellule qui se divise chaque jour ; le RISC est stable mais se dilue par division. Au bout de combien de jours le compte passe-t-il sous $100$ , à peu près le nombre nécessaire à une répression efficace ?
Un siARN thérapeutique dirigé contre un messager hépatique est administré une fois et agit six mois. Les hépatocytes se divisent rarement. Expliquer pourquoi le mécanisme de la question 10 ne le limite pas, et ce qui le limite.
Une graine de sept nucléotides s’apparie au hasard une fois tous les $4^{7}$ nucléotides. Le transcriptome du ver compte environ $20\,\mathrm{Mb}$ de séquence 3 $'$ non traduite. Combien de correspondances de graine dues au hasard lin-4 a-t-il, et comment les généticiens ont-ils su quelle cible comptait ?

Partie III — Le régulon du fer.

Dans une cellule riche en fer, le messager du récepteur de la transferrine a une demi-vie de $10\,\mathrm{min}$ ; avec l’IRP fixée, $50\,\mathrm{min}$ . À transcription inchangée, de quel facteur le messager monte-t-il quand le fer devient rare ?
Le messager de la ferritine ne change pas de niveau, mais sa traduction tombe de $1$ à $0.05$ protéine par messager et par minute quand l’IRP se fixe. De quel facteur la synthèse de ferritine baisse-t-elle ?
Combiner les deux : de quel facteur le rapport de la capacité d’importation à la capacité de stockage change-t-il entre l’état riche et l’état pauvre en fer ?
La protéine IRP1 est soit une protéine de liaison à l’ARN, soit une aconitase, selon qu’elle porte ou non un centre fer–soufre. Expliquer pourquoi cela en fait un capteur du fer lui-même et non d’une hormone.
Un patient porte une mutation de l’IRE de la ferritine qui abolit la fixation de l’IRP. Prévoir le taux de ferritine, le fer sérique, et pourquoi le cristallin est atteint.
Expliquer en une phrase pourquoi une même tige-boucle peut activer à une position et réprimer à une autre.
IRP2 n’a pas de centre fer–soufre ; quand le fer est haut, elle est détruite par une ubiquitine-ligase dont la stabilité exige elle-même du fer et du dioxygène. Pourquoi une cellule garderait-elle deux capteurs de chimie si différente ?

Partie IV — Compter les isoformes.

Dscam a des blocs d’exons offrant 12, 48, 33 et 2 possibilités mutuellement exclusives. Combien d’isoformes ? Si chaque neurone en exprime environ $50$ au hasard, quelle est la probabilité que deux neurones donnés en partagent au moins une ? (Utiliser $1 - (1 - 50/N)^{50}$ .)
Pourquoi un neurone gagne-t-il à posséder des isoformes que ses voisins n’ont presque sûrement pas ?
Un gène à $n$ exons cassettes, chacun inclus ou sauté de façon indépendante, donne combien de messagers ? Combien pour $n = 10$ ? Pourquoi le nombre réel dans un type cellulaire donné est-il bien plus petit ?
Chez la mouche, pourquoi une femelle à deux chromosomes X mais porteuse d’un allèle nul de Sxl meurt-elle au lieu de se développer simplement en mâle ? (Penser à ce que le système de comptage des X commande par ailleurs : la compensation de dose des gènes liés à l’X.)
SXL favorise l’épissage productif de son propre transcrit. Expliquer pourquoi cela fait de la décision sexuelle une mémoire qui persiste après la disparition du signal de comptage des X, présent seulement dans l’embryon précoce, et le rapprocher des interrupteurs auto-entretenus du Chapitre 1.
Résumer l’horloge : le facteur de répression sur la protéine LIN-14 (question 4), le temps de demi-basculement du messager (question 5) et le nombre de divisions qu’un signal non amplifié survit avant de tomber sous une molécule par cellule (question 8).

Solution

Solution de Problème 2.1.

1. $\gamma = \ln 2/40 = 0.0173\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $m^{*} = 3/0.0173 \approx 170$ messagers. 2. $\delta_{p} = \ln 2/180 = 0.003\,85\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $P^{*} = \beta m^{*}/\delta_{p} = 2\times 173/0.00385 \approx 9.0\times 10^{4}$ protéines. 3. Dégradation $4\gamma = 0.069\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $m^{*} = 3/0.069 \approx 43$ ; constante de temps $1/0.069 = 14\,\mathrm{min}$ . 4. $\beta = 1$ : $P^{*} = 43/0.00385 \approx 1.1\times 10^{4}$ ; répression d’un facteur $8$ ( $4$ par la dégradation, $2$ par la traduction). 5. Demi-approche du messager $\ln 2/(4\gamma) = 10\,\mathrm{min}$ . La protéine décroît ensuite avec sa propre demi-vie, $3\,\mathrm{h}$ : c’est la dégradation de la protéine qui limite le basculement. 6. Oui : le messager ne tombe qu’à $1/4$ (encore aisément détecté) tandis que la protéine tombe à $1/8$ et continue de baisser à mesure que l’ancienne protéine se renouvelle ; l’observation ancienne d’une protéine disparue « alors que l’ARNm demeurait » reflétait surtout la moitié traductionnelle de la répression. 7. $10^{6}/250 = 4000$ molécules par œuf. 8. $4000/550 \approx 7$ par cellule à l’éclosion. $4000/2^{n} < 1$ pour $n \ge 12$ divisions depuis le zygote — environ trois divisions après l’éclosion. 9. La polymérase recopie le messager cible en un nouvel ARN double brin, découpé en siARN secondaires : le déclencheur est régénéré depuis la cible elle-même, donc il survit à la dilution et se propage (un canal fait passer l’ARN double brin entre cellules et dans la lignée germinale). Il s’estompe parce que l’amplification exige à la fois la cible et un déclencheur primaire ; une fois l’ARN injecté disparu, le stock secondaire se dilue de génération en génération et la lignée germinale se remet à zéro. 10. $5000/2^{n} < 100$ : $2^{n} > 50$ , $n = 6$ jours ( $78$ copies restantes). 11. Des cellules qui ne se divisent pas ne diluent pas le RISC ; la limite est la durée de vie chimique du siARN (dégradation par les nucléases, ralentie par la modification chimique des brins) et la lente fuite du dépôt endosomal qui alimente le cytoplasme. 12. $2\times 10^{7}/16\,384 \approx 1200$ correspondances dues au hasard. C’est la génétique qui a tranché : la perte de lin-14 donne le phénotype inverse de la perte de lin-4, les allèles de gain de fonction de lin-14 étaient des délétions portant exactement sur les sites de la 3 $'$ UTR, et les sept sites étaient conservés. 13. Niveau $\propto$ demi-vie : hausse d’un facteur $50/10 = 5$ . 14. Chute d’un facteur $1/0.05 = 20$ de la synthèse de ferritine. 15. Le rapport importation/stockage monte d’un facteur $5\times 20 = 100$ entre l’état riche et l’état pauvre en fer. 16. Le centre ne s’assemble que si du fer cytosolique est disponible, de sorte que la conformation de la protéine est une lecture directe de la concentration en fer, sans récepteur, sans hormone ni transcription — comme un riborégulateur, un métabolite perçu par la molécule qu’il commande. 17. La ferritine est traduite quel que soit le fer : ferritine sérique très élevée, fer sérique et réserves normaux (pas de surcharge). Dans le cristallin, qui ne se renouvelle pas, la ferritine s’accumule des années et cristallise — une cataracte précoce. 18. La tige-boucle n’est qu’un site d’accueil ; l’effet est tout ce que la protéine fixée gêne physiquement — les ribosomes qui balaient l’extrémité 5 $'$ , une nucléase à l’extrémité 3 $'$ . 19. Deux chimies couvrent deux conditions : le centre fer–soufre d’IRP1 est aussi détruit par les oxydants et par un dioxygène rare, de sorte qu’IRP1 répond à l’état d’oxydoréduction, tandis que la dégradation d’IRP2 dépendante du fer répond au fer lui-même sur toute la gamme physiologique de dioxygène ; la redondance rend le régulon robuste, et les deux capteurs rapportent des choses différentes. 20. $12\times 48\times 33\times 2 = 38\,016$ . $1 - (1 - 50/38\,016)^{50} = 1 - 0.99868^{50} \approx 1 - e^{-0.066} = 0.064$ : environ $6\,\%$ . 21. Des isoformes identiques se lient de façon homophile et se repoussent : les branches d’un même neurone s’évitent et s’étalent, tandis que les branches de neurones différents, qui ne partagent presque aucune isoforme, peuvent se croiser — une identité privée par cellule. 22. $2^{n}$ ; $1024$ pour $n = 10$ . Bien moins en réalité : l’inclusion est décidée par des facteurs propres au type cellulaire et coordonnée entre exons, beaucoup de combinaisons décalent le cadre de lecture et sont détruites par la dégradation des ARNm non-sens, et les exons ne sont pas indépendants. 23. Sxl commande aussi la compensation de dose : chez la femelle, SXL bloque la traduction de msl-2, de sorte que les deux chromosomes X ne sont pas hypertranscrits ; sans SXL un embryon XX assemble le complexe MSL sur ses deux chromosomes X et double leur production — surdose létale de tous les gènes liés à l’X, avant même que le sexe soit en jeu. 24. Le promoteur précoce ne fonctionne que tant que le signal X:A est présent ; la SXL qu’il produit impose l’épissage productif du transcrit issu du promoteur de maintien, actif dans les deux sexes, de sorte qu’une fois SXL existante elle continue de se produire elle-même et le signal n’est plus nécessaire — la même logique auto-entretenue du lecteur qui recrute l’écrivain que pour les marques de chromatine, ici avec une protéine et un épissage. 25. Protéine LIN-14 réprimée d’un facteur $8$ ; demi-basculement du messager $10\,\mathrm{min}$ ; un ARN non amplifié tombe sous une molécule par cellule après $12$ divisions.

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