31Kromatografi

Setetes minuman energi, yang diencerkan dan disaring, disuntikkan ke dalam tabung baja yang tidak lebih panjang daripada sebatang pena dan diisi butiran silika berukuran beberapa mikrometer. Beberapa menit kemudian sebuah detektor telah menggambar garis dengan segelintir puncak, dan dari luas salah satunya laboratorium melaporkan berapa banyak kafeina yang ada dalam kaleng itu, dengan ketelitian beberapa persen. Kromatografi memisahkan komponen-komponen sebuah campuran dengan membiarkannya berlomba melalui sebuah kolom dengan kecepatan yang berbeda-beda; bab ini menjelaskan mengapa kecepatannya berbeda, mengapa puncak-puncaknya mempunyai lebar seperti itu, bagaimana memisahkan dua tetangga, dan bagaimana mengubah sebuah puncak menjadi sebuah kuantitas.

Yang sudah kamu ketahui

Jilid sekolah: kromatografi kertas dan lapis tipis, kromatogram, eluen. Jilid Tahun 1: koefisien partisi, ekstraksi cair–cair, faktor retensi $R_f$ pelat lapis tipis. Bab 7: pelat teoretis kolom distilasi.

31.1 Prinsip

Definisi 31.1 (Kromatografi)

Yang disebut kromatografi memisahkan komponen-komponen sebuah campuran dengan mendistribusikannya di antara fase diam, yang terpasang tetap di dalam kolom atau pada pelat, dan fase gerak, yaitu gas atau cairan yang mengalir melewatinya. Membawa komponen-komponen itu melalui dan keluar dari kolom bersama fase gerak disebut elusi.

Sebuah molekul hanya bergerak selama berada dalam fase gerak; selama ditahan oleh fase diam, molekul itu menunggu. Molekul itu berpindah di antara kedua fase jutaan kali dalam perjalanannya, sehingga kecepatan rata-ratanya ditentukan oleh fraksi waktu yang dihabiskannya dalam masing-masing fase, yaitu oleh kesetimbangan partisinya.

Definisi 31.2 (Retensi)

Yang disebut waktu retensi $t_R$ sebuah senyawa adalah waktu dari penyuntikan sampai maksimum puncaknya; waktu mati $t_M$ adalah waktu retensi senyawa yang tidak tertahan, yang tidak pernah masuk ke fase diam. Yang disebut faktor retensi $k$ sebuah senyawa pada sebuah kolom adalah

$$k = \frac{t_R - t_M}{t_M}.$$

Faktor ini bukan $R_f$ pelat lapis tipis, yang mengukur jarak yang ditempuh, walaupun keduanya menggambarkan partisi yang sama.

Proposisi 31.3 (Waktu retensi)

Jika, pada kesetimbangan, jumlah sebuah senyawa dalam fase diam dan fase gerak sebuah irisan kolom adalah $n_s$ dan $n_m$, senyawa itu bergerak dengan kecepatan $u/(1 + n_s/n_m)$, dengan $u$ kecepatan fase gerak, dan $t_R = t_M(1 + n_s/n_m)$.

Proposisi 31.4 (Retensi dan partisi)

Faktor retensi adalah rasio jumlah zat dalam kedua fase, $k = n_s/n_m = KV_s/V_m$, dengan $K$ koefisien partisi (konsentrasi dalam fase diam dibagi konsentrasi dalam fase gerak) dan $V_s$, $V_m$ volume kedua fase di dalam kolom.

Dua senyawa terpisah jika koefisien partisinya berbeda; geometri kolom ($V_s/V_m$) mengalikan semua retensi secara sama. Mengubah fase gerak, yang mengubah $K$, adalah tuas utama kimiawan untuk mengatur retensi.

31.2 Lebar puncak dan bilangan pelat

Sebuah pita tidak tetap tipis. Molekul-molekul senyawa yang sama menempuh jalur yang berbeda-beda di antara butiran, berdifusi sepanjang kolom, dan tertinggal di fase diam dalam jumlah yang acak. Puncak yang tercatat di ujung keluar hampir tepat berupa Gaussian dengan simpangan baku $\sigma_t$ (dalam waktu), dan makin sempit puncak itu untuk $t_R$ tertentu, makin baik kolomnya.

Definisi 31.5 (Bilangan pelat)

Yang disebut bilangan pelat sebuah kolom untuk sebuah senyawa adalah $N = (t_R/\sigma_t)^2$, dengan $\sigma_t$ simpangan baku puncaknya dalam waktu. Yang disebut tinggi pelat adalah $H = L/N$, untuk kolom sepanjang $L$.

Nama-nama itu berasal dari kolom distilasi pada Bab 7: kolom kromatografi berperilaku seolah-olah merupakan tumpukan $N$ tingkat kesetimbangan, masing-masing setinggi $H$. Analogi ini adalah cara menghitung, bukan gambaran kolom yang sebenarnya.

Proposisi 31.6 (Bilangan pelat dari sebuah puncak)

Dengan $w$ lebar dasar di antara garis-garis singgung pada titik-titik belok dan $w_{1/2}$ lebar pada setengah tinggi,

$$N = 16\left(\frac{t_R}{w}\right)^2 = 5.54\left(\frac{t_R}{w_{1/2}}\right)^2.$$

Proposisi 31.7 (Persamaan Van Deemter)

Tinggi pelat bergantung pada kecepatan linear $u$ fase gerak menurut

$$H = A + \frac{B}{u} + Cu,$$

dengan $A$ yang mewakili perbedaan jalur melalui isian kolom, $B/u$ difusi sepanjang kolom (makin buruk jika molekul-molekul tinggal lebih lama), dan $Cu$ pertukaran yang lambat dengan fase diam (makin buruk jika fase gerak melaju lewat). $H$ paling kecil pada $u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{B/C}$, tempat $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$.

Bentuk persamaannya diterima tanpa bukti; minimumnya tidak. $\mathrm dH/\mathrm du = -B/u^2 + C$ bernilai nol pada $u = \sqrt{B/C}$, dan di sana $B/u = Cu = \sqrt{BC}$, sehingga $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$; turunan kedua $2B/u^3$ positif, sehingga titik ini adalah minimum. Butiran yang kecil memperkecil $A$ dan $C$: itulah sebabnya kromatografi cair modern memakai partikel berukuran beberapa mikrometer dan tekanan tinggi untuk mendorong fase gerak melaluinya.

31.3 Memisahkan dua senyawa

Definisi 31.8 (Selektivitas dan resolusi)

Untuk dua puncak yang bertetangga dengan $k_2 > k_1$, faktor selektivitas adalah $\alpha = k_2/k_1$, dan resolusi adalah

$$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_1 + w_2},$$

yaitu jarak antara puncak-puncak dibagi lebar dasar rata-ratanya.

Pada $R_s = 1$ puncak-puncaknya masih jelas tumpang-tindih; pada $R_s = 1.5$ sinyal kembali ke garis dasar di antara keduanya (pemisahan garis dasar), yang merupakan sasaran lazim untuk pekerjaan kuantitatif.

Teorema 31.9 (Persamaan resolusi)

Untuk dua puncak bertetangga dengan bilangan pelat $N$ yang sama,

$$R_s = \frac{\sqrt N}{4}\,\frac{\alpha - 1}{\alpha}\,\frac{k_2}{1 + k_2}.$$

Metode 31.10 (Memperbaiki resolusi)

1. Efisiensi: $R_s \propto \sqrt N$. Melipatduakan panjang kolom melipatduakan $N$ dan waktu analisis tetapi hanya mengalikan $R_s$ dengan $\sqrt2 \approx 1.41$; partikel yang lebih kecil atau laju alir optimum menaikkan $N$ pada panjang yang tetap.
2. Selektivitas: faktor $(\alpha - 1)/\alpha$ adalah yang paling peka. Ubahlah fase gerak (pelarut, pH), fase diam, atau, dalam kromatografi gas, suhu.
3. Retensi: $k_2/(1+k_2)$ naik tajam sampai $k \approx 2$ dan lambat sesudahnya, sedangkan waktunya terus bertambah sebagai $1 + k$; bidiklah $k$ di antara sekitar 2 dan 10.

31.4 Teknik

Definisi 31.11 (Teknik-teknik kromatografi)

Dalam kromatografi gas (GC), fase geraknya adalah gas (helium, hidrogen, atau nitrogen) dan fase diamnya lapisan tipis cairan yang melapisi bagian dalam kolom kapiler yang panjang, yang ditempatkan di dalam oven. Dalam kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), sebuah pompa mendorong fase gerak cair melalui kolom pendek yang diisi partikel-partikel kecil. Dalam HPLC fase terbalik, fase diamnya nonpolar (silika yang membawa rantai-rantai alkil panjang) dan fase geraknya campuran polar air dengan metanol atau asetonitril. Dalam elusi gradien, komposisi fase gerak diubah selama analisis, dalam kromatografi cair, untuk mengelusi senyawa-senyawa yang sangat tertahan dengan lebih cepat.

Pilihan di antara keduanya ditentukan oleh keatsirian. GC memerlukan senyawa yang menguap tanpa terurai, kira-kira di bawah $400{}^{\circ}\mathrm{C}$: pelarut, bahan bakar, pewangi, molekul organik kecil. Menaikkan suhu oven selama analisis (program suhu) mengelusi senyawa-senyawa yang lebih berat lebih cepat, seperti gradien dalam HPLC. HPLC menangani segala sesuatu yang larut, termasuk garam, gula, obat, dan protein. Pada fase terbalik, senyawa yang paling polar keluar lebih dahulu dan yang paling nonpolar terakhir; menambah pelarut organik dalam fase gerak menurunkan setiap retensi. Kromatografi kolom preparatif, dan versinya yang lebih cepat, kromatografi kilat, menerapkan prinsip yang sama pada skala besar untuk memurnikan produk berskala gram, biasanya pada silika polar dengan campuran heksana dan etil asetat.

31.5 Analisis kuantitatif

Luas sebuah puncak sebanding dengan jumlah senyawa yang mencapai detektor, tetapi tetapan kesebandingannya bergantung pada senyawa dan detektornya. Volume yang disuntikkan, berorde satu mikroliter, tidak sepenuhnya dapat diulang. Sebuah standar internal menghilangkan kedua kesulitan itu.

Definisi 31.12 (Faktor respons dan standar internal)

Yang disebut standar internal adalah senyawa, yang tidak ada dalam sampel, yang ditambahkan dalam jumlah yang diketahui ke setiap larutan yang dianalisis; senyawa itu harus terpisah dari semua puncak lain dan berperilaku seperti analit. Yang disebut faktor respons $F$ sebuah analit relatif terhadap standar internal didefinisikan oleh

$$\frac{A_X}{A_{IS}} = F\,\frac{c_X}{c_{IS}},$$

dengan $A$ luas puncak dan $c$ konsentrasi dalam larutan yang disuntikkan.

Proposisi 31.13 (Kuantifikasi dengan standar internal)

$F$ yang diukur pada larutan kalibrasi dengan $c_X$ dan $c_{IS}$ yang diketahui memberikan, untuk sampel yang ditambahi standar internal pada $c_{IS}$, $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$, berapa pun volume yang disuntikkan.

Metode 31.14 (Kuantifikasi dengan standar internal)

1. Pilihlah standar yang strukturnya mirip dengan analit, tidak ada dalam sampel, dan terelusi di dekatnya tetapi terpisah ($R_s \ge 1.5$).
2. Suntikkan larutan kalibrasi dengan $c_X$ dan $c_{IS}$ yang diketahui; hitunglah $F$ dari rasio luas.
3. Tambahkan standar itu ke larutan sampel pada $c_{IS}$ yang sama; suntikkan; bacalah $A_X/A_{IS}$.
4. Hitunglah $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$, lalu telusuri kembali setiap pengenceran sampai ke sampel asal.

Kalibrasi eksternal (serangkaian standar analit saja, lalu sampel, semuanya disuntikkan dengan cara yang sama) lebih sederhana tetapi bergantung pada volume suntikan dan detektor yang tetap konstan dari satu analisis ke analisis berikutnya.

Sejarah — Tulisan warna, 1906

Ahli botani Mikhail Tsvet menuangkan ekstrak daun hijau ke dalam tabung kaca yang diisi serbuk kapur dan membilasnya dengan pelarut: pigmen-pigmennya terpisah menjadi pita-pita berwarna, klorofil hijau dan karotenoid kuning. Pada tahun 1906 ia menamai metode itu kromatografi, “tulisan warna”. Metode itu sebagian besar diabaikan selama seperempat abad, sampai dipakai lagi untuk bahan alam pada tahun 1930-an. (Potret: pembuat tidak diketahui, domain publik; Wikimedia Commons.)

Keselamatan

Asetonitril dan metanol, komponen organik yang lazim dalam fase gerak HPLC, mudah terbakar dan beracun; heksana, yang dipakai dalam kromatografi kolom, mudah terbakar, membahayakan kesehatan, dan beracun bagi kehidupan akuatik. Limbah pelarut dikumpulkan, tidak pernah dibuang ke wastafel.

31.6 Latihan

Latihan 31.1 ★

Sebuah senyawa mempunyai $t_R = 5.0\,\mathrm{min}$ pada kolom yang waktu matinya $1.0\,\mathrm{min}$. Hitunglah faktor retensinya dan fraksi waktunya yang dihabiskan dalam fase gerak.

Solusi

Solusi Latihan 31.1.

$k = (5.0 - 1.0)/1.0 = 4.0$; fraksi waktu dalam fase gerak $1/(1 + k) = 0.20$.

Latihan 31.2 ★

Sebuah puncak pada $t_R = 6.0\,\mathrm{min}$ mempunyai lebar dasar $0.30\,\mathrm{min}$. Hitunglah bilangan pelatnya.

Solusi

Solusi Latihan 31.2.

$N = 16(6.0/0.30)^2 = 16 \times 400 = 6400$.

Latihan 31.3 ★

Sebuah kolom $250\,\mathrm{mm}$ memberikan $N = 10\,000$ untuk sebuah senyawa. Hitunglah tinggi pelatnya.

Solusi

Solusi Latihan 31.3.

$H = 250\,\mathrm{mm}/10\,000 = 0.025\,\mathrm{mm} = 25\,\text{µ}\mathrm{m}$.

Latihan 31.4 ★

GC atau HPLC? Etanol dalam darah; sebuah protein; kafeina dalam minuman; benzena dalam bensin; gula dalam sari buah.

Solusi

Solusi Latihan 31.4.

Etanol dalam darah: GC (mudah menguap). Protein: HPLC. Kafeina dalam minuman: HPLC (dalam air, tidak cukup mudah menguap tanpa preparasi). Benzena dalam bensin: GC. Gula: HPLC (gula terurai sebelum mendidih).

Latihan 31.5 ★★

Dua puncak: $t_{R1} = 4.0\,\mathrm{min}$, $w_1 = 0.40\,\mathrm{min}$; $t_{R2} = 4.6\,\mathrm{min}$, $w_2 = 0.50\,\mathrm{min}$. Hitunglah resolusinya. Apakah keduanya terpisah sampai garis dasar?

Solusi

Solusi Latihan 31.5.

$R_s = 2(4.6 - 4.0)/(0.40 + 0.50) = 1.2/0.90 \approx 1.3$: belum sepenuhnya terpisah sampai garis dasar (di bawah 1.5).

Latihan 31.6 ★★

Berapa pelat yang diperlukan untuk memisahkan dua senyawa dengan $\alpha = 1.10$ dan $k_2 = 4.0$ pada $R_s = 1.5$?

Solusi

Solusi Latihan 31.6.

$\sqrt N = 4R_s\,\dfrac{\alpha}{\alpha - 1}\,\dfrac{1 + k_2}{k_2} = 4 \times 1.5 \times 11 \times 1.25 = 82.5$, sehingga $N \approx 6.8 \times 10^3$.

Latihan 31.7 ★★

Sebuah kolom mempunyai $A = 5\,\text{µ}\mathrm{m}$, $B = 8\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$, $C = 2\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}/\mathrm{mm}$ (data latihan). Tentukan kecepatan optimum dan tinggi pelat terkecil.

Solusi

Solusi Latihan 31.7.

$u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{8/2} = 2\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$; $H_{\min} = 5 + 2\sqrt{16} = 13\,\text{µ}\mathrm{m}$.

Latihan 31.8 ★★

Ramalkan urutan elusi benzena, fenol, dan toluena dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak air–metanol, dan apa yang terjadi jika fraksi metanol dinaikkan.

Solusi

Solusi Latihan 31.8.

Fenol ($\ce{OH}$ polar, ikatan hidrogen dengan air) lebih dahulu, lalu benzena, lalu toluena (satu $\ce{CH3}$ lebih banyak, lebih nonpolar). Lebih banyak metanol membuat fase gerak kurang polar: ketiganya terelusi lebih awal, dengan urutan yang sama.

Latihan 31.9 ★★

Larutan kalibrasi sebuah analit pada $20.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dengan standar internal pada $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ memberikan luas 860 dan 400. Sampel yang ditambahi standar pada $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ memberikan luas 645 dan 410. Hitunglah faktor respons dan konsentrasi analitnya (data latihan).

Solusi

Solusi Latihan 31.9.

$F = (860/400)/(20.0/10.0) = 2.15/2.00 = 1.075$. Sampel: $c_X = (645/410) \times 10.0/1.075 \approx 14.6\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$.

Latihan 31.10 ★★★

Sebuah pemisahan memberikan $R_s = 1.06$. Panjang kolom berapakah, relatif terhadap kolom yang sekarang, yang memberikan $R_s = 1.5$, dan berapa biayanya dalam waktu? Tuas lain apa saja yang ada?

Solusi

Solusi Latihan 31.10.

$R_s \propto \sqrt N \propto \sqrt L$: $L$ harus dikalikan dengan $(1.5/1.06)^2 \approx 2.0$, yang melipatduakan waktu analisis dan tekanan. Tuas lain: selektivitas (fase gerak, fase diam, suhu), partikel yang lebih kecil, laju alir optimum.

Latihan 31.11 ★★★

Untuk dua puncak Gaussian dengan tinggi dan lebar yang sama dan lebar dasar $w = 4\sigma$, hitunglah sinyal di tengah-tengah antara keduanya, relatif terhadap tinggi puncak, pada $R_s = 1$ dan pada $R_s = 1.5$ (abaikan sumbangan puncak yang jauh pada setiap maksimum).

Solusi

Solusi Latihan 31.11.

Puncak-puncaknya berjarak $4\sigma R_s$, sehingga titik tengahnya berjarak $2\sigma R_s$ dari masing-masing. $R_s = 1$: setiap puncak menyumbang $\mathrm e^{-(2)^2/2} = \mathrm e^{-2} = 0.135$; lembahnya berada pada $0.27$ tinggi puncak. $R_s = 1.5$: $2\mathrm e^{-(3)^2/2} = 2\mathrm e^{-4.5} \approx 0.022$, sekitar 2 %: kembali ke garis dasar untuk keperluan praktis.

Latihan 31.12 ★★★

Pada $N$ dan $\alpha$ yang tetap, bandingkan faktor resolusi $k_2/(1+k_2)$ dan waktu analisis relatif $1 + k_2$ untuk $k_2 = 2$, 5, dan 10. Rentang $k$ manakah yang sebaiknya dipilih?

Solusi

Solusi Latihan 31.12.

$k_2/(1+k_2)$: 0.67, 0.83, 0.91; waktu dalam satuan $t_M$: 3, 6, 11. Dari 2 ke 5 diperoleh 25 % resolusi untuk waktu dua kali lipat; dari 5 ke 10, 9 % untuk waktu yang hampir dua kali lipat lagi. $k$ sekitar 2 sampai 5 adalah kompromi yang lazim.

31.7 Soal: Kafeina dalam Minuman Energi

Soal 31.1

Soal akhir pekan — urutan elusi fase terbalik, kinerja kolom dari sebuah kromatogram, memperbaiki pemisahan, dan kuantifikasi dengan standar internal

Data latihan (rekaan, bukan metode yang sebenarnya). Sebuah minuman energi diencerkan sepuluh kali ($5.00\,\mathrm{mL}$ menjadi $50.0\,\mathrm{mL}$) dan teofilina ditambahkan sebagai standar internal pada $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dalam larutan yang diencerkan. Kolom: $150\,\mathrm{mm}$, fase terbalik; fase gerak air–metanol; deteksi UV. Matriks yang tidak tertahan (gula dan garam) terelusi pada $t_M = 1.0\,\mathrm{min}$; teofilina pada $3.0\,\mathrm{min}$ (lebar dasar $0.18\,\mathrm{min}$); kafeina pada $3.4\,\mathrm{min}$ (lebar dasar $0.20\,\mathrm{min}$). Kalibrasi: kafeina $50.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ dan teofilina $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ memberikan luas 1500 dan 1000. Sampel: luas 970 (kafeina) dan 1010 (teofilina). Sebuah kaleng berisi $250\,\mathrm{mL}$.

Bagian I — Fase terbalik.

1. Uraikan fase diam dan fase gerak sebuah kolom fase terbalik.
2. Mengapa gula-gula terelusi pada waktu mati?
3. Kafeina adalah 1,3,7-trimetilxantina, teofilina 1,3-dimetilxantina. Jelaskan urutan elusinya.
4. Mengapa teofilina merupakan standar internal yang baik di sini?
5. Apa yang akan terjadi pada kedua waktu retensi jika fraksi metanol dinaikkan?
6. Apa yang diukur oleh waktu mati?

Bagian II — Kinerja kolom.

7. Hitunglah faktor retensi teofilina dan kafeina.
8. Hitunglah faktor selektivitasnya.
9. Hitunglah bilangan pelat untuk kafeina dan untuk teofilina.
10. Hitunglah tinggi pelat untuk kafeina.
11. Hitunglah resolusi di antara kedua puncak.
12. Periksalah hasilnya dengan persamaan resolusi.
13. Apakah puncak-puncak itu terpisah sampai garis dasar?

Bagian III — Lebih cepat atau lebih baik.

14. Untuk menghemat waktu, kolomnya dipendekkan menjadi $75\,\mathrm{mm}$ (isian dan alir yang sama). Bagaimana resolusinya?
15. Dan waktu analisisnya?
16. Apa yang akan diberikan oleh kolom $300\,\mathrm{mm}$ sebagai gantinya, dan dengan biaya apa?
17. Tuas manakah yang bekerja pada $\alpha$?
18. Apakah menaikkan $k$ akan banyak membantu di sini?

Bagian IV — Kuantifikasi.

19. Hitunglah faktor respons kafeina relatif terhadap teofilina.
20. Mengapa volume suntikan tidak berpengaruh?
21. Hitunglah konsentrasi kafeina dalam larutan yang diencerkan.
22. Hitunglah konsentrasi kafeina dalam minuman itu.
23. Apa yang akan salah jika sebuah senyawa matriks terelusi bersama teofilina?
24. Apa yang akan diperlukan oleh kalibrasi eksternal sebagai gantinya?
25. Nyatakan massa kafeina dalam sebuah kaleng $250\,\mathrm{mL}$.

Solusi

Solusi Soal 31.1.

1. Fase diam: butiran silika yang membawa rantai-rantai alkil panjang, nonpolar. Fase gerak: air dengan metanol, polar. 2. Gula sangat polar dan tetap berada dalam fase gerak: $k \approx 0$. 3. Kafeina mempunyai satu gugus metil lebih banyak daripada teofilina, dan teofilina mempunyai $\ce{N-H}$ yang membentuk ikatan hidrogen dengan air: teofilina lebih polar dan terelusi lebih dahulu. 4. Strukturnya mirip (respons dan perilaku yang serupa), tidak ada dalam minuman, dan terelusi di dekat kafeina sambil tetap terpisah darinya. 5. Keduanya akan berkurang: fase gerak yang kurang polar bersaing lebih baik dengan fase diam. 6. Waktu yang diperlukan fase gerak untuk melintasi kolom, yaitu waktu yang dihabiskan sebuah senyawa untuk bergerak. 7. $k_{\mathrm{theo}} = (3.0 - 1.0)/1.0 = 2.0$; $k_{\mathrm{caf}} = 2.4$. 8. $\alpha = 2.4/2.0 = 1.2$. 9. Kafeina $N = 16(3.4/0.20)^2 = 4624 \approx 4.6 \times 10^3$; teofilina $16(3.0/0.18)^2 \approx 4.4 \times 10^3$. 10. $H = 150\,\mathrm{mm}/4624 \approx 0.032\,\mathrm{mm} = 32\,\text{µ}\mathrm{m}$. 11. $R_s = 2(3.4 - 3.0)/(0.18 + 0.20) = 0.80/0.38 \approx 2.1$. 12. $\frac{\sqrt{4624}}{4} \times \frac{0.2}{1.2} \times \frac{2.4}{3.4} = 17 \times 0.167 \times 0.706 \approx 2.0$; selisih kecil itu berasal dari asumsi lebar yang sama dalam persamaan itu. 13. Ya: $R_s > 1.5$. 14. $N$ menjadi separuhnya: $R_s \approx 2.1/\sqrt2 \approx 1.5$, tepat pada pemisahan garis dasar. 15. Menjadi separuhnya: kafeina pada $1.7\,\mathrm{min}$. 16. $R_s \approx 2.1\sqrt2 \approx 3.0$, dengan waktu dua kali lipat dan tekanan dua kali lipat: pemborosan di sini. 17. Komposisi fase gerak (fraksi metanol, pH, pelarut organik lain) atau fase diam. 18. Sedikit: $k_2/(1 + k_2) = 0.71$ sudah tercapai; pada $k_2 = 5$ nilainya akan 0.83 (+18 %) dengan waktu analisis dikalikan $6/3.4 \approx 1.8$. 19. $F = (1500/1000)/(50.0/40.0) = 1.50/1.25 = 1.20$. 20. Kedua puncak berasal dari suntikan yang sama: volumenya saling meniadakan dalam rasio luas. 21. $c = (970/1010) \times 40.0/1.20 \approx 32.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 22. Pengenceran sepuluh kali: $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 23. $A_{IS}$ akan terlalu besar, dan hasil kafeina terlalu rendah. 24. Serangkaian standar kafeina yang disuntikkan dalam kondisi yang persis sama dengan sampel, garis kalibrasi luas terhadap konsentrasi, dan volume suntikan yang terulangkan. 25. $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L} \times 0.250\,\mathrm{L}$: $\boldsymbol{\approx 80\,\mathrm{mg}}$ kafeina per kaleng (data latihan).