Biology · Livre 3 · Bachelor Year 1

Biologie universitaire — 1re année

Biologie universitaire — 1re année · Bachelor Year 1

11Nucléotides et acides nucléiques

Versez de l’éthanol froid sur une solution de cellules broyées et un nuage blanc de fibres apparaît, que l’on peut enrouler sur une baguette de verre : l’ADN, la molécule qui porte chaque instruction de l’organisme, visible à l’œil nu. Deux mètres en sont repliés dans chaque noyau humain ; le tout est écrit dans un alphabet de quatre lettres, lu dans un seul sens, et copié en séparant deux brins qui s’ajustent l’un à l’autre comme une main et son gant. Ce chapitre décrit les nucléotides — lettres, monnaie énergétique et coenzymes à la fois — les chaînes qu’ils forment, la double hélice et les faits qui l’établissent, ce qui se passe quand on la fond et qu’on la réassocie, et les ARN qui portent son message dans la cellule.

11.1 Les nucléotides

Définition 11.1 (Nucléotide)

Un nucléotide est fait de trois parties : une base azotée — une purine (adénine A, guanine G : deux cycles accolés) ou une pyrimidine (cytosine C, thymine T, uracile U : un cycle) ; un sucre à cinq carbones, le ribose dans l’ARN ou le 2′'-désoxyribose dans l’ADN (privé de l’hydroxyle porté par le carbone 2′2') ; et un à trois groupes phosphate sur le carbone 5′5' du sucre. La base est fixée au carbone 1′1' ; les carbones du sucre sont numérotés avec des primes pour les distinguer de ceux de la base. Base plus sucre font un nucléoside (adénosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine) ; avec des phosphates, c’est un nucléotide (AMP, ADP, ATP et leurs semblables).

Les parties d’un nucléotide : une base sur le carbone 1' d’un pentose, des phosphates sur le carbone 5'. L’hydroxyle 3' est l’endroit où s’attachera le nucléotide suivant de la chaîne ; la position 2' distingue l’ARN (OH) de l’ADN (H).
Les parties d’un nucléotide : une base sur le carbone 1′1' d’un pentose, des phosphates sur le carbone 5′5'. L’hydroxyle 3′3' est l’endroit où s’attachera le nucléotide suivant de la chaîne ; la position 2′2' distingue l’ARN (OH) de l’ADN (H).

Proposition 11.2 (Les nucléotides remplissent trois offices)

Outre qu’ils sont les monomères de l’ADN et de l’ARN, les nucléotides sont la monnaie énergétique de la cellule — l’ATP et le GTP, dont les liaisons phosphoanhydride (Chapitre 8) paient les synthèses, les transports et les mouvements ; ses coenzymes — NAD+\mathrm{NAD^+}, NADP+\mathrm{NADP^+} et FAD, qui transportent les électrons dans la respiration et la photosynthèse (Chapitre 15), et le coenzyme A, qui transporte des groupes acyles ; et ses messagers — l’AMP cyclique, qui relaie les signaux hormonaux à l’intérieur des cellules. Tous sont des nucléotides à adénine ou bâtis sur eux : la même molécule qui épelle le message alimente son exécution.

11.2 La chaîne polynucléotidique

Définition 11.3 (Liaison phosphodiester, polarité)

Les nucléotides sont unis en un polynucléotide par des liaisons phosphodiester : le phosphate porté par le carbone 5′5' d’un nucléotide est lié à l’hydroxyle 3′3' du suivant. La chaîne possède donc un squelette sucre–phosphate, uniforme et chargé négativement (une charge par phosphate), d’où les bases font saillie en une séquence ; et elle possède un sens : une extrémité 5′5' portant un phosphate libre et une extrémité 3′3' portant un hydroxyle libre. Les séquences s’écrivent et se lisent de 5′→3′5' \to 3', le sens dans lequel les chaînes sont synthétisées. L’ADN (acide désoxyribonucléique) emploie le désoxyribose et les bases A, G, C, T ; l’ARN (acide ribonucléique) emploie le ribose et A, G, C, U.

Une chaîne de quatre nucléotides. Le phosphate 5' de chaque nucléotide est uni à l’hydroxyle 3' de celui du dessus par une liaison phosphodiester ; la chaîne va d’une extrémité 5' à une extrémité 3' et les bases pendent d’un squelette uniforme.
Une chaîne de quatre nucléotides. Le phosphate 5′5' de chaque nucléotide est uni à l’hydroxyle 3′3' de celui du dessus par une liaison phosphodiester ; la chaîne va d’une extrémité 5′5' à une extrémité 3′3' et les bases pendent d’un squelette uniforme.

Exemple 11.4 (L’ARN est fragile, l’ADN est durable)

L’hydroxyle 2′2' du ribose peut attaquer la liaison phosphodiester voisine : en milieu légèrement alcalin, l’ARN est hydrolysé en nucléotides en quelques heures, tandis que l’ADN, dépourvu de cet hydroxyle, survit à une ébullition en milieu alcalin et a été retrouvé intact dans des os vieux de dizaines de milliers d’années. L’uracile de l’ARN est une thymine sans son groupe méthyle ; l’ADN emploie la thymine pour que la cytosine, qui perd lentement son groupe aminé et devient de l’uracile, puisse être reconnue comme lésée et réparée — un uracile dans l’ADN est toujours une erreur.

11.3 La double hélice

Proposition 11.5 (Les règles de Chargaff)

Dans l’ADN de n’importe quel organisme, la quantité d’adénine égale celle de thymine et la quantité de guanine celle de cytosine (A=TA = T, G=CG = C, donc purines == pyrimidines), tandis que le rapport (G+C)/(A+T)(G + C)/(A + T) varie d’une espèce à l’autre (de 25 %25\,\% à 75 %75\,\% de G+CG + C).

Faits expérimentaux. Chargaff (1950) hydrolysa l’ADN de nombreux organismes et sépara les bases par chromatographie, en dosant chacune par son absorption dans l’ultraviolet. Les égalités furent vérifiées aux erreurs d’expérience près pour tous les ADN ; la teneur en G+CG + C, elle, ne l’était pas, et elle était la même dans tous les tissus d’un même organisme. ∎

Théorème 11.6 (La double hélice de Watson et Crick)

L’ADN est fait de deux chaînes polynucléotidiques enroulées autour d’un axe commun en une double hélice droite : les squelettes sucre–phosphate à l’extérieur, les bases à l’intérieur, planes et empilées perpendiculairement à l’axe. Les chaînes sont antiparallèles (l’une va de 5′→3′5' \to 3' vers le haut, l’autre vers le bas) et complémentaires : face à chaque A se trouve un T, tenu par deux liaisons hydrogène, et face à chaque G un C, tenu par trois ; chaque paire de bases a la même largeur, de sorte que l’hélice est uniforme quelle que soit la séquence. Dans la forme B, la plus courante, l’hélice fait 2 nm2\,\mathrm{nm} de diamètre, s’élève de 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} par paire de bases et de 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} par tour de dix paires, et présente un large grand sillon et un étroit petit sillon où les bords des bases sont exposés aux protéines.

Faits expérimentaux. Les clichés de diffraction des rayons X de fibres d’ADN obtenus par Franklin (1952) montraient la croix caractéristique d’une hélice, avec une répétition de 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} le long de l’axe, une réflexion intense à 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} (unités planes empilées) et un diamètre de 2 nm2\,\mathrm{nm} ; les phosphates, atomes les plus lourds, devaient être à l’extérieur. Watson et Crick (1953) trouvèrent qu’une purine appariée à une pyrimidine — et seulement A avec T et G avec C — donne des paires de largeur égale s’ajustant au diamètre de 2 nm2\,\mathrm{nm}, ce qui expliquait les règles de Chargaff, et que deux chaînes antiparallèles ainsi appariées bâtissent une hélice régulière aux dimensions de la fibre. Le modèle prédisait que chaque chaîne est une matrice pour l’autre ; la démonstration de la réplication semi-conservative par Meselson et Stahl (rappelée du volume du lycée, et reprise au Chapitre 18) l’a confirmé. ∎

À gauche : un modèle de la double hélice ; les deux squelettes s’enroulent autour des paires de bases empilées, laissant un grand et un petit sillon. À droite : les mêmes dix paires de bases déroulées en échelle : brins antiparallèles, paires complémentaires de largeur égale, 0.34\, nm par paire et 3.4\, nm par tour.
À gauche : un modèle de la double hélice ; les deux squelettes s’enroulent autour des paires de bases empilées, laissant un grand et un petit sillon. À droite : les mêmes dix paires de bases déroulées en échelle : brins antiparallèles, paires complémentaires de largeur égale, 0.34\, nm par paire et 3.4\, nm par tour.
À gauche : un modèle de la double hélice ; les deux squelettes s’enroulent autour des paires de bases empilées, laissant un grand et un petit sillon. À droite : les mêmes dix paires de bases déroulées en échelle : brins antiparallèles, paires complémentaires de largeur égale, 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} par paire et 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} par tour.

Exemple 11.7 (Lire un brin)

Si un brin se lit 5′5'-ATGGCATTC-3′3', son partenaire, écrit 5′→3′5' \to 3', est 5′5'-GAATGCCAT-3′3' : complémenter chaque base, puis inverser l’ordre. Neuf paires, 3.1 nm3.1\,\mathrm{nm} d’hélice, vingt-deux liaisons hydrogène (cinq G–C, quatre A–T). Un chromosome humain de 2.5×1082.5 \times 10^{8} paires mesure 8.5 cm8.5\,\mathrm{cm} sous cette forme et doit être replié cent mille fois pour tenir dans un noyau (Chapitre 17).

Proposition 11.8 (Ce qui tient l’hélice)

Les liaisons hydrogène entre bases appariées donnent la spécificité ; l’empilement des bases planes les unes sur les autres — contacts de van der Waals et effet hydrophobe qui garde les bases hors de l’eau — donne l’essentiel de la stabilité ; les squelettes chargés négativement se repoussent, et l’hélice n’est stable qu’en présence de cations (les Mg2+\mathrm{Mg^{2+}} et Na+\mathrm{Na^+} physiologiques, ou les protéines basiques de la chromatine) qui écrantent la charge. Une paire G–C, avec trois liaisons hydrogène et un empilement plus fort, tient mieux qu’une paire A–T.

11.4 Fusion et hybridation

Définition 11.9 (Dénaturation, température de fusion)

Le chauffage, ou un pH extrême, sépare les deux brins de l’ADN : c’est la dénaturation (ou fusion), une transition coopérative sur quelques degrés, dont le milieu est la température de fusion TmT_m. Elle s’accompagne de l’effet hyperchrome : les brins simples absorbent environ 40 %40\,\% de lumière ultraviolette de plus à 260 nm260\,\mathrm{nm} que les mêmes bases empilées dans une hélice. TmT_m croît avec la teneur en G+CG + C (0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} par pour cent), avec la concentration en sel et avec la longueur ; dans un sel à 0.15 mol/L0.15\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}, un long ADN à 50 %50\,\% de G+CG + C fond vers 90 ∘C90\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Refroidis lentement, les brins retrouvent leurs complémentaires et reforment l’hélice : c’est la renaturation, ou l’hybridation lorsque les brins viennent de sources différentes.

Courbes de fusion de deux ADN dans le même sel. L’absorbance croît de 40\,\% à mesure que les brins se séparent, sur quelques degrés ; le point milieu, T_m, est plus élevé pour l’ADN le plus riche en paires G–C.
Courbes de fusion de deux ADN dans le même sel. L’absorbance croît de 40 %40\,\% à mesure que les brins se séparent, sur quelques degrés ; le point milieu, TmT_m, est plus élevé pour l’ADN le plus riche en paires G–C.

Méthode 11.10 (Doser les acides nucléiques par absorbance)

  1. Les bases absorbent l’ultraviolet avec un maximum à 260 nm260\,\mathrm{nm}. Dans une cuve de 1 cm1\,\mathrm{cm}, une absorbance de 1.01.0 correspond à 50 µg/mL50\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} d’ADN double brin (40 µg/mL40\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} d’ARN, 33 µg/mL33\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} d’ADN simple brin).
  2. Le rapport A260/A280A_{260}/A_{280} vaut 1.81.8 pour de l’ADN pur et 2.02.0 pour de l’ARN pur ; les protéines absorbent à 280 nm280\,\mathrm{nm} et l’abaissent.
  3. Pour suivre la fusion, enregistrer A260A_{260} pendant un chauffage lent ; le milieu de la courbe est TmT_m et sa raideur mesure l’homogénéité de l’échantillon.
  4. Pour détecter une séquence, dénaturer l’échantillon et ajouter un brin simple marqué qui lui soit complémentaire (une sonde) ; il ne s’hybride que là où se trouve son complémentaire, et le marquage en signale l’endroit — sur un gel, sur un chromosome, dans un tissu.
ADN précipité par de l’éthanol froid à partir d’un lysat cellulaire et enroulé sur une baguette de verre : quelques milligrammes de la molécule, visibles sous forme de fibres parce que chacune est longue de millions de paires de bases.
ADN précipité par de l’éthanol froid à partir d’un lysat cellulaire et enroulé sur une baguette de verre : quelques milligrammes de la molécule, visibles sous forme de fibres parce que chacune est longue de millions de paires de bases.

Exemple 11.11 (Une sonde trouve un gène)

Une sonde de vingt nucléotides complémentaire d’un gène, à 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C} sous son propre TmT_m, se lie à son complémentaire exact et à rien d’autre dans trois milliards de paires de bases : un seul mésappariement sur vingt abaisse TmT_m de plusieurs degrés et l’hybride mésapparié fond. La spécificité de l’appariement des bases, multipliée sur vingt positions, est ce sur quoi repose tout test d’ADN, de la recherche de paternité à la détection d’un pathogène.

11.5 L’ARN

Définition 11.12 (Les ARN)

L’ARN est le plus souvent simple brin, et se replie sur lui-même partout où de courtes portions complémentaires le permettent, en épingles, en boucles et en renflements — une structure secondaire — qui se tasse ensuite en une forme. Trois classes portent le flux de l’information génétique (Chapitre 19) : l’ARN messager (ARNm), copie d’un gène que le ribosome lit ; l’ARN de transfert (ARNt), quelque 75 75\, nucléotides repliés en trèfle, portant un acide aminé à son extrémité 3′3' et un anticodon qui s’apparie au message ; l’ARN ribosomique (ARNr), cœur structural et catalytique du ribosome, les quatre cinquièmes de l’ARN d’une cellule. Beaucoup d’autres ARN régulent, épissent et guident (volume de troisième année).

Un ARN de transfert dans sa structure secondaire en trèfle : un brin unique d’environ 75 nucléotides apparié avec lui-même en quatre bras. L’acide aminé est porté à l’extrémité 3' ; l’anticodon, à la pointe opposée, lit le message.
Un ARN de transfert dans sa structure secondaire en trèfle : un brin unique d’environ 75 nucléotides apparié avec lui-même en quatre bras. L’acide aminé est porté à l’extrémité 3′3' ; l’anticodon, à la pointe opposée, lit le message.

Remarque 11.13 (Un ARN peut être un catalyseur)

Certains ARN sont des enzymes (les ribozymes) : la liaison peptidique de toute protéine est formée par l’ARN ribosomique et non par une protéine, et certains ARN se coupent et s’épissent eux-mêmes. Une molécule qui porte à la fois l’information et catalyse des réactions est ce dont un premier système vivant a pu être fait ; le monde ADN–protéines serait alors une division du travail plus tardive, avec l’ARN maintenu en son centre.

11.6 Exercices

Exercice 11.1 ★

Nommer les trois parties d’un nucléotide et les deux différences entre un ribonucléotide et un désoxyribonucléotide.

Solution

Solution de Exercice 11.1.

Une base azotée, un pentose, un à trois phosphates. ARN : ribose (avec un hydroxyle 2′2') et uracile ; ADN : 2′2'-désoxyribose et thymine.

Exercice 11.2 ★

Écrire le brin complémentaire de 5′5'-GGATCCTA-3′3' dans le sens 5′→3′5' \to 3', et compter ses liaisons hydrogène.

Solution

Solution de Exercice 11.2.

5′5'-TAGGATCC-3′3'. Paires : G–C, G–C, A–T, T–A, C–G, C–G, T–A, A–T : quatre G–C (12 liaisons) et quatre A–T (8) : 20 liaisons hydrogène.

Exercice 11.3 ★

Un ADN contient 22 %22\,\% d’adénine. Donner les pourcentages de T, de G et de C, ainsi que la teneur en G+CG + C.

Solution

Solution de Exercice 11.3.

T 22 %22\,\% ; G et C se partagent les 56 %56\,\% restants : 28 %28\,\% chacune ; G+C=56 %G + C = 56\,\%.

Exercice 11.4 ★

D’après la figure de la fusion, quel est le TmT_m d’un ADN à 50 %50\,\% de G+CG + C dans les mêmes conditions, et de combien l’absorbance croît-elle à la fusion ?

Solution

Solution de Exercice 11.4.

Entre les deux courbes, à 0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} par pour cent : environ 85 ∘C85\,{}^{\circ}\mathrm{C}. L’absorbance croît de 40 %40\,\%.

Exercice 11.5 ★★

Calculer la longueur du chromosome d’E. coli (4.6×1064.6 \times 10^{6} paires de bases) en millimètres, son nombre de tours, et le facteur de compaction nécessaire pour tenir dans une cellule de 2 µm2\,\text{µ}\mathrm{m}.

Solution

Solution de Exercice 11.5.

4.6×106×0.34 nm=1.56 mm4.6 \times 10^{6}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 1.56\,\mathrm{mm} ; 460 000460\,000 tours ; 1560/2=7801560/2 = 780 en longueur (le chromosome est replié en boucles et en surenroulements).

Exercice 11.6 ★★

Expliquer pourquoi les deux brins de l’ADN doivent être antiparallèles, à l’aide de la géométrie du squelette sucre–phosphate et de l’exigence que toutes les paires de bases aient la même largeur.

Solution

Solution de Exercice 11.6.

Les bases s’apparient en se faisant face par leurs bords, et le sucre de chacune n’est fixé du même côté de la paire que si les deux squelettes courent en sens opposés ; avec des brins parallèles, les deux sucres se placeraient sur des bords opposés et la largeur de la paire, comme la position du squelette, varierait avec la séquence. Des brins antiparallèles avec des paires purine–pyrimidine donnent les 2 nm2\,\mathrm{nm} constants qu’exige le diagramme de la fibre.

Exercice 11.7 ★★

Une solution d’ADN a A260=0.35A_{260} = 0.35 dans une cuve de 1 cm1\,\mathrm{cm} et A280=0.20A_{280} = 0.20. Calculer la concentration et commenter la pureté. Combien y a-t-il de paires de bases dans 1 mL1\,\mathrm{mL}, si la masse moyenne d’une paire vaut 650 Da650\,\mathrm{Da} ?

Solution

Solution de Exercice 11.7.

0.35×50=17.5 µg/mL0.35\times 50 = 17.5\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}. A260/A280=1.75A_{260}/A_{280} = 1.75 : un ADN essentiellement pur (1.8), avec peut-être une trace de protéine. Dans 1 mL1\,\mathrm{mL} : 17.5×10−6/(650×1.66×10−24)=1.6×101617.5\times 10^{-6}/(650\times 1.66\times 10^{-24}) = 1.6 \times 10^{16} paires de bases.

Exercice 11.8 ★★

Expliquer l’effet hyperchrome et pourquoi la courbe de fusion d’un ADN pur est raide alors que celle d’un mélange d’ADN de nombreuses espèces est étalée.

Solution

Solution de Exercice 11.8.

Les bases empilées se masquent mutuellement et absorbent moins ; séparer les brins expose chaque base à la lumière et l’absorbance croît de 40 %40\,\%. Un ADN pur fond à quelques degrés près autour de son unique TmT_m, de façon coopérative ; un mélange contient des ADN de teneurs en G+CG + C variées, chacun avec son propre TmT_m, de sorte que la somme de leurs courbes s’étale sur des dizaines de degrés.

Exercice 11.9 ★★

Une sonde de vingt nucléotides a un Tm=62 ∘CT_m = 62\,{}^{\circ}\mathrm{C} avec son complémentaire exact ; un mésappariement abaisse TmT_m d’environ 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C}. À quelle température faut-il conduire l’hybridation pour détecter la séquence exacte et rejeter les mésappariements uniques ? Que se passe-t-il à 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C} ?

Solution

Solution de Exercice 11.9.

Juste au-dessous de 62 ∘C62\,{}^{\circ}\mathrm{C} et au-dessus de 57 ∘C57\,{}^{\circ}\mathrm{C}, disons 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C} : l’hybride parfait tient, le mésapparié fond. À 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C}, des hybrides comptant jusqu’à trois mésappariements sont stables et la sonde révèle aussi des séquences apparentées.

Exercice 11.10 ★★★

Les règles de Chargaff valent pour l’ADN double brin mais non pour l’ARN ni pour l’ADN de certains petits virus. Expliquer ce que chaque exception apprend sur la structure de ces acides nucléiques.

Solution

Solution de Exercice 11.10.

Les règles découlent de l’appariement des bases entre deux brins complémentaires. L’ARN, simple brin, n’a pas de partenaire qui contraigne sa composition, de sorte que A≠UA \neq U en général ; les petits virus en question ont un génome d’ADN simple brin, qui n’a pas non plus à obéir aux règles — et le fait qu’ils n’y obéissaient pas a été l’un des premiers indices qu’ils étaient simple brin.

Exercice 11.11 ★★★

Deux liaisons hydrogène tiennent une paire A–T, et pourtant une hélice de mille paires A–T est stable à 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C} alors qu’une paire isolée ne se forme pas du tout. Expliquer à l’aide des idées du Chapitre 8 (liaisons faibles, coopérativité, empilement), et dire ce que cela implique pour la fidélité d’une sonde.

Solution

Solution de Exercice 11.11.

Chaque paire seule vaut quelques kilojoules par mole, moins que l’agitation thermique, et se forme et se rompt en quelques microsecondes. Dans une hélice, les paires se forment ensemble : chacune s’empile sur la précédente et les premières nucléent les suivantes, de sorte que les énergies s’additionnent et que la probabilité qu’elles se rompent toutes à la fois est négligeable — c’est la coopérativité. L’empilement contribue autant que les liaisons hydrogène. Pour une sonde, cela signifie que la stabilité croît avec la longueur et chute nettement à chaque mésappariement, qui interrompt la série coopérative : la spécificité est une propriété de la portion entière.

Exercice 11.12 ★★★

« La structure de l’ADN est l’explication de l’hérédité. » Discuter en un paragraphe : ce que la double hélice explique immédiatement (la copie, la mutation comme changement de séquence), ce qu’elle n’explique pas à elle seule (comment la séquence devient une protéine), et pourquoi le modèle de Watson et Crick a été accepté avant tout test biochimique.

Solution

Solution de Exercice 11.12.

L’hélice explique aussitôt la copie : chaque brin spécifie l’autre, de sorte que les séparer et apparier de nouveaux nucléotides sur chacun donne deux molécules identiques ; une mutation est une base fautive fixée dans une copie et fidèlement recopiée ensuite. Elle ne dit pas, à elle seule, comment une séquence de quatre bases spécifie une protéine — il a fallu une décennie pour cela (code, ARNm, ARNt, ribosome). Le modèle a été accepté parce qu’il s’accordait à toutes les mesures (Chargaff, les dimensions des rayons X, la densité) sans rien laisser de côté, et parce que son explication de l’hérédité était si économique que l’autre hypothèse — une coïncidence — était invraisemblable ; Meselson et Stahl ont ensuite confirmé la copie qu’il prédisait.

11.7 Problème : le génome d’un virus

Problème 11.1

Problème du week-end — l’ADN du phage λ\lambda mesuré, pesé, compté, fondu et empaqueté dans sa capside, jusqu’à sa température de fusion et sa longueur développée

Le génome du bactériophage λ\lambda est un unique ADN linéaire double brin de 48 50248\,502 paires de bases, dont la teneur en G+CG + C vaut 49.9 %49.9\,\%. Il est empaqueté dans une capside icosaédrique de 55 nm55\,\mathrm{nm} de diamètre intérieur. Prendre 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} par paire de bases, 2.0 nm2.0\,\mathrm{nm} pour le diamètre de l’hélice, 650 Da650\,\mathrm{Da} par paire de bases, et Tm=81.5+16.6log⁡10[Na+]+0.41 (% G+C)−500/LT_m = 81.5 + 16.6\log_{10}[\mathrm{Na^+}] + 0.41\,(\%\,G{+}C) - 500/L en degrés Celsius, avec [Na+][\mathrm{Na^+}] en mol/L\mathrm{mol}/\mathrm{L} et LL la longueur en paires de bases.

Partie I — Mesuré et pesé.

  1. Calculer la longueur développée de la molécule, en micromètres.
  2. Calculer le nombre de tours de l’hélice.
  3. Calculer sa masse molaire, en daltons.
  4. Calculer la masse d’une molécule, en grammes.
  5. Calculer le nombre de groupes phosphate et, de là, la charge nette de la molécule.
  6. Calculer le nombre de nucléotides de chaque base (A, T, G, C).
  7. Calculer le nombre total de liaisons hydrogène qui tiennent les deux brins.

Partie II — Fondu.

  1. Calculer TmT_m dans un sodium à 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}.
  2. Calculer TmT_m dans un sodium à 0.01 mol/L0.01\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}, et expliquer pourquoi le sel stabilise l’hélice.
  3. Le génome de λ\lambda contient une région de 1000 1000\, paires à 35 %35\,\% de G+CG + C et une autre à 62 %62\,\%. Calculer le TmT_m de chaque région dans un sodium à 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} et décrire l’allure de la courbe de fusion de la molécule entière.
  4. Une solution d’ADN de λ\lambda a A260=0.50A_{260} = 0.50 avant la fusion. Quelle est sa concentration, et que vaudra A260A_{260} après fusion complète ?
  5. Combien de molécules de λ\lambda y a-t-il dans 1 mL1\,\mathrm{mL} de cette solution ?
  6. Les deux extrémités du génome de λ\lambda sont des débords simple brin de 12 nucléotides, complémentaires l’un de l’autre, par lesquels la molécule se circularise chez l’hôte. Calculer leur TmT_m (prendre L=12L = 12) et dire pourquoi le cercle tient malgré tout à 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} dans la cellule.

Partie III — Empaqueté.

  1. Calculer le volume de l’ADN assimilé à un cylindre.
  2. Calculer le volume intérieur de la capside.
  3. Quelle fraction de la capside l’ADN occupe-t-il ? Comparer avec l’empilement le plus compact de cylindres parallèles (91 %91\,\%).
  4. L’ADN porte 97 00097\,000 charges négatives dans une sphère de 55 nm55\,\mathrm{nm}. Expliquer ce qui doit accompagner l’ADN dans la capside, et pourquoi l’ADN empaqueté exerce sur la coque une pression (de quelques dizaines d’atmosphères) qui aide à l’injecter dans une bactérie.
  5. La molécule doit être courbée en boucles de rayon comparable à celui de la capside. L’ADN résiste à la courbure en deçà d’un rayon d’environ 50 nm50\,\mathrm{nm}. Commenter.

Partie IV — Lu.

  1. Un brin du génome commence par 5′5'-GGGCGGCGACCT-3′3'. Écrire le brin complémentaire de 5′→3′5' \to 3'.
  2. Si un gène de 12001200 paires de bases est transcrit en un ARNm, quelle est la longueur de cet ARNm en nucléotides et, à 330 Da330\,\mathrm{Da} par nucléotide, sa masse ?
  3. Le génome compte 75 75\, gènes pour 48 50248\,502 paires. Quelle fraction du génome est codante si le gène moyen fait 600600 paires ? Comparer avec un génome humain (1.5 %1.5\,\%).
  4. Le génome est répliqué en 20 min20\,\mathrm{min} à 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} par les enzymes de l’hôte. Calculer la vitesse en paires de bases par seconde si la réplication démarre à une origine unique et progresse dans les deux sens.
  5. Combien de liaisons hydrogène sont rompues par seconde aux deux fourches au cours de la réplication (utiliser la moyenne par paire de la question 7) ?
  6. Une mutation change une paire G–C en A–T. De combien le TmT_m de la molécule entière varie-t-il ? La fusion pourrait-elle le détecter ?
  7. Énoncer le résultat : la température de fusion de l’ADN de λ\lambda dans un sodium à 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} et sa longueur développée, ainsi que la compaction qui le fait tenir dans la capside.
Solution

Solution de Problème 11.1.

1. 48 502×0.34=16 490 nm=16.5 µm48\,502\times 0.34 = 16\,490\,\mathrm{nm} = 16.5\,\text{µ}\mathrm{m}. 2. 48 502/10=485048\,502/10 = 4850 tours. 3. 48 502×650=3.15×107 Da48\,502\times 650 = 3.15 \times 10^{7}\,\mathrm{Da}. 4. 3.15×107×1.66×10−24=5.2×10−17 g3.15 \times 10^{7}\times 1.66\times 10^{-24} = 5.2 \times 10^{-17}\,\mathrm{g}. 5. Deux par paire : 97 00497\,004 phosphates, charge nette −97 004 e-97\,004\,e. 6. G+C=0.499×97 004=48 405G + C = 0.499\times97\,004 = 48\,405 : G=C=24 203G = C = 24\,203 ; A=T=24 299A = T = 24\,299. 7. 3×24 203+2×24 299=121 2073\times24\,203 + 2\times24\,299 = 121\,207. 8. 81.5+16.6×(−1)+0.41×49.9−500/48502=81.5−16.6+20.5−0.01=85.4 ∘C81.5 + 16.6\times(-1) + 0.41\times 49.9 - 500/48502 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 0.01 = 85.4\,{}^{\circ}\mathrm{C}. 9. 81.5−33.2+20.5=68.8 ∘C81.5 - 33.2 + 20.5 = 68.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Les cations écrantent la répulsion entre les deux squelettes chargés négativement ; avec moins de sel, les brins se repoussent davantage et se séparent à plus basse température. 10. 35 %35\,\% : 81.5−16.6+14.4−0.5=78.8 ∘C81.5 - 16.6 + 14.4 - 0.5 = 78.8\,{}^{\circ}\mathrm{C} ; 62 %62\,\% : 81.5−16.6+25.4−0.5=89.8 ∘C81.5 - 16.6 + 25.4 - 0.5 = 89.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. La molécule entière fond par étapes : les régions riches en A–T s’ouvrent les premières, celles riches en G–C les dernières, de sorte que la courbe est une montée large à épaulements plutôt qu’une marche unique et nette. 11. 0.50×50=25 µg/mL0.50\times 50 = 25\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} ; après fusion A260=0.70A_{260} = 0.70. 12. 25×10−6/5.2×10−17=4.8×101125\times 10^{-6}/5.2\times 10^{-17} = 4.8 \times 10^{11} molécules. 13. 81.5−16.6+0.41×50−500/12=81.5−16.6+20.5−41.7=43.7 ∘C81.5 - 16.6 + 0.41\times 50 - 500/12 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 41.7 = 43.7\,{}^{\circ}\mathrm{C} (la formule est grossière pour de si courtes portions). À 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} les extrémités s’apparient mais respireraient ; dans la cellule, une enzyme (la ligase) soude les deux brèches par covalence, et le cercle ne dépend plus des douze paires. 14. π×(1.0)2×16 490=5.2×104 nm3\pi\times(1.0)^2\times16\,490 = 5.2 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 15. 43π×27.53=8.7×104 nm3\frac{4}{3}\pi\times 27.5^3 = 8.7 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 16. 60 %60\,\% : les deux tiers de l’empilement le plus compact possible de cylindres — l’ADN est enroulé en spires presque cristallines. 17. Des contre-ions (polyamines, Mg2+\mathrm{Mg^{2+}}) doivent neutraliser l’essentiel de la charge, sans quoi la répulsion ne pourrait pas être vaincue ; la répulsion résiduelle et l’énergie de courbure emmagasinée dans les spires serrées poussent vers l’extérieur sur la coque, et quand la queue s’ouvre cette pression pousse la première partie du génome dans la bactérie. 18. Les boucles d’une capside de 55 nm55\,\mathrm{nm} ont des rayons de 10 to 25 nm10\text{ to }25\,\mathrm{nm}, en deçà des 50 nm50\,\mathrm{nm} où l’ADN se courbe librement : le courber coûte de l’énergie, payée par le moteur d’empaquetage (ATP) et emmagasinée sous forme de la pression de la question 17. 19. 5′5'-AGGTCGCCGCCC-3′3'. 20. 12001200 nucléotides ; 1200×330=4.0×105 Da1200\times 330 = 4.0 \times 10^{5}\,\mathrm{Da}. 21. 75×600=45 00075\times 600 = 45\,000 paires, soit 93 %93\,\% de codant — un génome compact ; le génome humain est soixante fois moins dense en gènes. 22. Deux fourches, copiant chacune 24 25124\,251 paires en 1200 s1200\,\mathrm{s} : 20 20\, paires par seconde et par fourche (la polymérase de l’hôte peut en faire 1000 1000\, ; c’est le cycle entier qui fixe la durée, non la polymérase). 23. 121 207/48 502=2.5121\,207/48\,502 = 2.5 liaisons par paire ; deux fourches à 20 paires par seconde : 100 liaisons hydrogène par seconde — et autant reformées derrière elles. 24. Une paire sur 48 50248\,502 change le G+CG + C de 0.002 %0.002\,\% et le TmT_m de 0.001 ∘C0.001\,{}^{\circ}\mathrm{C} : indétectable en faisant fondre la molécule entière ; seule une sonde courte couvrant le site le montrerait. 25. Tm=85 ∘CT_m = 85\,{}^{\circ}\mathrm{C} dans un sodium à 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} ; longueur développée 16.5 µm16.5\,\text{µ}\mathrm{m}, trois cents fois le diamètre de la capside, empaquetée dans celle-ci à 60 %60\,\% de son volume.

Termes définis dans ce chapitre

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