Biologie universitaire — 1re année · Bachelor Year 1

5La cellule : unité du vivant

En 1665, Robert Hooke plaça un éclat de liège sous une lentille et le vit divisé en petites loges qu’il appela cellules, d’après les chambres d’un monastère. Dix ans plus tard, un drapier néerlandais, Antoni van Leeuwenhoek, taillant lui-même des lentilles d’un pouvoir que nul autre n’atteignait, vit des êtres vivants nager dans une goutte d’eau de mare, dans le raclage de ses dents, dans sa propre semence. Il fallut encore un siècle et demi pour énoncer ce que ces deux hommes avaient vu : que tout organisme est fait de cellules, et que toute cellule provient d’une cellule. Ce chapitre énonce la théorie cellulaire et ses preuves, oppose les deux sortes de cellules, et décrit les instruments — les microscopes, la centrifugeuse, la fiole de culture — qui permettent de voir les cellules, de les démonter et de les garder vivantes hors d’un organisme.

5.1 La théorie cellulaire

Définition 5.1 (Cellule)

Une cellule est la plus petite unité de matière vivante : un volume de cytoplasme aqueux limité par une membrane plasmique, contenant le matériel génétique (ADN) et la machinerie qui l’exprime, capable de prélever des nutriments, de transformer de l’énergie, de maintenir sa propre organisation et, quand les conditions le permettent, de se diviser en deux cellules.

Proposition 5.2 (La théorie cellulaire)

Tout organisme est fait d’une ou de plusieurs cellules, et la cellule est l’unité de structure et de fonction des êtres vivants (Schleiden et Schwann, 1838–1839).
Toute cellule provient d’une cellule préexistante par division (Virchow, 1855 : omnis cellula e cellula) ; il n’y a pas de génération spontanée.
Le matériel héréditaire passe de cellule en cellule à la division, de sorte que la continuité de la vie est la continuité des cellules.

Faits expérimentaux. Le liège de Hooke (1665) et les coupes végétales de Grew et de Malpighi montrèrent les tissus végétaux comme des assemblages de loges ; les lentilles de Leeuwenhoek (années 1670) montrèrent des organismes unicellulaires, des cellules du sang et des spermatozoïdes. Deux siècles d’amélioration des lentilles trouvèrent des cellules dans tous les tissus examinés, animaux aussi bien que végétaux, une fois que Schwann eut reconnu des cellules nucléées dans le cartilage et dans les embryons. La division fut observée directement chez les algues et dans les embryons, et Virchow ne trouva aucun tissu, sain ou malade, dont les cellules ne provinssent d’autres cellules. Les ballons à col de cygne de Pasteur (1861) — des bouillons restés stériles des mois durant quand la poussière ne pouvait les atteindre, et grouillants en quelques jours quand elle le pouvait — clôturèrent la question de la génération spontanée. Le troisième énoncé est l’œuvre de la fin du dix-neuvième siècle, qui suivit les chromosomes au cours de la division (Chapitre 18). ∎

À gauche : le dessin du liège par Hooke dans Micrographia (1665), les premières cellules jamais figurées — les parois vides de cellules mortes, vues selon deux orientations. À droite : Antoni van Leeuwenhoek, peint par Jan Verkolje vers 1680, dont les microscopes à lentille unique montrèrent les premières cellules vivantes. — À gauche : le dessin du liège par Hooke dans *Micrographia* (1665), les premières cellules jamais figurées — les parois vides de cellules mortes, vues selon deux orientations. À droite : Antoni van Leeuwenhoek, peint par Jan Verkolje vers 1680, dont les microscopes à lentille unique montrèrent les premières cellules vivantes.

Exemple 5.3 (Une cellule, beaucoup de cellules)

Une bactérie, une levure, une amibe sont des organismes entiers d’une seule cellule, qui font tout — se nourrir, se déplacer, se diviser — en quelques micromètres. Un humain est quelque $3 \times 10^{13}$ cellules de deux cents sortes, dont aucune ne pourrait vivre seule dans une mare, et dont chacune descend par des divisions ininterrompues d’un unique œuf fécondé. Le lapin du Chapitre 2 et le chêne du Chapitre 3 sont la même théorie appliquée deux fois.

5.2 Deux sortes de cellules

Définition 5.4 (Cellules procaryote et eucaryote)

Une cellule procaryote (bactéries, archées) n’a pas de noyau : son ADN, en général un chromosome circulaire, occupe une région du cytoplasme appelée nucléoïde, et elle n’a pas de compartiment limité par une membrane. Elle est petite ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) et limitée par une membrane plasmique et, à l’extérieur de celle-ci, une paroi. Une cellule eucaryote (protistes, champignons, plantes, animaux) garde son ADN, sous forme de plusieurs chromosomes linéaires, dans un noyau limité par une double membrane, et divise son cytoplasme en organites limités par des membranes (Chapitre 6). Elle est plus grande ( $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) et possède un squelette interne de filaments protéiques.

Une bactérie (Escherichia coli) ouverte. Ni noyau, ni organites : un chromosome circulaire lâchement replié dans le cytoplasme parmi des milliers de ribosomes, une paroi à l’extérieur de la membrane plasmique, des flagelles pour nager et des pili pour adhérer. Longueur environ 2\, µ m. — Une bactérie (*Escherichia coli*) ouverte. Ni noyau, ni organites : un chromosome circulaire lâchement replié dans le cytoplasme parmi des milliers de ribosomes, une paroi à l’extérieur de la membrane plasmique, des flagelles pour nager et des pili pour adhérer. Longueur environ $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Escherichia coli au microscope électronique à balayage (la barre au bas de l’image vaut 2\, µ m). Des bâtonnets de 2\, µ m de long, dont mille tiendraient sur un millimètre ; une cellule isolée se divise toutes les vingt minutes dans un milieu riche. Image : NIAID, domaine public. — *Escherichia coli* au microscope électronique à balayage (la barre au bas de l’image vaut $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ). Des bâtonnets de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ de long, dont mille tiendraient sur un millimètre ; une cellule isolée se divise toutes les vingt minutes dans un milieu riche. Image : NIAID, domaine public.

Proposition 5.5 (La cellule bactérienne)

E. coli, la bactérie modèle, est un bâtonnet de $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ de long et de $0.8\,\text{µ}\mathrm{m}$ de large : un volume d’environ $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ contenant un chromosome de $4.6 \times 10^{6}$ paires de bases ( $1.5\,\mathrm{mm}$ d’ADN replié dix mille fois), quelque $20\,000$ ribosomes, quelques millions de molécules de protéines de $2000$ sortes, et souvent un ou plusieurs plasmides — petites molécules d’ADN circulaire portant des gènes supplémentaires. Son enveloppe est, de l’intérieur vers l’extérieur, la membrane plasmique, une mince paroi de peptidoglycane (un maillage de chaînes de sucres réticulées par de courts peptides, qui résiste à la pression interne de la cellule), et une membrane externe. Les bactéries à paroi de peptidoglycane épaisse et sans membrane externe retiennent le violet de cristal de la coloration de Gram (Gram positives) ; celles à paroi mince sous une membrane externe le perdent (Gram négatives, comme E. coli). Les flagelles tournent comme des hélices ; les pili fixent la cellule aux surfaces et aux autres cellules.

Méthode 5.6 (La coloration de Gram)

Fixer par la chaleur un mince frottis de bactéries sur une lame.
Colorer au violet de cristal (toutes les cellules deviennent violettes), puis à l’iode, qui forme dans les cellules un gros complexe avec le colorant.
Rincer à l’alcool : le peptidoglycane épais des cellules Gram positives se rétracte et emprisonne le complexe ; la paroi mince des cellules Gram négatives, une fois la membrane externe dissoute par l’alcool, le laisse partir au rinçage.
Contre-colorer avec un colorant rose (safranine) : les cellules Gram positives apparaissent violettes, les Gram négatives roses. Le résultat prédit la structure de la paroi et, avec elle, la sensibilité à de nombreux antibiotiques.

Les tailles des choses, en échelle logarithmique, et les instruments qui les résolvent. Les bactéries se situent juste au-dessus de la limite du microscope photonique ; la cellule eucaryote est dix fois plus grande dans chaque dimension, mille fois en volume.

Exemple 5.7 (Pourquoi la cellule eucaryote est compartimentée)

Une cellule de $20\,\text{µ}\mathrm{m}$ a mille fois le volume d’une bactérie mais seulement cent fois sa surface membranaire (Proposition 1.6). Les membranes sont le siège des chaînes de transduction d’énergie et des systèmes de transport ; l’eucaryote récupère de la surface en repliant des membranes à l’intérieur d’elle-même — la membrane interne d’une mitochondrie, les saccules du réticulum endoplasmique — et gagne en outre des chambres séparées où des chimies incompatibles (la digestion dans le lysosome, la synthèse dans le cytosol) peuvent fonctionner côte à côte.

5.3 Voir les cellules : la microscopie

Définition 5.8 (Grossissement et résolution)

Un microscope grossit (il agrandit l’image) et résout (il sépare des points voisins). Seule la seconde propriété limite ce que l’on peut voir : le pouvoir de résolution est la plus petite distance $d$ entre deux points qui apparaissent encore distincts,

d = \frac{0.61\,\lambda}{\mathrm{NA}},

où $\lambda$ est la longueur d’onde de l’éclairage et $\mathrm{NA}$ l’ouverture numérique de l’objectif (le sinus de son demi-angle de collecte de la lumière multiplié par l’indice de réfraction du milieu, au plus $1.4$ environ avec de l’huile). Grossir au-delà du pouvoir de résolution agrandit le flou, non le détail.

Proposition 5.9 (Microscopes photonique et électronique)

Avec de la lumière visible ( $\lambda \approx 550\,\mathrm{nm}$ ) et $\mathrm{NA} = 1.4$ , le microscope photonique résout $0.24\,\text{µ}\mathrm{m}$ : cellules, noyaux, chloroplastes, mitochondries en points, bactéries en bâtonnets — et des échantillons vivants et mobiles. Le contraste, dans une cellule transparente, s’obtient par coloration (qui tue en général), par contraste de phase (conversion des différences d’indice de réfraction en différences de brillance), ou par fluorescence (marquage d’une molécule par un colorant ou une protéine fluorescente, dont seule la lumière est imagée). Le microscope électronique emploie des électrons de longueur d’onde de quelques picomètres ; sa résolution pratique, limitée par ses lentilles, est d’environ $0.2\,\mathrm{nm}$ en transmission (MET : les électrons traversent une coupe de $50\,\mathrm{nm}$ d’épaisseur, contrastée aux métaux lourds, ce qui donne la structure interne des organites) et de quelques nanomètres en balayage (MEB : un faisceau balaie une surface métallisée, ce qui en donne le relief). La microscopie électronique exige le vide et des échantillons morts, fixés et déshydratés.

Le microscope photonique composé : l’objectif forme une image intermédiaire agrandie et renversée, que l’oculaire agrandit encore pour l’œil. C’est l’ouverture numérique de l’objectif, et non le grossissement total, qui fixe ce qui peut être résolu.

Un microscope photonique composé : lampe et condenseur sous la platine, tourelle d’objectifs au-dessus, oculaires binoculaires. Résolution 0.2\, µ m, grossissement jusqu’à 1000\,, échantillons vivants possibles. — Un microscope photonique composé : lampe et condenseur sous la platine, tourelle d’objectifs au-dessus, oculaires binoculaires. Résolution $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ , grossissement jusqu’à $1000\,$ , échantillons vivants possibles.

Méthode 5.10 (Choisir l’instrument)

Pour suivre un processus vivant (division cellulaire, mouvement, protéine fluorescente passant d’un compartiment à un autre) : microscopie photonique, contraste de phase ou fluorescence, sur cellules non fixées.
Pour compter et identifier des cellules dans un tissu : une préparation fixée, coupée et colorée, au microscope photonique.
Pour voir la structure interne d’un organite, d’une membrane, d’un virus : microscopie électronique à transmission sur coupes minces, ou sur particules en coloration négative.
Pour voir le relief de surface d’une cellule ou d’un tissu : microscopie électronique à balayage.
Pour localiser une protéine : immunofluorescence (photonique) ou immunomarquage à l’or (électronique), à l’aide d’un anticorps dirigé contre elle.

Exemple 5.11 (Une bactérie et une mitochondrie)

Au microscope photonique à $1000\times$ , une cellule d’E. coli est un bâtonnet de $2\,\mathrm{mm}$ à l’échelle de la rétine, sans intérieur visible ; une mitochondrie est un point à la limite de la résolution. Sur une coupe au MET, la même bactérie montre ses deux membranes, sa paroi, son nucléoïde en région fibreuse et pâle et ses ribosomes en grains sombres ; la mitochondrie montre sa double membrane et les replis de la membrane interne. Ni l’une ni l’autre n’est vivante.

5.4 Démonter les cellules et les garder vivantes

Définition 5.12 (Fractionnement cellulaire)

Le fractionnement cellulaire sépare les constituants d’une cellule pour les étudier. Le tissu est homogénéisé — les cellules sont ouvertes dans un tampon froid et isotonique, par broyage ou cisaillement, ce qui laisse les organites intacts — et l’homogénat est soumis à une centrifugation différentielle : une série de tours de force et de durée croissantes, dont chacun sédimente les particules les plus grosses et les plus denses restant en suspension. Chaque fraction est identifiée par son aspect au microscope électronique et par des enzymes marqueurs, activités connues pour ne résider que dans un seul compartiment.

Centrifugation différentielle d’un homogénat. Chaque tour sédimente ce qui est plus gros ou plus dense que ce que le précédent a laissé en suspension : les noyaux d’abord, puis les mitochondries, puis les fragments de membranes, et enfin le cytosol soluble. Les enzymes marqueurs disent quel organite est allé où.

Les fractions après tours successifs : les culots de noyaux, de mitochondries et de microsomes, chacun sous son surnageant clarifié.

Proposition 5.13 (Sédimentation)

Une particule sphérique de rayon $r$ et de masse volumique $\rho_p$ , dans un fluide de masse volumique $\rho_f$ et de viscosité $\eta$ , soumise à un champ centrifuge $g_c$ (multiple de $g$ ), sédimente à la vitesse constante

v = \frac{2}{9}\,\frac{r^2\,(\rho_p - \rho_f)\,g_c}{\eta}

(loi de Stokes). La vitesse croît comme le carré du rayon : un noyau de $5\,\text{µ}\mathrm{m}$ tombe cent fois plus vite qu’une mitochondrie de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , laquelle tombe mille fois plus vite qu’un ribosome de $15\,\mathrm{nm}$ . C’est pourquoi le même tube les sépare à des vitesses croissantes.

Démonstration. À vitesse constante, la force de traînée de Stokes, $6\pi\eta r v$ , équilibre le poids apparent de la particule dans le fluide, $\frac{4}{3}\pi r^3(\rho_p - \rho_f)g_c$ ; la résolution en $v$ donne la formule. ∎

Définition 5.14 (Culture cellulaire)

La culture cellulaire maintient des cellules vivantes et en division hors de l’organisme, dans un milieu stérile fournissant nutriments, sels, facteurs de croissance et, pour les cellules animales, une surface d’adhérence, à la température de l’organisme. Bactéries et levures poussent dans des milieux simples et doublent en quelques minutes à quelques heures ; les cellules animales prélevées sur un tissu (cultures primaires) se divisent un nombre limité de fois, tandis que les lignées cellulaires, issues de tumeurs ou de cellules transformées, se divisent indéfiniment. La culture fait de la cellule un objet d’expérience : un type, un milieu, une variable à la fois.

Exemple 5.15 (Une courbe de croissance)

Une fiole d’E. coli dans un milieu riche à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : une latence d’une demi-heure, puis une croissance exponentielle — le nombre double toutes les $20\,\mathrm{min}$ , soit $N = N_0\,2^{t/20}$ — jusqu’à ce qu’un nutriment vienne à manquer ou que les déchets s’accumulent, et la culture atteint un plateau voisin de $10^9$ cellules par millilitre. À partir d’une cellule unique, $2^{30} \approx 10^9$ cellules en dix heures. La même courbe, avec un temps de doublement d’un jour, décrit une culture de cellules humaines.

5.5 Exercices

Exercice 5.1 ★

Énoncer les trois propositions de la théorie cellulaire et nommer un fait expérimental à l’appui de chacune.

Solution

Solution de Exercice 5.1.

Tous les organismes sont faits de cellules (tous les tissus examinés au microscope, végétaux comme animaux, en montrent) ; toute cellule provient d’une cellule (division observée dans les embryons et chez les algues ; les ballons de Pasteur excluent la génération spontanée) ; le matériel héréditaire passe à la division (chromosomes suivis au cours de la mitose).

Exercice 5.2 ★

Énumérer quatre différences entre une cellule procaryote et une cellule eucaryote.

Solution

Solution de Exercice 5.2.

Noyau (absent / présent), organites limités par une membrane (absents / présents), chromosome (un seul, circulaire / plusieurs, linéaires), taille ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ / $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ), paroi de peptidoglycane (bactéries) / de cellulose, de chitine ou absente, cytosquelette (rudimentaire / élaboré).

Exercice 5.3 ★

D’après la figure des échelles de taille, combien de bactéries mises bout à bout couvrent un œuf de grenouille ? Et combien de cellules animales ?

Solution

Solution de Exercice 5.3.

$1\,\mathrm{mm}/1\,\text{µ}\mathrm{m} = 1000$ bactéries ; $1000/20 = 50$ cellules animales.

Exercice 5.4 ★

Pourquoi un microscope photonique à $2000\times$ ne montre-t-il pas plus de détail qu’un microscope à $1000\times$ ?

Solution

Solution de Exercice 5.4.

La résolution dépend de la longueur d’onde et de l’ouverture numérique, non du grossissement ; au-delà de $1000\times$ environ, l’image agrandit le flou de la limite de diffraction ( $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) sans rien séparer de nouveau.

Exercice 5.5 ★★

Calculer le pouvoir de résolution d’un objectif d’ $\mathrm{NA} = 0.65$ en lumière verte ( $550\,\mathrm{nm}$ ), puis en lumière bleue ( $450\,\mathrm{nm}$ ). Peut-il séparer deux bactéries distantes de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ? Deux ribosomes distants de $30\,\mathrm{nm}$ ?

Solution

Solution de Exercice 5.5.

$0.61\times 550/0.65 = 516\,\mathrm{nm}$ ; dans le bleu, $422\,\mathrm{nm}$ . Deux bactéries distantes de $500\,\mathrm{nm}$ : tout juste, en lumière bleue ; des ribosomes distants de $30\,\mathrm{nm}$ : non, d’un facteur quinze.

Exercice 5.6 ★★

Une coloration de Gram d’une culture mixte montre des coques violettes et des bâtonnets roses. Que dit chaque couleur sur la paroi ? Lequel des deux est E. coli ?

Solution

Solution de Exercice 5.6.

Violettes : paroi épaisse de peptidoglycane retenant le complexe violet de cristal–iode, sans membrane externe (Gram positives). Roses : peptidoglycane mince sous une membrane externe, colorant éliminé au rinçage, contre-coloration (Gram négatives). E. coli est un bâtonnet Gram négatif : les bâtonnets roses.

Exercice 5.7 ★★

À l’aide de la loi de Stokes avec $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ et $\rho_p - \rho_f = 100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ , calculer la vitesse de sédimentation d’une mitochondrie ( $r = 0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) à $10\,000\,g$ et le temps qu’elle met à tomber de $5\,\mathrm{cm}$ . Reprendre pour un noyau ( $r = 4\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) à $1000\,g$ .

Solution

Solution de Exercice 5.7.

Mitochondrie : $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81\times 10^4/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $92\,\mathrm{s}$ . Noyau à $1000\,g$ : $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $14\,\mathrm{s}$ .

Exercice 5.8 ★★

Les activités marqueurs d’un homogénat sont : succinate déshydrogénase $80\,\%$ dans le culot 2, $15\,\%$ dans le culot 1, $5\,\%$ dans le surnageant ; lactate déshydrogénase $95\,\%$ dans le surnageant final. Interpréter chaque nombre, y compris les $15\,\%$ du culot 1.

Solution

Solution de Exercice 5.8.

La succinate déshydrogénase est mitochondriale : $80\,\%$ des mitochondries sont dans le culot 2 ; les $15\,\%$ du culot 1 sont des mitochondries piégées dans des cellules entières et des débris ou entraînées avec les noyaux ; les $5\,\%$ du surnageant proviennent de mitochondries rompues pendant l’homogénéisation. La lactate déshydrogénase est cytosolique et soluble : elle reste dans le surnageant final.

Exercice 5.9 ★★

Quel microscope emploierait-on pour (a) observer un globule blanc en train d’engloutir une bactérie, (b) compter les mitochondries sur une coupe de muscle, (c) voir les pores d’une enveloppe nucléaire, (d) voir la forme de la surface d’un grain de pollen ? Justifier chaque choix.

Solution

Solution de Exercice 5.9.

(a) Microscopie photonique à contraste de phase sur cellules vivantes (le processus dure quelques minutes et exige des cellules vivantes). (b) Microscopie photonique sur coupe colorée, ou MET pour être sûr (les mitochondries sont à la limite du photonique). (c) MET (les pores font $100\,\mathrm{nm}$ ). (d) MEB (relief de surface).

Exercice 5.10 ★★★

Les ballons de Pasteur : un bouillon bouilli dans un ballon à col de cygne reste limpide indéfiniment ; incliné de sorte que le bouillon touche la poussière du col, il se trouble en deux jours. Expliquer ce que chaque observation exclut et ce que le couple démontre, et dire pourquoi l’ébullition dans un ballon scellé n’avait pas, à elle seule, tranché la question.

Solution

Solution de Exercice 5.10.

Le ballon resté limpide exclut que l’air lui-même, ou le bouillon bouilli lui-même, engendre la vie : l’air entre librement par le col ouvert. Le ballon devenu trouble, après contact avec la poussière, montre que ce que le col avait retenu — des particules venues de l’air — est la source des organismes. Ensemble, ils prouvent que les microbes viennent de microbes portés par la poussière. Un ballon scellé et bouilli laissait ouverte l’objection que le scellement avait privé le contenu de l’air dont une « force vitale » aurait eu besoin ; le col de cygne admet l’air et n’exclut que la poussière.

Exercice 5.11 ★★★

Une culture d’E. coli part de $10^3$ cellules par millilitre et double toutes les $25\,\mathrm{min}$ . Quand atteint-elle $10^8$ par millilitre ? Si chaque cellule a une masse de $1\,\mathrm{pg}$ , quelle est la masse bactérienne dans un litre à ce moment-là, et pourquoi la croissance s’arrête-t-elle peu après, même en excès de glucose ?

Solution

Solution de Exercice 5.11.

$10^5 = 2^{n}$ donne $n = 16.6$ doublements, soit $415\,\mathrm{min}$ , environ $7\,\mathrm{h}$ . $10^8\times 10^3\,\mathrm{mL}\times1\,\mathrm{pg} = 0.1\,\mathrm{g}$ par litre. La croissance s’arrête parce que l’oxygène (que le milieu ne peut fournir qu’à quelques milligrammes par litre), un minéral, ou l’accumulation d’acides et de déchets devient limitant, et non le glucose.

Exercice 5.12 ★★★

« La cellule eucaryote est une bactérie qui a appris à se replier. » Discuter en un paragraphe, à l’aide du rapport surface/volume, des membranes des organites, et de ce que les compartiments permettent.

Solution

Solution de Exercice 5.12.

Une cellule dix fois plus grande dans chaque dimension a dix fois moins de surface membranaire par unité de volume ; comme les membranes portent la machinerie de transduction d’énergie et de transport, la grande cellule mourrait de faim. L’eucaryote multiplie la membrane en la repliant à l’intérieur d’elle-même (réticulum endoplasmique, membrane interne des mitochondries, thylakoïdes) et crée du même coup des compartiments clos où des processus incompatibles — digestion acide, chimie oxydative, conservation de l’ADN — fonctionnent séparément, chacun dans ses conditions. L’image est juste pour ce qui touche aux membranes, et incomplète : l’eucaryote a aussi acquis un cytosquelette et un noyau, et ses mitochondries sont des descendantes de bactéries englobées, non des replis.

5.6 Problème : fractionner un foie

Problème 5.1

Problème du week-end — dix grammes de foie de rat démontés par centrifugation : culots, marqueurs, loi de Stokes et bilan d’une enzyme, jusqu’au facteur de purification de la fraction mitochondriale

$10\,\mathrm{g}$ de foie de rat sont homogénéisés dans $50\,\mathrm{mL}$ de saccharose isotonique froid et centrifugés en trois étapes : $1000\,g$ pendant $10\,\mathrm{min}$ (culot 1), $10\,000\,g$ pendant $20\,\mathrm{min}$ (culot 2), $100\,000\,g$ pendant $60\,\mathrm{min}$ (culot 3), ce qui laisse le surnageant final. La teneur en protéines et deux activités enzymatiques sont mesurées dans l’homogénat et dans chaque fraction :

fraction	protéines (mg)	succinate déshydrogénase (U)	lactate déshydrogénase (U)
homogénat	2000	100	400
culot 1	500	15	20
culot 2	200	60	12
culot 3	300	5	8
surnageant final	950	4	350

Prendre $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ pour le milieu, un trajet de sédimentation de $5\,\mathrm{cm}$ , et $g = 9.81\,\mathrm{m}/\mathrm{s}^{2}$ .

Partie I — Qu’y a-t-il où.

Nommer le principal organite de chaque culot.
Pourquoi le milieu d’homogénéisation doit-il être froid et isotonique ?
La succinate déshydrogénase est le marqueur de quel compartiment ? Et la lactate déshydrogénase ?
Calculer le rendement en protéines : la somme sur les fractions rapportée à l’homogénat, en pourcentage. Commenter.
Calculer de la même façon le rendement de chaque activité enzymatique.
Calculer la teneur en protéines par gramme de foie et la fraction de la masse fraîche du foie qui est protéique.

Partie II — La loi de Stokes. Mitochondries : rayon $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , excès de masse volumique $100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ . Noyaux : rayon $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ , même excès. Ribosomes : rayon $12\,\mathrm{nm}$ , excès de masse volumique $600\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ .

Calculer la vitesse de sédimentation d’une mitochondrie à $10\,000\,g$ et le temps qu’elle met à parcourir $5\,\mathrm{cm}$ . $20\,\mathrm{min}$ suffisent-elles ?
Calculer la distance parcourue par une mitochondrie pendant le premier tour ( $1000\,g$ , $10\,\mathrm{min}$ ). Quelle fraction des mitochondries, uniformément réparties au départ, serait sédimentée à la première étape ?
Comparer avec les $15\,\%$ de succinate déshydrogénase trouvés dans le culot 1. Qu’est-ce qui peut encore entraîner des mitochondries dans le culot 1 ?
Calculer le temps que met un noyau à parcourir $5\,\mathrm{cm}$ à $1000\,g$ .
Calculer le temps que met un ribosome à parcourir $5\,\mathrm{cm}$ à $100\,000\,g$ . Un ribosome serait-il sédimenté à $10\,000\,g$ en $20\,\mathrm{min}$ ?
Expliquer pourquoi la suite des tours se fait à force croissante et pourquoi chaque étape doit être assez longue sans l’être trop.

Partie III — Activité spécifique et purification. L’activité spécifique d’une enzyme dans une fraction est son activité par milligramme de protéines. Le facteur de purification d’une fraction pour une enzyme est son activité spécifique divisée par celle de l’homogénat ; le rendement est l’activité de la fraction divisée par celle de l’homogénat.

Calculer l’activité spécifique de la succinate déshydrogénase dans l’homogénat et dans chaque fraction.
Calculer le facteur de purification et le rendement de la succinate déshydrogénase dans le culot 2.
Calculer le facteur de purification de la succinate déshydrogénase dans le culot 3 et interpréter sa valeur.
Calculer l’activité spécifique de la lactate déshydrogénase dans l’homogénat et dans le surnageant final, ainsi que le facteur de purification et le rendement correspondants.
Pourquoi le facteur de purification de l’enzyme cytosolique est-il plus faible que celui de l’enzyme mitochondriale, alors que son rendement est plus élevé ?
Le culot 2 contient $12\,\mathrm{U}$ de lactate déshydrogénase. L’enzyme est-elle en partie mitochondriale ? Proposer une meilleure explication et un moyen de la tester.
Quelle fraction des protéines du foie est mitochondriale, si toute la succinate déshydrogénase est mitochondriale et si le culot 2 est pur à $60\,\%$ ? (Indication : utiliser l’activité spécifique de mitochondries pures, déduite du culot 2, et l’activité totale.)

Partie IV — Contrôler les fractions.

Le culot 2 est examiné en microscopie électronique : quel instrument et quelle préparation, et que devrait-on voir ?
Comment vérifierait-on la présence de cellules entières dans le culot 1, et que ferait-on si l’on en trouvait beaucoup ?
Le culot 2 est remis en suspension et déposé sur un gradient de densité de saccharose, puis centrifugé jusqu’à ce que chaque particule s’arrête là où sa masse volumique égale celle du milieu. Les mitochondries se rassemblent à $1.18\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ , les lysosomes à $1.22\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ , les peroxysomes à $1.24\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . Expliquer pourquoi cette séparation fonctionne alors que la centrifugation différentielle n’y parvenait pas.
L’activité phosphatase acide du culot 2 augmente brusquement lorsqu’on ajoute un détergent au dosage. Expliquer, et dire ce que cela apprend sur l’état des lysosomes dans le culot.
Un étudiant homogénéise dans l’eau pure au lieu du saccharose isotonique. Prédire l’effet sur le culot 2 et sur la répartition de la succinate déshydrogénase et de la phosphatase acide.
Résumer le résultat : le facteur de purification et le rendement de la fraction mitochondriale, et ce qui limite chacun.

Solution

Solution de Problème 5.1.

1. Culot 1 : noyaux (et cellules entières, débris). Culot 2 : mitochondries (avec lysosomes et peroxysomes). Culot 3 : microsomes (fragments de réticulum endoplasmique) et ribosomes. 2. Le froid ralentit les enzymes (dont les protéases et les phospholipases libérées par la rupture) et préserve les organites ; l’isotonie évite que les organites ne gonflent et n’éclatent, ou ne se rétractent. 3. Les mitochondries (membrane interne) ; le cytosol. 4. $500 + 200 + 300 + 950 = 1950\,\mathrm{mg}$ , soit $97.5\,\%$ : pertes sur les parois des tubes et lors des transferts. 5. SDH : $15 + 60 + 5 + 4 = 84$ , soit $84\,\%$ (une partie de l’activité est perdue par lésion des mitochondries). LDH : $20 + 12 + 8 + 350 = 390$ , soit $97.5\,\%$ . 6. $2000/10 = 200\,\mathrm{mg}/\mathrm{g}$ : $20\,\%$ de la masse fraîche (le reste est surtout de l’eau). 7. $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81 \times 10^{4}/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $92\,\mathrm{s}$ : $20\,\mathrm{min}$ sont largement suffisantes. 8. À $1000\,g$ , $v = 5.4 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; en $600\,\mathrm{s}$ , $3.3\,\mathrm{cm}$ . Réparties uniformément sur $5\,\mathrm{cm}$ , les mitochondries situées à moins de $3.3\,\mathrm{cm}$ du fond l’atteignent : $65\,\%$ , si rien d’autre n’intervenait. 9. Seuls $15\,\%$ sédimentent en fait : un culot réel ne retient pas tout ce qui l’atteint (les noyaux tassés sont remis en suspension avec ménagement et la couche supérieure, lâche, reste dans le surnageant), et la formule surestime la vitesse d’organites non sphériques et hydratés. Des mitochondries incluses dans des cellules entières ou adhérant aux noyaux entrent aussi dans le culot 1. 10. $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $14\,\mathrm{s}$ . 11. $v = \frac{2}{9}\times(1.2\times 10^{-8})^2\times 600\times 9.81 \times 10^{5}/10^{-3} = 1.9 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ en $2650\,\mathrm{s}$ , soit $44\,\mathrm{min}$ . À $10\,000\,g$ la vitesse vaut $1.9 \times 10^{-6}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ : en $20\,\mathrm{min}$ , $2.3\,\mathrm{mm}$ , de sorte que les ribosomes restent dans le surnageant 2. 12. La vitesse varie comme $r^2$ : à faible force, seules les plus grosses particules se déplacent sensiblement, de sorte que chaque étape sédimente une classe et laisse les plus petites. Trop courte, la classe est incomplètement sédimentée ; trop longue, la classe suivante commence à contaminer le culot. 13. Homogénat $100/2000 = 0.05\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; culot 1 $15/500 = 0.03$ ; culot 2 $60/200 = 0.30$ ; culot 3 $5/300 = 0.017$ ; surnageant $4/950 = 0.004$ . 14. Purification $0.30/0.05 = 6$ ; rendement $60/100 = 60\,\%$ . 15. $0.017/0.05 = 0.33$ : le culot 3 est appauvri en mitochondries ; le peu d’activité qu’il retient vient de fragments de membrane mitochondriale produits par l’homogénéisation, qui sédimentent avec les microsomes. 16. LDH : homogénat $400/2000 = 0.2\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; surnageant $350/950 = 0.37\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; purification $1.8$ ; rendement $87.5\,\%$ . 17. Le cytosol représente la moitié des protéines de la cellule, de sorte que même un cytosol pur ne peut que doubler l’activité spécifique ; les mitochondries en représentent le sixième ou moins, de sorte que les isoler concentre leurs enzymes six fois ou davantage. Le rendement est élevé pour l’enzyme soluble parce qu’elle n’est pas perdue avec les organites lésés. 18. Non : le culot 2 retient $200\,\mathrm{mg}$ de protéines et piège du surnageant entre ses particules ; $12\,\mathrm{U}$ font $3\,\%$ du total, ce qui est compatible avec du cytosol piégé. Test : laver le culot (remise en suspension et nouvelle centrifugation) : une enzyme piégée part, une enzyme liée reste. 19. Si le culot 2 est à $60\,\%$ de mitochondries, des mitochondries pures ont $0.30/0.6 = 0.5\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; les $100\,\mathrm{U}$ du foie correspondent alors à $200\,\mathrm{mg}$ de protéines mitochondriales, soit $10\,\%$ des $2000\,\mathrm{mg}$ . 20. MET sur culot fixé, inclus, coupé finement et contrasté aux métaux lourds : des profils en haricot à double membrane et à crêtes, avec quelques lysosomes (corps denses) et peroxysomes parmi eux. 21. Observer une goutte du culot remis en suspension au microscope à contraste de phase et compter les cellules intactes parmi les noyaux libres ; s’il y en a beaucoup, homogénéiser plus complètement (plus de va-et-vient, piston plus serré) et recentrifuger, car les organites piégés abaissent tous les rendements. 22. La centrifugation différentielle sépare selon la taille (vitesse $\propto r^2$ ) et les trois organites ont des tailles voisines ; dans un gradient de densité, une particule s’arrête à sa propre masse volumique quelle que soit sa taille, et les trois masses volumiques diffèrent. 23. Des lysosomes intacts gardent l’enzyme derrière une membrane que le substrat ne franchit pas (latence) ; le détergent rompt la membrane et l’expose. Les lysosomes du culot sont donc pour la plupart intacts. 24. L’eau est hypotonique : les organites gonflent et éclatent. Mitochondries et lysosomes se rompent, de sorte que le culot 2 diminue ; la succinate déshydrogénase (liée aux membranes) passe en partie dans le culot 3 sous forme de fragments membranaires ; la phosphatase acide (soluble dans le lysosome) est libérée dans le surnageant final. 25. Facteur de purification $6$ , rendement $60\,\%$ . Le facteur est limité par la contamination (lysosomes, peroxysomes, cytosol piégé : le culot 2 est à $60\,\%$ de mitochondries) ; le rendement, par les mitochondries perdues dans le culot 1 (piégées) et rompues pendant l’homogénéisation.

Termes définis dans ce chapitre

Voir les 479 termes du glossaire