Biologie universitaire — 1re année · Bachelor Year 1

20Le contrôle de l’expression génétique

Une bactérie qui pousse sur glucose porte cinq molécules de l’enzyme qui digère le lactose ; donnez-lui du lactose et, en quelques minutes, elle en porte cinq mille. Une cellule hépatique et un neurone portent les mêmes vingt mille gènes et fabriquent des jeux de protéines presque entièrement différents, et jamais l’un ne fabriquera ceux de l’autre. Rien dans le Chapitre 19 n’explique cela : la machinerie de l’expression est la même pour tous les gènes. Ce qui diffère, c’est qu’un gène soit lu ou non, à quelle fréquence et pendant combien de temps — décisions prises au promoteur par des protéines qui se lient à l’ADN, et après lui par le sort du messager et de la protéine. Ce chapitre décrit comment les bactéries allument et éteignent leurs gènes selon leur nourriture, comment les eucaryotes commandent les leurs par la chromatine, des amplificateurs lointains et des combinaisons de facteurs, et comment le même contrôle, appliqué à des gènes différents dans des cellules différentes, fait un corps à partir d’un seul génome.

20.1 Pourquoi et où les gènes sont commandés

Proposition 20.1 (L’expression est régulée, à tous les niveaux)

Certains gènes sont constitutifs — exprimés toujours, à un niveau constant, parce que leurs produits sont toujours nécessaires (les protéines du ribosome, les enzymes de la glycolyse). La plupart sont régulés : exprimés seulement dans certaines conditions, dans certaines cellules, à certains moments. Le contrôle agit à chaque étape du flux — surtout au démarrage de la transcription, l’endroit le moins coûteux pour décider, mais aussi à la maturation, à l’exportation, à la stabilité et à la traduction du messager, et à la modification et à la dégradation de la protéine — et les temps de réponse vont de la seconde (une protéine modifiée) à la minute (un gène bactérien allumé) et au jour (un état de la chromatine changé).

Exemple 20.2 (Ne fabriquer les enzymes qu’en cas de besoin)

La $\beta$ -galactosidase, qui scinde le lactose, est un tétramère de quatre chaînes de $1024\,$ résidus : cinq mille copies font $3\,\%$ des protéines d’une cellule et coûtent $8 \times 10^{7}\,$ ATP par génération. Une bactérie qui les fabriquerait sans lactose à digérer croîtrait environ un pour cent moins vite qu’une concurrente qui ne le ferait pas, et en quelques centaines de générations serait submergée. La régulation est sélectionnée parce que l’expression coûte cher.

20.2 L’opéron lactose

Définition 20.3 (Opéron, répresseur, opérateur)

Un opéron est un groupe de gènes bactériens transcrits ensemble à partir d’un seul promoteur en un seul messager, et donc commandés ensemble. L’opéron lactose d’E. coli comprend trois gènes pour l’usage du lactose — lacZ ( $\beta$ -galactosidase), lacY (la perméase du lactose, qui l’importe) et lacA — derrière un promoteur et un opérateur, courte séquence qui chevauche le promoteur. Un gène à part, lacI, fabrique le répresseur lac, protéine qui se lie à l’opérateur et bloque la polymérase. Le lactose, converti dans la cellule en allolactose, est l’inducteur : il se lie au répresseur, en change la forme, et lui fait lâcher l’opérateur. L’opéron est donc éteint sauf en présence de lactose — un contrôle négatif levé par induction.

L’opéron lactose. Sans lactose, le répresseur occupe l’opérateur et la polymérase ne peut pas démarrer ; avec du lactose, l’inducteur détache le répresseur et les trois gènes sont transcrits en un seul messager.

Proposition 20.4 (Le modèle de l’opéron)

Les gènes lac sont commandés par un répresseur diffusible agissant sur un site voisin des gènes : le contrôle est négatif, le répresseur agit en trans (depuis n’importe où dans la cellule), et l’opérateur agit en cis (seulement sur les gènes qui le jouxtent).

Faits expérimentaux. Jacob et Monod (1959–1961) raisonnèrent à partir de mutants. Des souches mutées dans lacI ( $I^-$ ) faisaient l’enzyme avec ou sans lactose (de façon constitutive) ; un gène lacI normal introduit sur une seconde copie de la région rétablissait la régulation : le produit du gène est donc un répresseur diffusible dont un mutant est privé. Des souches mutées dans l’opérateur ( $O^c$ ) étaient elles aussi constitutives, mais un second opérateur normal sur une autre copie ne rétablissait pas la régulation — l’opérateur ne commande que les gènes qui lui sont physiquement attachés : c’est donc un site, non un produit. Une troisième classe ( $I^s$ ) ne pouvait pas être induite du tout, et était dominante : un répresseur qui ne fixe plus l’inducteur. Dans l’expérience PaJaMo (1959), un gène lacI normal transféré par conjugaison dans une cellule $I^-$ éteignit la synthèse de l’enzyme en quelques minutes : le répresseur agit vite, et sur la transcription — on montra plus tard que le messager a une demi-vie de quelques minutes. ∎

Définition 20.5 (Contrôle positif : CAP et AMPc)

Le promoteur lac est faible : même sans répresseur, la polymérase ne démarre que rarement à moins qu’une seconde protéine, la CAP (protéine activatrice par les catabolites), ne soit fixée juste en amont de lui, où elle courbe l’ADN et maintient la polymérase en place. La CAP ne se lie à l’ADN que si elle porte de l’AMP cyclique, dont le taux dans la cellule baisse quand le glucose abonde. L’opéron n’est donc pleinement allumé que si le lactose est présent et le glucose absent : deux signaux, l’un négatif, l’autre positif, sont intégrés à un seul promoteur. Avec les deux sucres, E. coli mange d’abord le glucose, marque une pause pendant que l’AMPc monte et que les enzymes lac sont fabriquées, puis mange le lactose — c’est la courbe de croissance à deux phases appelée diauxie, que Monod décrivit en 1941 et qui le mit sur la route de l’opéron.

Croissance diauxique d’E. coli sur glucose plus lactose. La culture croît sur le glucose seul, s’arrête quand il est épuisé, et repart sur le lactose après la demi-heure qu’il faut pour induire l’opéron lactose. — Croissance diauxique d’*E. coli* sur glucose plus lactose. La culture croît sur le glucose seul, s’arrête quand il est épuisé, et repart sur le lactose après la demi-heure qu’il faut pour induire l’opéron lactose.

L’opéron lactose rendu visible : des colonies sur une boîte contenant du X-gal, substrat incolore que la -galactosidase fait virer au bleu. Les colonies bleues expriment lacZ ; les blanches portent un gène cassé — le rapporteur employé dans mille expériences. — L’opéron lactose rendu visible : des colonies sur une boîte contenant du X-gal, substrat incolore que la $\beta$ -galactosidase fait virer au bleu. Les colonies bleues expriment *lacZ* ; les blanches portent un gène cassé — le rapporteur employé dans mille expériences.

Méthode 20.6 (Prédire un phénotype lac)

Écrire le génotype de chaque copie de la région : $I$ , $P$ , $O$ , $Z$ ( $^+$ normal, $^-$ inactif, $O^c$ opérateur constitutif, $I^s$ super-répresseur).
Le répresseur agit en trans : un seul $I^+$ où qu’il soit réprime tout opérateur normal ; $I^s$ réprime quel que soit l’inducteur.
L’opérateur et le promoteur agissent en cis : un $O^c$ ne libère que le $Z$ de son propre ADN ; un $P^-$ n’éteint que ses propres gènes.
Se demander, avec et sans inducteur, si chaque gène $Z^+$ est transcrit ; le phénotype est inductible, constitutif ou non inductible selon le cas. Ajouter ensuite du glucose : sans le couple AMPc–CAP, la transcription est faible quoi que fasse le répresseur.

Exemple 20.7 (Deux diploïdes partiels)

$I^-\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^-$ : la copie $I^+$ fabrique un répresseur qui se lie à l’ $O^+$ voisin de $Z^+$ ; inductible — la mutation est complémentée. $I^+\,O^c\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^-$ : le seul $Z$ en état de marche se trouve derrière un opérateur que le répresseur ne peut pas lier ; constitutif — l’opérateur normal de l’autre copie ne peut rien, puisqu’il ne commande que le $Z$ cassé.

20.3 Autres stratégies bactériennes

Proposition 20.8 (Répression, atténuation et facteurs sigma)

Les opérons de biosynthèse sont commandés en sens inverse : l’opéron tryptophane, cinq gènes pour fabriquer le tryptophane, est transcrit sauf en présence de tryptophane — l’acide aminé se lie au répresseur trp et lui permet de se lier à l’opérateur (c’est un corépresseur). Un second contrôle, plus fin, l’atténuation, exploite le couplage de la transcription et de la traduction chez les bactéries : le début du messager code un court peptide portant deux tryptophanes à la suite ; si l’ARNt chargé en tryptophane abonde, un ribosome le traduit vite et l’ARN qui suit se replie en épingle terminatrice qui arrête la polymérase avant les gènes ; si le tryptophane est rare, le ribosome cale sur les codons du tryptophane et l’ARN se replie autrement, ce qui laisse la transcription continuer. Les bactéries commutent aussi des jeux entiers de gènes en changeant la sous-unité $\sigma$ de leur polymérase : un $\sigma$ de choc thermique la dirige vers les promoteurs des gènes de chaperons ; un $\sigma$ de sporulation vers ceux de la formation des spores.

20.4 Le contrôle chez les eucaryotes

Définition 20.9 (Facteurs de transcription, amplificateurs)

Chez les eucaryotes, la polymérase ne démarre jamais seule : les facteurs généraux du promoteur (Chapitre 19) la recrutent, et le débit est fixé par des facteurs de transcription liés à des séquences régulatrices — certaines près du promoteur, beaucoup dans des amplificateurs qui peuvent se trouver à des milliers de paires de bases, en amont, en aval ou dans un intron, dans l’une ou l’autre orientation, et qui agissent en faisant boucler l’ADN pour que les facteurs qui y sont liés touchent le complexe du promoteur par l’intermédiaire de protéines médiatrices. Un facteur de transcription est modulaire : un domaine de liaison à l’ADN qui reconnaît une courte séquence (familles hélice-tour-hélice, doigt de zinc, glissière à leucines) et un domaine d’activation ou de répression qui recrute ou bloque la machinerie. Un gène est lu quand la bonne combinaison de facteurs est présente : quelques centaines de facteurs, en combinaisons, commandent vingt mille gènes.

L’action d’un amplificateur. Les activateurs liés à un amplificateur lointain sont amenés au promoteur par le bouclage de l’ADN, et un complexe médiateur relaie leur signal à la polymérase.

Proposition 20.10 (La chromatine fait partie du contrôle)

Un gène emballé dans des nucléosomes tassés en hétérochromatine ne peut pas être lu : les facteurs ne l’atteignent pas. Les activateurs recrutent des enzymes qui acétylent les histones, ce qui desserre leur prise sur l’ADN et marque la région comme ouverte ; les répresseurs recrutent des enzymes qui retirent les groupes acétyle et ajoutent des marques qui compactent la chromatine. Des groupes méthyle ajoutés aux cytosines d’un promoteur l’éteignent durablement, et les marques sont copiées à la réplication, de sorte que la configuration des gènes ouverts et fermés d’une cellule est héritée par ses filles — la mémoire par laquelle les filles d’une cellule hépatique restent des cellules hépatiques (le volume de troisième année traite en profondeur ces mécanismes épigénétiques).

Faits expérimentaux. Dans les chromosomes polytènes géants des larves de drosophile (mille copies de chaque chromosome côte à côte, striées), les gènes en cours de transcription apparaissent en puffs là où la chromatine s’est déployée ; l’ecdysone, l’hormone qui déclenche la mue, fait apparaître un jeu précis de puffs en quelques minutes et d’autres quelques heures plus tard, dans un ordre fixe — la transcription vue directement, et commutée par un signal. Des gènes déplacés par un remaniement chromosomique auprès de l’hétérochromatine sont éteints dans certaines cellules et pas dans d’autres, et l’état est hérité par leurs filles. ∎

Un chromosome polytène d’une glande salivaire de drosophile : strié, avec deux puffs là où la chromatine s’est ouverte pour la transcription. Les puffs apparaissent et disparaissent à mesure que des gènes sont allumés et éteints.

Exemple 20.11 (Un signal devient un profil d’expression)

Le cortisol entre dans une cellule hépatique et se lie à son récepteur, facteur de transcription maintenu inactif dans le cytosol ; le complexe gagne le noyau, se lie à une séquence de quinze bases présente auprès d’une centaine de gènes — dont ceux de la néoglucogenèse (Chapitre 16) — et recrute des acétylases et le médiateur : en une heure, les enzymes de la synthèse du glucose sont en fabrication. La même hormone dans un lymphocyte, dont la chromatine ouverte expose un autre jeu de ces séquences, allume des gènes qui tuent la cellule. Un signal, un récepteur, deux réponses : la différence est dans les gènes qui étaient accessibles.

20.5 Après la transcription, et la fabrication d’un corps

Proposition 20.12 (Le contrôle au-delà du promoteur)

Une cellule eucaryote décide aussi comment un transcrit est épissé (l’épissage alternatif donne à un muscle et à un cerveau des protéines différentes à partir d’un seul gène), s’il est exporté, combien de temps il dure (des demi-vies allant de la minute pour les messages des protéines régulatrices au jour pour celui de l’hémoglobine, fixées par des séquences des régions non traduites qui lient des protéines et de petits ARN régulateurs), et s’il est traduit (les cellules carencées en fer bloquent la traduction du message de la ferritine par une protéine fixée à son extrémité $5'$ , et la libèrent quand le fer est présent). La protéine, une fois faite, est commandée par sa modification et par sa dégradation (Chapitre 13). Chaque niveau plus tardif est plus rapide et plus local que le précédent, et plus coûteux : la transcription décide de ce que la cellule peut faire, les niveaux ultérieurs de ce qu’elle fait maintenant.

Proposition 20.13 (L’expression différentielle fait un corps)

Chaque cellule d’un organisme pluricellulaire porte le même génome ; les cellules diffèrent parce qu’elles en expriment des sous-ensembles différents. Les gènes de ménage — quelques milliers pour le métabolisme, le ribosome, le cytosquelette — sont allumés dans toute cellule ; les autres sont allumés dans certaines cellules et éteints dans d’autres selon les combinaisons de facteurs de transcription que chaque cellule porte et les états de chromatine dont elle a hérité. Le précurseur d’un globule rouge allume la globine et éteint presque tout le reste ; un neurone allume ses canaux et ne se divise plus jamais. La différenciation est l’acquisition d’un profil d’expression stable, et le développement (volume de deuxième année) est le processus par lequel des signaux entre cellules établissent ces profils aux bons endroits.

Faits expérimentaux. Un noyau prélevé sur une cellule différenciée de grenouille et placé dans un ovule dont le noyau propre a été retiré peut diriger le développement d’un têtard entier (Gurdon, 1962 ; rappel du volume du lycée) : la cellule différenciée n’avait perdu aucun gène, elle les avait seulement éteints, et le cytoplasme de l’ovule a réarmé les interrupteurs. Les protéines d’un type cellulaire, séparées sur gel, diffèrent de celles d’un autre type ; ses messagers, une fois séquencés, forment un sous-ensemble du génome qui lui est propre ; et une poignée de facteurs de transcription introduits dans une cellule de peau peuvent la reprogrammer en cellule souche ou en neurone. ∎

Exemple 20.14 (Un gène lu dans deux organes)

Le gène de l’enzyme qui fabrique du glucose à partir du glucose-6-phosphate est exprimé dans le foie et dans le rein et dans aucun autre tissu : son promoteur porte des sites pour des facteurs présents là seulement, et dans les autres cellules ce promoteur est méthylé et sa chromatine fermée. Un muscle, qui porte le gène intact, ne peut pas libérer de glucose dans le sang (Chapitre 16) — non faute du gène, mais parce que le gène n’est pas lu. Le génome est le même ; l’expression fait l’organe.

20.6 Exercices

Exercice 20.1 ★

Nommer les éléments de l’opéron lactose et donner l’état de l’opéron avec et sans lactose, avec et sans glucose.

Solution

Solution de Exercice 20.1.

lacI (gène du répresseur), promoteur, opérateur, lacZ, lacY, lacA, et le site CAP. Sans lactose : éteint (répresseur fixé). Lactose et glucose présents : à peine allumé (répresseur détaché, mais pas de couple AMPc–CAP). Lactose sans glucose : pleinement allumé. Aucun des deux sucres : éteint.

Exercice 20.2 ★

Expliquer la différence entre un produit de gène qui agit en trans et un site qui agit en cis, avec un exemple de chacun tiré de l’opéron.

Solution

Solution de Exercice 20.2.

Un produit qui agit en trans est une molécule diffusible qui peut agir sur n’importe quelle copie de sa cible dans la cellule : le répresseur. Un site qui agit en cis est une séquence d’ADN qui n’affecte que les gènes qui lui sont physiquement liés : l’opérateur.

Exercice 20.3 ★

D’après la figure de la diauxie, lire la durée de la latence et les temps de doublement sur chaque sucre.

Solution

Solution de Exercice 20.3.

Latence d’environ $36\,\mathrm{min}$ (de $2\,\mathrm{h}$ à $2.6\,\mathrm{h}$ ) ; doublement en $20\,\mathrm{min}$ sur glucose, en $30\,\mathrm{min}$ sur lactose.

Exercice 20.4 ★

Définir amplificateur, facteur de transcription et gène de ménage.

Solution

Solution de Exercice 20.4.

Amplificateur : séquence régulatrice, souvent lointaine, qui augmente la transcription d’un gène quand des facteurs s’y fixent. Facteur de transcription : protéine munie d’un domaine de liaison à l’ADN et d’un domaine d’activation ou de répression, qui règle la transcription. Gène de ménage : gène exprimé dans toute cellule à un niveau constant.

Exercice 20.5 ★★

Donner le phénotype (inductible, constitutif, non inductible) de : $I^-$ ; $O^c$ ; $I^s$ ; $I^-\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^+$ ; $I^s\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^+$ ; $I^+\,O^c\,Z^- / I^+\,O^+\,Z^+$ .

Solution

Solution de Exercice 20.5.

$I^-$ : constitutif. $O^c$ : constitutif. $I^s$ : non inductible. $I^-/I^+$ : inductible (le répresseur $I^+$ agit en trans). $I^s/I^+$ : non inductible ( $I^s$ dominant). $I^+\,O^c\,Z^- / I^+\,O^+\,Z^+$ : inductible — le seul $Z$ en état de marche est derrière un opérateur normal.

Exercice 20.6 ★★

Comparer les opérons lactose et tryptophane : ce que la petite molécule fait au répresseur dans chacun, et pourquoi la logique est inverse.

Solution

Solution de Exercice 20.6.

Lac : le sucre (l’inducteur) se lie au répresseur et le détache de l’opérateur — les enzymes sont faites quand leur substrat est présent. Trp : l’acide aminé (le corépresseur) se lie au répresseur et lui permet de se lier — les enzymes sont faites quand leur produit est absent. Les voies cataboliques sont allumées par leur entrée, les voies anaboliques éteintes par leur sortie.

Exercice 20.7 ★★

Un mutant ne sait pas fabriquer d’AMPc. Prédire sa croissance sur glucose, sur lactose seul et sur les deux, ainsi que le taux de $\beta$ -galactosidase dans chaque cas.

Solution

Solution de Exercice 20.7.

Sur glucose : croissance normale (le glucose n’a pas besoin de CAP). Sur lactose seul : presque pas de croissance — sans AMPc, la CAP ne peut pas activer le promoteur lac, de sorte que l’enzyme reste à quelques pour cent du niveau induit même avec le répresseur détaché. Sur les deux : croissance sur glucose, puis arrêt ; pas de seconde phase. Enzyme faible dans tous les cas.

Exercice 20.8 ★★

Expliquer pourquoi l’atténuation est impossible chez les eucaryotes, à partir de l’architecture de la cellule eucaryote.

Solution

Solution de Exercice 20.8.

L’atténuation exige que le ribosome traduise le messager pendant que la polymérase le transcrit encore, de sorte que la position du ribosome façonne l’ARN situé derrière la polymérase. Chez les eucaryotes, la transcription se fait dans le noyau et la traduction dans le cytosol, et le message n’est traduit qu’une fois mûri et exporté.

Exercice 20.9 ★★

Un amplificateur est déplacé de $5\,\mathrm{kb}$ en amont de son gène à $5\,\mathrm{kb}$ en aval et retourné ; le gène est toujours exprimé. Expliquer ce que cela montre du fonctionnement des amplificateurs.

Solution

Solution de Exercice 20.9.

Les amplificateurs agissent à distance, dans l’une ou l’autre orientation et de part et d’autre du gène ; ils ne peuvent donc pas agir en étant lus ni en plaçant directement la polymérase ; ils agissent en fixant des facteurs qui touchent le promoteur par une boucle d’ADN, ce pour quoi la distance et l’orientation importent peu.

Exercice 20.10 ★★★

Cinq mille tétramères de $\beta$ -galactosidase de $4096\,$ résidus coûtent combien d’ATP (quatre par résidu) ? Le budget d’une cellule par génération est d’environ $1 \times 10^{10}\,$ ATP. Calculer le désavantage de croissance d’un mutant constitutif, et le nombre de générations pour que sa part d’une population mixte passe de la moitié au centième.

Solution

Solution de Exercice 20.10.

$5000\times 4096\times 4 = 8.2 \times 10^{7}$ ATP : $0.8\,\%$ du budget. Taux de croissance abaissé de $0.8\,\%$ : par génération, la part du mutant est multipliée par $2^{-0.008} = 0.9945$ . De $1:1$ à $1:99$ : $0.9945^n = 1/99$ , $n = \ln 99/0.00555 = 830$ générations — quelques semaines de culture continue.

Exercice 20.11 ★★★

On compare une cellule hépatique et un neurone d’une même personne : même génome, protéines différentes, et chaque division de la cellule hépatique donne des cellules hépatiques. Expliquer, à l’aide de la chromatine, des facteurs et de l’hérédité des marques, comment la différence est faite et comment elle est maintenue.

Solution

Solution de Exercice 20.11.

Chaque type cellulaire porte un jeu propre de facteurs de transcription, qui se lient aux amplificateurs de ses gènes et recrutent des acétylases qui en ouvrent la chromatine, tandis que les gènes des autres types sont méthylés et tassés dans une hétérochromatine qu’aucun facteur ne peut atteindre. Les facteurs entretiennent mutuellement leur expression (un réseau à états stables), et les marques de la chromatine sont copiées à la réplication, de sorte que les filles héritent à la fois des facteurs et des régions ouvertes et fermées. Le génome est le même ; le génome accessible ne l’est pas, et l’inaccessibilité est héritée.

Exercice 20.12 ★★★

« Une bactérie lit son environnement ; une cellule d’un corps lit son histoire. » Discuter en un paragraphe les deux sortes de contrôle, leurs signaux, leurs échelles de temps et leur réversibilité.

Solution

Solution de Exercice 20.12.

Les contrôles d’une bactérie sont accordés au milieu : un sucre, un acide aminé, une température lie un répresseur ou un facteur sigma et la réponse est complète en quelques minutes, puis annulée dès que le signal disparaît — l’expression suit l’environnement. Une cellule d’un corps répond elle aussi à des signaux, mais ses décisions principales ont été prises au cours du développement et verrouillées dans la chromatine : ce qu’elle peut exprimer a été fixé par les facteurs dont elle a hérité et par les marques de son ADN, changées seulement par la division et pour l’essentiel irréversibles. La bactérie est une lectrice du présent ; la cellule différenciée a une mémoire, et cette mémoire est son identité.

20.7 Problème : la diauxie

Problème 20.1

Problème du week-end — la courbe de croissance à deux phases de Monod reconstruite cellule par cellule : glucose épuisé, lactose induit, enzymes comptées, mutants prédits et coût de la régulation évalué, jusqu’au facteur d’induction de la $\beta$ -galactosidase

Une culture d’E. coli part de $10^7$ cellules par millilitre dans un milieu contenant $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de glucose et $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de lactose. Sur glucose, les cellules doublent toutes les $20\,\mathrm{min}$ , sur lactose toutes les $30\,\mathrm{min}$ ; une cellule a besoin de $1.5 \times 10^{-12}\,\mathrm{g}$ de sucre par division ( $180\,\mathrm{g}/\mathrm{mol}$ pour le glucose ; le lactose, $342\,\mathrm{g}/\mathrm{mol}$ , compte pour deux glucoses). Les cellules non induites contiennent 5 molécules de $\beta$ -galactosidase ; pleinement induites, $5000$ . L’induction prend $30\,\mathrm{min}$ . L’enzyme est un tétramère de $4\times 1024$ résidus ; chaque résidu coûte 4 ATP ; le budget ATP d’une cellule est de $10^{10}$ par division et ses protéines pèsent $1.5 \times 10^{-13}\,\mathrm{g}$ ( $110\,\mathrm{Da}$ par résidu).

Partie I — La phase glucose.

Calculer le glucose disponible par millilitre, en grammes.
Combien de divisions par millilitre peut-il soutenir ?
En partant de $10^7$ cellules, combien y a-t-il de cellules quand le glucose est épuisé ? (Une division fait une cellule de plus.)
Combien cela fait-il de doublements, et combien de temps dure la phase glucose ?
Pendant cette phase, quel est l’état de l’opéron lactose, et pourquoi, en termes moléculaires (répresseur et CAP) ?

Partie II — Le basculement.

Quand le glucose est épuisé, qu’est-ce qui monte à l’intérieur des cellules et à quoi cela se lie-t-il ?
Le lactose était présent depuis le début. Pourquoi l’opéron était-il néanmoins presque éteint pendant la phase glucose ?
Pendant les $30\,\mathrm{min}$ de latence, chaque cellule fabrique ses $5000$ enzymes. Calculer le nombre de molécules d’enzyme faites par seconde et par cellule, ainsi que le nombre de résidus par seconde.
Une cellule contient $20\,000$ ribosomes à $20\,$ résidus par seconde. Quelle fraction de sa traduction est consacrée à la $\beta$ -galactosidase pendant la latence ?
Calculer la masse de $5000$ tétramères et la fraction des protéines de la cellule qu’ils représentent.
Calculer le facteur d’induction.
Pourquoi la perméase (lacY) est-elle aussi nécessaire que l’enzyme pour croître sur lactose, et qu’advient-il d’un mutant lacY $^-$ mis en présence de lactose ?

Partie III — La phase lactose.

Calculer le lactose disponible par millilitre en équivalents glucose, en grammes.
Combien de divisions supplémentaires cela soutient-il, et quel est le nombre final de cellules ?
Combien de temps dure la phase lactose ?
Dresser la chronologie : phase glucose, latence, phase lactose, total.
Expliquer pourquoi le temps de doublement est plus long sur lactose (deux raisons : l’une tenant à l’étape enzymatique, l’autre à la perméase).

Partie IV — Mutants et coûts.

Un mutant $I^-$ : décrire sa courbe de croissance sur le même milieu et son taux d’enzyme tout du long.
Un mutant CAP $^-$ : décrire sa courbe et son taux d’enzyme.
Un mutant $O^c$ dans un milieu à lactose seul : une différence avec le type sauvage ? Et dans un milieu à glucose seul ?
Calculer le coût en ATP, par génération, de la fabrication de $5000$ tétramères, et la fraction du budget de la cellule.
Si cette fraction allonge le temps de génération de la même fraction, de combien le taux de croissance du mutant $I^-$ reste-t-il en retard sur celui du type sauvage sur glucose ?
En partant d’effectifs égaux, au bout de combien de générations sur glucose le mutant ne fait-il plus que le dixième de la population ? ( $r^n = 0.1/0.9$ avec $r$ le rapport des taux de croissance par génération, soit $2^{-\delta}$ pour un retard $\delta$ en doublements.)
Expliquer pourquoi, malgré tout, les mutants $I^-$ sont fréquents dans les souches de laboratoire cultivées sur lactose.
Énoncer le résultat : le facteur d’induction de la $\beta$ -galactosidase, le coût de sa fabrication inutile en fraction du budget ATP, et la durée totale de l’expérience de diauxie. diauxic experiment.

Solution

Solution de Problème 20.1.

1. $0.5\times 10^{-3}\times 180 = 0.09\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 9 \times 10^{-5}\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . 2. $9\times 10^{-5}/1.5\times 10^{-12} = 6 \times 10^{7}$ divisions. 3. $10^7 + 6 \times 10^{7} = 7 \times 10^{7}$ cellules par mL. 4. $7 = 2^n$ : $n = 2.8$ doublements, soit $56\,\mathrm{min}$ . 5. Éteint : le lactose (l’allolactose) a détaché le répresseur, mais le glucose maintient l’AMPc bas, de sorte que la CAP n’est pas fixée et que le promoteur est presque muet ; de plus la perméase est rare, si bien que peu de lactose entre. 6. L’AMPc monte et se lie à la CAP, qui se lie au promoteur. 7. Le contrôle négatif était levé mais le contrôle positif manquait : un promoteur faible sans CAP démarre rarement (répression catabolique). 8. $5000/1800 = 2.8$ tétramères par seconde ; $2.8\times 4096 = 11\,400$ résidus par seconde. 9. Capacité $20\,000\times 20 = 4 \times 10^{5}$ résidus par seconde : $3\,\%$ des ribosomes. 10. $5000\times 4096\times 110\times 1.66\times 10^{-24} = 3.7 \times 10^{-15}\,\mathrm{g}$ : $2.5\,\%$ des protéines de la cellule. 11. $5000/5 = 1000$ . 12. Le lactose ne peut pas traverser la membrane sans la perméase ; un mutant lacY $^-$ a l’enzyme mais pas de substrat à l’intérieur et ne croît pas sur lactose (et s’induit mal, puisque l’inducteur est fabriqué à partir du lactose dans la cellule). 13. $1.0\times 10^{-3}\times 342 = 0.342\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , qui valent $2\times 180 = 360\,\mathrm{g}$ de glucose par mole, soit $0.36\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ $= 3.6 \times 10^{-4}\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . 14. $3.6\times 10^{-4}/1.5\times 10^{-12} = 2.4 \times 10^{8}$ divisions ; total final $7 \times 10^{7} + 2.4 \times 10^{8} = 3.1 \times 10^{8}$ par mL. 15. $3.1/0.7 = 4.4 = 2^n$ : $n = 2.1$ doublements, soit $64\,\mathrm{min}$ . 16. Glucose $56\,\mathrm{min}$ , latence $30\,\mathrm{min}$ , lactose $64\,\mathrm{min}$ : $150\,\mathrm{min}$ en tout. 17. Le lactose doit d’abord être hydrolysé, étape enzymatique supplémentaire dont la vitesse limite l’approvisionnement en glucose ; et la perméase emploie le gradient de protons pour l’importer, coût que le transport du glucose ne paie pas. 18. $I^-$ : enzyme à $5000$ tout du long (constitutif, une fois le glucose épuisé ; sur glucose la CAP la limite encore, de sorte que le niveau est intermédiaire) ; sa latence est plus courte ou nulle, de sorte que la courbe montre une pause plus faible ; le coût le ralentit légèrement sur glucose. 19. CAP $^-$ : croît sur glucose jusqu’à $7 \times 10^{7}$ , puis s’arrête : l’opéron lactose ne peut pas être activé, l’enzyme reste vers 5 molécules, et le lactose n’est jamais employé. 20. Sur lactose seul : aucune différence de taux d’enzyme une fois induit (les deux pleinement allumés) et pratiquement aucune en croissance ; l’ $O^c$ n’évite que le délai d’induction. Sur glucose seul : l’ $O^c$ fabrique l’enzyme inutilement (dans la mesure où la CAP le permet), le type sauvage non. 21. $5000\times 4096\times 4 = 8.2 \times 10^{7}$ ATP : $0.8\,\%$ de $10^{10}$ . 22. Temps de génération allongé de $0.8\,\%$ : taux de croissance abaissé de $0.8\,\%$ , $\delta = 0.008$ doublement par génération. 23. $r = 2^{-0.008} = 0.99447$ ; $r^n = 0.111$ : $n = \ln 0.111/\ln 0.99447 = 2.20/0.00555 = 400$ générations. 24. Sur lactose, l’enzyme est de toute façon nécessaire, de sorte que le mutant ne paie rien et gagne la latence : il n’est pas contre-sélectionné et il l’est parfois positivement ; et les souches de laboratoire sont cultivées pour la commodité, non pour la compétition. 25. Facteur d’induction 1000 (de 5 à $5000$ molécules) ; la synthèse inutile coûte $0.8\,\%$ du budget ATP ; l’expérience dure environ deux heures et demie.

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