Biologie universitaire — 1re année · Bachelor Year 1

13Enzymes et catalyse biochimique

Versez du peroxyde d’hydrogène sur une pomme de terre coupée : elle mousse. Une seule molécule de catalase des cellules du tubercule brise quarante millions de molécules de peroxyde chaque seconde, une réaction qui, livrée à elle-même, prendrait des années. Le peroxyde allait de toute façon se décomposer — la réaction suit la pente — mais pas en un temps utile. Toute réaction de la cellule est ainsi : la thermodynamique dit dans quel sens elle peut aller, et une enzyme dit si elle va maintenant. Ce chapitre décrit ce qu’une enzyme fait à une réaction, la cinétique par laquelle on mesure et compare les enzymes, les façons de les inhiber, et les façons dont la cellule les allume et les éteint.

13.1 La catalyse

Définition 13.1 (Enzyme, substrat, site actif)

Une enzyme est une protéine (rarement un ARN) qui catalyse une réaction : elle en augmente la vitesse sans être consommée et sans changer l’équilibre. Les molécules sur lesquelles elle agit sont ses substrats ; ils se fixent dans le site actif, une crevasse que bordent quelques résidus, où la chimie se fait. Les enzymes sont spécifiques — d’un substrat ou d’une famille, d’une liaison, d’un stéréo-isomère — et elles sont nommées d’après leur substrat et leur réaction avec le suffixe -ase (lactase, ADN polymérase, succinate déshydrogénase), en six classes : oxydoréductases, transférases, hydrolases, lyases, isomérases, ligases. Beaucoup ont besoin d’un cofacteur non protéique : un ion métallique (Zn, Mg, Fe), ou un coenzyme organique — $\mathrm{NAD^+}$ , FAD, coenzyme A, la plupart fabriqués à partir de vitamines, ce à quoi les vitamines servent.

Proposition 13.2 (Ce qu’une enzyme change et ce qu’elle ne change pas)

Une réaction passe par un état de transition, arrangement contraint des atomes, plus haut en énergie libre que les réactifs ou les produits de l’énergie d’activation $E_a$ ; seules les molécules que l’agitation thermique fait franchir cette barrière réagissent, en une fraction proportionnelle à $e^{-E_a/RT}$ . Une enzyme lie l’état de transition plus fortement que le substrat — son site actif est complémentaire de la forme contrainte — et abaisse ainsi $E_a$ : l’abaisser de $34\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ (la valeur de quelques liaisons hydrogène) à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ multiplie la vitesse par $e^{34\,000/2580} \approx 10^6$ . Elle ne change ni $\Delta G$ ni la constante d’équilibre, qui ne dépendent que des réactifs et des produits : une enzyme accélère également les réactions directe et inverse et amène le système au même équilibre plus vite.

Énergie libre le long d’une réaction. L’enzyme (en rouge) abaisse la barrière de l’état de transition et laisse intacte la différence entre substrat et produit — et donc l’équilibre.

Du peroxyde d’hydrogène sur une pomme de terre coupée : la catalase des cellules le sépare en eau et en oxygène quarante millions de fois par seconde et par molécule d’enzyme, et l’oxygène mousse au dehors.

Proposition 13.3 (Comment travaille un site actif)

Un site actif accélère sa réaction par plusieurs moyens à la fois : il lie et oriente les substrats de sorte que les groupes réactifs se rencontrent dans la bonne géométrie, remplaçant une collision rare par une collision certaine ; il contraint le substrat vers l’état de transition (ajustement induit : l’enzyme se referme sur le substrat, et l’ajustement est le meilleur pour l’état de transition) ; ses chaînes latérales agissent comme acides et bases, cédant et reprenant des protons au substrat au bon moment (l’histidine, dont le p $K_a$ est proche de 7, le fait dans de nombreuses enzymes) ; certains forment une liaison covalente transitoire avec le substrat (les sérine-protéases) ; et ses ions métalliques polarisent des liaisons et stabilisent des charges. L’eau est largement exclue du site, de sorte que charges et liaisons hydrogène agissent de toute leur force.

Exemple 13.4 (Trois enzymes)

Le lysozyme, présent dans les larmes et le blanc d’œuf, contraint un cycle de sucre de la paroi bactérienne dans la forme de l’état de transition et coupe la chaîne : une accélération d’un facteur $10^8$ . L’anhydrase carbonique, dans les globules rouges, porte un ion zinc qui transforme l’eau en un hydroxyde prêt à attaquer le $\mathrm{CO_2}$ : un million de molécules par seconde, l’enzyme la plus rapide après la catalase. La chymotrypsine, dans le suc pancréatique, emploie une sérine rendue réactive par une histidine pour couper les protéines après les résidus aromatiques : cent par seconde, avec un intermédiaire covalent.

13.2 La cinétique enzymatique

Définition 13.5 (Vitesse initiale, saturation)

La vitesse $v$ d’une réaction enzymatique est la quantité de produit formée par unité de temps ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , ou en unités d’enzyme : $1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). On la mesure comme vitesse initiale $v_0$ , avant que le substrat ne s’épuise ou que le produit ne s’accumule. À concentration d’enzyme fixée, $v_0$ croît avec la concentration de substrat $[S]$ puis sature à un maximum $V_{\max}$ : l’enzyme est entièrement occupée et ne peut pas aller plus vite.

Théorème 13.6 (Michaelis–Menten)

Pour une enzyme $E$ qui lie son substrat de façon réversible et le convertit,

E + S \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} ES \overset{k_{\text{cat}}}{\longrightarrow} E + P ,

la vitesse initiale à la concentration de substrat $[S]$ vaut

v_0 = \frac{V_{\max}\,[S]}{K_m + [S]}, \qquad V_{\max} = k_{\text{cat}}\,[E]_{\text{tot}}, \qquad K_m = \frac{k_{-1} + k_{\text{cat}}}{k_1} .

$K_m$ , la constante de Michaelis, est la concentration de substrat à laquelle la vitesse vaut la moitié de son maximum, et mesure la quantité de substrat dont l’enzyme a besoin ; $k_{\text{cat}}$ , le nombre de renouvellement, est le nombre de molécules de substrat qu’une enzyme convertit par seconde à saturation ; le rapport $k_{\text{cat}}/K_m$ est l’efficacité catalytique, la constante de vitesse à faible substrat, majorée par la vitesse à laquelle le substrat peut atteindre l’enzyme par diffusion, soit environ $10^8$ – $10^9$ $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ .

Démonstration. On suppose un régime stationnaire dans lequel $ES$ se forme aussi vite qu’il disparaît (valable après les premières millisecondes, tant que $[S] \gg [E]$ ) : $k_1[E][S] = (k_{-1} + k_{\text{cat}})[ES]$ , donc $[E][S] = K_m[ES]$ avec $K_m$ tel que défini. La conservation donne $[E] = [E]_{\text{tot}} - [ES]$ ; en substituant, $([E]_{\text{tot}} - [ES])[S] = K_m[ES]$ , d’où $[ES] = [E]_{\text{tot}}[S]/(K_m + [S])$ . La vitesse vaut $v_0 = k_{\text{cat}}[ES]$ , ce qui donne la formule ; pour $[S] \gg K_m$ , $v_0 \to k_{\text{cat}}[E]_{\text{tot}} = V_{\max}$ , et pour $[S] = K_m$ , $v_0 = V_{\max}/2$ . ∎

À gauche : l’hyperbole de Michaelis–Menten pour K_m = 2\, mmol/ L et V_ = 1\, µ mol/ min, avec les six points mesurés du problème du week-end. À droite : les mêmes données en représentation de Lineweaver–Burk, 1/v_0 en fonction de 1/[S] : une droite dont les ordonnées et abscisses à l’origine donnent V_ et K_m. — À gauche : l’hyperbole de Michaelis–Menten pour $K_m = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ et $V_{\max} = 1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , avec les six points mesurés du problème du week-end. À droite : les mêmes données en représentation de Lineweaver–Burk, $1/v_0$ en fonction de $1/[S]$ : une droite dont les ordonnées et abscisses à l’origine donnent $V_{\max}$ et $K_m$ .

Méthode 13.7 (Mesurer $K_m$ et $V_{\max}$ )

Préparer une série de concentrations de substrat allant de $K_m/4$ à $10K_m$ , à concentration d’enzyme constante ; suivre le produit (couleur, absorbance, gaz) pendant la première minute et prendre la pente pour $v_0$ .
Porter $v_0$ en fonction de $[S]$ : l’hyperbole donne un $V_{\max}$ approché (le plateau) et $K_m$ (la concentration à la moitié de celui-ci).
Pour plus de précision, inverser : $1/v_0 = (K_m/V_{\max})(1/[S]) + 1/V_{\max}$ (Lineweaver–Burk). L’intersection de la droite avec l’axe des $y$ vaut $1/V_{\max}$ , avec l’axe des $x$ $-1/K_m$ , et sa pente $K_m/V_{\max}$ .
Diviser $V_{\max}$ par la concentration d’enzyme pour obtenir $k_{\text{cat}}$ ; diviser par $K_m$ pour l’efficacité. Recommencer avec un inhibiteur pour voir quel paramètre il change.

Un dosage enzymatique : le produit absorbe la lumière, et le spectrophotomètre en enregistre l’apparition seconde par seconde ; la pente initiale est v_0. — Un dosage enzymatique : le produit absorbe la lumière, et le spectrophotomètre en enregistre l’apparition seconde par seconde ; la pente initiale est $v_0$ .

Exemple 13.8 (Enzymes comparées)

enzyme	$K_m$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ )	$k_{\text{cat}}$ ( $\mathrm{s}^{-1}$ )	$k_{\text{cat}}/K_m$ ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ )
catalase	$2.5 \times 10^{-2}$	$4 \times 10^{7}$	$1.6 \times 10^{9}$
anhydrase carbonique	$1.2 \times 10^{-2}$	$1 \times 10^{6}$	$8 \times 10^{7}$
chymotrypsine	$1.5 \times 10^{-2}$	100	$7 \times 10^{3}$
lysozyme	$6 \times 10^{-6}$	0.5	$8 \times 10^{4}$
ADN polymérase	$1 \times 10^{-5}$	15	$1.5 \times 10^{6}$

La catalase et l’anhydrase carbonique travaillent à la limite de diffusion : chaque collision avec le substrat est productive. La chymotrypsine est lente, mais elle doit l’être — elle coupe une liaison peptidique, tâche bien plus ardue que de briser du peroxyde.

13.3 L’inhibition

Définition 13.9 (Inhibiteurs)

Un inhibiteur abaisse la vitesse d’une enzyme. Les inhibiteurs irréversibles se lient par covalence et détruisent définitivement l’activité de l’enzyme (les neurotoxiques sur l’acétylcholinestérase, la pénicilline sur l’enzyme qui réticule la paroi bactérienne, l’aspirine sur l’enzyme qui fabrique les prostaglandines). Les inhibiteurs réversibles se lient par des liaisons faibles et peuvent être éliminés par lavage ; selon l’endroit où ils se lient :

compétitif : l’inhibiteur ressemble au substrat et occupe le site actif ; il augmente le $K_m$ apparent (du facteur $1 + [I]/K_i$ ) et laisse $V_{\max}$ inchangé — assez de substrat le déloge ;
non compétitif : l’inhibiteur se lie ailleurs et gâche la catalyse, que le substrat soit fixé ou non ; il abaisse $V_{\max}$ et laisse $K_m$ inchangé — aucune quantité de substrat n’en vient à bout ;
incompétitif : l’inhibiteur ne se lie qu’au complexe $ES$ ; $V_{\max}$ et $K_m$ diminuent tous deux.

$K_i$ , la constante de dissociation de l’inhibiteur, mesure sa puissance : plus elle est basse, plus il est fort.

Représentations de Lineweaver–Burk avec les deux inhibiteurs courants. Un inhibiteur compétitif fait pivoter la droite autour de son intersection avec l’axe des y (V_ inchangé, K_m augmenté) ; un inhibiteur non compétitif la fait pivoter autour de son intersection avec l’axe des x (K_m inchangé, V_ abaissé). — Représentations de Lineweaver–Burk avec les deux inhibiteurs courants. Un inhibiteur compétitif fait pivoter la droite autour de son intersection avec l’axe des $y$ ( $V_{\max}$ inchangé, $K_m$ augmenté) ; un inhibiteur non compétitif la fait pivoter autour de son intersection avec l’axe des $x$ ( $K_m$ inchangé, $V_{\max}$ abaissé).

Exemple 13.10 (La compétition comme médicament)

Le méthanol est inoffensif jusqu’à ce que l’alcool déshydrogénase du foie le transforme en formaldéhyde et en acide formique, qui rendent aveugle et tuent. Le traitement est l’éthanol : un substrat concurrent de $K_m$ plus faible, qui occupe l’enzyme pendant que le méthanol est excrété inchangé. Les statines sont des inhibiteurs compétitifs, ressemblant à l’état de transition, de l’enzyme qui engage le carbone vers le cholestérol ; les sulfamides ressemblent au substrat d’une enzyme bactérienne qui fabrique le folate, que l’humain ne fabrique pas et dont il ne manque donc pas.

13.4 La régulation

Définition 13.11 (Enzymes allostériques)

Une enzyme allostérique a plusieurs sous-unités et, outre ses sites actifs, des sites régulateurs où se fixent des effecteurs : les activateurs la font basculer vers sa conformation active, les inhibiteurs vers l’inactive. Sa vitesse en fonction de $[S]$ est sigmoïde et non hyperbolique (coopérativité entre les sites actifs, comme pour l’hémoglobine, Chapitre 12), de sorte qu’une faible variation de substrat au voisinage de la partie raide change beaucoup la vitesse ; les effecteurs décalent la courbe latéralement (ce qui change la concentration de substrat nécessaire) ou verticalement (ce qui change la vitesse maximale). Les enzymes allostériques siègent aux carrefours du métabolisme, et les effecteurs sont les produits mêmes de la voie et les signaux énergétiques de la cellule (ATP, ADP, AMP).

Une enzyme allostérique. La courbe sigmoïde rend la vitesse sensible au substrat au voisinage du point milieu ; un activateur la décale à gauche (plus active à [S] donné), un inhibiteur à droite. Au voisinage de [S] = 3, la vitesse peut passer du dixième aux neuf dixièmes du maximum. — Une enzyme allostérique. La courbe sigmoïde rend la vitesse sensible au substrat au voisinage du point milieu ; un activateur la décale à gauche (plus active à $[S]$ donné), un inhibiteur à droite. Au voisinage de $[S] = 3$ , la vitesse peut passer du dixième aux neuf dixièmes du maximum.

Proposition 13.12 (Quatre façons dont la cellule commande une enzyme)

La rétro-inhibition : le produit final d’une voie est un inhibiteur allostérique de sa première enzyme engagée, de sorte que la voie ne tourne qu’au rythme auquel le produit est consommé (l’isoleucine sur la thréonine désaminase ; l’ATP sur la phosphofructokinase, Chapitre 15). Temps de réponse : quelques millisecondes.
La modification covalente : une kinase fixe un phosphate sur une sérine, une thréonine ou une tyrosine de l’enzyme, une phosphatase le retire, et les deux formes diffèrent par leur activité (la glycogène phosphorylase est allumée par phosphorylation, la glycogène synthase éteinte, par le même signal hormonal). De quelques secondes à quelques minutes ; réversible ; amplifiable en cascades.
L’activation protéolytique : certaines enzymes sont fabriquées sous forme de précurseurs inactifs (les zymogènes : trypsinogène, pepsinogène, facteurs de la coagulation) et allumées par la coupure d’un peptide, une fois pour toutes, là et quand on les veut.
La quantité : la cellule fabrique plus ou moins d’enzyme en commandant son gène (Chapitre 20) et la dégrade plus ou moins vite. De quelques minutes à quelques heures.

Exemple 13.13 (Les isoenzymes)

La lactate déshydrogénase existe sous cinq formes, tétramères de deux types de sous-unités en toutes combinaisons ; la forme du cœur a un faible $K_m$ pour le lactate et est inhibée par le pyruvate (elle oxyde le lactate pour alimenter le cycle de Krebs), la forme du muscle a un $V_{\max}$ élevé et tolère le pyruvate (elle fabrique du lactate lors d’un sprint). Le profil des formes présentes dans le sang révèle quel organe a été lésé — un infarctus libère celle du cœur.

13.5 Température et pH

Proposition 13.14 (Les enzymes et leur environnement)

La vitesse d’une réaction enzymatique double à peu près tous les $10\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ ( $Q_{10} \approx 2$ ), l’énergie thermique faisant franchir la barrière à davantage de molécules, jusqu’à ce que l’enzyme commence à se déplier ( $40\text{ to }60\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ pour la plupart ; $100\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ pour les enzymes des bactéries des sources chaudes) et que la vitesse s’effondre. Chaque enzyme a un pH optimal, où l’ionisation de ses résidus catalytiques et de son substrat est la bonne : la pepsine, dans l’estomac, vers pH 2 ; la trypsine, dans l’intestin, vers 8 ; la plupart des enzymes intracellulaires vers 7. En s’éloignant de l’optimum la vitesse baisse, et très loin de lui la protéine se dénature. Température et pH agissent sur la protéine ; la cellule maintient les deux dans le domaine où ses mille enzymes fonctionnent toutes.

Exemple 13.15 (Une fièvre et une source chaude)

Une fièvre à $40\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ accélère d’un quart chaque réaction du corps et commence à déplier les protéines les plus fragiles ; à $42\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ celles de l’encéphale cèdent. L’ADN polymérase d’une bactérie d’une source à $75\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ survit à $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , ce qui lui permet d’être soumise des milliers de fois au cycle de fusion de l’ADN et lui a valu de devenir l’enzyme de la réaction de polymérisation en chaîne (volume de troisième année) : la thermostabilité est une propriété de la séquence, non de la chimie catalysée.

13.6 Exercices

Exercice 13.1 ★

Que change une enzyme dans une réaction, et que laisse-t-elle inchangé ? Illustrer avec le profil énergétique.

Solution

Solution de Exercice 13.1.

Elle abaisse l’énergie d’activation (la hauteur de l’état de transition), et donc la vitesse, dans les deux sens ; elle laisse inchangés $\Delta G$ , la constante d’équilibre et la position de l’équilibre. Sur le profil, le sommet est abaissé, les deux extrémités non.

Exercice 13.2 ★

Définir $K_m$ , $V_{\max}$ , $k_{\text{cat}}$ et $k_{\text{cat}}/K_m$ , avec leurs unités.

Solution

Solution de Exercice 13.2.

$K_m$ : concentration de substrat à la moitié de $V_{\max}$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ ). $V_{\max}$ : vitesse à substrat saturant ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , ou $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). $k_{\text{cat}}$ : molécules de substrat converties par seconde et par enzyme à saturation ( $\mathrm{s}^{-1}$ ). $k_{\text{cat}}/K_m$ : l’efficacité, constante de vitesse du second ordre à faible substrat ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ ).

Exercice 13.3 ★

D’après la figure de Lineweaver–Burk des inhibiteurs, lire $V_{\max}$ et $K_m$ pour l’enzyme non inhibée et pour chaque inhibiteur.

Solution

Solution de Exercice 13.3.

Sans inhibiteur : ordonnée à l’origine 1, donc $V_{\max} = 1$ ; abscisse $x$ à l’origine $-0.5$ , donc $K_m = 2$ . Compétitif : $V_{\max} = 1$ , abscisse $x$ $-0.25$ , $K_m = 4$ . Non compétitif : ordonnée 2, $V_{\max} = 0.5$ ; abscisse $x$ $-0.5$ , $K_m = 2$ .

Exercice 13.4 ★

Nommer les quatre façons dont une cellule règle l’activité d’une enzyme et donner l’échelle de temps de chacune.

Solution

Solution de Exercice 13.4.

Régulation allostérique (rétro-inhibition), quelques millisecondes ; modification covalente (phosphorylation), de la seconde à la minute ; activation protéolytique d’un zymogène, une fois, à la demande ; contrôle de la quantité par l’expression du gène et la dégradation, de la minute à l’heure.

Exercice 13.5 ★★

Une enzyme a $K_m = 0.1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ et $V_{\max} = 50\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . Calculer $v_0$ pour $[S] = 0.02$ , $0.1$ , $1$ et $10\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Pour quel $[S]$ a-t-on $v_0 = 0.9\,V_{\max}$ ?

Solution

Solution de Exercice 13.5.

$v_0 = 50[S]/(0.1 + [S])$ : 8.3, 25, 45.5 et $49.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . $0.9 = [S]/(0.1 + [S])$ donne $[S] = 0.9\,K_m/0.1 = 0.9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

Exercice 13.6 ★★

Abaisser $E_a$ de $20\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ multiplie la vitesse par quel facteur ? De combien $E_a$ doit-elle baisser pour gagner un facteur $10^{10}$ ?

Solution

Solution de Exercice 13.6.

$e^{20\,000/2580} = e^{7.75} = 2300$ . Pour $10^{10}$ : $\Delta E_a = RT\ln 10^{10} = 2.58\times 23.0 = 59\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ .

Exercice 13.7 ★★

$2\,\mathrm{pmol}$ d’anhydrase carbonique dans $1\,\mathrm{mL}$ donnent $V_{\max} = 120\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ par minute. Calculer $k_{\text{cat}}$ et, avec $K_m = 12\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , l’efficacité. Comparer à la limite de diffusion.

Solution

Solution de Exercice 13.7.

$V_{\max} = 0.12\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ par minute dans $1\,\mathrm{mL}$ : $1.2 \times 10^{-4}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ $= 2.0 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ de produit ; enzyme $2 \times 10^{-12}\,\mathrm{mol}$ : $k_{\text{cat}} = 2\times 10^{-6}/2\times 10^{-12} = 1 \times 10^{6}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Efficacité $10^6/0.012 = 8 \times 10^{7}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ , à un facteur dix près de la limite de diffusion : presque chaque rencontre avec une molécule de substrat est productive.

Exercice 13.8 ★★

Un inhibiteur compétitif à $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ double le $K_m$ apparent. Calculer $K_i$ . Quelle concentration de substrat ramène la vitesse à $90\,\%$ de $V_{\max}$ avec et sans l’inhibiteur, si $K_m = 1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?

Solution

Solution de Exercice 13.8.

$1 + 2/K_i = 2$ : $K_i = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Pour $90\,\%$ : $[S] = 9K_m^{\text{app}}$ : $9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ sans l’inhibiteur, $18\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ avec.

Exercice 13.9 ★★

Expliquer pourquoi la rétro-inhibition agit sur la première étape engagée d’une voie plutôt que sur la dernière, et pourquoi l’inhibiteur est en général le produit final plutôt qu’un intermédiaire.

Solution

Solution de Exercice 13.9.

Inhiber la première étape engagée arrête toute la voie d’un coup et ne gaspille aucun intermédiaire, qui s’accumulerait sinon ; le produit final est le signal qui compte — son abondance est exactement l’information que la voie n’est plus nécessaire — alors que le taux d’un intermédiaire ne dit rien de la demande.

Exercice 13.10 ★★★

Le trypsinogène est activé dans l’intestin et non dans le pancréas qui le fabrique ; une petite fraction activée trop tôt détruit le pancréas. Expliquer la logique des zymogènes, le rôle de l’enzyme qui active le trypsinogène, et pourquoi le pancréas fabrique aussi un inhibiteur de la trypsine.

Solution

Solution de Exercice 13.10.

Une protéase active dans la cellule qui la fabrique digérerait cette cellule ; fabriquée en zymogène inactif, elle est inoffensive jusqu’à ce que l’entéropeptidase, enzyme du revêtement intestinal, coupe le trypsinogène en trypsine dans le duodénum, là où l’on veut digérer ; la trypsine active ensuite les autres zymogènes (une cascade). Comme une trace de trypsine peut déclencher la cascade prématurément, le pancréas emballe dans ses granules un inhibiteur spécifique de la trypsine, par sécurité ; la défaillance de ce dispositif est la pancréatite.

Exercice 13.11 ★★★

Une enzyme allostérique de $n = 3$ et de demi-saturation en $[S]_{0.5} = 3$ voit sa courbe décalée à $[S]_{0.5} = 5.5$ par un inhibiteur. Calculer la vitesse en $[S] = 3$ avec et sans l’inhibiteur, et comparer au changement qu’un inhibiteur compétitif produisant le même décalage de $K_m$ donnerait sur une enzyme michaélienne. Qu’ajoute la coopérativité à la régulation ?

Solution

Solution de Exercice 13.11.

Sans : $3^3/(3^3 + 3^3) = 0.50$ . Avec : $27/(166 + 27) = 0.14$ : la vitesse tombe à $28\,\%$ de sa valeur. Une enzyme michaélienne dont le $K_m$ passe de 3 à 5.5 : $3/6 = 0.50$ devient $3/8.5 = 0.35$ , soit $70\,\%$ . La coopérativité rend le même décalage de courbe plus de deux fois plus efficace au voisinage du point de fonctionnement : un interrupteur plutôt qu’un variateur.

Exercice 13.12 ★★★

« Une enzyme est un catalyseur à qui l’on a dit quoi faire. » Discuter en un paragraphe : catalyse et spécificité, la régulation comme information ajoutée, et le coût d’une enzyme régulée comparée à un simple catalyseur.

Solution

Solution de Exercice 13.12.

Un simple catalyseur (une surface de platine, un acide) accélère indistinctement de nombreuses réactions ; une enzyme accélère une réaction sur un substrat — la spécificité de son site actif est déjà une information sur ce que la cellule veut voir faire. La régulation ajoute une seconde couche : sites allostériques, sites de phosphorylation et peptides des zymogènes disent à l’enzyme quand et où agir, en réponse à l’état de la cellule. Le coût est une grosse protéine (des centaines de résidus pour un site d’une douzaine), un renouvellement plus lent que celui des meilleurs catalyseurs inorganiques, et la machinerie pour la fabriquer, la modifier et la détruire ; le bénéfice est une chimie qui ne tourne que là et quand elle est utile, et c’est cela, un métabolisme.

13.7 Problème : une enzyme mesurée

Problème 13.1

Problème du week-end — une estérase dosée à six concentrations de substrat, seule puis avec deux inhibiteurs, ses constantes extraites et son comportement dans la cellule prédit, jusqu’à ses $K_m$ , $V_{\max}$ et $K_i$

Une estérase est dosée dans $1.0\,\mathrm{mL}$ à $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , pH 7.5, avec $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ d’enzyme. Les vitesses initiales ( $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ) à six concentrations de substrat, seule et en présence de $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ d’inhibiteur I ou de $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ d’inhibiteur J :

$[S]$ ( $\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ )	0.5	1	2	5	10	20
$v_0$ , sans inhibiteur	0.200	0.333	0.500	0.714	0.833	0.909
$v_0$ , avec I	0.111	0.200	0.333	0.556	0.714	0.833
$v_0$ , avec J	0.100	0.167	0.250	0.357	0.417	0.455

Partie I — L’enzyme seule.

Calculer $1/[S]$ et $1/v_0$ pour les six points sans inhibiteur.
Montrer que les points sont alignés et trouver la pente et l’ordonnée à l’origine de la droite.
En déduire $V_{\max}$ et $K_m$ .
Vérifier avec l’équation de Michaelis–Menten en $[S] = 5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .
Calculer la quantité d’enzyme dans le dosage (en moles) et $k_{\text{cat}}$ en $\mathrm{s}^{-1}$ .
Calculer $k_{\text{cat}}/K_m$ et comparer à la limite de diffusion.
À quelle concentration de substrat l’enzyme travaille-t-elle à $95\,\%$ de $V_{\max}$ ?

Partie II — L’inhibiteur I.

Calculer $1/v_0$ pour les six points avec I et trouver la pente et l’ordonnée à l’origine de leur droite.
En déduire les $V_{\max}$ et $K_m$ apparents avec I.
Quel paramètre a changé ? Classer l’inhibiteur.
Calculer $K_i$ à partir de $K_m^{\text{app}} = K_m(1 + [I]/K_i)$ .
En $[S] = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , quelle concentration de I divise la vitesse par deux ? Et en $[S] = 20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?
Proposer ce que I pourrait être, structurellement, et où il se fixe.

Partie III — L’inhibiteur J.

Calculer la pente et l’ordonnée à l’origine de la droite avec J et en déduire les $V_{\max}$ et $K_m$ apparents.
Classer J et calculer son $K_i$ à partir de $V_{\max}^{\text{app}} = V_{\max}/(1 + [J]/K_i)$ .
Expliquer pourquoi augmenter le substrat ne peut pas venir à bout de J.
Doubler la concentration d’enzyme en présence de J fait quoi à la vitesse ? Et en présence de I ?

Partie IV — Dans la cellule. La cellule maintient le substrat à $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ et l’enzyme à $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ dans un volume de $1000\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , avec $Q_{10} = 2$ .

Calculer la vitesse dans la cellule (molécules de produit par seconde dans la cellule entière).
Le produit est nécessaire à raison de $3 \times 10^{6}\,$ molécules par seconde. De quel facteur la cellule doit-elle augmenter la vitesse, et nommer deux moyens d’y parvenir.
Le produit est un inhibiteur compétitif de l’enzyme, de $K_i = 0.2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , et il s’accumule jusqu’à $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Calculer alors la vitesse, et commenter ce que cela réalise.
L’enzyme est phosphorylée par une kinase, ce qui abaisse son $K_m$ à $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Calculer la vitesse à $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de substrat avant et après.
Le pH optimal de l’enzyme est 7.5 et son activité est divisée par deux à pH 6.5. Un lysosome est à pH 5. Prédire qualitativement son activité là, et l’expliquer en termes de résidus ionisables.
Une mutation remplace l’histidine du site actif par une alanine. Prédire l’effet sur $K_m$ et sur $k_{\text{cat}}$ , en justifiant chacun.
Expliquer pourquoi la cellule maintient le substrat au voisinage de $K_m$ plutôt que très au-dessus.
Énoncer le résultat : $K_m$ , $V_{\max}$ , $k_{\text{cat}}$ de l’estérase, ainsi que le type et le $K_i$ de chaque inhibiteur.

Solution

Solution de Problème 13.1.

1. $1/[S]$ : 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05. $1/v_0$ : 5.0, 3.0, 2.0, 1.4, 1.2, 1.1. 2. Chaque pas de $1/[S]$ change $1/v_0$ proportionnellement : pente $(5.0 - 1.1)/(2 - 0.05) = 2.0$ ; ordonnée à l’origine $1.0$ . 3. $V_{\max} = 1/1.0 = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ; $K_m = \text{pente}\times V_{\max} = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 4. $1.0\times 5/(2 + 5) = 0.714$ : la valeur mesurée. 5. $10 \times 10^{-9}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}\times1 \times 10^{-3}\,\mathrm{L} = 1 \times 10^{-11}\,\mathrm{mol}$ ; $V_{\max} = 1 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min} = 1.67 \times 10^{-8}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ ; $k_{\text{cat}} = 1.67\times 10^{-8}/10^{-11} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ . 6. $1670/(2\times 10^{-3}) = 8.3 \times 10^{5}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ : mille fois sous la limite de diffusion ; une collision sur mille seulement est productive. 7. $0.95 = [S]/(2 + [S])$ : $[S] = 19\,K_m = 38\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 8. $1/v_0$ : 9.0, 5.0, 3.0, 1.8, 1.4, 1.2. Pente $(9.0 - 1.2)/1.95 = 4.0$ ; ordonnée à l’origine $1.0$ . 9. $V_{\max}^{\text{app}} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (inchangé) ; $K_m^{\text{app}} = 4.0\times 1.0 = 4.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 10. $K_m$ doublé, $V_{\max}$ inchangé : compétitif. 11. $4 = 2(1 + 1/K_i)$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 12. Avec l’inhibiteur, $v = V_{\max}[S]/(K_m(1 + [I]/K_i) + [S])$ ; diviser la vitesse par deux exige $K_m(1 + [I]/K_i) + [S] = 2(K_m + [S])$ , soit $[I] = K_i(K_m + [S])/K_m$ : à $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $[I] = 1\times 4/2 = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; à $20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $[I] = 22/2 = 11\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Plus il y a de substrat, plus il faut d’inhibiteur. 13. Une molécule ressemblant au substrat (ou à son état de transition) — un analogue d’ester non hydrolysable — qui se fixe dans le site actif. 14. $1/v_0$ : 10.0, 6.0, 4.0, 2.8, 2.4, 2.2 ; pente $4.0$ , ordonnée à l’origine $2.0$ : $V_{\max}^{\text{app}} = 0.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , $K_m^{\text{app}} = 4.0\times 0.5 = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 15. $V_{\max}$ divisé par deux, $K_m$ inchangé : non compétitif ; $2 = 1 + 1/K_i$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 16. J se fixe sur un site autre que le site actif, sur l’enzyme libre comme sur $ES$ , avec la même affinité : le substrat ne lui fait pas concurrence, et à tout $[S]$ la moitié des molécules d’enzyme est inactivée. 17. Avec J la vitesse double (la moitié de deux fois plus d’enzyme est toujours active) ; avec I elle double aussi (la vitesse est proportionnelle à l’enzyme à tout $[S]$ ) : doubler l’enzyme ne permet jamais de distinguer les inhibiteurs. 18. Vitesse à $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $V_{\max}[S]/(K_m + [S])$ avec $V_{\max} = k_{\text{cat}}[E]$ : par litre, $1670\times 10^{-8} = 1.67 \times 10^{-5}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; $\times 0.5/2.5 = 3.3 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $\times 2^{1.2} = 2.3$ : $7.7 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; dans $1 \times 10^{-12}\,\mathrm{L}$ : $7.7 \times 10^{-18}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ $= 4.6 \times 10^{6}$ molécules par seconde. 19. Aucune augmentation nécessaire : la vitesse ( $4.6 \times 10^{6}$ ) dépasse la demande ( $3 \times 10^{6}$ ) ; s’il fallait l’augmenter, la cellule pourrait élever le substrat, ou phosphoryler l’enzyme pour abaisser son $K_m$ , ou fabriquer plus d’enzyme. 20. $K_m^{\text{app}} = 2(1 + 0.4/0.2) = 6\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ : vitesse $\times 0.5/6.5$ au lieu de $0.5/2.5$ : $38\,\%$ de la précédente, $1.8 \times 10^{6}$ par seconde — le produit freine sa propre synthèse en dessous de la demande, de sorte qu’il est consommé et que son taux baisse, ce qui libère l’enzyme : un approvisionnement qui s’ajuste tout seul. 21. Avant : $0.5/2.5 = 0.20$ de $V_{\max}$ ; après : $0.5/0.9 = 0.56$ : presque le triple. 22. Quasi nulle : à pH 5 l’histidine du site actif est protonée et ne peut plus agir en base, et les résidus acides du site sont neutralisés ; l’état d’ionisation de l’enzyme, et peut-être son repliement, sont faussés. Elle est faite pour le cytosol, non pour le lysosome. 23. Le $K_m$ change peu (la fixation tient surtout au reste du site) ; le $k_{\text{cat}}$ s’effondre de plusieurs ordres de grandeur, puisque l’histidine était la base catalytique qui activait l’eau ou la sérine. 24. Au voisinage de $K_m$ , la vitesse répond aux variations de substrat (pente voisine de $V_{\max}/2K_m$ ) ; très au-dessus, l’enzyme est saturée et insensible, et l’excès de substrat serait une charge osmotique et chimique. Travailler près de $K_m$ rend la voie commandable par l’approvisionnement. 25. $K_m = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $V_{\max} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (enzyme à $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ), $k_{\text{cat}} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ ; I compétitif, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; J non compétitif, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

Termes définis dans ce chapitre

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