Biologie universitaire — 1re année · Bachelor Year 1

12Acides aminés et protéines

Faites cuire un œuf : le blanc limpide devient opaque et ferme ; rien n’a été ajouté ni retiré, mais chaque molécule de protéine s’y est dépliée et emmêlée à ses voisines. Refroidissez-le : il reste cuit. Et pourtant une petite enzyme dépliée avec ménagement dans un tube à essai, puis laissée dans un simple tampon, se replie en quelques minutes dans sa forme de travail exacte, sans aucune aide : la forme était écrite dans la chaîne. Les protéines sont les molécules ouvrières de la cellule — ses enzymes, ses pompes, ses moteurs, ses charpentes, ses anticorps, ses hormones — et chacune est une chaîne d’acides aminés repliée dans une forme que sa séquence dicte. Ce chapitre décrit les vingt acides aminés, la liaison qui les unit, les quatre niveaux de structure des protéines, le repliement qui fait d’une chaîne une machine, le comportement coopératif des protéines à plusieurs sous-unités, et les méthodes par lesquelles les protéines sont séparées et observées.

12.1 Les acides aminés

Définition 12.1 (Acide aminé)

Un acide aminé possède un carbone $\alpha$ central portant un groupe aminé ( $-\mathrm{NH_2}$ ), un groupe carboxyle ( $-\mathrm{COOH}$ ), un hydrogène et une chaîne latérale $R$ qui distingue les vingt acides aminés standard des protéines. Au pH de la cellule, le groupe aminé est protoné et le carboxyle ionisé : la molécule est un zwitterion, $\mathrm{^+H_3N{-}CHR{-}COO^-}$ , sans charge nette. Le carbone $\alpha$ est chiral chez tous sauf la glycine, et les êtres vivants n’emploient que l’énantiomère L. Les chaînes latérales se groupent par leur chimie :

classe	acides aminés (codes à trois et à une lettre)	chaîne latérale
apolaire, aliphatique	Gly G, Ala A, Val V, Leu L, Ile I, Met M, Pro P	hydrocarbonée ; Pro un cycle
aromatique	Phe F, Tyr Y, Trp W	cycles ; Tyr et Trp absorbent l’UV
polaire, non chargée	Ser S, Thr T, Cys C, Asn N, Gln Q	$-$ OH, $-$ SH, amide
chargée positivement	Lys K, Arg R, His H	bases ; His p $K_a$ 6.0
chargée négativement	Asp D, Glu E	carboxylates, p $K_a$ 4

Neuf d’entre eux (His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val) sont indispensables à l’humain : nous ne savons pas les fabriquer et devons les manger.

Proposition 12.2 (Ionisation)

Chaque groupe ionisable d’un acide aminé a son propre p $K_a$ : environ 2 pour le carboxyle $\alpha$ , 9.5 pour l’aminé $\alpha$ , et pour les chaînes latérales 3.9 (Asp), 4.1 (Glu), 6.0 (His), 8.3 (Cys), 10.1 (Tyr), 10.5 (Lys), 12.5 (Arg). Le point isoélectrique p $I$ est le pH auquel la charge nette est nulle — la moyenne des deux p $K_a$ qui encadrent la forme neutre ; le p $I$ d’une protéine est fixé par sa teneur en chaînes latérales chargées, et à ce pH elle est la moins soluble et ne migre pas dans un champ électrique. L’histidine, dont le p $K_a$ est proche de 7, est le résidu qui change de charge dans le domaine physiologique, et elle siège dans le site actif de nombreuses enzymes.

Titrage de la glycine. Deux plateaux tampons, aux pK_a du carboxyle et du groupe aminé ; entre eux, au point isoélectrique, le zwitterion ne porte aucune charge nette. — Titrage de la glycine. Deux plateaux tampons, aux p $K_a$ du carboxyle et du groupe aminé ; entre eux, au point isoélectrique, le zwitterion ne porte aucune charge nette.

12.2 La liaison peptidique

Définition 12.3 (Liaison peptidique, polypeptide)

La liaison peptidique unit le carboxyle d’un acide aminé au groupe aminé du suivant par condensation (une liaison amide, $\mathrm{-CO{-}NH-}$ ). Une chaîne d’acides aminés ainsi unis est un polypeptide : un squelette d’unités $\mathrm{N{-}C_\alpha{-}C}$ répétées d’où les chaînes latérales font saillie, avec une extrémité N-terminale (groupe aminé libre) et une extrémité C-terminale (carboxyle libre). Les séquences s’écrivent de N vers C, l’ordre de la synthèse (Chapitre 19). Une protéine est un ou plusieurs polypeptides repliés en une forme définie ; les chaînes usuelles comptent $100\text{ to }1000\,$ résidus de masse moyenne $110\,\mathrm{Da}$ , de sorte qu’une protéine de $300\,$ résidus fait $33\,\mathrm{kDa}$ .

Proposition 12.4 (Géométrie de la liaison peptidique)

La liaison C–N d’un peptide a un caractère partiel de double liaison (la résonance de l’amide) : elle est courte, ne peut pas tourner, et maintient les six atomes $\mathrm{C_\alpha{-}C(=O){-}N(H){-}C_\alpha}$ dans un même plan, presque toujours avec les deux carbones $\alpha$ en trans. Le squelette est donc une chaîne de plans rigides articulés aux carbones $\alpha$ , chaque articulation ayant deux rotations, $\phi$ (autour de N– $\mathrm{C_\alpha}$ ) et $\psi$ (autour de $\mathrm{C_\alpha}$ –C), et les gênes stériques entre chaînes latérales et squelette interdisent la plupart des combinaisons de $\phi$ et de $\psi$ . La conformation d’une protéine est essentiellement la liste de ses angles $\phi$ et $\psi$ .

Deux liaisons peptidiques. Chaque plan grisé tient six atomes rigidement ; la chaîne ne fléchit qu’aux carbones , par les angles et . — Deux liaisons peptidiques. Chaque plan grisé tient six atomes rigidement ; la chaîne ne fléchit qu’aux carbones $\alpha$ , par les angles $\phi$ et $\psi$ .

12.3 La structure secondaire

Définition 12.5 (Structure secondaire)

La structure secondaire d’une protéine est le repliement local et régulier de son squelette, tenu par des liaisons hydrogène entre les groupes C=O et N–H du squelette. Deux motifs dominent. L’hélice $\alpha$ : une spirale droite de 3.6 résidus par tour, s’élevant de $0.15\,\mathrm{nm}$ par résidu ( $0.54\,\mathrm{nm}$ par tour), chaque C=O étant lié au N–H situé quatre résidus plus loin, les chaînes latérales pointant vers l’extérieur. Le feuillet $\beta$ : des chaînes presque entièrement étirées ( $0.35\,\mathrm{nm}$ par résidu) et disposées côte à côte, parallèles ou antiparallèles, liées entre brins voisins, les chaînes latérales alternant au-dessus et au-dessous du feuillet. Entre eux, des coudes et des boucles inversent le sens de la chaîne. La proline, dont le cycle bloque $\phi$ , brise les hélices ; la glycine, sans chaîne latérale, permet des coudes qu’aucun autre résidu ne peut faire.

Le diagramme de Ramachandran : les combinaisons de et de qu’un résidu peut adopter. Deux grandes régions autorisées correspondent au feuillet et à l’hélice droite ; la plus grande partie du plan est interdite par les collisions entre atomes. — Le diagramme de Ramachandran : les combinaisons de $\phi$ et de $\psi$ qu’un résidu peut adopter. Deux grandes régions autorisées correspondent au feuillet $\beta$ et à l’hélice $\alpha$ droite ; la plus grande partie du plan est interdite par les collisions entre atomes.

Linus Pauling (1901–1994), qui déduisit l’hélice et le feuillet en 1951 de la planéité de la liaison peptidique et de la géométrie des liaisons hydrogène, avant que l’une ou l’autre n’ait été vue dans une protéine. Photographie : Fondation Nobel, 1962, domaine public. — Linus Pauling (1901–1994), qui déduisit l’hélice $\alpha$ et le feuillet $\beta$ en 1951 de la planéité de la liaison peptidique et de la géométrie des liaisons hydrogène, avant que l’une ou l’autre n’ait été vue dans une protéine. Photographie : Fondation Nobel, 1962, domaine public.

Exemple 12.6 (Hélice et feuillet en chiffres)

Une hélice $\alpha$ qui traverse une membrane doit franchir $3\,\mathrm{nm}$ de cœur hydrophobe : $3/0.15 = 20$ résidus, et de fait les segments transmembranaires du Chapitre 7 sont des suites d’une vingtaine de résidus hydrophobes. Un brin $\beta$ de même longueur couvre $7\,\mathrm{nm}$ : la fibroïne de la soie est faite de feuillets antiparallèles empilés de glycine et d’alanine, et un fil de soie est plus résistant que de l’acier de même masse parce que les squelettes covalents s’alignent le long de la fibre.

12.4 Structures tertiaire et quaternaire

Définition 12.7 (Structures tertiaire et quaternaire)

La structure tertiaire est l’arrangement tridimensionnel complet d’un polypeptide : ses hélices, ses feuillets et ses boucles tassés ensemble, souvent en plusieurs domaines compacts qui se replient indépendamment. Elle est tenue par des forces non covalentes — l’effet hydrophobe qui enfouit les chaînes latérales apolaires dans un cœur à l’abri de l’eau, des liaisons hydrogène, des ponts salins entre chaînes latérales chargées, un tassement de van der Waals — et parfois par des ponts disulfure, liaisons covalentes S–S entre deux cystéines, dans les protéines sécrétées vers l’extérieur oxydant. La structure quaternaire est l’assemblage de plusieurs polypeptides (sous-unités) en une seule protéine : l’hémoglobine est faite de deux chaînes $\alpha$ et de deux chaînes $\beta$ . Les protéines globulaires sont compactes et hydrosolubles (enzymes, transporteurs) ; les protéines fibreuses sont étirées et insolubles (triple hélice du collagène, hélices superenroulées de la kératine et de la myosine, soie).

L’hémoglobine : quatre sous-unités, deux (bleu) et deux (rouge), chacune formant un faisceau d’hélices autour d’un groupe hème (sombre) dont le fer fixe un O_2. Les quatre sites n’agissent pas indépendamment. — L’hémoglobine : quatre sous-unités, deux $\alpha$ (bleu) et deux $\beta$ (rouge), chacune formant un faisceau d’hélices $\alpha$ autour d’un groupe hème (sombre) dont le fer fixe un $\mathrm{O_2}$ . Les quatre sites n’agissent pas indépendamment.

Théorème 12.8 (La séquence détermine le repliement)

La structure tridimensionnelle d’une protéine est déterminée par sa séquence d’acides aminés : le repliement natif est la conformation d’énergie libre la plus basse que la chaîne puisse atteindre dans son environnement cellulaire, et l’information nécessaire pour l’atteindre est contenue dans la chaîne elle-même.

Faits expérimentaux. Anfinsen (1961) déplia la ribonucléase A, enzyme de $124\,$ résidus à quatre ponts disulfure, dans de l’urée concentrée avec un réducteur qui rompait les ponts : la chaîne perdit toute activité. En retirant l’urée et en laissant les cystéines se réoxyder lentement à l’air, il récupéra l’enzyme pleinement active, ses quatre ponts reformés entre les huit mêmes cystéines parmi les $105\,$ appariements possibles — la chaîne avait trouvé son propre repliement. Réoxydée alors qu’elle était encore dans l’urée, elle formait des ponts au hasard et restait inactive ; une trace de réducteur lui permettait ensuite de les rebrasser jusqu’à atteindre le jeu natif, le plus stable. Depuis, des milliers de séquences ont été repliées à partir de rien dans le tube à essai, et le repliement d’une séquence nouvelle peut désormais en être calculé. ∎

Proposition 12.9 (Dénaturation)

La chaleur, les pH extrêmes, l’urée, les détergents ou les solvants organiques déplient les protéines en submergeant les liaisons faibles qui tiennent le repliement : la chaîne perd sa forme et sa fonction, expose son cœur hydrophobe et s’agrège avec ses voisines. Les petites protéines se replient de nouveau quand on retire le dénaturant ; les grandes, et les protéines d’une cellule encombrée, souvent non, et la cellule entretient des chaperons — protéines qui lient les chaînes dépliées, masquent leurs surfaces hydrophobes et leur offrent des chances répétées de se replier correctement — et détruit ce qui reste mal replié. Une fièvre de quelques degrés, et les $42\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ auxquels les protéines de l’encéphale commencent à se déplier, marquent l’étroite marge de stabilité : un repliement typique n’est que de $20\text{ to }60\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ plus stable que la chaîne dépliée, la valeur de quelques liaisons hydrogène.

Blanc d’œuf cru et cuit : les mêmes protéines, repliées et solubles à gauche, dépliées et agrégées en un solide opaque à droite. Rien n’a été ajouté que de la chaleur.

Exemple 12.10 (Le collagène)

Le quart des protéines d’un mammifère est du collagène : trois chaînes, chacune une hélice gauche de mille résidus avec une glycine une position sur trois (Gly–X–Y, Y souvent une hydroxyproline), enroulées ensemble en une triple hélice droite longue de $300\,\mathrm{nm}$ , puis empaquetées côte à côte en fibrilles réticulées par des liaisons covalentes. L’absence de chaîne latérale chez la glycine est ce qui permet aux trois chaînes de se tasser sur l’axe ; une seule substitution de glycine par un autre résidu coude l’hélice et donne des os cassants. La vitamine C est nécessaire pour hydroxyler les prolines ; sans elle l’hélice est instable et les fibrilles cèdent : c’est le scorbut.

12.5 L’allostérie : l’hémoglobine

Définition 12.11 (Allostérie, coopérativité)

Une protéine est allostérique lorsque la fixation d’un ligand sur un site change la conformation de la protéine et, par là, son affinité en un autre site. Lorsque les sites sont semblables et que le changement augmente l’affinité des autres, la fixation est coopérative : la courbe de saturation est sigmoïde plutôt qu’hyperbolique, et la protéine bascule de presque vide à presque pleine sur un étroit domaine de concentration du ligand. L’équation de Hill la décrit :

Y = \frac{P^n}{P_{50}^n + P^n},

où $Y$ est la fraction des sites occupés, $P$ la concentration du ligand (ou sa pression partielle), $P_{50}$ la valeur à la demi-saturation, et $n$ le coefficient de Hill — 1 pour des sites indépendants, jusqu’au nombre de sites pour une coopérativité parfaite.

Proposition 12.12 (Hémoglobine et myoglobine)

La myoglobine, une chaîne à un seul hème, fixe l’ $\mathrm{O_2}$ selon une hyperbole ( $n = 1$ , $P_{50} = 0.37\,\mathrm{kPa}$ ) : elle est saturée à toute pression que les tissus offrent et sert de réserve dans le muscle. L’hémoglobine, quatre sous-unités, fixe de façon coopérative ( $n \approx 2.8$ , $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ ) : le premier $\mathrm{O_2}$ fixé fait basculer le tétramère d’un état T de faible affinité vers un état R de forte affinité, de sorte qu’elle se charge presque complètement aux $13\,\mathrm{kPa}$ du poumon et décharge une large fraction aux $5\,\mathrm{kPa}$ des tissus. Son affinité est encore abaissée, et la décharge favorisée, par l’acidité et le $\mathrm{CO_2}$ (l’effet Bohr) et par le 2,3-bisphosphoglycérate (BPG), qui se lie à l’état T : dans un muscle qui travaille, ou en altitude, davantage d’oxygène est libéré à pression égale. Le fœtus fabrique une hémoglobine qui lie faiblement le BPG, de sorte que son sang tire l’oxygène de celui de la mère à travers le placenta.

Fixation de l’oxygène par la myoglobine (hyperbolique) et par l’hémoglobine (sigmoïde). Entre les poumons et les tissus, la myoglobine ne libère presque rien ; l’hémoglobine libère le cinquième de sa charge, et davantage quand le tissu est acide.

Méthode 12.13 (Utiliser l’équation de Hill)

Lire $P_{50}$ sur la courbe en $Y = 0.5$ ; estimer $n$ par la pente de $\log[Y/(1-Y)]$ en fonction de $\log P$ (le diagramme de Hill), qui est une droite de pente $n$ au voisinage de $P_{50}$ .
Calculer $Y$ à la pression de charge (poumons) et à la pression de décharge (tissus) ; la différence est la fraction de la capacité de transport effectivement délivrée.
Multiplier par la capacité : le sang contient $150\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ d’hémoglobine, chaque gramme fixant $1.34\,\mathrm{mL}$ d’ $\mathrm{O_2}$ , soit $200\,\mathrm{mL}$ d’ $\mathrm{O_2}$ par litre à saturation.
Pour tenir compte de l’effet Bohr ou du BPG, employer le $P_{50}$ décalé aux tissus seulement, là où se trouve l’acide.

12.6 Voir et séparer les protéines

Méthode 12.14 (Séparer les protéines)

Électrophorèse en SDS : le détergent enrobe chaque chaîne d’une charge négative proportionnelle à sa longueur, de sorte que les chaînes migrent dans un gel de polyacrylamide selon leur seule taille ; une échelle de masses connues étalonne le gel, et la position d’une bande colorée donne la masse à quelques pour cent près.
Chromatographie : à travers une colonne de billes qui retardent les protéines selon la taille (filtration sur gel : les grandes sortent les premières), selon la charge (échange d’ions), ou par une liaison spécifique (affinité : un ligand immobilisé retient une protéine et laisse passer le reste). Une purification se suit par la montée de l’activité spécifique (Chapitre 5).
Séquençage : la séquence du gène, traduite ; ou la protéine elle-même, coupée en peptides et lue par spectrométrie de masse.
Structure : la diffraction des rayons X d’un cristal, ou la microscopie électronique de particules isolées congelées, donne la position de chaque atome ; les rubans dessinés dans ce chapitre en sont les résumés.

Un gel de polyacrylamide–SDS coloré. Chaque piste est un échantillon ; chaque bande une protéine d’une taille ; la piste de gauche une échelle de marqueurs de masse connue. Les petites protéines migrent plus loin.

Exemple 12.15 (Lire un gel)

Un extrait brut montre des dizaines de bandes ; après chromatographie d’affinité, il reste une bande à la position du marqueur de $33\,\mathrm{kDa}$ . Migrée sans SDS et sans réducteur, la même protéine se déplace comme une espèce de $66\,\mathrm{kDa}$ : c’est un dimère de deux chaînes identiques tenues par un pont disulfure, que le réducteur rompt et que le détergent sépare. Deux gels, un seul raisonnement, et la structure quaternaire est connue.

12.7 Exercices

Exercice 12.1 ★

Dessiner ou décrire la structure générale d’un acide aminé à pH 7, et classer Leu, Ser, Lys, Glu et Phe par chaîne latérale.

Solution

Solution de Exercice 12.1.

$\mathrm{^+H_3N{-}CH(R){-}COO^-}$ : un zwitterion. Leu apolaire aliphatique ; Ser polaire non chargée ; Lys chargée positivement ; Glu chargée négativement ; Phe aromatique.

Exercice 12.2 ★

Définir les quatre niveaux de structure d’une protéine et les liaisons qui tiennent chacun.

Solution

Solution de Exercice 12.2.

Primaire : la séquence, liaisons peptidiques. Secondaire : le repliement local du squelette (hélice, feuillet), liaisons hydrogène du squelette. Tertiaire : le repliement de la chaîne entière ; effet hydrophobe, liaisons hydrogène, ponts salins, contacts de van der Waals, ponts disulfure. Quaternaire : l’assemblage des sous-unités, par les mêmes forces non covalentes.

Exercice 12.3 ★

Une protéine compte $450\,$ résidus. Estimer sa masse. Si elle était une hélice $\alpha$ unique, quelle serait sa longueur ? Et un brin $\beta$ unique ?

Solution

Solution de Exercice 12.3.

$450\times 110 = 50\,\mathrm{kDa}$ . Hélice : $450\times 0.15 = 68\,\mathrm{nm}$ . Brin : $450\times 0.35 = 158\,\mathrm{nm}$ .

Exercice 12.4 ★

D’après la figure de la fixation de l’oxygène, lire la saturation de l’hémoglobine à $13.3\,\mathrm{kPa}$ et à $5.3\,\mathrm{kPa}$ , et la fraction délivrée.

Solution

Solution de Exercice 12.4.

Environ $0.98$ et $0.76$ : un cinquième de la charge ( $22\,\%$ ) est délivré.

Exercice 12.5 ★★

Calculer la charge nette du peptide Lys–Gly–Asp–Ala à pH 7, à pH 2 et à pH 12, à l’aide des p $K_a$ du chapitre, et estimer son point isoélectrique.

Solution

Solution de Exercice 12.5.

Groupes : aminé N-terminal (9.5), chaîne latérale de Lys (10.5), chaîne latérale d’Asp (3.9), carboxyle C-terminal (2). pH 7 : $+1 + 1 - 1 - 1 = 0$ . pH 2 : $+1 + 1 + 0 - 0.5 = +1.5$ (le carboxyle terminal à moitié ionisé). pH 12 : $0 + 0 - 1 - 1 = -2$ (Lys en grande partie déprotonée). Charge nulle entre le p $K_a$ d’Asp (3.9) et celui du groupe aminé (9.5), où la charge vaut $0$ tout du long : p $I \approx 6.7$ (moyenne de 3.9 et de 9.5).

Exercice 12.6 ★★

Expliquer pourquoi la proline se rencontre rarement à l’intérieur des hélices $\alpha$ et pourquoi la glycine se trouve aux coudes serrés, à partir de la géométrie du squelette.

Solution

Solution de Exercice 12.6.

La chaîne latérale de la proline est refermée sur son propre azote : l’azote ne porte plus d’hydrogène à donner à la liaison hydrogène de l’hélice, et $\phi$ est bloqué vers $-60^\circ$ , ce qui n’est toléré qu’au premier tour d’une hélice. La glycine, dont la chaîne latérale est un hydrogène, ne subit aucune gêne stérique et peut adopter des valeurs de $\phi$ et de $\psi$ interdites à tout autre résidu, dont celles des coudes serrés.

Exercice 12.7 ★★

Dans l’expérience d’Anfinsen, quelle fraction des réoxydations aléatoires donnerait le jeu natif de quatre ponts disulfure ? (Compter les manières d’apparier huit cystéines.) Qu’a prouvé la récupération effective de la pleine activité ?

Solution

Solution de Exercice 12.7.

Appariements de huit cystéines : $7\times 5\times 3\times 1 = 105$ ; une réoxydation au hasard donne le jeu natif environ $1\,\%$ du temps. La récupération d’une activité presque complète a montré que c’était la chaîne, et non le hasard, qui choisissait l’appariement : la séquence code le repliement et les ponts disulfure ne font que le verrouiller.

Exercice 12.8 ★★

À l’aide de l’équation de Hill avec $n = 2.8$ et $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ , calculer $Y$ à $2\,\mathrm{kPa}$ , à $3.5\,\mathrm{kPa}$ et à $8\,\mathrm{kPa}$ . Reprendre avec $n = 1$ . Quelle protéine délivre le plus entre $8\,$ et $2\,\mathrm{kPa}$ ?

Solution

Solution de Exercice 12.8.

$P_{50}^{2.8} = 33.4$ . À 2 : $2^{2.8} = 6.96$ , $Y = 0.17$ ; à 3.5 : $0.50$ ; à 8 : $8^{2.8} = 337$ , $Y = 0.91$ . Avec $n = 1$ : $Y = P/(3.5 + P)$ : $0.36$ , $0.50$ , $0.70$ . Livraison entre 8 et 2 : coopératif $0.74$ , non coopératif $0.34$ : la protéine coopérative délivre deux fois plus.

Exercice 12.9 ★★

Une protéine migre en une seule bande de $50\,\mathrm{kDa}$ sur un gel SDS et sort d’une colonne de filtration sur gel à $200\,\mathrm{kDa}$ . Donner sa structure quaternaire et dire comment on vérifierait la présence de ponts disulfure entre les sous-unités.

Solution

Solution de Exercice 12.9.

Un tétramère de quatre sous-unités identiques de $50\,\mathrm{kDa}$ . Faire migrer le gel SDS sans réducteur : si des bandes apparaissent à 100, 150 ou $200\,\mathrm{kDa}$ , des ponts disulfure relient les sous-unités ; s’il ne reste que la bande de $50\,\mathrm{kDa}$ , elles sont tenues de façon non covalente.

Exercice 12.10 ★★★

L’hémoglobine drépanocytaire porte une valine au lieu d’un glutamate en position 6 de la chaîne $\beta$ , à la surface. Expliquer, à partir de la chimie des deux chaînes latérales, pourquoi la protéine mutée polymérise lorsqu’elle est désoxygénée, et pourquoi la maladie se manifeste dans les tissus plutôt que dans les poumons.

Solution

Solution de Exercice 12.10.

Le glutamate est chargé et hydraté à la surface ; la valine est hydrophobe et crée une plage collante que l’eau exclut. Dans l’état T désoxygéné, une poche hydrophobe complémentaire est exposée sur une molécule voisine, de sorte que les molécules se collent bout à bout en fibres qui déforment le globule rouge. Dans les poumons, l’état R cache la poche et les fibres se dissolvent ; dans les tissus, où l’hémoglobine est désoxygénée, elles se forment — et c’est là que les globules se falciforment et bloquent les petits vaisseaux.

Exercice 12.11 ★★★

Un repliement n’est stable que de $40\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ . Calculer la fraction de molécules dépliées à l’équilibre à $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ ( $K = e^{-\Delta G/RT}$ ), puis à $45\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ si $\Delta G$ est tombé à $10\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ . Pourquoi une stabilité aussi marginale est-elle utile à une cellule ?

Solution

Solution de Exercice 12.11.

À $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $RT = 2.58\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ : $K = e^{-40/2.58} = e^{-15.5} = 1.8 \times 10^{-7}$ : une molécule sur cinq millions est dépliée. À $45\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ avec $10\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , $RT = 2.64$ : $K = e^{-3.8} = 0.022$ : $2\,\%$ de dépliées, et la proportion monte vite. Une stabilité marginale permet aux protéines de changer de forme quand elles travaillent (allostérie, catalyse), d’être dépliées pour traverser des membranes, et d’être dégradées et remplacées vite quand elles sont endommagées ou devenues inutiles.

Exercice 12.12 ★★★

« Une protéine est une séquence qui se replie en une forme, et la forme est la fonction. » Discuter en un paragraphe à l’aide d’Anfinsen, des chaperons, de la drépanocytose et de l’allostérie : où la phrase tient et où la cellule doit intervenir.

Solution

Solution de Exercice 12.12.

Anfinsen a montré que la séquence suffit à spécifier le repliement, et l’allostérie montre que la forme — et ses changements — est la fonction. Mais la cellule intervient à chaque étape : les chaperons sauvent les chaînes qui s’agrégeraient avant de se replier, car le cytosol encombré n’est pas un tube à essai dilué ; une seule substitution (drépanocytose) donne une protéine correctement repliée dont la surface est fautive, de sorte que la « forme » doit inclure la chimie de surface et non le seul squelette ; et beaucoup de protéines exigent des modifications, des partenaires ou des ligands ajoutés après le repliement avant de fonctionner. La phrase énonce le principe ; la cellule en fournit les conditions.

12.8 Problème : l’hémoglobine au travail

Problème 12.1

Problème du week-end — l’oxygène porté du poumon au muscle, au repos, en sprint, en montagne et avant la naissance, jusqu’à l’oxygène délivré par litre de sang

Le sang contient $150\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ d’hémoglobine ; $1\,\mathrm{g}$ fixe $1.34\,\mathrm{mL}$ d’ $\mathrm{O_2}$ . L’hémoglobine obéit à l’équation de Hill avec $n = 2.8$ et $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ à pH 7.4 ; la myoglobine a $n = 1$ et $P_{50} = 0.37\,\mathrm{kPa}$ . Pressions partielles d’ $\mathrm{O_2}$ : $13.3\,\mathrm{kPa}$ dans les poumons au niveau de la mer, $5.3\,\mathrm{kPa}$ dans les tissus au repos. Prendre $2.8\ln 3.5 = 3.51$ , $2.8\ln 5.3 = 4.67$ , $2.8\ln 13.3 = 7.25$ , $2.8\ln 2.7 = 2.78$ , $2.8\ln 4.5 = 4.21$ , $2.8\ln 7 = 5.45$ , $2.8\ln 4 = 3.88$ , $2.8\ln 2.6 = 2.68$ .

Partie I — Au repos.

Calculer la capacité en oxygène d’un litre de sang.
Calculer $P^{2.8}$ pour $P = 3.5$ , $5.3$ et $13.3$ kPa (sous la forme $e^{2.8\ln P}$ ).
Calculer la saturation $Y$ de l’hémoglobine dans les poumons et dans les tissus.
Calculer la fraction de la charge délivrée et l’oxygène délivré par litre de sang, en millilitres.
Un humain au repos consomme $250\,\mathrm{mL}$ d’ $\mathrm{O_2}$ par minute. Quel débit cardiaque cette livraison exige-t-elle ?
Calculer la saturation de la myoglobine aux deux mêmes pressions et l’oxygène qu’elle délivrerait par litre si elle remplaçait l’hémoglobine. Conclure.
Expliquer en une phrase ce qu’apporte la coopérativité.

Partie II — Un sprint. Dans un muscle qui sprinte, le pH tombe à 7.2 et la pression locale d’ $\mathrm{O_2}$ à $2.7\,\mathrm{kPa}$ ; l’effet Bohr y porte $P_{50}$ à $4.5\,\mathrm{kPa}$ .

Calculer $Y$ à $2.7\,\mathrm{kPa}$ avec $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ (sans effet Bohr).
Calculer $Y$ à $2.7\,\mathrm{kPa}$ avec $P_{50} = 4.5\,\mathrm{kPa}$ .
Calculer l’oxygène délivré par litre dans les deux cas (la charge dans les poumons restant inchangée) et le gain dû à l’effet Bohr.
La myoglobine du muscle est à $P = 2.7\,\mathrm{kPa}$ . Quelle est sa saturation, et que lui arrive-t-il si la pression tombe à $0.5\,\mathrm{kPa}$ pendant une contraction ?
Expliquer pourquoi l’effet Bohr est une forme d’allostérie et où les protons agissent.

Partie III — En montagne. À $4000\,\mathrm{m}$ , la pression d’ $\mathrm{O_2}$ dans les poumons vaut $7\,\mathrm{kPa}$ . En quelques jours les globules rouges augmentent leur BPG, ce qui porte $P_{50}$ à $4.0\,\mathrm{kPa}$ ; en quelques semaines la moelle porte l’hémoglobine à $180\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ .

Calculer la saturation dans les poumons à $7\,\mathrm{kPa}$ avec $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ , et la livraison par litre (tissus à $5.3\,\mathrm{kPa}$ ). Comparer au niveau de la mer.
Calculer les saturations pulmonaire et tissulaire avec $P_{50} = 4.0\,\mathrm{kPa}$ , et la livraison.
Expliquer pourquoi abaisser l’affinité aide, bien que cela abaisse la charge dans les poumons.
Calculer la livraison par litre avec $P_{50} = 4.0\,\mathrm{kPa}$ et $180\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ d’hémoglobine.
Une affinité encore plus basse ( $P_{50} = 6\,\mathrm{kPa}$ ) aiderait-elle à $7\,\mathrm{kPa}$ ? Calculer les deux saturations et trancher.

Partie IV — Avant la naissance. L’hémoglobine fœtale a $P_{50} = 2.6\,\mathrm{kPa}$ ; dans le placenta la pression d’ $\mathrm{O_2}$ vaut $4\,\mathrm{kPa}$ des deux côtés.

Calculer la saturation de l’hémoglobine maternelle à $4\,\mathrm{kPa}$ .
Calculer la saturation de l’hémoglobine fœtale à $4\,\mathrm{kPa}$ .
Expliquer comment l’oxygène passe de la mère au fœtus alors que la pression est la même des deux côtés.
L’hémoglobine fœtale a des chaînes $\gamma$ au lieu de $\beta$ , qui lient faiblement le BPG. Expliquer comment cela produit le $P_{50}$ plus bas.
À la naissance, le sang fœtal doit décharger dans des tissus à $5.3\,\mathrm{kPa}$ . Calculer la livraison fœtale par litre à partir de poumons à $13.3\,\mathrm{kPa}$ , et dire pourquoi le passage à l’hémoglobine adulte au cours des premiers mois est utile.
Une mutation porte le $P_{50}$ adulte à $5\,\mathrm{kPa}$ . Prédire la saturation artérielle de la personne au niveau de la mer, et la conséquence pour la livraison.
Expliquer pourquoi un transporteur de $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ et sans coopérativité ( $n = 1$ ) serait un mauvais transporteur d’oxygène : calculer sa livraison.
Énoncer le résultat : l’oxygène délivré par litre de sang au repos et dans un muscle qui sprinte, et les deux propriétés de l’hémoglobine qui font la différence.

Solution

Solution de Problème 12.1.

1. $150\times 1.34 = 201\,\mathrm{mL}$ d’ $\mathrm{O_2}$ par litre. 2. $e^{3.51} = 33.4$ ; $e^{4.67} = 106.7$ ; $e^{7.25} = 1408$ . 3. Poumons : $1408/(33.4 + 1408) = 0.977$ . Tissus : $106.7/(33.4 + 106.7) = 0.762$ . 4. $0.977 - 0.762 = 0.215$ : $0.215\times 201 = 43\,\mathrm{mL}$ par litre. 5. $250/43 = 5.8\,\mathrm{L}/\mathrm{min}$ — proche du débit cardiaque de repos. 6. Myoglobine : poumons $13.3/13.67 = 0.973$ ; tissus $5.3/5.67 = 0.935$ ; elle délivre $0.038\times 201 = 7.7\,\mathrm{mL}$ par litre, six fois moins : un transporteur hyperbolique qui se charge bien ne sait pas décharger aux pressions des tissus. 7. La coopérativité place la partie raide de la courbe entre les deux pressions de travail, de sorte qu’une faible baisse de pression libère une grande fraction de la charge. 8. $e^{2.78} = 16.1$ ; $Y = 16.1/(33.4 + 16.1) = 0.325$ . 9. $e^{4.21} = 67.4$ ; $Y = 16.1/(67.4 + 16.1) = 0.193$ . 10. Sans Bohr : $(0.977 - 0.325)\times 201 = 131\,\mathrm{mL}$ ; avec : $(0.977 - 0.193)\times 201 = 158\,\mathrm{mL}$ par litre ; gain $27\,\mathrm{mL}$ , soit $20\,\%$ . 11. $2.7/3.07 = 0.88$ de saturation ; à $0.5\,\mathrm{kPa}$ , $0.5/0.87 = 0.57$ : elle libère le tiers de sa réserve vers les mitochondries pendant la contraction, et se recharge entre les contractions. 12. Les protons se fixent sur des sites (histidines, extrémités N-terminales) éloignés des hèmes et, ce faisant, stabilisent l’état T, ce qui abaisse l’affinité des hèmes : un ligand sur un site change l’affinité en un autre — c’est l’allostérie. 13. $e^{5.45} = 233$ ; poumons $233/(33.4 + 233) = 0.875$ ; tissus $0.762$ ; livraison $0.113\times 201 = 23\,\mathrm{mL}$ : environ la moitié du niveau de la mer. 14. $e^{3.88} = 48.4$ : poumons $233/(48.4 + 233) = 0.828$ ; tissus $106.7/(48.4 + 106.7) = 0.688$ ; livraison $0.140\times 201 = 28\,\mathrm{mL}$ . 15. La charge baisse un peu (de 0.875 à 0.828) mais la décharge baisse davantage (de 0.762 à 0.688), de sorte que la différence augmente : à $7\,\mathrm{kPa}$ les poumons sont encore sur le plateau de la courbe alors que les tissus sont sur sa partie raide. 16. Capacité $180\times 1.34 = 241\,\mathrm{mL}$ ; $0.140\times 241 = 34\,\mathrm{mL}$ par litre — les trois quarts du niveau de la mer retrouvés. 17. $6^{2.8} = e^{2.8\times 1.79} = e^{5.02} = 151$ : poumons $233/384 = 0.607$ , tissus $106.7/258 = 0.414$ : livraison $0.193$ , meilleure encore sur le papier — mais le sang artériel ne serait saturé qu’à $61\,\%$ , et toute baisse supplémentaire de la pression pulmonaire ou toute exigence d’une pression tissulaire plus élevée laisserait l’encéphale à court ; l’ajustement réel s’arrête vers $4\,\mathrm{kPa}$ . 18. $48.4/(33.4 + 48.4) = 0.59$ . 19. $e^{2.68} = 14.6$ ; $48.4/(14.6 + 48.4) = 0.77$ . 20. À pression égale, la protéine fœtale fixe davantage : à mesure que le sang de la mère décharge vers $59\,\%$ et que le sang fœtal se charge vers $77\,\%$ , l’oxygène descend le gradient de pression que la différence d’affinités entretient de part et d’autre de la membrane placentaire. 21. Le BPG se lie à l’état T et abaisse l’affinité ; les chaînes $\gamma$ le lient faiblement, de sorte que l’hémoglobine fœtale reste plus près de sa forte affinité intrinsèque : $P_{50}$ plus bas. 22. Poumons : $1408/(14.6 + 1408) = 0.990$ ; tissus $106.7/(14.6 + 106.7) = 0.880$ ; livraison $0.110\times 201 = 22\,\mathrm{mL}$ , la moitié de celle de l’adulte : bon pour prendre l’oxygène à la mère, mauvais pour le délivrer une fois les poumons en service, d’où le changement. 23. $5^{2.8} = e^{2.8\times 1.609} = e^{4.51} = 90.6$ : poumons $1408/1499 = 0.94$ , tissus $106.7/197 = 0.54$ : livraison $0.40$ , presque le double de la normale — la personne est légèrement cyanosée aux lèvres mais le tolère bien ; le prix est une réserve moindre en altitude. 24. $Y = P/(3.5 + P)$ : poumons $0.79$ , tissus $0.60$ : livraison $0.19\times 201 = 38\,\mathrm{mL}$ — et, dans le muscle qui sprinte à $2.7\,\mathrm{kPa}$ , $0.44$ : livraison $0.35\times 201 = 70\,\mathrm{mL}$ contre $158\,\mathrm{mL}$ . Sans coopérativité, le transporteur se charge mal et décharge mal. 25. $43\,\mathrm{mL}$ d’ $\mathrm{O_2}$ par litre au repos, $158\,\mathrm{mL}$ par litre dans un muscle qui sprinte ; la différence vient de la coopérativité (la courbe sigmoïde) et de l’effet Bohr (le décalage de $P_{50}$ en milieu acide).

Termes définis dans ce chapitre

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