Universitaire biologie — jaar 2 · Bachelor Year 2

11Organogenese: de bouw van de ledemaat van tetrapoden

Drie dagen nadat een kippenei is gelegd, verschijnt aan elke flank van het embryo een bultje zo groot als een speldenknop. Vier dagen later is het een vleugel, met een opperarmbeen, een spaakbeen en een ellepijp, een pols en drie vingers, in de juiste volgorde, met de juiste lengten, en met spieren die aan de juiste botten vastzitten. Snijd de rand van verdikte huid van het bultje weg en de vleugel houdt op met groeien; zet een reepje van de achterrand ervan op de voorrand en er groeien zes vingers in spiegelbeeld. De ledemaatknop is het klassieke voorbeeld van organogenese — de bouw van een orgaan uit een veld van cellen door signalen die zeggen hoe ver naar buiten, hoe ver naar voren en hoe ver naar boven elke cel ligt — en de experimenten die haar ontcijferden, behoren tot de helderste van de biologie. Dit hoofdstuk volgt de knop van zijn uitgroei tot zijn skelet.

11.1 De knop en zijn drie assen

Definitie 11.1 (De ledemaatknop)

De ledemaatknop is een zwelling van mesoderm van de laterale plaat, bedekt met ectoderm, die ontstaat op een vaste plaats langs de flank (het ledemaatveld) waar de Hox-code van de lichaamsas dat toelaat; zijn mesoderm zal bot, kraakbeen, pezen en lederhuid maken, en cellen die er vanuit de somieten in migreren, zullen de spieren maken. De knop heeft drie assen, elk bestuurd door een signaalcentrum. Proximodistaal (van schouder tot vingertop): de apicale ectodermale richel (AER), een verdikte strook ectoderm langs de top, scheidt fibroblastgroeifactoren (FGF’s) af die het mesoderm eronder delend en ongedifferentieerd houden. Anteroposterior (van duim tot pink): de zone van polariserende activiteit (ZPA), een blok mesoderm aan de achterrand, scheidt het morfogeen Sonic hedgehog (Shh) af. Dorsoventraal (van handrug tot handpalm): het dorsale ectoderm scheidt Wnt7a af. Knoppen van voor- en achterpoot zien er gelijk uit en gebruiken dezelfde signalen; ze verschillen in een transcriptiefactor die al vóór het verschijnen van de knop tot expressie komt (Tbx5 in de voorpoot, Tbx4 in de achterpoot), en daarom is een vleugel een vleugel.

De ledemaatknop van een kuiken van bovenaf gezien, met zijn drie signaalcentra: de AER langs de top drijft de uitgroei aan, de ZPA aan de achterrand geeft de vingers hun patroon, het dorsale ectoderm onderscheidt rug van palm.

Een kuikenembryo onder de rasterelektronenmicroscoop: de rij somieten langs de romp en, op de flank, de peddelvormige ledemaatknop met de verdikte richel langs zijn rand.

11.2 Uitgroei: de proximodistale as

Propositie 11.2 (De apicale ectodermale richel)

De AER is nodig voor de uitgroei en haar FGF’s volstaan: het mesoderm eronder, de progressiezone, deelt zich ongeveer om de twaalf uur, en cellen die de zone verlaten naarmate de top oprukt, houden op met delen, condenseren en differentiëren. Het skelet vormt zich in proximodistale volgorde — stylopodium (opperarmbeen of dijbeen), zeugopodium (spaakbeen en ellepijp, scheenbeen en kuitbeen), autopodium (pols en vingers) — waarbij elk segment op zijn beurt wordt gespecificeerd terwijl de knop groeit, en de segmenten komen overeen met geneste domeinen van Hox-genexpressie (Hoxa/d 9–10 in het stylopodium, 11 in het zeugopodium, 13 in het autopodium). Een ledemaatknop wordt in vier dagen zo’n tien keer langer, terwijl het bereik van het signaal van de richel dezelfde paar honderd micrometer blijft, zodat de richel de ledemaat niet in één keer een patroon geeft maar als een oprukkend front, zoals een printer een pagina regel voor regel neerlegt.

Bewijsmateriaal. Saunders (1948) verwijderde de AER van vleugelknoppen van kuikens in opeenvolgende stadia: vroeg verwijderd leverde de knop alleen een stompje opperarmbeen op; een dag later verwijderd, opperarmbeen en onderarm maar geen hand; nog later verwijderd, een bijna volledige vleugel — hoe later de ingreep, hoe distaler het niveau van de afknotting, zodat de richel voor elk segment op zijn beurt nodig is. Het transplanteren van een tweede richel gaf een tweede uitgroei; een kraal gedrenkt in FGF, geplaatst op een knop waarvan de richel was verwijderd, herstelde een volledige ledemaat (Niswander, 1993), en een kraal op de flank tussen de ledemaatvelden induceerde een extra ledemaat. Muizen zonder de FGF’s van de richel hebben geen ledematen. ∎

Het experiment van Saunders. Hoe vroeger de richel wordt verwijderd, hoe meer er van de ledemaat ontbreekt, altijd vanaf de top: de richel is voor elk segment nodig zolang dat segment wordt aangelegd.

Stelling 11.3 (Groei door deling)

Een knop waarvan de cellen zich om de $T$ uur delen, vermenigvuldigt zijn aantal cellen met $2^{t/T}$ in een tijd $t$ ; vier dagen van cycli van twaalf uur geven $2^{8} = 256$ . Als het volume van de knop in die vier dagen duizendvoudig groeit, levert deling een factor 256 en moet de resterende factor vier komen van celvergroting en van de matrix die kraakbeencellen om zich heen afscheiden. Omgekeerd komt een segment waarvan de specificatie één celcyclus vergt — de ongeveer twaalf uur die de opeenvolgende afknottingsniveaus van het experiment van Saunders van elkaar scheiden — overeen met één verdubbeling van de progressiezone.

Bewijs. $N(t) = N_0 2^{t/T}$ ; met $t = 96\,\mathrm{h}$ en $T = 12\,\mathrm{h}$ is $t/T = 8$ . De verhouding van de vereiste factor tot de factor door deling, $1000/256 \approx 4$ , is wat andere groei dan deling moet leveren. ∎

11.3 Vingers: de anteroposterieure as

Propositie 11.4 (De zone van polariserende activiteit)

De ZPA bepaalt welke vinger zich waar vormt. Haar cellen scheiden Sonic hedgehog af, dat zich vanaf de achterrand over de knop verspreidt, en mesodermcellen lezen de concentratie — en de tijd dat ze eraan zijn blootgesteld — als een positie: de hoogste dosis geeft de meest posterieure vinger, lagere doses meer anterieure, en onder een drempel helemaal geen vinger. De gradiënt heeft de exponentiële vorm van Hoofdstuk 10, met een vervallengte van enkele tientallen micrometers, en zijn drempels verdelen de knop in de aanleg van de vingers: in de vleugel van een kuiken, van posterieur naar anterieur, vinger 4, 3 en 2. Een tweede bron van het signaal aan de voorrand geeft een tweede reeks in spiegelbeeld; een zwakkere bron, of een kortere blootstelling, geeft alleen de anterieure vingers van de extra reeks. Hetzelfde gen geeft, in dezelfde rol, de vingers van elke tetrapode hun patroon, en een mutatie die een anterieure bron van Shh toevoegt, geeft polydactylie bij katten, kippen, muizen en mensen.

Bewijsmateriaal. Saunders en Gasseling (1968) transplanteerden een blok mesoderm van de achterrand van de ene vleugelknop naar de voorrand van een andere: de gastheer kreeg een vleugel met zes vingers in de volgorde 4-3-2-2-3-4, een spiegelbeeld rond het midden. Tickle (1975) toonde aan dat het aantal extra vingers afhing van het aantal getransplanteerde cellen — een dosis. Riddle en Tabin (1993) vonden dat het getransplanteerde weefsel het gen Sonic hedgehog tot expressie bracht, dat het gen nergens anders in de knop tot expressie kwam, en dat cellen die zo waren gemodificeerd dat ze het tot expressie brachten, anterieur getransplanteerd, de verdubbeling in spiegelbeeld reproduceerden; een kraal met het eiwit deed hetzelfde. Kuikenmutanten met een ectopische anterieure plek van Shh hebben extra anterieure vingers. ∎

De polariserende zone. Links: Shh verspreidt zich vanaf de achterrand en zijn dalende concentratie specificeert vinger 4, 3 en 2. Rechts: een tweede ZPA, naar de voorrand getransplanteerd, maakt een tweede gradiënt en een reeks vingers in spiegelbeeld.

Stelling 11.5 (Vingergrenzen uit de gradiënt)

Met Shh in concentratie $c_0$ aan de achterrand en een vervallengte $\lambda$ ligt de grens van het territorium van een vinger met drempel $T_i$ op $x_i = \lambda\ln(c_0/T_i)$ van de rand. Met $\lambda = 50\,\text{µ}\mathrm{m}$ en drempels van $0.6$ , $0.25$ en $0.08$ van $c_0$ voor vinger 4, 3 en 2 zijn de territoria $0$ – $26$ , $26$ – $69$ en $69$ – $126$ micrometer, en vormt het weefsel voorbij $126\,\text{µ}\mathrm{m}$ geen vinger. Verdubbeling van de bron verschuift elke grens naar buiten met $\lambda\ln 2 = 35\,\text{µ}\mathrm{m}$ — genoeg, in een knop van enkele honderden micrometers, om aan de anterieure rand een vinger toe te voegen; een tweede bron aan de voorrand legt dezelfde territoria in omgekeerde volgorde aan.

Bewijs. Uit $c(x) = c_0 e^{-x/\lambda}$ volgt $c = T_i$ bij $x_i = \lambda \ln(c_0/T_i)$ : $50\ln(1/0.6) = 25.5$ , $50\ln 4 = 69$ , $50\ln 12.5 = 126$ . Vervangen van $c_0$ door $2c_0$ telt $\lambda\ln 2$ bij elke $x_i$ op. ∎

Eén plan, vier ledematen: de voorpoten van een mens, een kat, een walvis en een vleermuis delen dezelfde botten in dezelfde volgorde — één stylopodium, twee zeugopodiumbotten, pols, vingers —, gebouwd door dezelfde signaalcentra en verschillend in groei.

11.4 Coördinatie en beeldhouwen

Propositie 11.6 (De assen praten met elkaar)

De centra houden elkaar in stand: FGF uit de richel laat de ZPA Shh tot expressie brengen, en Shh laat, via een doorgeefluik in het mesoderm, de richel FGF tot expressie brengen; verwijder een van beide en de ander dooft binnen een dag uit. Wnt7a uit het dorsale ectoderm is eveneens nodig voor volledige expressie van Shh, en het stuurt het dorsale lot van het mesoderm aan (een muis zonder Wnt7a heeft twee handpalmen). Deze wederzijdse afhankelijkheid is een positieve terugkoppelingslus die de drie assen aan elkaar koppelt: de ledemaat groeit alleen waar hij een patroon krijgt, en krijgt alleen een patroon waar hij groeit, zodat een knop nooit een hand zonder arm maakt of vingers van de verkeerde soort. Wanneer de uitgroei voltooid is, wordt de lus verbroken — het mesoderm geeft niets meer door, Shh stopt, de richel gaat in regressie — en houdt de ledemaat op zijn juiste grootte op met groeien.

Propositie 11.7 (Van patroon tot bot)

Eenmaal gespecificeerd condenseren mesodermcellen die de progressiezone verlaten tot staven en platen met de vorm van de toekomstige botten, differentiëren ze tot kraakbeencellen die een matrix rijk aan collageen en proteoglycanen afscheiden, en leggen ze van elk skeletelement een kraakbeenmodel aan; gewrichten ontstaan waar een band cellen te horen krijgt geen kraakbeen te worden; bloedvaten dringen de modellen binnen en bot vervangt kraakbeen van het midden naar buiten, waarbij aan de uiteinden groeischijven overblijven die het bot tot de volwassenheid laten verlengen (endochondrale ossificatie). Spiervoorlopers uit de somieten migreren binnen, delen zich, versmelten tot vezels (Hoofdstuk 12) en hechten zich via pezen die door het eigen mesoderm van de ledemaat worden gemaakt. Tussen de vingerstralen wordt het weefsel door geprogrammeerde celdood verwijderd: de cellen van de interdigitale vliezen activeren, op een signaal van een botmorfogenetisch eiwit (BMP), hun eigen vernietiging en worden binnen een dag opgeruimd, wat de vingers van elkaar scheidt. Een eend behoudt zijn zwemvliezen omdat in zijn interdigitale weefsel een BMP-remmer tot expressie komt; een kuiken dat dezelfde remmer op een kraal krijgt, krijgt zwemvliezen.

Bewijsmateriaal. Interdigitaal mesoderm dat uit een beenknop van een kuiken wordt gesneden en elders wordt getransplanteerd, sterft volgens schema — de dood is intrinsiek en werd al beslist voordat het weefsel werd verwijderd; hetzelfde weefsel van een eend overleeft. Kralen met BMP tussen de tenen van een eend laten het zwemvlies afsterven; kralen met de remmer gremlin tussen de tenen van een kuiken redden het. Een muis zonder BMP-receptor in de ledemaat behoudt zijn vliezen. ∎

Het beeldhouwen van de hand: kraakbeenstralen condenseren in de peddel, de cellen ertussen sterven (rood), en de vrijgekomen vingers verbenen.

Voorbeeld 11.8 (Dezelfde ledemaat, anders gegroeid)

De vleugel van een vleermuis is een hand waarvan de vingers 2 tot 5 meermaals langer uitgroeiden dan die van een muis — een enhancer van een ledemaatgen, van vleermuis naar muis overgebracht, verlengt de botten van de voorpoot van de muis — en waarvan het interdigitale weefsel overleefde, omdat het vlies de BMP-remmer tot expressie brengt die ook de eend gebruikt. De flipper van een walvis is een hand met extra kootjes en zonder interdigitale celdood. Het been van een paard is één enkele vinger, met de andere teruggebracht tot griffelbeentjes. De slang heeft geen ledematen omdat haar flank de signalen die een knop starten nooit tot expressie brengt. En de vinnen van vissen, die geen autopodium hebben, worden gebouwd door dezelfde AER en ZPA, maar breken hun Hox-programma af vóór de late fase die vingers maakt; het fossiel Tiktaalik (375 miljoen jaar oud) laat de pols in een vin zien verschijnen. De evolutie van ledematen is vooral de modulatie van een geconserveerd programma — hoe lang elke fase duurt, hoe ver elk signaal reikt, welke cellen sterven.

11.5 Opgaven

Oefening 11.1 ★

Noem de drie assen van de ledemaatknop en, voor elk, het signaalcentrum, zijn positie en zijn signaal.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.1.

Proximodistaal: de apicale ectodermale richel langs de top, FGF’s. Anteroposterior: de zone van polariserende activiteit aan de achterrand, Sonic hedgehog. Dorsoventraal: het dorsale ectoderm, Wnt7a.

Oefening 11.2 ★

Geef de drie segmenten van het skelet van de ledemaat en de botten van elk in een menselijke arm en een menselijk been. Welke Hox-genen markeren ze?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.2.

Stylopodium: opperarmbeen, dijbeen (Hoxa/d 9–10). Zeugopodium: spaakbeen en ellepijp, scheenbeen en kuitbeen (Hox 11). Autopodium: pols en hand, enkel en voet (Hox 13).

Oefening 11.3 ★

Noem in volgorde de stappen van een stukje mesoderm van de laterale plaat tot een vinger met zijn bot, gewricht en spier.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.3.

Ledemaatveld gespecificeerd (Tbx5); de knop groeit uit onder het FGF van de richel; de ZPA en het dorsale ectoderm geven hem een patroon; cellen die de progressiezone verlaten, condenseren tot stralen; kraakbeen differentieert; gewrichten ontstaan waar kraakbeen wordt onderdrukt; bloedvaten dringen binnen en bot vervangt kraakbeen; interdigitale cellen sterven; spiervoorlopers uit de somieten migreren binnen, versmelten en hechten zich via pezen.

Oefening 11.4 ★

Hoe ziet de ledemaat eruit als de AER wordt verwijderd (a) zodra de knop verschijnt, (b) nadat de onderarm is gespecificeerd, (c) helemaal niet, maar vervangen door een kraal met FGF?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.4.

(a) Een stompje met weinig of geen opperarmbeen; (b) opperarmbeen, spaakbeen en ellepijp, maar geen hand; (c) een volledige ledemaat — FGF vervangt de richel.

Oefening 11.5 ★★

Bereken met $\lambda = 40\,\text{µ}\mathrm{m}$ en drempels van $0.5$ , $0.2$ en $0.05$ van de bronconcentratie voor vinger 4, 3 en 2 de drie grenzen en de breedte van elk vingerterritorium.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.5.

$x = 40\ln 2 = 28\,\text{µ}\mathrm{m}$ , $40\ln 5 = 64\,\text{µ}\mathrm{m}$ , $40\ln 20 = 120\,\text{µ}\mathrm{m}$ : territoria van 28, 36 en $56\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Oefening 11.6 ★★

Voorspel het vingerpatroon van een vleugel van een kuiken na (a) een volledige ZPA die naar de voorrand wordt getransplanteerd, (b) een transplantaat van een kwart zoveel ZPA-cellen, (c) een kraal met Shh aan de voorrand die na een korte blootstelling wordt verwijderd. Verklaar elk geval met dosis en tijd.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.6.

(a) 4-3-2-2-3-4, een volledige spiegelreeks. (b) Een zwakkere bron geeft een lagere piek, zodat alleen de vinger met de lage drempel wordt toegevoegd: 2-2-3-4. (c) Een korte blootstelling specificeert eveneens alleen de meest anterieure extra vinger: 2-2-3-4 — cellen integreren de concentratie over de tijd.

Oefening 11.7 ★★

Een ledemaatknop van een kuiken telt $5000$ cellen wanneer de richel zich vormt, en zijn cellen delen zich om de $12\,\mathrm{h}$ . Hoeveel cellen zijn er na vier dagen? Als de ledemaat in dat stadium $4\times 10^{6}$ cellen telt, wat moet er dan gelden voor de celcyclus of voor celdood?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.7.

$5000\times 2^{8} = 1.3\times 10^{6}$ . Om $4\times 10^{6}$ te bereiken zijn $\log_2 800 = 9.6$ verdubbelingen nodig, zodat de cyclus gemiddeld ongeveer $10\,\mathrm{h}$ moet duren, of de telling de spiervoorlopers moet omvatten die vanuit de somieten binnenmigreren; celdood zou de discrepantie groter maken, niet kleiner.

Oefening 11.8 ★★

Leg uit waarom een kuiken vrije tenen heeft en een eend zwemvliezen, en wat een kraal met BMP-remmer tussen de tenen van een kuikenembryo doet. Wat zegt de intrinsieke timing van de interdigitale celdood (ze treedt in een transplantaat volgens schema op) over de manier waarop de cellen werden geïnstrueerd?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.8.

Interdigitale cellen van een kuiken ontvangen een BMP-signaal en sterven; interdigitale cellen van een eend brengen een BMP-remmer tot expressie en overleven, zodat het vlies blijft bestaan. De remmer op een kraal redt het kuikenvlies: een voet met zwemvliezen. Celdood volgens schema in een transplantaat betekent dat de cellen al vóór het verwijderen waren geïnstrueerd — de beslissing wordt vroeg genomen en later, autonoom, uitgevoerd.

Oefening 11.9 ★★

Een muis mist zowel Hoxa13 als Hoxd13; een andere mist Hoxa11 en Hoxd11. Voorspel het skelet van elke voorpoot en zeg wat het resultaat aantoont over de relatie tussen Hox-domeinen en segmenten.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.9.

Zonder Hoxa13 en Hoxd13: geen autopodium — de voorpoot eindigt bij de pols. Zonder Hoxa11 en Hoxd11: een sterk verkort spaakbeen en ellepijp, met een hand die vrijwel rechtstreeks aan het opperarmbeen vastzit. Elk segment heeft zijn eigen Hox-paar nodig; de domeinen zijn niet alleen merkers, maar instructies.

Oefening 11.10 ★★★

Leg de positieve terugkoppeling tussen de AER en de ZPA uit, waarom ze de ledemaat robuust maakt, en wat er zou gebeuren met een knop waarin Shh FGF niet in stand kon houden. Vergelijk met de positieve terugkoppeling van de bevalling in Hoofdstuk 8: wat beëindigt elke lus?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.10.

FGF uit de richel houdt Shh in de ZPA aan; Shh houdt, via een doorgeefluik in het mesoderm, FGF in de richel aan. Het signaal van elk centrum bevestigt dus dat het andere werkt, zodat een ledemaat nooit groeit zonder een patroon te krijgen of een patroon krijgt zonder te groeien, en een tijdelijk verlies van een van beide door het andere wordt hersteld. Als Shh FGF niet in stand kon houden, zou de richel binnen een dag in regressie gaan en zou de uitgroei stoppen bij het segment dat dan was bereikt: een afgeknotte ledemaat. De lus van de bevalling wordt beëindigd door de gebeurtenis die ze aandrijft — de geboorte neemt de prikkel weg; de lus van de ledemaat wordt beëindigd door differentiatie — het mesoderm geeft niets meer door wanneer de ledemaat af is.

Oefening 11.11 ★★★

De derde vinger van een vleermuis is, relatief ten opzichte van de lichaamsgrootte, acht keer langer dan die van een muis. Als het kraakbeen van een vinger tijdens een groeivenster exponentieel verlengt met snelheid $r$ per dag, en het venster van de vleermuis vier dagen langer duurt dan dat van de muis, welke $r$ is dan nodig? Geef twee ontwikkelingsveranderingen (één in groei, één in celdood) die van een hand een vleugel maken.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.11.

$e^{4r} = 8$ : $r = \ln 8/4 = 0.52\,\mathrm{d}^{-1}$ . Groei: een langere, snellere proliferatie van het vingerkraakbeen (een ledemaatenhancer die de expressie van een groeigen in de vingers verhoogt). Dood: overleving van het interdigitale weefsel door expressie van een BMP-remmer, die het membraan behoudt.

Oefening 11.12 ★★★

Sonic hedgehog geeft de neurale buis een patroon vanuit de bodemplaat (Hoofdstuk 10) en de vingers vanuit de ZPA. Bespreek waarom de evolutie een paar signalen voor veel taken hergebruikt, hoe hetzelfde molecuul in verschillende weefsels verschillende dingen kan betekenen, en wat dit inhoudt voor het effect van een mutatie in zo’n gen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.12.

Signalen worden hergebruikt omdat een werkende module van receptor en signaaltransductie goedkoop opnieuw in te zetten is: wat tussen weefsels verandert, is niet het signaal maar de verzameling genen die de ontvangende cellen competent zijn aan te schakelen, zodat hetzelfde concentratieprofiel op de ene plaats motorneuron betekent en op een andere vinger 4. Een mutatie in zo’n gen treft daardoor veel organen tegelijk — mutaties van Shh geven holoprosencefalie en ledemaatafwijkingen samen — tenzij ze in een weefselspecifieke enhancer ligt, in welk geval ze maar één orgaan verandert, en zo verloopt de meeste evolutionaire verandering in deze genen.

11.6 Vraagstuk: een vleugel gebouwd in een week

Probleem 11.1

Weekendvraagstuk — de vleugel van een kuiken gevolgd van knop tot skelet: zijn groei door deling, de richelverwijderingen van Saunders getimed, de Shh-gradiënt berekend en zijn verdubbelingen voorspeld, de vliezen weggebeeldhouwd en de vleugel vergeleken met die van een vleermuis, met als besluit het aantal verdubbelingen, de vingergrenzen en de breedte die een knop nodig heeft voor een verdubbeling in spiegelbeeld

Een vleugelknop van een kuiken verschijnt na 3 dagen broeden met $2000$ mesodermcellen en een lengte van $0.4\,\mathrm{mm}$ ; na 7 dagen is de vleugel $4\,\mathrm{mm}$ lang en is zijn volume $1000$ keer dat van de knop. Cellen van de progressiezone delen zich om de $12\,\mathrm{h}$ . Richelverwijderingen: bij 3.0 dagen is de ledemaat een stompje; bij 3.5 dagen alleen een opperarmbeen; bij 4.0 dagen opperarmbeen, spaakbeen en ellepijp; bij 4.5 dagen een vleugel waaraan alleen de vingertoppen ontbreken. Shh: $D = 1 \times 10^{-12}\,\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , halveringstijd $29\,\mathrm{min}$ ; drempels $0.6$ , $0.25$ , $0.08$ van $c_0$ voor vinger 4, 3, 2. Breedte van de knop (van posterieur naar anterieur) $600\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Interdigitale vliezen: drie gebieden van $300\,\text{µ}\mathrm{m}$ $\times$ $300\,\text{µ}\mathrm{m}$ $\times$ $200\,\text{µ}\mathrm{m}$ , cellen van $1000\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , opgeruimd in $24\,\mathrm{h}$ .

Deel I — Groei.

Hoeveel verdubbelingen vinden er in vier dagen plaats? Hoeveel cellen levert dat op vanaf $2000$ ?
Vergelijk met de duizendvoudige volumetoename: welke factor moeten celvergroting en matrix leveren?
Met welke factor groeide de lengte? Als de knop groeide als een cilinder met constante straal, welke volumefactor zou dat zijn, en wat zegt het verschil over de vorm?
Het FGF van de richel reikt $300\,\text{µ}\mathrm{m}$ ver het mesoderm in. Welk deel van de knop staat na 3 dagen en na 7 dagen onder zijn invloed?
Leg uit waarom een signaal met een vast bereik in een groeiend orgaan een proximodistale opeenvolging voortbrengt.
Een cel verlaat de progressiezone na 4 dagen. Bij welk segment sluit ze aan?

Deel II — De segmenten getimed.

Geef uit de reeks verwijderingen het tijdstip waarop elk segment (stylopodium, zeugopodium, autopodium) is gespecificeerd.
Hoeveel celcycli scheiden de specificatie van opeenvolgende segmenten?
Verklaar het resultaat in termen van de progressiezone en de Hox-domeinen.
Op een knop waarvan de richel na 3.5 dagen is verwijderd, wordt een kraal met FGF geplaatst. Voorspel de ledemaat.
Na 3.5 dagen wordt een tweede richel op het dorsale oppervlak van een intacte knop getransplanteerd. Voorspel.
Waarom houdt de knop na 7 dagen op met groeien in plaats van onbeperkt door te gaan?

Deel III — De gradiënt.

Bereken $k$ en $\lambda$ voor Shh.
Bereken de drie vingergrenzen en de breedte van de territoria.
Hoe breed is het anterieure gebied dat in een knop van $600\,\text{µ}\mathrm{m}$ geen vinger vormt?
Een mutatie verdubbelt de productie van Shh. Bereken de grenzen opnieuw en zeg of er een extra vinger ontstaat, en welke.
Een ZPA wordt naar de voorrand getransplanteerd. Welke minimale breedte van de knop laat een volledige spiegelreeks 4-3-2-2-3-4 toe zonder overlap van de twee territoria van vinger 2? Is de knop van het kuiken breed genoeg?
Voorspel het patroon als de knop maar $200\,\text{µ}\mathrm{m}$ breed was.
Waarom geeft een transplantaat van een kwart van de ZPA alleen 2-2-3-4?

Deel IV — Beeldhouwen en evolutie.

Bereken het aantal cellen in de drie vliezen en het tempo van de celdood tijdens het opruimen, in cellen per seconde.
De interdigitale cellen van een eend brengen een BMP-remmer tot expressie. Voorspel het effect van een kraal met BMP in een eendenvlies en van de remmer in een kuikenvlies.
Het vingerkraakbeen van een vleermuis groeit vier extra dagen met een exponentiële snelheid van $0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ . Met welke factor is het langer dan dat van het kuiken? Noem een tweede verandering die het vleugelmembraan maakt.
Een vinknop van een vis heeft een AER en een ZPA, maar geen vingers. Wat ontbreekt er, en wat laat Tiktaalik zien?
Als de vliescellen in plaats daarvan door deling uit $1000$ stichtercellen waren gemaakt, bij $12\,\mathrm{h}$ per cyclus, hoelang zou het maken ervan dan hebben geduurd? Vergelijk met de dag die het verwijderen kost.
Formuleer het resultaat: het aantal verdubbelingen in vier dagen, de drie vingergrenzen, en de minimale breedte voor een verdubbeling in spiegelbeeld.

Oplossing

Oplossing van Probleem 11.1.

1. $96/12 = 8$ verdubbelingen: $2000\times 256 = 5.1\times 10^{5}$ cellen. 2. $1000/256 \approx 4$ : celvergroting en kraakbeenmatrix. 3. Lengte $\times 10$ ; een cilinder met constante straal zou $\times 10$ in volume geven; de extra factor honderd betekent dat ook de straal ongeveer tienvoudig groeide — de knop verbreedde zich tot een peddel terwijl hij langer werd. 4. Na 3 dagen $300/400 = 75\,\%$ ; na 7 dagen $300/4000 = 7.5\,\%$ . 5. Alleen de top staat onder het signaal; naarmate de top oprukt, verlaten de achtergebleven cellen de zone in de volgorde waarin ze zijn gemaakt, zodat proximale structuren eerst worden gespecificeerd en distale als laatste. 6. Het zeugopodium (spaakbeen en ellepijp), gespecificeerd tussen 3.5 en 4 dagen. 7. Stylopodium na 3.5 dagen, zeugopodium na 4.0 dagen, autopodium na 4.5 dagen (vingertoppen later). 8. Een halve dag: één celcyclus. 9. Elke cyclus in de progressiezone schuift de Hox-code op (9–10, dan 11, dan 13); cellen die na één, twee of drie cycli vertrekken, dragen de code van het stylopodium, het zeugopodium of het autopodium. 10. Een volledige vleugel: FGF is wat de richel leverde. 11. Een tweede uitgroei vanuit het dorsale oppervlak: verdubbelde distale structuren, een overtallige ledemaat. 12. Het mesoderm geeft Shh niet meer door aan de richel, de expressie van Shh stopt, de richel gaat in regressie, en cellen differentiëren in plaats van te delen: de lus die de groei onderhield, is verbroken. 13. $k = \ln 2/1740 = 4.0 \times 10^{-4}\,\mathrm{s}^{-1}$ ; $\lambda = \sqrt{10^{-12}/4\times 10^{-4}} = 50\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 14. $x = 50\ln(1/0.6) = 26$ , $50\ln 4 = 69$ , $50\ln 12.5 = 126\,\text{µ}\mathrm{m}$ : territoria van 26, 43 en $57\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 15. $600 - 126 = 474\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 16. Elke grens schuift met $50\ln 2 = 35\,\text{µ}\mathrm{m}$ naar buiten: 61, 104, 161; de buitengrens van het territorium van vinger 2 komt op $161\,\text{µ}\mathrm{m}$ in plaats van 126, genoeg voor een extra anterieure vinger 2. 17. Elke reeks heeft $126\,\text{µ}\mathrm{m}$ nodig: minstens $252\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; de knop van $600\,\text{µ}\mathrm{m}$ heeft ruimte, met $348\,\text{µ}\mathrm{m}$ vingervrij weefsel in het midden. 18. Bij $200\,\text{µ}\mathrm{m}$ overlappen de twee gradiënten en tellen ze op: de middelste cellen zien genoeg voor vinger 3 en de territoria van vinger 2 verdwijnen — 4-3-4 of 4-3-3-4, minder vingers dan een volledige spiegelreeks. 19. Een kwart van de cellen geeft $c_0/4$ : geen enkele cel bereikt de drempel van vinger 4 of 3 ( $0.25 c_0$ aan de rand zelf), en de drempel van vinger 2 wordt overschreden tot op $50\ln(0.25/0.08) = 57\,\text{µ}\mathrm{m}$ : één extra vinger 2. 20. $3\times 300\times 300\times 200 = 5.4\times 10^{7}$ $\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ : $5.4\times 10^{4}$ cellen; over $86\,400\,\mathrm{s}$ $0.6$ cellen per seconde. 21. Kraal met BMP in het eendenvlies: het vlies sterft af en de tenen komen los; remmer in het kuikenvlies: het vlies overleeft, een voet met zwemvliezen. 22. $e^{0.5\times 4} = e^{2} = 7.4$ . De tweede verandering is het overleven van het interdigitale membraan dankzij een BMP-remmer. 23. De late fase van Hox 13-expressie die een autopodium specificeert, en het blijven bestaan van de richel: de vinplooi van de vis maakt in plaats daarvan vinstralen. De vin van Tiktaalik bevat polsachtige botjes — een vin die een ledemaat begint te worden. 24. $5.4\times 10^{4}/1000 = 54$ : $\log_2 54 = 5.8$ verdubbelingen, ongeveer $69\,\mathrm{h}$ , drie dagen om te maken wat één dag verwijdert. 25. Acht verdubbelingen; vingergrenzen bij 26, 69 en $126\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; een verdubbeling in spiegelbeeld vraagt minstens $252\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

De ledemaatknop

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst