Universitaire biologie — jaar 2 · Bachelor Year 2

3Mutaties en diversificatie van het genoom

Strijk een miljard bacteriën uit op een plaat met een antibioticum en de volgende ochtend zijn er een handvol kolonies gegroeid. Heeft het middel die cellen geleerd het te weerstaan, of waren ze al resistent voordat ze het tegenkwamen? De vraag klinkt filosofisch en werd in 1943 beslecht door een experiment van grote elegantie: de resistente cellen waren er al vooraf, voortgebracht door mutaties die willekeurig waren opgetreden, zonder acht te slaan op hun nut. Dit hoofdstuk gaat over de bronnen van die variatie — de kopieerfouten, de chemische ongelukken, de springende genen, de genen die tussen cellen worden verhandeld, de duplicaties van genen en van hele genomen — en over hoe snel ze werken. Selectie, die de variatie sorteert, is het onderwerp van Hoofdstuk 22; hier gaat het over de herkomst van het ruwe materiaal.

3.1 Mutaties

Definitie 3.1 (Mutatie en haar soorten)

Een mutatie is een erfelijke verandering in de sequentie van het genoom. Puntmutaties veranderen één of enkele basen: een substitutie vervangt een base door een andere (een transitie verwisselt purine voor purine of pyrimidine voor pyrimidine, A $\leftrightarrow$ G of C $\leftrightarrow$ T; een transversie verwisselt de klassen); een insertie of deletie voegt basen toe of verwijdert ze. In een coderende sequentie is een substitutie stil als het nieuwe codon hetzelfde aminozuur specificeert, missense als het een ander specificeert, nonsense als het een stopcodon vormt; een insertie of deletie die geen veelvoud van drie is, verschuift het leesraam (leesraamverschuiving) en verminkt elk codon stroomafwaarts. Chromosomale herschikkingen verplaatsen grote segmenten: deletie, duplicatie, inversie, translocatie tussen chromosomen. Genoommutaties veranderen het aantal chromosomen: aneuploïdie (één chromosoom te veel of te weinig, zoals bij trisomie 21) en polyploïdie (hele extra sets). Een mutatie in een somatische cel wordt alleen door de nakomelingen van die cel geërfd; een mutatie in de kiembaan wordt door de nakomelingen van het organisme geërfd, en alleen die tellen voor de evolutie.

Puntmutaties in een korte coderende sequentie (verandering in rood). Een stille substitutie behoudt het eiwit; een missensemutatie verandert één residu; een nonsensemutatie kort het in; één ingevoegde base verschuift het leesraam en herschrijft alles stroomafwaarts.

Propositie 3.2 (Waar mutaties vandaan komen)

Drie bronnen. Replicatiefouten: DNA-polymerase plaatst ongeveer één op de $10^{5}$ basen verkeerd; zijn proefleesexonuclease verwijdert de meeste, zodat er één op de $10^{7}$ overblijft; mismatchherstel, dat de replicatievork volgt en de nieuwe streng aan de hand van de oude corrigeert, brengt de uiteindelijke foutenfrequentie op ongeveer $10^{-9}$ tot $10^{-10}$ per base per replicatie. Spontane chemie: elke dag vallen in elke menselijke cel zo’n $10\,000$ purines van hun suikers af (depurinering) en verliezen honderd cytosines een aminogroep (deaminering, waardoor C in U verandert, dat met A paart); beide worden hersteld, maar niet altijd. Mutagenen: ultraviolet licht smeedt naast elkaar liggende thymines tot dimeren; ioniserende straling breekt strengen; alkylerende stoffen en salpeterigzuur veranderen basen; intercalerende kleurstoffen schuiven tussen basenparen en veroorzaken leesraamverschuivingen; zuurstofradicalen uit de ademhaling oxideren guanine. De snelheid per base is piepklein; vermenigvuldigd met de grootte van een genoom en het aantal cellen is ze dat niet.

Stelling 3.3 (Mutaties per genoom en per populatie)

Als de mutatiesnelheid $u$ per basenpaar per replicatie is en het genoom $G$ basenparen bevat, levert elke replicatie gemiddeld $U = uG$ nieuwe mutaties op, en een populatie van $N$ cellen levert er $UN$ per generatie. Voor E. coli ( $u \approx 5 \times 10^{-10}\,$ , $G = 4.6 \times 10^{6}\,$ ): $U \approx 0.002$ , zodat één cel op de vijfhonderd een nieuwe mutatie draagt — maar een cultuur van $10^{9}$ cellen maakt er twee miljoen per generatie, en elk van de $3G \approx 1.4\times 10^{7}$ mogelijke veranderingen van één base ontstaat er om de paar generaties wel ergens in. Voor een mens ( $u \approx 1.2 \times 10^{-8}\,$ per generatie, $G = 3.2 \times 10^{9}\,$ per haploïde set, twee sets): elk kind draagt ongeveer $75$ nieuwe mutaties, waarvan één of twee in coderende sequentie.

Bewijs. Elke base wordt onafhankelijk gekopieerd met een kans $u$ op een fout, zodat het aantal fouten per genoomkopie een som is van $G$ onafhankelijke zeldzame gebeurtenissen, met gemiddelde $uG$ (en bij benadering poissonverdeeld). $N$ cellen maken $N$ kopieën. Het menselijke getal vermenigvuldigt $u$ met $2G$ voor het diploïde genoom; de snelheid per generatie geldt per generatie en niet per replicatie, omdat kiemcellen tussen de ene bevruchting en de volgende vele replicaties doormaken. ∎

Stelling 3.4 (Mutanten in een groeiende cultuur)

Een cultuur die van $N_0$ tot $N$ cellen is gegroeid, waarin een bepaalde mutatie bij elke celdeling met kans $m$ optreedt, bevat aan het eind een gemiddeld aantal mutatiegebeurtenissen $m(N - N_0)$ , en een gemiddeld aantal mutante cellen

\langle M\rangle = m\,N\,\ln\frac{N}{N_0},

groter dan het aantal gebeurtenissen, omdat een vroege mutatie een kloon sticht. Het aantal mutante cellen varieert enorm van cultuur tot cultuur (zeldzame vroege gebeurtenissen geven “jackpots”), terwijl het, als de mutaties bij het uitplaten werden geïnduceerd, een poissonverdeling zou volgen met een variantie gelijk aan het gemiddelde. De fractie culturen zonder enige mutant is $p_0 = e^{-m(N - N_0)}$ , wat $m$ rechtstreeks oplevert.

Bewijs. Groei van $n$ tot $n + \mathrm{d}n$ cellen vergt $\mathrm{d}n$ delingen, elk een gelegenheid voor de mutatie, zodat er in dat interval $m\,\mathrm{d}n$ gebeurtenissen optreden; optellen geeft in totaal $m(N - N_0)$ gebeurtenissen. Een mutatie die optreedt wanneer de cultuur $n$ cellen telt, sticht een kloon die gelijk op groeit met de cultuur en aan het eind $N/n$ cellen telt; het verwachte aantal mutante cellen is dus $\int_{N_0}^{N} m\,(N/n)\,\mathrm{d}n = mN\ln(N/N_0)$ . De gebeurtenissen zijn zeldzaam en onafhankelijk, dus is hun aantal poissonverdeeld met gemiddelde $m(N - N_0)$ , en is de kans op geen enkele $e^{-m(N - N_0)}$ . ∎

Bewijsmateriaal. Luria en Delbrück (1943) kweekten twintig kleine culturen van E. coli uit telkens enkele cellen, en namen tegelijk twintig monsters uit één grote cultuur; ze plaatten alle veertig uit met een bacteriofaag die elke gevoelige cel doodt, en telden de resistente kolonies. De monsters uit de ene cultuur gaven aantallen dicht bij hun gemiddelde, zoals een poissonverdeling voorspelt; de onafhankelijke culturen gaven aantallen van 0, 0, 1, 0, 3, 0, 107, 0, 5… — een variantie die vele malen groter was dan het gemiddelde. Mutaties naar resistentie waren op willekeurige momenten opgetreden voordat de cellen de faag tegenkwamen, en vroege mutaties hadden jackpots opgeleverd. Lederberg en Lederberg (1952) bevestigden dit zonder de geselecteerde cellen ooit aan het middel bloot te stellen: door een fluwelen stempel op een plaat te drukken en afdrukken te maken, vonden ze resistente kolonies op dezelfde posities op elke replica, en isoleerden ze die uit de onbehandelde moederplaat. ∎

De fluctuatietest. Treden mutaties (rood) willekeurig op tijdens de groei, dan hangt het aantal mutanten af van wanneer de mutatie plaatsvond, en verschillen onafhankelijke culturen sterk; als het selecterende middel ze bij het uitplaten had geïnduceerd, zou elke cultuur een vergelijkbaar klein aantal tonen. — De fluctuatietest. Treden mutaties (rood) willekeurig op tijdens de groei, dan hangt het aantal mutanten af van *wanneer* de mutatie plaatsvond, en verschillen onafhankelijke culturen sterk; als het selecterende middel ze bij het uitplaten had geïnduceerd, zou elke cultuur een vergelijkbaar klein aantal tonen.

Een antibioticumschijfje op een bacteriegazon: de heldere zone is waar het middel dat uit het schijfje diffundeert de gevoelige cellen heeft gedood, en de kolonies daarbinnen zijn gegroeid uit resistente mutanten die al aanwezig waren voordat het schijfje werd neergelegd.

Propositie 3.5 (Herstel en zijn grenzen)

Een cel corrigeert de meeste schade voordat die een mutatie wordt. Mismatchherstel verwijdert de verkeerde base uit de nieuw gemaakte streng. Base-excisieherstel knipt één beschadigde base weg (een uracil, een geoxideerd guanine) en vult het gat op; het is de reden waarom DNA thymine gebruikt in plaats van uracil: een uracil in DNA kan alleen een gedeamineerd cytosine zijn, en wordt als vreemd herkend. Nucleotide-excisieherstel verwijdert een stuk van een twaalftal basen rond een omvangrijke beschadiging zoals een thyminedimeer; mensen bij wie het ontbreekt (xeroderma pigmentosum), krijgen huidkanker door gewoon zonlicht. Recombinatieherstel bouwt een gebroken chromosoom opnieuw op aan de hand van de zusterkopie. Wat aan herstel ontsnapt, of verkeerd wordt hersteld, is een mutatie — en een cel die een herstelsysteem heeft verloren (een mutator), muteert honderd keer sneller, wat op korte termijn een voordeel is onder stress en op lange termijn een last. Herstelmechanismen worden uitgebreid behandeld in het deel van jaar 3.

3.2 Genen die bewegen

Definitie 3.6 (Transponeerbare elementen)

Een transponeerbaar element is een DNA-segment dat zich naar een nieuwe positie in het genoom kan verplaatsen. DNA-transposons coderen voor een transposase die het element uitknipt en elders inplakt (of het daar kopieert); bacteriële insertiesequenties zijn de eenvoudigste (een transposasegen tussen twee omgekeerde herhalingen), en samengestelde transposons dragen tussen twee daarvan extra genen — vaak antibioticumresistenties. Retrotransposons verplaatsen zich langs een kopiëren-en-plakkenroute via een RNA-tussenproduct, dat door een reverse transcriptase weer in DNA wordt omgeschreven; ze verlaten hun oude plaats nooit en hopen zich dus op. Een element dat in een gen belandt, verstoort het; belandt het ernaast, dan kan het de expressie ervan veranderen; twee kopieën in één chromosoom bieden plaatsen voor ongelijke crossing-over. Transposons en hun overblijfselen vormen de helft van het menselijke genoom en tachtig procent van het genoom van maïs; de meeste zijn nu onbeweeglijk.

Bewijsmateriaal. McClintock (jaren 1940–1950) bestudeerde maïskorrels waarvan het paarse pigment in sommige cellen verloren ging en in andere werd hersteld, wat gespikkelde korrels gaf. Ze toonde door kruisingen en door chromosoomwaarnemingen aan dat de instabiliteit werd veroorzaakt door een element (Dissociation) dat het chromosoom brak waar het zat en tussen posities bewoog onder controle van een tweede element (Activator), en dat een gen werd uitgeschakeld wanneer het element erin zat en weer werd geactiveerd wanneer het vertrok. Genen, concludeerde ze, konden van positie veranderen; het idee werd pas twintig jaar later aanvaard, toen bacteriële insertiesequenties werden gevonden, en leverde haar in 1983 een Nobelprijs op. ∎

Barbara McClintock, en de korrels die haar naar transponeerbare elementen leidden: een gen voor paars pigment dat door een ingevoegd element wordt uitgeschakeld en cel voor cel weer wordt aangeschakeld wanneer het element eruit springt, wat spikkels en sectoren achterlaat.

Twee manieren om te bewegen. Een DNA-transposon wordt uitgeknipt en opnieuw ingevoegd; een retrotransposon wordt getranscribeerd, weer in DNA gekopieerd en elders ingevoegd, zodat zijn kopieën zich ophopen.

Definitie 3.7 (Horizontale genoverdracht)

Prokaryoten verwerven langs drie routes genen van cellen die niet hun ouders zijn. Transformatie: een cel neemt naakt DNA op uit haar omgeving (vrijgekomen uit dode cellen) en recombineert het in haar chromosoom; sommige soorten zijn van nature competent, en langs deze route wisselen pneumokokken kapselgenen uit. Conjugatie: een donor met een conjugatief plasmide (de F-factor van E. coli) bouwt een pilus, trekt een ontvanger dichtbij en voert één streng van het plasmide door een porie, terwijl hij het volgens de rollende cirkel repliceert; als het plasmide in het chromosoom is geïntegreerd (een Hfr-stam), worden chromosomale genen in volgorde erachter overgedragen, en het moment waarop elk gen binnenkomt, brengt het chromosoom in kaart. Transductie: een bacteriofaag verpakt per vergissing een stuk gastheer-DNA en injecteert het in de volgende cel die hij infecteert. Samen verplaatsen deze routes resistentiegenen binnen enkele jaren tussen soorten in ziekenhuizen, en hebben ze over geologische tijd metabole genen over de hele bacteriële boom verplaatst, zodat de afstamming van een prokaryoot evengoed een web als een boom is (Hoofdstuk 24).

Bewijsmateriaal. Lederberg en Tatum (1946) mengden twee stammen van E. coli, die elk twee verschillende voedingsstoffen niet konden maken, en plaatten het mengsel uit op een minimaal medium waarop geen van beide alleen kon groeien: er verschenen kolonies, ongeveer één per tien miljoen cellen, die alle vier konden maken — recombinanten. Davis (1950) herhaalde het met de stammen gescheiden door een filter dat moleculen doorliet maar geen cellen: geen recombinanten, dus was contact nodig. Hayes toonde vervolgens aan dat de overdracht in één richting verliep, van een donor naar een ontvanger, en Wollman en Jacob (1956) onderbraken paringen met tussenpozen in een blender en vonden dat de genen van de donor in een vaste volgorde de ontvanger binnenkwamen, het ene na het andere, over ongeveer honderd minuten. ∎

Links: conjugatie — de donor voert één streng van zijn F-plasmide door de verbinding van de pilus terwijl hij die kopieert. Rechts: het experiment met onderbroken paring met een Hfr-donor: elk chromosomaal gen verschijnt op een kenmerkend tijdstip onder de recombinanten, wat het chromosoom in minuten in kaart brengt.

Twee bacteriën verbonden door een conjugatieve pilus, gezien met de transmissie-elektronenmicroscoop: de brug waarlangs het plasmide passeert.

Voorbeeld 3.8 (Resistentie op reis)

Een resistentiegen ontstaat doorgaans één keer, door mutatie of vanuit de bodembacterie die het antibioticum maakt, en gaat dan op reis: van een chromosoom naar een transposon, van het transposon naar een conjugatief plasmide, van het plasmide via conjugatie naar andere soorten en via transductie naar andere stammen, en via transformatie terug in een chromosoom. Plasmiden met vijf of zes resistenties tegelijk (samengebracht in integronen, die gencassettes invangen) werden in de jaren 1950 in Japan gevonden, enkele jaren nadat de middelen in gebruik kwamen; het gen voor het carbapenemase NDM-1, voor het eerst gezien in 2008, bereikte binnen drie jaar op een plasmide elk continent. De evolutie van resistentie is meestal niet de evolutie van nieuwe genen, maar de verplaatsing van oude.

3.3 Duplicatie: genen en genomen

Propositie 3.9 (Genduplicatie en genfamilies)

Wanneer twee gelijkende sequenties achter elkaar op een chromosoom liggen, kunnen de homologen bij de meiose verschoven paren en ongelijk overkruisen, zodat het ene product drie kopieën draagt en het andere één. Een gedupliceerd gen is overbodig: de ene kopie kan de oude taak blijven vervullen terwijl de andere vrij mutaties opstapelt — meestal vervalt die tot een pseudogen, soms verwerft ze een nieuwe functie (neofunctionalisatie) of een deel van de oude (subfunctionalisatie). Herhaald over honderden miljoenen jaren bouwt dit genfamilies op: de globines (één voorouderlijk gen werd myoglobine, de $\alpha$ -cluster en de $\beta$ -cluster, met embryonale, foetale en volwassen leden die na elkaar tot expressie komen), de geurreceptoren (duizend genen bij een muis), de homeoboxgenen, de kristallines van de lens. De meeste genen van een genoom behoren tot een familie, en duplicatie is de belangrijkste bron van nieuwe genen.

Bewijsmateriaal. De menselijke $\beta$ -globinecluster op chromosoom 11 bevat vijf functionele genen ( $\varepsilon$ , $^{G}\gamma$ , $^{A}\gamma$ , $\delta$ , $\beta$ ) en een pseudogen, in de volgorde waarin ze tijdens de ontwikkeling worden aangeschakeld, alle met dezelfde exon-intronstructuur, en met sequenties die meer op elkaar lijken naarmate ze recenter zijn uiteengegaan; de $\alpha$ -cluster op chromosoom 16 heeft dezelfde architectuur. Deleties van één of meer $\alpha$ -genen, ontstaan door ongelijke crossing-over tussen de bijna identieke kopieën, komen vaak voor en veroorzaken $\alpha$ -thalassemie; het wederkerige product, een chromosoom met drie $\alpha$ -genen, wordt in dezelfde populaties aangetroffen. ∎

Boven: ongelijke crossing-over tussen verschoven gepaarde tandemkopieën levert een chromosoom met drie kopieën en een met één kopie. Onder: de globinefamilie, opgebouwd door opeenvolgende duplicaties en divergentie.

Definitie 3.10 (Polyploïdie)

Een polyploïd draagt meer dan twee volledige chromosoomsets. Een autopolyploïd heeft meerdere sets van één soort (een mislukte meiose geeft een diploïde gameet; twee zulke gameten geven een tetraploïd); een allopolyploïd combineert de sets van twee soorten na een hybridisatie. De diploïde hybride AB, zonder homoloog voor welk chromosoom ook, kan ze bij de meiose niet paren en is steriel; verdubbelt haar genoom tot AABB, dan heeft elk chromosoom weer een partner, werkt de meiose, en is de nieuwe plant vruchtbaar — maar kan ze niet terugkruisen met een van beide ouders (een nakomeling AAB is steriel). Polyploïdie maakt zo in één stap een nieuwe soort, en ongeveer een derde van de soorten bloemplanten is zo ontstaan: broodtarwe is een hexaploïde AABBDD van drie grassen, de tuinaardbei een octoploïde, katoen en tabak zijn allotetraploïden, en de lijn van de gewervelden heeft zelf nabij haar oorsprong tweemaal haar genoom verdubbeld. Polyploïden zijn meestal groter dan hun diploïde voorouders (meer DNA, grotere cellen) en zeer gewild bij veredelaars.

De oorsprong van broodtarwe: twee hybridisaties, elk gevolgd door een verdubbeling van het genoom, bouwden in ongeveer tienduizend jaar een hexaploïde uit drie diploïde grassen.

Een wilde diploïde aardbei en de gekweekte octoploïde: de polyploïde, met vier keer zoveel DNA in elke cel, is de grotere plant met de grotere vrucht.

3.4 Toeval en snelheid

Propositie 3.11 (Mutatie is willekeurig ten opzichte van de behoefte)

De fluctuatietest en het replicaplaten tonen aan dat een mutatie die in een nieuwe omgeving nuttig is, met dezelfde snelheid ontstaat of die omgeving nu aanwezig is of niet: de omgeving selecteert tussen mutaties, ze roept ze niet op. Mutatie is niet in elke zin willekeurig — transities zijn talrijker dan transversies, CpG-dinucleotiden muteren tien keer sneller dan andere plaatsen (hun gemethyleerde cytosine deamineert tot thymine, dat het herstel niet als vreemd herkent), sommige gebieden zijn hotspots, en stress kan de algehele snelheid verhogen — maar ze is blind voor de gevolgen. De mutatiesnelheid zelf is een erfelijke eigenschap, en selectie stelt haar bij: te hoog, en elke generatie erft schadelijke veranderingen; te laag, en de populatie kan een veranderende wereld niet volgen. Mutatorstammen winnen kortstondig in een ziekenhuis en verliezen op den duur, en de snelheid van $10^{-9}$ per base waarop de meeste cellen uitkomen, is een compromis tussen de kosten van fouten en de kosten van proeflezen.

3.5 Opgaven

Oefening 3.1 ★

Deel elke verandering van het codon GAA (glutamaat) in: GAG; GTA; TAA; insertie van een C na de eerste base. Welke is een transitie, welke een transversie?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.1.

GAG: stil (nog steeds glutamaat), een transitie (A $\to$ G). GTA: missense (valine), een transversie (A $\to$ T). TAA: nonsense (stop), een transversie (G $\to$ T). Invoegen van een base: een leesraamverschuiving, die elk volgend codon herschrijft.

Oefening 3.2 ★

Met $u = 5 \times 10^{-10}\,$ per basenpaar per replicatie en $G = 4.6 \times 10^{6}\,$ : hoeveel nieuwe mutaties levert één deling van E. coli gemiddeld op? Hoeveel per generatie in een cultuur van $10^{9}$ cellen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.2.

$U = 5\times 10^{-10}\times 4.6\times 10^{6} = 2.3\times 10^{-3}$ : één deling op ongeveer 430 levert een mutatie op. In $10^{9}$ cellen: $2.3\times 10^{6}$ nieuwe mutaties per generatie.

Oefening 3.3 ★

Noem de drie routes van horizontale genoverdracht en zeg bij elk wat ze vereist (contact, een virus, vrij DNA) en wat ze doorgaans overdraagt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.3.

Transformatie: opname van vrij DNA uit gelyseerde cellen, vereist een competente ontvanger; draagt chromosoomfragmenten over (kapselgenen bij pneumokokken). Conjugatie: contact van cel tot cel via een pilus, vereist een conjugatief plasmide in de donor; draagt plasmiden over (resistentiegenen) en, vanuit een Hfr-stam, chromosomale genen. Transductie: een bacteriofaag die gastheer-DNA heeft verpakt; draagt een willekeurig fragment over (gegeneraliseerd) of de genen naast de plaats van de profaag (gespecialiseerd).

Oefening 3.4 ★

Onderscheid autopolyploïdie van allopolyploïdie, met een voorbeeld van elk, en leg uit waarom een diploïde hybride van twee soorten meestal steriel is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.4.

Autopolyploïd: extra sets van één soort, via een diploïde gameet (tetraploïde aardappel, veel autotetraploïde klavers). Allopolyploïd: de sets van twee soorten, gecombineerd door hybridisatie en daarna verdubbeld (broodtarwe, katoen, tabak). De diploïde hybride AB heeft geen twee gelijke chromosomen, dus kan geen enkel chromosoom bij meiose I paren; de chromosomen segregeren willekeurig en de gameten zijn ongebalanceerd en niet levensvatbaar.

Oefening 3.5 ★★

Een menselijke kiembaan stapelt $u = 1.2 \times 10^{-8}\,$ mutaties per basenpaar per generatie op over een haploïd genoom van $3.2 \times 10^{9}\,$ basenparen. Hoeveel nieuwe mutaties draagt een kind? Als $1.5\,\%$ van het genoom voor eiwit codeert en $70\,\%$ van de coderende substituties een aminozuur verandert, hoeveel nieuwe aminozuurveranderingen draagt het kind dan?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.5.

$2\times 3.2\times 10^{9}\times 1.2\times 10^{-8} = 77$ nieuwe mutaties. In coderende sequentie: $77\times 0.015 = 1.2$ ; met verandering van een aminozuur: $1.2\times 0.7 = 0.8$ — de meeste kinderen dragen ongeveer één nieuwe aminozuursubstitutie.

Oefening 3.6 ★★

Een cultuur groeit van $10^{3}$ tot $10^{9}$ cellen; een bepaalde mutatie treedt op met $m = 2 \times 10^{-8}\,$ per deling. Bereken het verwachte aantal mutatiegebeurtenissen en mutante cellen. Waarom is de fractie culturen zonder mutant hier onbruikbaar om $m$ te meten, en welke grootte van de cultuur zou haar bruikbaar maken?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.6.

Gebeurtenissen: $m(N - N_0) = 2\times 10^{-8}\times 10^{9} = 20$ . Mutante cellen: $mN\ln(N/N_0) = 20\times \ln 10^{6} = 20\times 13.8 = 276$ . $p_0 = e^{-20} \approx 2\times 10^{-9}$ : elke cultuur heeft mutanten, dus het tellen van culturen zonder mutant meet niets. Men heeft $m(N - N_0) \approx 1$ nodig, d.w.z. $N \approx 5\times 10^{7}$ , waarbij $p_0 \approx 0.37$ en enkele tientallen culturen $m$ tot op een factor twee geven.

Oefening 3.7 ★★

Cytosine deamineert tot uracil; 5-methylcytosine deamineert tot thymine. Leg uit waarom het eerste efficiënt wordt hersteld en het tweede niet, en leid af waarom CpG-plaatsen (waar cytosine gemethyleerd is) mutatiehotspots zijn en zeldzamer in het genoom dan het toeval zou voorspellen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.7.

Uracil hoort niet in DNA thuis, dus kan een uracil-DNA-glycosylase elk uracil dat het vindt zonder dubbelzinnigheid verwijderen. Thymine is een normale base: nadat 5-methylcytosine is gedeamineerd, wordt de G $\cdot$ T-mismatch wel gezien, maar de herstelmachinerie kan niet weten welke streng fout is en “corrigeert” de helft van de tijd de G, waardoor een C $\to$ T-transitie wordt vastgelegd. Gemethyleerde CpG-plaatsen muteren daardoor ongeveer tien keer sneller dan andere plaatsen, en in de loop van de evolutie zijn ze omgezet in TpG en CpA: genomen van zoogdieren bevatten slechts ongeveer een vijfde van het CpG dat de basensamenstelling voorspelt.

Oefening 3.8 ★★

In een experiment met onderbroken paring komen vier genen de ontvanger binnen na 8, 17, 25 en $40\,\mathrm{min}$ ; het hele chromosoom ( $4.6\,\mathrm{Mb}$ ) zou $100\,\mathrm{min}$ vergen. Zet de tijden om in posities in kilobasen en bereken de afstanden tussen opeenvolgende genen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.8.

$46\,\mathrm{kb}$ per minuut. Posities: 368, 782, 1150 en $1840\,\mathrm{kb}$ ; afstanden 414, 368 en $690\,\mathrm{kb}$ .

Oefening 3.9 ★★

Teken de paring en de crossing-over die van twee chromosomen met elk twee tandemgenen voor $\alpha$ -globine er één met drie en één met één maken. Iemand erft van elke ouder een chromosoom met één gen: hoeveel $\alpha$ -genen heeft die persoon, en wat valt er van zijn hemoglobine te verwachten?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.9.

De tweede kopie van het ene chromosoom paart met de eerste kopie van het andere; een crossing-over tussen beide levert één chromatide met kopie 1, kopie 2 en kopie 2 $'$ (drie genen) en één met alleen kopie 1 $'$ . Iemand met van elke ouder een chromosoom met één gen heeft twee $\alpha$ -genen in plaats van vier ( $-\alpha/-\alpha$ ): $\alpha$ -ketens worden op halve snelheid gemaakt, de rode bloedcellen zijn klein en bleek, met milde of geen bloedarmoede — dragerschap van $\alpha$ -thalassemie.

Oefening 3.10 ★★★

Broodtarwe is AABBDD met $2n = 42$ . Geef het chromosoomaantal van haar gameten, van de steriele hybriden bij elke stap van haar ontstaan, en van een kruising tussen broodtarwe en emmertarwe (AABB). Leg in termen van meiotische paring uit waarom elke verdubbeling de vruchtbaarheid herstelde en waarom de hexaploïde niet met haar ouders kan terugkruisen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.10.

Gameten: $n = 21$ (één set elk van A, B, D). Hybriden: AB, 14 chromosomen; ABD, 21. Broodtarwe $\times$ emmertarwe: AABBD, 35 chromosomen — de sets A en B paren, de set D heeft geen partners, en de plant is grotendeels steriel. Elke verdubbeling gaf elk chromosoom een identieke homoloog, zodat bivalenten ontstaan en de gameten gebalanceerd zijn; terugkruisen met een ouder levert planten met één ongepaarde set, waarvan de gameten ongebalanceerd zijn, zodat de hexaploïde reproductief geïsoleerd is van haar voorouders — een soort in één stap.

Oefening 3.11 ★★★

In een darmpopulatie van $N = 10^{9}$ bacteriën verspreidt een resistentieplasmide zich via conjugatie met een snelheid die evenredig is met de ontmoetingen tussen dragers $R$ en niet-dragers $N - R$ : $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma R (N - R)$ met $\gamma N = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ . Los op, uitgaande van één drager, en bereken de tijd tot de helft van de populatie het plasmide draagt. Wat gebeurt er als het antibioticum daarna wordt stopgezet en het plasmide zijn gastheer $5\,\%$ aan groeisnelheid kost?

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.11.

Logistische groei: $R(t) = N/\bigl(1 + (N - 1)e^{-\gamma Nt}\bigr)$ . De helft van de populatie wanneer $(N - 1)e^{-\gamma Nt} = 1$ : $t = \ln(N - 1)/\gamma N = 20.7/0.5 = 41\,\mathrm{h}$ . Zonder het antibioticum groeien plasmidevrije cellen $5\,\%$ sneller, zodat de verhouding van dragers tot niet-dragers afneemt als $e^{-st}$ met $s = 0.05\ln 2 = 0.035\,\mathrm{h}^{-1}$ (generatietijd $1\,\mathrm{h}$ ): van $99\,\%$ naar $1\,\%$ duurt $\ln(99^2)/0.035 = 260\,\mathrm{h}$ , elf dagen — en voortdurende overdracht kan het plasmide onbeperkt op een lage frequentie houden, klaar voor de volgende kuur met het middel.

Oefening 3.12 ★★★

“Mutatie is willekeurig; evolutie niet.” Bespreek dit aan de hand van de fluctuatietest, het replicaplaten en het feit dat de mutatiesnelheid zelf aan selectie onderhevig is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 3.12.

De fluctuatietest toonde aan dat resistentiemutaties vóór en zonder het selecterende middel ontstaan, op willekeurige momenten, zodat mutatie blind is voor wat nuttig zou zijn; het replicaplaten toonde hetzelfde zonder de geselecteerde cellen ook maar bloot te stellen. Evolutie is niet willekeurig, omdat selectie deze blinde varianten consequent en cumulatief naar hun gevolgen sorteert. De enige plaats waar het toeval zelf wordt gevormd, is de snelheid: lijnen met te veel of te weinig fouten verliezen, zodat de mutatiesnelheid een aangepast compromis is — maar wat elke mutatie doet, blijft onvoorspelbaar en ongekozen.

3.6 Vraagstuk: een fluctuatietest

Probleem 3.1

Weekendvraagstuk — een fluctuatietest wordt uitgevoerd en geanalyseerd, de mutatiesnelheid van een stam eruit afgeleid en opgeschaald naar haar genoom en haar populatie, de verspreiding van een resistentieplasmide gemodelleerd en de kosten van een mutator gewogen, met als besluit de mutatiesnelheid van de stam per base en de tijd die het plasmide nodig heeft om de overhand te krijgen

Twintig culturen van E. coli worden elk gestart met $100$ cellen in $0.2\,\mathrm{mL}$ en gekweekt tot $N = 2 \times 10^{8}\,$ cellen; elke cultuur wordt dan uitgestreken op een plaat met een bacteriofaag, en de resistente kolonies worden geteld: 0, 0, 0, 1, 0, 0, 3, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 107, 0, 2, 0, 0, 5. Tegelijk worden twintig monsters van $0.2\,\mathrm{mL}$ genomen uit één grote cultuur met dezelfde dichtheid en op dezelfde manier uitgeplaat: 14, 15, 13, 21, 15, 14, 26, 16, 20, 13, 17, 12, 18, 14, 16, 19, 15, 13, 17, 16. Genoom: $4.6 \times 10^{6}\,$ basenparen, $88\,\%$ coderend. Resistentie tegen de faag kan ontstaan door elk van $20$ verschillende veranderingen van één base in één receptorgen.

Deel I — De test.

Bereken het gemiddelde en de variantie van de twintig onafhankelijke culturen.
Bereken het gemiddelde en de variantie van de twintig monsters.
Bij een poissonverdeling is de variantie gelijk aan het gemiddelde. Welke reeks is poissonverdeeld, en wat zegt de verdeling van elke reeks over wanneer de mutaties optraden?
Verklaar het aantal van 107.
Hoeveel van de onafhankelijke culturen bevatten geen mutant? Gebruik $p_0 = e^{-m(N - N_0)}$ om $m$ te schatten, de mutatiesnelheid naar resistentie per celdeling.
Bereken het verwachte aantal mutante cellen per cultuur met $mN\ln(N/N_0)$ en vergelijk met het waargenomen gemiddelde.
Waarom zouden de monsters uit de ene cultuur onbruikbaar zijn geweest om $m$ met de $p_0$ -methode te schatten?

Deel II — Opschalen naar het genoom.

Leid de mutatiesnelheid $u$ per basenpaar per replicatie af uit $m$ en het aantal veranderingen dat resistentie geeft.
Bereken het gemiddelde aantal nieuwe mutaties per genoom per replicatie, $U$ .
Een cultuur van één liter met $10^{9}$ cellen per milliliter verdubbelt één keer. Hoeveel nieuwe mutaties ontstaan er in de populatie?
Hoeveel verschillende veranderingen van één base zijn er in dit genoom mogelijk? Hoe vaak ontstaat elk ervan gemiddeld in die ene verdubbeling?
Leg uit waarom in zo’n populatie resistentie tegen elk afzonderlijk antibioticum dat door één mutatie te verslaan is, vrijwel zeker aanwezig is.
Leg met een getal uit waarom een combinatie van twee antibiotica die twee onafhankelijke mutaties vergt, dit verandert.

Deel III — Een plasmide verspreidt zich. In een darm met $N = 10^{9}$ cellen verwerft één cel een conjugatief resistentieplasmide. Dragers $R$ geven het bij contact door: $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma R(N - R)$ , met $\gamma N = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Toon aan dat $R(t) = N/\bigl(1 + (N - 1)e^{-\gamma N t}\bigr)$ de vergelijking oplost met $R(0) = 1$ .
Bereken het tijdstip waarop de helft van de cellen het plasmide draagt.
Bereken het tijdstip waarop $99\,\%$ het draagt.
Hoeveel conjugatiegebeurtenissen per uur vinden er plaats op het moment dat de helft van de cellen drager is?
Vergelijk met de tijd die een resistente mutant nodig heeft om de helft van de populatie te bereiken door onder het antibioticum $10\,\%$ sneller te groeien dan de rest (generatietijd $1\,\mathrm{h}$ voor de gevoelige cellen): hoelang duurt dat, uitgaande van één cel?
Trek een conclusie over waarom resistentie zich vooral door overdracht verspreidt en niet door afstamming.

Deel IV — Een mutator. Een stam zonder mismatchherstel muteert $100$ keer sneller. Neem aan dat $30\,\%$ van de mutaties in coderende sequentie schadelijk is.

Bereken zijn $U$ en het gemiddelde aantal schadelijke mutaties per cel per generatie.
Welk deel van de nakomelingen van een lijn draagt na $200$ generaties helemaal geen schadelijke mutatie (Poisson)?
Bereken hetzelfde voor het wildtype.
Welk gemiddeld aantal zou de mutator in de bovenstaande fluctuatietest hebben gegeven, en welke fractie culturen zonder mutant?
Leg in twee zinnen uit waarom mutators onder ziekenhuisisolaten worden gevonden en in de natuur zeldzaam zijn.
Formuleer het resultaat: $m$ , $u$ , $U$ voor de stam, en de tijden waarin het plasmide de helft en $99\,\%$ van de darm bereikt.

Oplossing

Oplossing van Probleem 3.1.

1. Som 119, gemiddelde $5.95$ ; gemiddelde van de kwadraten $11489/20 = 574$ ; variantie $574 - 35 = 540$ . 2. Som 324, gemiddelde $16.2$ ; gemiddelde van de kwadraten $5462/20 = 273$ ; variantie $273 - 262 = 11$ . 3. De monsters uit één cultuur zijn poissonverdeeld (variantie dicht bij het gemiddelde): het zijn willekeurige trekkingen uit één vaste mutantfractie. De onafhankelijke culturen hebben een variantie die negentig keer het gemiddelde is: hun mutanten ontstonden op verschillende, willekeurige momenten tijdens de groei, en hoe vroeger de mutatie, hoe groter haar kloon. 4. Een jackpot: een mutatie in een van de eerste delingen, waarvan de kloon daarna met de cultuur meegroeide tot honderd cellen. 5. Veertien van de twintig: $p_0 = 0.70$ ; $m(N - N_0) = -\ln 0.70 = 0.36$ ; $m = 0.36/2\times 10^{8} = 1.8 \times 10^{-9}\,$ per deling. 6. $1.8\times 10^{-9}\times 2\times 10^{8}\times \ln(2\times 10^{6}) = 0.36\times 14.5 = 5.2$ mutante cellen; waargenomen $5.95$ — overeenstemming binnen de ruis van twintig culturen. 7. Geen enkel monster was leeg (alle delen de mutanten van de moedercultuur), dus geeft $p_0 = 0$ geen schatting; de monsters meten de mutantfractie van één cultuur, die afhangt van het toevallige moment waarop haar mutaties optraden. 8. $u = m/20 = 9 \times 10^{-11}\,$ per basenpaar per replicatie. 9. $U = 9\times 10^{-11}\times 4.6\times 10^{6} = 4.1 \times 10^{-4}\,$ . 10. $10^{12}$ cellen $\times$ $4.1\times 10^{-4}$ $= 4.1\times 10^{8}$ nieuwe mutaties. 11. $3\times 4.6\times 10^{6} = 1.4\times 10^{7}$ mogelijke veranderingen; elk ontstaat $4.1\times 10^{8}/1.4\times 10^{7} \approx 30$ keer. 12. Elke verandering van één base, ook elke verandering die resistentie geeft tegen een middel dat door één mutatie wordt verslagen, is al in tientallen cellen aanwezig voordat het middel wordt toegevoegd; het middel selecteert ze alleen. 13. Twee onafhankelijke mutaties in dezelfde cel treden op met $m^2 \approx (2\times 10^{-9})^2 = 4\times 10^{-18}$ per deling: in $10^{12}$ cellen $4\times 10^{-6}$ per generatie — een dubbel resistente cel bestaat vrijwel nooit vooraf, en daarom wordt tuberculose met meerdere middelen tegelijk behandeld. 14. Met $a = N - 1$ en $E = e^{-\gamma Nt}$ : $R = N/(1 + aE)$ , $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma N\cdot NaE/(1 + aE)^2$ ; en $\gamma R(N - R) = \gamma\,\frac{N}{1 + aE}\cdot\frac{NaE}{1 + aE}$ , hetzelfde; $R(0) = N/(1 + N - 1) = 1$ . 15. $(N - 1)E = 1$ : $t = \ln(N - 1)/\gamma N = 20.7/0.5 = 41\,\mathrm{h}$ . 16. $1 + aE = 1/0.99$ , $aE = 0.0101$ : $t = \ln(10^{9}/0.0101) /0.5 = (20.7 + 4.6)/0.5 = 51\,\mathrm{h}$ . 17. $\gamma (N/2)^2 = \gamma N\cdot N/4 = 0.5\times 2.5\times 10^{8} = 1.25\times 10^{8}$ overdrachten per uur. 18. Groeisnelheden $\ln 2 = 0.693\,\mathrm{h}^{-1}$ en $0.762\,\mathrm{h}^{-1}$ ; de verhouding mutant/gevoelig groeit als $e^{st}$ met $s = 0.069\,\mathrm{h}^{-1}$ ; van $1/N$ naar 1 duurt $\ln N/s = 20.7/0.069 = 300\,\mathrm{h}$ , twaalf dagen. 19. Overdracht is evenredig met het product van dragers en niet-dragers en verloopt in het tempo van de ontmoetingen, niet van de delingen; afstamming wordt beperkt door het groeivoordeel van de mutant, dat klein is. Een plasmide doorkruist de populatie in twee dagen, een bevoordeelde mutant in twee weken. 20. $U = 4.1\times 10^{-2}$ ; schadelijk: $0.041\times 0.88\times 0.3 = 0.011$ per generatie. 21. Gemiddelde $2.2$ : $e^{-2.2} = 0.11$ , één nakomeling op negen ongeschonden. 22. Wildtype: $1.1\times 10^{-4}$ per generatie, $0.022$ in 200: $e^{-0.022} = 0.98$ . 23. Gemiddeld $520$ mutante cellen; $p_0 = e^{-36} \approx 10^{-16}$ : geen enkele lege cultuur. 24. Onder intense, wisselende selectie (de roterende antibiotica van een ziekenhuis) weegt het honderdvoudige aanbod aan nieuwe varianten op tegen de last, en liften mutators mee met de resistenties die ze voortbrengen. In een stabiele omgeving valt er niets te winnen en per honderd generaties één schadelijke mutatie te verliezen, zodat mutatorlijnen worden weggeselecteerd. 25. $m = 1.8 \times 10^{-9}\,$ per deling naar resistentie, $u = 9 \times 10^{-11}\,$ per basenpaar per replicatie, $U = 4.1 \times 10^{-4}\,$ mutaties per genoom per replicatie; het plasmide bereikt de helft van de darm in $41\,\mathrm{h}$ en $99\,\%$ ervan in $51\,\mathrm{h}$ .

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst