31الكروماتوغرافيا

قطرة من مشروب طاقة، مخففة ومرشحة، تُحقن في أنبوب فولاذي لا يزيد طوله على طول قلم، ومحشو بحبيبات سيليكا قطرها بضعة ميكرومترات. وبعد دقائق قليلة يكون الكاشف قد رسم خطًا فيه عدد قليل من القمم، ومن مساحة إحداها يعلن المختبر كمية الكافيين التي تحويها العلبة، بدقة بضعة بالمئة. وتفصل الكروماتوغرافيا مكونات خليط بجعلها تتسابق عبر عمود بسرعات مختلفة؛ ويفسر هذا الفصل لماذا تسير بسرعات مختلفة، ولماذا يكون لقممها العرض الذي لها، وكيف يُفصل مكوّنان متجاوران، وكيف تتحول القمة إلى كمية.

ما تعرفه من قبل

المجلد المدرسي: الكروماتوغرافيا الورقية والكروماتوغرافيا على طبقة رقيقة، والكروماتوغرام، والمُزيح. ومجلد السنة الأولى: معامل التوزيع، والاستخلاص سائل–سائل، ومعامل الاحتجاز $R_f$ لصفيحة الطبقة الرقيقة. والفصل 7: الطبق النظري لعمود التقطير.

31.1 المبدأ

تعريف 31.1 (الكروماتوغرافيا)

الكروماتوغرافيا تفصل مكونات خليط بتوزيعها بين طور ثابت، مثبت في عمود أو على صفيحة، وطور متحرك، غاز أو سائل يجري بمحاذاته. وحمل المكونات عبر العمود وإخراجها منه بالطور المتحرك هو الإزاحة.

لا يتحرك الجزيء إلا ما دام في الطور المتحرك؛ وحين يمسكه الطور الثابت ينتظر. وهو ينتقل بين الطورين ملايين المرات في طريقه، فتتحدد سرعته المتوسطة بكسر الزمن الذي يقضيه في كل منهما، أي بتوازن توزعه.

تعريف 31.2 (الاحتجاز)

زمن الاحتجاز $t_R$ لمركب هو الزمن من الحقن حتى قمة ذروته؛ والزمن الميت $t_M$ هو زمن الاحتجاز لمركب غير محتجز، لا يدخل الطور الثابت أبدًا. ومعامل الاحتجاز $k$ لمركب على عمود هو

$$k = \frac{t_R - t_M}{t_M}.$$

وهو ليس $R_f$ لصفيحة الطبقة الرقيقة، الذي يقيس مسافة مقطوعة، وإن كان كلاهما يصف التوزع نفسه.

قضية 31.3 (زمن الاحتجاز)

إذا كانت كميتا مركب في الطورين الثابت والمتحرك لشريحة من العمود عند التوازن $n_s$ و$n_m$، فإن المركب يتحرك بالسرعة $u/(1 + n_s/n_m)$، حيث $u$ سرعة الطور المتحرك، و$t_R = t_M(1 + n_s/n_m)$.

قضية 31.4 (الاحتجاز والتوزع)

معامل الاحتجاز هو نسبة الكميتين في الطورين، $k = n_s/n_m = KV_s/V_m$، حيث $K$ معامل التوزع (التركيز في الطور الثابت على التركيز في الطور المتحرك) و$V_s$، $V_m$ حجما الطورين في العمود.

ينفصل مركبان إذا اختلف معاملا توزعهما؛ أما هندسة العمود ($V_s/V_m$) فتضرب كل الاحتجازات بالعامل نفسه. وتغيير الطور المتحرك، الذي يغيّر $K$، هو الرافعة الرئيسية للكيميائي على الاحتجاز.

31.2 عرض القمة وعدد الأطباق

لا يبقى النطاق رقيقًا. فجزيئات المركب نفسه تسلك مسارات مختلفة بين الحبيبات، وتنتشر على طول العمود وتتأخر في الطور الثابت بمقادير عشوائية. والقمة المسجلة عند المخرج دالة غاوس تقريبًا انحرافها المعياري $\sigma_t$ (زمنًا)، وكلما كانت أضيق من أجل $t_R$ معطاة، كان العمود أفضل.

تعريف 31.5 (عدد الأطباق)

عدد الأطباق لعمود بالنسبة إلى مركب هو $N = (t_R/\sigma_t)^2$، حيث $\sigma_t$ الانحراف المعياري لقمته زمنًا. وارتفاع الطبق هو $H = L/N$، لعمود طوله $L$.

تأتي التسميات من عمود التقطير في الفصل 7: فالعمود الكروماتوغرافي يسلك كما لو كان كومة من $N$ مرحلة توازن، ارتفاع كل منها $H$. والتشبيه طريقة في العدّ، لا صورة للعمود.

قضية 31.6 (عدد الأطباق من قمة)

مع $w$ العرض عند القاعدة بين المماسين عند نقطتي الانعطاف و$w_{1/2}$ العرض عند منتصف الارتفاع،

$$N = 16\left(\frac{t_R}{w}\right)^2 = 5.54\left(\frac{t_R}{w_{1/2}}\right)^2.$$

قضية 31.7 (معادلة فان ديمتر)

يتعلق ارتفاع الطبق بالسرعة الخطية $u$ للطور المتحرك وفق

$$H = A + \frac{B}{u} + Cu,$$

حيث يعبّر $A$ عن اختلاف المسارات عبر الحشوة، و$B/u$ عن الانتشار على طول العمود (أسوأ حين تمكث الجزيئات أطول) و$Cu$ عن بطء التبادل مع الطور الثابت (أسوأ حين يسرع الطور المتحرك بمحاذاته). ويكون $H$ أصغر ما يمكن عند $u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{B/C}$، حيث $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$.

شكل المعادلة مقبول هنا؛ أما قيمتها الصغرى فلا. فالمشتق $\mathrm dH/\mathrm du = -B/u^2 + C$ ينعدم عند $u = \sqrt{B/C}$، وهناك $B/u = Cu = \sqrt{BC}$، إذن $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$؛ والمشتق الثاني $2B/u^3$ موجب، فهذه قيمة صغرى. والحبيبات الصغيرة تخفض $A$ و$C$: ولهذا تستعمل الكروماتوغرافيا السائلة الحديثة جسيمات من بضعة ميكرومترات وضغوطًا مرتفعة لدفع الطور المتحرك عبرها.

31.3 فصل مركبين

تعريف 31.8 (الانتقائية والميز)

من أجل قمتين متجاورتين مع $k_2 > k_1$، يكون معامل الانتقائية $\alpha = k_2/k_1$، والميز هو

$$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_1 + w_2},$$

أي المسافة بين القمتين مقسومة على متوسط عرضيهما عند القاعدة.

عند $R_s = 1$ تبقى القمتان متداخلتين على نحو مرئي؛ وعند $R_s = 1.5$ تعود الإشارة إلى خط الأساس بينهما (فصل حتى خط الأساس)، وهو الهدف المعتاد في العمل الكمي.

مبرهنة 31.9 (معادلة الميز)

من أجل قمتين متجاورتين لهما عدد الأطباق نفسه $N$،

$$R_s = \frac{\sqrt N}{4}\,\frac{\alpha - 1}{\alpha}\,\frac{k_2}{1 + k_2}.$$

طريقة 31.10 (تحسين الميز)

1. الكفاءة: $R_s \propto \sqrt N$. ومضاعفة طول العمود تضاعف $N$ وزمن التحليل لكنها لا تضرب $R_s$ إلا في $\sqrt2 \approx 1.41$؛ والجسيمات الأصغر أو معدل التدفق الأمثل يرفعان $N$ عند طول ثابت.
2. الانتقائية: العامل $(\alpha - 1)/\alpha$ هو الأشد حساسية. غيّر الطور المتحرك (المذيب، pH)، أو الطور الثابت أو، في كروماتوغرافيا الغاز، درجة الحرارة.
3. الاحتجاز: يرتفع $k_2/(1+k_2)$ بحدة حتى $k \approx 2$ ثم ببطء بعد ذلك، بينما يواصل الزمن نموه بمقدار $1 + k$؛ فاستهدف $k$ بين نحو 2 و10.

31.4 التقنيات

تعريف 31.11 (التقنيات الكروماتوغرافية)

في كروماتوغرافيا الغاز (GC)، يكون الطور المتحرك غازًا (الهيليوم، أو الهيدروجين أو النيتروجين) والطور الثابت غشاءً سائلًا يكسو داخل عمود شعري طويل، محفوظ في فرن. وفي الكروماتوغرافيا السائلة العالية الأداء (HPLC)، تدفع مضخة طورًا متحركًا سائلًا عبر عمود قصير محشو بجسيمات صغيرة. وفي HPLC بالطور المعكوس، يكون الطور الثابت غير قطبي (سيليكا تحمل سلاسل ألكيلية طويلة) والطور المتحرك خليطًا قطبيًا من الماء مع الميثانول أو الأسيتونتريل. وفي الإزاحة المتدرجة، يُغيَّر تركيب الطور المتحرك أثناء التشغيل، في الكروماتوغرافيا السائلة، لإزاحة المركبات الشديدة الاحتجاز أسرع.

يتحدد الاختيار بينهما بالتطاير. إذ تحتاج GC إلى مركبات تتبخر دون أن تتفكك، أي تقريبًا دون $400{}^{\circ}\mathrm{C}$: المذيبات، والوقود، والعطور، والجزيئات العضوية الصغيرة. ورفع درجة حرارة الفرن أثناء التشغيل (منحدر حراري) يزيح المركبات الأثقل أسرع، كما يفعل التدرج في HPLC. أما HPLC فتعالج كل ما يذوب، بما في ذلك الأملاح والسكريات والأدوية والبروتينات. وفي الطور المعكوس تخرج المركبات الأشد قطبية أولًا والأقل قطبية أخيرًا؛ وإضافة مزيد من المذيب العضوي إلى الطور المتحرك تخفض كل الاحتجازات. والكروماتوغرافيا العمودية التحضيرية، ونسختها الأسرع، الكروماتوغرافيا الومضية، تطبقان المبدأ نفسه على نطاق واسع لتنقية غرامات من الناتج، عادة على سيليكا قطبية بخلائط من الهكسان وإيثانوات الإيثيل.

31.5 التحليل الكمي

مساحة القمة متناسبة مع كمية المركب التي بلغت الكاشف، لكن ثابت التناسب يتعلق بالمركب وبالكاشف. والحجوم المحقونة، التي هي من رتبة الميكرولتر، ليست قابلة للتكرار تمامًا. والمعيار الداخلي يزيل الصعوبتين كلتيهما.

تعريف 31.12 (معامل الاستجابة والمعيار الداخلي)

المعيار الداخلي مركب، غائب عن العينة، يُضاف بكمية معلومة إلى كل محلول يُحلَّل؛ ويجب أن يكون مفصولًا عن كل القمم الأخرى وأن يسلك سلوك المادة المحللة. ومعامل الاستجابة $F$ للمادة المحللة بالنسبة إلى المعيار الداخلي يُعرَّف بالعلاقة

$$\frac{A_X}{A_{IS}} = F\,\frac{c_X}{c_{IS}},$$

حيث $A$ مساحات القمم و$c$ التراكيز في المحلول المحقون.

قضية 31.13 (التقدير الكمي بالمعيار الداخلي)

$F$ المقيس على محلول معايرة معلوم $c_X$ و$c_{IS}$ يعطي، من أجل عينة أُضيف إليها المعيار الداخلي بالتركيز $c_{IS}$، $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$، أيًّا كان الحجم المحقون.

طريقة 31.14 (التقدير الكمي بمعيار داخلي)

1. اختر معيارًا قريب البنية من المادة المحللة، غائبًا عن العينة، يخرج قربها لكن مفصولًا عنها ($R_s \ge 1.5$).
2. احقن محلول معايرة معلوم $c_X$ و$c_{IS}$؛ واحسب $F$ من نسبة المساحتين.
3. أضف المعيار إلى محلول العينة بالتركيز نفسه $c_{IS}$؛ واحقن؛ واقرأ $A_X/A_{IS}$.
4. احسب $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$، ثم عُد عبر كل تخفيف إلى العينة الأصلية.

المعايرة الخارجية (سلسلة من معايير المادة المحللة وحدها، ثم العينة، وكلها تُحقن بالطريقة نفسها) أبسط لكنها تعتمد على بقاء الحجم المحقون والكاشف ثابتين بين التشغيلات.

لمحة تاريخية — الكتابة بالألوان، 1906

صبّ عالم النبات ميخائيل تسفيت مستخلصًا من الأوراق الخضراء على أنبوب زجاجي مملوء بمسحوق الطباشير وغسله بمذيب: فانفصلت الأصباغ في نطاقات ملوّنة، كلوروفيلات خضراء وكاروتينات صفراء. وفي سنة 1906 سمّى الطريقة الكروماتوغرافيا، أي «الكتابة بالألوان». وظلت مهملة إلى حد بعيد ربع قرن، حتى استُعيدت لدراسة المنتجات الطبيعية في الثلاثينيات. (صورة شخصية: مؤلف مجهول، ملكية عامة؛ ويكيميديا كومنز.)

السلامة

الأسيتونتريل والميثانول، المكوّنان العضويان المعتادان للأطوار المتحركة في HPLC، قابلان للاشتعال وسامّان؛ والهكسان، المستعمل في الكروماتوغرافيا العمودية، قابل للاشتعال وخطر على الصحة وسام للأحياء المائية. وتُجمع نفايات المذيبات، ولا تُسكب أبدًا في المجرى.

31.6 تمارين

تمرين 31.1 ★

لمركب $t_R = 5.0\,\mathrm{min}$ على عمود زمنه الميت $1.0\,\mathrm{min}$. احسب معامل احتجازه وكسر الزمن الذي يقضيه في الطور المتحرك.

حل

حل التمرين 31.1.

$k = (5.0 - 1.0)/1.0 = 4.0$؛ وكسر الزمن في الطور المتحرك $1/(1 + k) = 0.20$.

تمرين 31.2 ★

قمة عند $t_R = 6.0\,\mathrm{min}$ عرضها عند القاعدة $0.30\,\mathrm{min}$. احسب عدد الأطباق.

حل

حل التمرين 31.2.

$N = 16(6.0/0.30)^2 = 16 \times 400 = 6400$.

تمرين 31.3 ★

يعطي عمود طوله $250\,\mathrm{mm}$ القيمة $N = 10\,000$ لمركب. احسب ارتفاع الطبق.

حل

حل التمرين 31.3.

$H = 250\,\mathrm{mm}/10\,000 = 0.025\,\mathrm{mm} = 25\,\text{µ}\mathrm{m}$.

تمرين 31.4 ★

GC أم HPLC؟ الإيثانول في الدم؛ وبروتين؛ والكافيين في مشروب؛ والبنزين في وقود السيارات؛ والسكريات في عصير الفاكهة.

حل

حل التمرين 31.4.

الإيثانول في الدم: GC (متطاير). البروتين: HPLC. الكافيين في مشروب: HPLC (في الماء، وليس متطايرًا بما يكفي دون تحضير). البنزين في وقود السيارات: GC. السكريات: HPLC (تتفكك قبل أن تغلي).

تمرين 31.5 ★★

قمتان: $t_{R1} = 4.0\,\mathrm{min}$، $w_1 = 0.40\,\mathrm{min}$؛ $t_{R2} = 4.6\,\mathrm{min}$، $w_2 = 0.50\,\mathrm{min}$. احسب الميز. هل هما مفصولتان حتى خط الأساس؟

حل

حل التمرين 31.5.

$R_s = 2(4.6 - 4.0)/(0.40 + 0.50) = 1.2/0.90 \approx 1.3$: ليستا مفصولتين تمامًا حتى خط الأساس (دون 1.5).

تمرين 31.6 ★★

كم طبقًا يلزم لفصل مركبين مع $\alpha = 1.10$ و$k_2 = 4.0$ عند $R_s = 1.5$؟

حل

حل التمرين 31.6.

$\sqrt N = 4R_s\,\dfrac{\alpha}{\alpha - 1}\,\dfrac{1 + k_2}{k_2} = 4 \times 1.5 \times 11 \times 1.25 = 82.5$، إذن $N \approx 6.8 \times 10^3$.

تمرين 31.7 ★★

لعمود $A = 5\,\text{µ}\mathrm{m}$، $B = 8\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$، $C = 2\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}/\mathrm{mm}$ (معطيات التمرين). أوجد السرعة المثلى وأصغر ارتفاع للطبق.

حل

حل التمرين 31.7.

$u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{8/2} = 2\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$؛ $H_{\min} = 5 + 2\sqrt{16} = 13\,\text{µ}\mathrm{m}$.

تمرين 31.8 ★★

تنبأ بترتيب خروج البنزين والفينول والتولوين في HPLC بالطور المعكوس مع طور متحرك ماء–ميثانول، وبما يحدث حين يُرفع كسر الميثانول.

حل

حل التمرين 31.8.

الفينول ($\ce{OH}$ قطبية، وروابط هيدروجينية مع الماء) أولًا، ثم البنزين، ثم التولوين (بمجموعة $\ce{CH3}$ إضافية، فهو أقل قطبية). وزيادة الميثانول تجعل الطور المتحرك أقل قطبية: فتخرج الثلاثة أبكر، بالترتيب نفسه.

تمرين 31.9 ★★

يعطي محلول معايرة لمادة محللة تركيزها $20.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ مع المعيار الداخلي بتركيز $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ المساحتين 860 و400. وتعطي عينة أُضيف إليها المعيار بتركيز $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ المساحتين 645 و410. احسب معامل الاستجابة وتركيز المادة المحللة (معطيات التمرين).

حل

حل التمرين 31.9.

$F = (860/400)/(20.0/10.0) = 2.15/2.00 = 1.075$. العينة: $c_X = (645/410) \times 10.0/1.075 \approx 14.6\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$.

تمرين 31.10 ★★★

يعطي فصلٌ القيمة $R_s = 1.06$. أي طول للعمود، بالنسبة إلى الطول الحالي، يعطي $R_s = 1.5$، وما كلفة ذلك من الزمن؟ وما الروافع الأخرى المتاحة؟

حل

حل التمرين 31.10.

$R_s \propto \sqrt N \propto \sqrt L$: يجب ضرب $L$ في $(1.5/1.06)^2 \approx 2.0$، مما يضاعف زمن التحليل والضغط. والروافع الأخرى: الانتقائية (الطور المتحرك، والطور الثابت، ودرجة الحرارة)، والجسيمات الأصغر، ومعدل التدفق الأمثل.

تمرين 31.11 ★★★

من أجل قمتين غاوسيتين متساويتي الارتفاع والعرض عرضهما عند القاعدة $w = 4\sigma$، احسب الإشارة في منتصف المسافة بينهما، بالنسبة إلى ارتفاع القمة، عند $R_s = 1$ وعند $R_s = 1.5$ (أهمل مساهمة القمة البعيدة عند كل قيمة عظمى).

حل

حل التمرين 31.11.

تفصل بين القمتين مسافة $4\sigma R_s$، فتبعد نقطة المنتصف $2\sigma R_s$ عن كل منهما. عند $R_s = 1$: تساهم كل قمة بالمقدار $\mathrm e^{-(2)^2/2} = \mathrm e^{-2} = 0.135$؛ فيكون الوادي عند $0.27$ من ارتفاع القمة. وعند $R_s = 1.5$: $2\mathrm e^{-(3)^2/2} = 2\mathrm e^{-4.5} \approx 0.022$، أي نحو 2 %: عودة إلى خط الأساس من الناحية العملية.

تمرين 31.12 ★★★

عند $N$ و$\alpha$ ثابتين، قارن عامل الميز $k_2/(1+k_2)$ وزمن التحليل النسبي $1 + k_2$ من أجل $k_2 = 2$، 5 و10. أي مجال من $k$ تختار؟

حل

حل التمرين 31.12.

$k_2/(1+k_2)$: 0.67، 0.83، 0.91؛ والزمن بوحدة $t_M$: 3، 6، 11. فالانتقال من 2 إلى 5 يربح 25 % في الميز مقابل ضعف الزمن؛ ومن 5 إلى 10، يربح 9 % مقابل نحو ضعف الزمن مرة أخرى. فقيمة $k$ بين نحو 2 و5 هي الحل الوسط المعتاد.

31.7 مسألة: الكافيين في مشروب طاقة

مسألة 31.1

مسألة نهاية الأسبوع — ترتيب الإزاحة في الطور المعكوس، وأداء العمود من كروماتوغرام، وتحسين الفصل، والتقدير الكمي بمعيار داخلي

معطيات تمرين (مختلقة، ليست طريقة حقيقية). يُخفف مشروب طاقة عشر مرات ($5.00\,\mathrm{mL}$ إلى $50.0\,\mathrm{mL}$) ويُضاف الثيوفيلين معيارًا داخليًا بتركيز $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ في المحلول المخفف. العمود: $150\,\mathrm{mm}$، طور معكوس؛ والطور المتحرك ماء–ميثانول؛ والكشف بالأشعة فوق البنفسجية. وتخرج مكونات المصفوفة غير المحتجزة (السكريات والأملاح) عند $t_M = 1.0\,\mathrm{min}$؛ والثيوفيلين عند $3.0\,\mathrm{min}$ (عرض القاعدة $0.18\,\mathrm{min}$)؛ والكافيين عند $3.4\,\mathrm{min}$ (عرض القاعدة $0.20\,\mathrm{min}$). المعايرة: الكافيين $50.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ والثيوفيلين $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ يعطيان المساحتين 1500 و1000. العينة: المساحتان 970 (الكافيين) و1010 (الثيوفيلين). وتحوي العلبة $250\,\mathrm{mL}$.

الجزء الأول — الطور المعكوس.

1. صف الطورين الثابت والمتحرك لعمود الطور المعكوس.
2. لماذا تخرج السكريات عند الزمن الميت؟
3. الكافيين هو 1،3،7-ثلاثي ميثيل الزانثين، والثيوفيلين 1،3-ثنائي ميثيل الزانثين. فسّر ترتيب خروجهما.
4. لماذا يكون الثيوفيلين معيارًا داخليًا جيدًا هنا؟
5. ماذا يحدث لزمني الاحتجاز كليهما لو رُفع كسر الميثانول؟
6. ماذا يقيس الزمن الميت؟

الجزء الثاني — أداء العمود.

7. احسب معاملي الاحتجاز للثيوفيلين والكافيين.
8. احسب معامل الانتقائية.
9. احسب عدد الأطباق للكافيين وللثيوفيلين.
10. احسب ارتفاع الطبق للكافيين.
11. احسب الميز بين القمتين.
12. تحقق منه بمعادلة الميز.
13. هل القمتان مفصولتان حتى خط الأساس؟

الجزء الثالث — أسرع أم أفضل.

14. لتوفير الوقت، يُقصَّر العمود إلى $75\,\mathrm{mm}$ (الحشوة والتدفق نفساهما). ماذا يصير الميز؟
15. وزمن التحليل؟
16. ماذا كان سيعطي عمود طوله $300\,\mathrm{mm}$ بدلًا من ذلك، وبأي كلفة؟
17. أي رافعة تؤثر في $\alpha$؟
18. هل تفيد زيادة $k$ كثيرًا هنا؟

الجزء الرابع — التقدير الكمي.

19. احسب معامل الاستجابة للكافيين بالنسبة إلى الثيوفيلين.
20. لماذا لا يهم الحجم المحقون؟
21. احسب تركيز الكافيين في المحلول المخفف.
22. احسب تركيز الكافيين في المشروب.
23. ما الخلل الذي يحدث لو خرج مركب من المصفوفة مع الثيوفيلين في الوقت نفسه؟
24. ماذا كانت ستتطلب المعايرة الخارجية بدلًا من ذلك؟
25. اذكر كتلة الكافيين في علبة سعتها $250\,\mathrm{mL}$.

حل

حل المسألة 31.1.

1. الثابت: حبيبات سيليكا تحمل سلاسل ألكيلية طويلة، غير قطبية. والمتحرك: ماء مع الميثانول، قطبي. 2. إنها شديدة القطبية وتبقى في الطور المتحرك: $k \approx 0$. 3. للكافيين مجموعة ميثيل واحدة أكثر من الثيوفيلين، وللثيوفيلين رابطة $\ce{N-H}$ تكوّن روابط هيدروجينية مع الماء: فالثيوفيلين أكثر قطبية ويخرج أولًا. 4. فهو قريب البنية (استجابة وسلوك متشابهان)، وغائب عن المشروب، ويخرج قرب الكافيين مع بقائه مفصولًا عنه. 5. سينقص كلاهما: فالطور المتحرك الأقل قطبية ينافس الطور الثابت على نحو أفضل. 6. الزمن الذي يستغرقه الطور المتحرك لعبور العمود، وهو الزمن الذي يقضيه المركب متحركًا. 7. $k_{\mathrm{theo}} = (3.0 - 1.0)/1.0 = 2.0$؛ $k_{\mathrm{caf}} = 2.4$. 8. $\alpha = 2.4/2.0 = 1.2$. 9. الكافيين $N = 16(3.4/0.20)^2 = 4624 \approx 4.6 \times 10^3$؛ والثيوفيلين $16(3.0/0.18)^2 \approx 4.4 \times 10^3$. 10. $H = 150\,\mathrm{mm}/4624 \approx 0.032\,\mathrm{mm} = 32\,\text{µ}\mathrm{m}$. 11. $R_s = 2(3.4 - 3.0)/(0.18 + 0.20) = 0.80/0.38 \approx 2.1$. 12. $\frac{\sqrt{4624}}{4} \times \frac{0.2}{1.2} \times \frac{2.4}{3.4} = 17 \times 0.167 \times 0.706 \approx 2.0$؛ والفرق الصغير يأتي من افتراض تساوي العرضين في المعادلة. 13. نعم: $R_s > 1.5$. 14. يُنصَّف $N$: $R_s \approx 2.1/\sqrt2 \approx 1.5$، عند حد الفصل حتى خط الأساس بالضبط. 15. يُنصَّف: الكافيين عند $1.7\,\mathrm{min}$. 16. $R_s \approx 2.1\sqrt2 \approx 3.0$، مقابل ضعف الزمن وضعف الضغط: وهذا هدر هنا. 17. تركيب الطور المتحرك (كسر الميثانول، وpH، ومذيب عضوي آخر) أو الطور الثابت. 18. قليلًا: فقيمة $k_2/(1 + k_2) = 0.71$ أصلًا؛ وعند $k_2 = 5$ تصير 0.83 (+18 %) مقابل زمن تحليل مضروب في $6/3.4 \approx 1.8$. 19. $F = (1500/1000)/(50.0/40.0) = 1.50/1.25 = 1.20$. 20. القمتان كلتاهما من الحقنة نفسها: فيُختزل الحجم في نسبة المساحتين. 21. $c = (970/1010) \times 40.0/1.20 \approx 32.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 22. التخفيف عشر مرات: $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 23. ستكون $A_{IS}$ أكبر مما ينبغي، ونتيجة الكافيين أدنى مما ينبغي. 24. سلسلة من معايير الكافيين تُحقن في الظروف نفسها بالضبط التي تُحقن فيها العينة، وخط معايرة للمساحة بدلالة التركيز، وحجوم حقن قابلة للتكرار. 25. $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L} \times 0.250\,\mathrm{L}$: $\boldsymbol{\approx 80\,\mathrm{mg}}$ من الكافيين لكل علبة (معطيات التمرين).