Biology · Boek 3 · Bachelor Year 1

Universitaire biologie — jaar 1

Universitaire biologie — jaar 1 · Bachelor Year 1

11Nucleotiden en nucleïnezuren

Giet koude ethanol op een oplossing van opengebroken cellen en er verschijnt een witte wolk vezels die om een glazen staaf kan worden gewonden: DNA, het molecuul dat elke instructie van het organisme draagt, met het blote oog zichtbaar. Er zit twee meter van opgevouwen in elke menselijke celkern; het geheel is geschreven in een alfabet van vier letters, in één richting gelezen, en gekopieerd door twee strengen te scheiden die op elkaar passen als een hand en haar handschoen. Dit hoofdstuk beschrijft de nucleotiden — tegelijk letters, energiemunt en co-enzymen — de ketens die zij vormen, de dubbele helix en het bewijsmateriaal ervoor, wat er gebeurt als zij wordt gesmolten en weer samengevoegd, en de RNA-moleculen die haar boodschap de cel in dragen.

11.1 Nucleotiden

Definitie 11.1 (Nucleotide)

Een nucleotide bestaat uit drie delen: een stikstofhoudende base — een purine (adenine A, guanine G: twee gefuseerde ringen) of een pyrimidine (cytosine C, thymine T, uracil U: één ring); een suiker met vijf koolstoffen, ribose in RNA of 2′'-deoxyribose in DNA (zonder de hydroxylgroep op koolstof 2′2'); en een tot drie fosfaatgroepen op koolstof 5′5' van de suiker. De base zit vast aan koolstof 1′1'; de koolstoffen van de suiker worden met accenttekens genummerd om ze van die van de base te onderscheiden. Base plus suiker is een nucleoside (adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine); met fosfaten is het een nucleotide (AMP, ADP, ATP en hun verwanten).

De onderdelen van een nucleotide: een base op koolstof 1' van een pentose, fosfaten op koolstof 5'. De 3'-hydroxylgroep is de plaats waar de volgende nucleotide van een keten zal aanhechten; de stand 2' onderscheidt RNA (OH) van DNA (H).
De onderdelen van een nucleotide: een base op koolstof 1′1' van een pentose, fosfaten op koolstof 5′5'. De 3′3'-hydroxylgroep is de plaats waar de volgende nucleotide van een keten zal aanhechten; de stand 2′2' onderscheidt RNA (OH) van DNA (H).

Propositie 11.2 (Nucleotiden doen drie dingen)

Behalve de bouwstenen van DNA en RNA zijn nucleotiden de energiemunt van de cel — ATP en GTP, waarvan de fosfoanhydridebindingen (Hoofdstuk 8) opbouw, transport en beweging betalen; haar co-enzymen — NAD+\mathrm{NAD^+}, NADP+\mathrm{NADP^+} en FAD, die elektronen dragen in de ademhaling en de fotosynthese (Hoofdstuk 15), en co-enzym A, dat acylgroepen draagt; en haar boodschappers — cyclisch AMP, dat hormoonsignalen binnen de cel doorgeeft. Zij zijn alle adeninenucleotiden of daarop gebouwd: hetzelfde molecuul dat de boodschap spelt, drijft haar uitvoering aan.

11.2 De polynucleotideketen

Definitie 11.3 (Fosfodiesterbinding, polariteit)

Nucleotiden worden tot een polynucleotide aaneengeregen door fosfodiesterbindingen: het fosfaat op koolstof 5′5' van de ene nucleotide wordt aan de 3′3'-hydroxylgroep van de volgende gekoppeld. De keten heeft daardoor een ruggengraat van suiker en fosfaat, gelijkvormig en negatief geladen (één lading per fosfaat), waarvan de basen als een reeks uitsteken; en zij heeft een richting: een 5′5'-uiteinde met een vrij fosfaat en een 3′3'-uiteinde met een vrije hydroxylgroep. Sequenties worden 5′→3′5' \to 3' geschreven en gelezen, de richting waarin ketens worden opgebouwd. DNA (deoxyribonucleïnezuur) gebruikt deoxyribose en de basen A, G, C, T; RNA (ribonucleïnezuur) gebruikt ribose en A, G, C, U.

Een keten van vier nucleotiden. Het 5'-fosfaat van elke nucleotide is door een fosfodiesterbinding verbonden met de 3'-hydroxylgroep van de nucleotide erboven; de keten loopt van een 5'-uiteinde naar een 3'-uiteinde en de basen hangen aan een gelijkvormige ruggengraat.
Een keten van vier nucleotiden. Het 5′5'-fosfaat van elke nucleotide is door een fosfodiesterbinding verbonden met de 3′3'-hydroxylgroep van de nucleotide erboven; de keten loopt van een 5′5'-uiteinde naar een 3′3'-uiteinde en de basen hangen aan een gelijkvormige ruggengraat.

Voorbeeld 11.4 (RNA is breekbaar, DNA is duurzaam)

De 2′2'-hydroxylgroep van ribose kan de naburige fosfodiesterbinding aanvallen: in mild alkalisch milieu is RNA binnen enkele uren tot nucleotiden gehydrolyseerd, terwijl DNA, dat die hydroxylgroep mist, koken in loog overleeft en intact is teruggewonnen uit botten van tienduizenden jaren oud. Uracil in RNA is thymine zonder methylgroep; DNA gebruikt thymine opdat cytosine, dat langzaam zijn aminogroep verliest en uracil wordt, als beschadigd kan worden herkend en hersteld — een uracil in DNA is altijd een fout.

11.3 De dubbele helix

Propositie 11.5 (De regels van Chargaff)

In het DNA van elk organisme is de hoeveelheid adenine gelijk aan die van thymine en de hoeveelheid guanine aan die van cytosine (A=TA = T, G=CG = C, dus purinen == pyrimidinen), terwijl de verhouding (G+C)/(A+T)(G + C)/(A + T) van soort tot soort verschilt (van 25 %25\,\% tot 75 %75\,\% G+CG + C).

Bewijsmateriaal. Chargaff (1950) hydrolyseerde DNA van vele organismen en scheidde de basen met chromatografie, waarbij hij elk aan zijn ultraviolette absorptie mat. De gelijkheden gingen binnen de meetfout op voor elk DNA; het G+CG + C-gehalte deed dat niet, en was in elk weefsel van hetzelfde organisme gelijk. ∎

Stelling 11.6 (De dubbele helix van Watson en Crick)

DNA bestaat uit twee polynucleotideketens die om een gemeenschappelijke as tot een rechtsdraaiende dubbele helix zijn gewonden: de ruggengraten van suiker en fosfaat aan de buitenkant, de basen binnenin, vlak en loodrecht op de as gestapeld. De ketens zijn antiparallel (de ene loopt 5′→3′5' \to 3' omhoog, de andere omlaag) en complementair: tegenover elke A staat een T, door twee waterstofbruggen vastgehouden, en tegenover elke G een C, door drie; elk zo’n basenpaar is even breed, zodat de helix bij elke sequentie gelijkvormig is. In de gebruikelijke B-vorm is de helix 2 nm2\,\mathrm{nm} breed, stijgt zij 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} per basenpaar en 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} per winding van tien paren, en vertoont zij een brede grote groeve en een smalle kleine groeve waarin de randen van de basen aan eiwitten blootliggen.

Bewijsmateriaal. De röntgendiffractiebeelden die Franklin (1952) van DNA-vezels maakte, toonden het kruis van een helix met een herhaling van 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} langs de as, een sterke reflectie bij 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} (gestapelde vlakke eenheden), en een doorsnede van 2 nm2\,\mathrm{nm}; de fosfaten, de zwaarste atomen, moesten aan de buitenkant zitten. Watson en Crick (1953) vonden dat een purine gepaard met een pyrimidine — en alleen A met T en G met C — paren van gelijke breedte geeft die op de doorsnede van 2 nm2\,\mathrm{nm} passen, wat de regels van Chargaff verklaart, en dat twee zo gepaarde antiparallelle ketens een regelmatige helix met de afmetingen van de vezel opbouwen. Het model voorspelde dat elke keten een matrijs voor de andere is; de demonstratie van semiconservatieve replicatie door Meselson en Stahl (bekend uit het deel over de bovenbouw, en in Hoofdstuk 18) bevestigde dat. ∎

Links: een model van de dubbele helix; de twee ruggengraten winden zich om de gestapelde basenparen en laten een grote en een kleine groeve open. Rechts: dezelfde tien basenparen tot een ladder ontrold: antiparallelle strengen, complementaire paren van gelijke breedte, 0.34\, nm per paar en 3.4\, nm per winding.
Links: een model van de dubbele helix; de twee ruggengraten winden zich om de gestapelde basenparen en laten een grote en een kleine groeve open. Rechts: dezelfde tien basenparen tot een ladder ontrold: antiparallelle strengen, complementaire paren van gelijke breedte, 0.34\, nm per paar en 3.4\, nm per winding.
Links: een model van de dubbele helix; de twee ruggengraten winden zich om de gestapelde basenparen en laten een grote en een kleine groeve open. Rechts: dezelfde tien basenparen tot een ladder ontrold: antiparallelle strengen, complementaire paren van gelijke breedte, 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} per paar en 3.4 nm3.4\,\mathrm{nm} per winding.

Voorbeeld 11.7 (Een streng lezen)

Als de ene streng 5′5'-ATGGCATTC-3′3' luidt, dan is haar partner, 5′→3′5' \to 3' geschreven, 5′5'-GAATGCCAT-3′3': neem van elke base de complementaire en keer dan de volgorde om. Negen paren, 3.1 nm3.1\,\mathrm{nm} helix, tweeëntwintig waterstofbruggen (vijf G–C, vier A–T). Een menselijk chromosoom van 2.5×1082.5 \times 10^{8} paren is in deze vorm 8.5 cm8.5\,\mathrm{cm} lang en moet honderdduizend keer worden opgevouwen om in een kern te passen (Hoofdstuk 17).

Propositie 11.8 (Wat de helix bijeenhoudt)

De waterstofbruggen tussen de gepaarde basen geven de specificiteit; de stapeling van de vlakke basen op elkaar — vanderwaalscontacten en het hydrofobe effect dat de basen uit het water houdt — levert het grootste deel van de stabiliteit; de negatief geladen ruggengraten stoten elkaar af, en de helix is alleen stabiel in aanwezigheid van kationen (het fysiologische Mg2+\mathrm{Mg^{2+}}, Na+\mathrm{Na^+}, of de basische eiwitten van het chromatine) die de lading afschermen. Een G–C-paar, met drie waterstofbruggen en een sterkere stapeling, houdt beter stand dan een A–T-paar.

11.4 Smelten en hybridisatie

Definitie 11.9 (Denaturatie, smelttemperatuur)

Verwarmen, of een extreme pH, scheidt de twee strengen van DNA: denaturatie (smelten), een coöperatieve overgang over enkele graden, waarvan het middelpunt de smelttemperatuur TmT_m is. Zij gaat gepaard met het hyperchroom effect: enkele strengen nemen bij 260 nm260\,\mathrm{nm} ongeveer 40 %40\,\% meer ultraviolet licht op dan dezelfde basen gestapeld in een helix. TmT_m stijgt met het G+CG + C-gehalte (0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} per procent), met de zoutconcentratie en met de lengte; in 0.15 mol/L0.15\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} zout smelt een lang DNA met 50 %50\,\% G+CG + C rond 90 ∘C90\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Bij langzame afkoeling vinden de strengen hun complement en vormen zij de helix opnieuw: renaturatie, of hybridisatie wanneer de strengen uit verschillende bronnen komen.

Smeltcurves van twee DNA-monsters in hetzelfde zout. De absorptie stijgt met 40\,\% naarmate de strengen scheiden, over enkele graden; het middelpunt, T_m, ligt hoger voor het DNA dat rijker is aan G–C-paren.
Smeltcurves van twee DNA-monsters in hetzelfde zout. De absorptie stijgt met 40 %40\,\% naarmate de strengen scheiden, over enkele graden; het middelpunt, TmT_m, ligt hoger voor het DNA dat rijker is aan G–C-paren.

Methode 11.10 (Nucleïnezuren meten met absorptie)

  1. Basen nemen ultraviolet licht op met een maximum bij 260 nm260\,\mathrm{nm}. In een cuvet van 1 cm1\,\mathrm{cm} komt een absorptie van 1.01.0 overeen met 50 µg/mL50\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} dubbelstrengs DNA (40 µg/mL40\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} RNA, 33 µg/mL33\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL} enkelstrengs DNA).
  2. De verhouding A260/A280A_{260}/A_{280} is 1.81.8 voor zuiver DNA en 2.02.0 voor zuiver RNA; eiwitten nemen bij 280 nm280\,\mathrm{nm} op en verlagen haar.
  3. Om het smelten te volgen, registreer A260A_{260} tijdens langzaam verwarmen; het middelpunt van de curve is TmT_m en haar steilheid een maat voor de homogeniteit van het monster.
  4. Om een sequentie op te sporen, denatureer het monster en voeg een gemerkte enkele streng toe die er complementair aan is (een probe); die hybridiseert alleen waar haar complement zit, en het merk wijst de plaats aan — op een gel, op een chromosoom, in een weefsel.
DNA neergeslagen met koude ethanol uit een cellysaat en op een glazen staaf gewonden: enkele milligrammen van het molecuul, zichtbaar als vezels omdat elk miljoenen basenparen lang is.
DNA neergeslagen met koude ethanol uit een cellysaat en op een glazen staaf gewonden: enkele milligrammen van het molecuul, zichtbaar als vezels omdat elk miljoenen basenparen lang is.

Voorbeeld 11.11 (Een probe vindt een gen)

Een probe van twintig nucleotiden die complementair is aan één gen bindt, bij 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C} onder haar eigen TmT_m, haar exacte complement en niets anders in drie miljard basenparen: één mismatch op twintig verlaagt TmT_m met enkele graden en de mismatchende hybride smelt. De specificiteit van de basenparing, over twintig posities vermenigvuldigd, is waar elke DNA-test op steunt, van vaderschap tot het opsporen van ziekteverwekkers.

11.5 RNA

Definitie 11.12 (De RNA-moleculen)

RNA is meestal enkelstrengs en vouwt op zichzelf terug overal waar korte complementaire stukken dat toelaten, tot haarspelden, lussen en uitstulpingen — een secundaire structuur — die zich vervolgens tot een vorm samenpakt. Drie klassen dragen de stroom van erfelijke informatie (Hoofdstuk 19): boodschapper-RNA (mRNA), een kopie van een gen die het ribosoom leest; transfer-RNA (tRNA), zo’n 75 75\, nucleotiden gevouwen tot een klaverblad, dat aan zijn 3′3'-uiteinde een aminozuur draagt en een anticodon dat met de boodschap paart; ribosomaal RNA (rRNA), de structurele en katalytische kern van het ribosoom, vier vijfde van het RNA van een cel. Vele andere RNA-moleculen reguleren, splicen en gidsen (het deel van jaar 3).

Een transfer-RNA in zijn secundaire klaverbladstructuur: één streng van ongeveer 75 nucleotiden die met zichzelf tot vier stammen is gepaard. Het aminozuur wordt aan het 3'-uiteinde gedragen; het anticodon aan de tegenoverliggende punt leest de boodschap.
Een transfer-RNA in zijn secundaire klaverbladstructuur: één streng van ongeveer 75 nucleotiden die met zichzelf tot vier stammen is gepaard. Het aminozuur wordt aan het 3′3'-uiteinde gedragen; het anticodon aan de tegenoverliggende punt leest de boodschap.

Opmerking 11.13 (RNA kan een katalysator zijn)

Sommige RNA-moleculen zijn enzymen (ribozymen): de peptidebinding van elk eiwit wordt gevormd door het ribosomale RNA en niet door een eiwit, en sommige RNA-moleculen knippen en splicen zichzelf. Een molecuul dat tegelijk informatie draagt en reacties katalyseert, is waaruit een eerste levend systeem gemaakt kan zijn geweest; de wereld van DNA en eiwit zou dan een latere taakverdeling zijn, met RNA nog altijd in het midden.

11.6 Opgaven

Oefening 11.1 ★

Noem de drie onderdelen van een nucleotide en de twee verschillen tussen een ribonucleotide en een deoxyribonucleotide.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.1.

Een stikstofhoudende base, een pentose, een tot drie fosfaten. RNA: ribose (met een 2′2'-hydroxylgroep) en uracil; DNA: 2′2'-deoxyribose en thymine.

Oefening 11.2 ★

Schrijf de complementaire streng van 5′5'-GGATCCTA-3′3' in de richting 5′→3′5' \to 3', en tel haar waterstofbruggen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.2.

5′5'-TAGGATCC-3′3'. Paren: G–C, G–C, A–T, T–A, C–G, C–G, T–A, A–T: vier G–C (12 bruggen) en vier A–T (8): 20 waterstofbruggen.

Oefening 11.3 ★

Een DNA bevat 22 %22\,\% adenine. Geef de percentages van T, G en C, en het G+CG + C-gehalte.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.3.

T 22 %22\,\%; G en C delen de resterende 56 %56\,\%: elk 28 %28\,\%; G+C=56 %G + C = 56\,\%.

Oefening 11.4 ★

Wat is volgens de smeltfiguur de TmT_m van een DNA met 50 %50\,\% G+CG + C onder dezelfde omstandigheden, en met hoeveel stijgt de absorptie bij het smelten?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.4.

Tussen de twee curves, bij 0.4 ∘C0.4\,{}^{\circ}\mathrm{C} per procent: ongeveer 85 ∘C85\,{}^{\circ}\mathrm{C}. De absorptie stijgt met 40 %40\,\%.

Oefening 11.5 ★★

Bereken de lengte van het chromosoom van E. coli (4.6×1064.6 \times 10^{6} basenparen) in millimeters, het aantal windingen, en de factor waarmee het moet worden samengepakt om in een cel van 2 µm2\,\text{µ}\mathrm{m} te passen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.5.

4.6×106×0.34 nm=1.56 mm4.6 \times 10^{6}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 1.56\,\mathrm{mm}; 460 000460\,000 windingen; 1560/2=7801560/2 = 780 keer korter (het chromosoom wordt tot lussen en superspiralen opgevouwen).

Oefening 11.6 ★★

Leg uit waarom de twee strengen van DNA antiparallel moeten zijn, aan de hand van de meetkunde van de ruggengraat van suiker en fosfaat en de eis dat elk basenpaar even breed is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.6.

De basen paren met hun randen naar elkaar toe, en de suiker van elk zit alleen aan dezelfde kant van het paar wanneer de twee ruggengraten in tegengestelde richting lopen; bij evenwijdige strengen zouden de twee suikers aan tegenoverliggende randen zitten en zouden de breedte van het paar en de plaats van de ruggengraat met de sequentie meeveranderen. Antiparallelle strengen met purine-pyrimidineparen geven de constante 2 nm2\,\mathrm{nm} die het vezelpatroon vereist.

Oefening 11.7 ★★

Een DNA-oplossing heeft in een cuvet van 1 cm1\,\mathrm{cm} A260=0.35A_{260} = 0.35 en A280=0.20A_{280} = 0.20. Bereken de concentratie en becommentarieer de zuiverheid. Hoeveel basenparen zitten er in 1 mL1\,\mathrm{mL}, als de gemiddelde massa van een paar 650 Da650\,\mathrm{Da} is?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.7.

0.35×50=17.5 µg/mL0.35\times 50 = 17.5\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}. A260/A280=1.75A_{260}/A_{280} = 1.75: in wezen zuiver DNA (1.8), met misschien een spoor eiwit. In 1 mL1\,\mathrm{mL}: 17.5×10−6/(650×1.66×10−24)=1.6×101617.5\times 10^{-6}/(650\times 1.66\times 10^{-24}) = 1.6 \times 10^{16} basenparen.

Oefening 11.8 ★★

Verklaar het hyperchroom effect en waarom de smeltcurve van een zuiver DNA steil is terwijl die van een mengsel van DNA uit vele soorten is uitgesmeerd.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.8.

Gestapelde basen schermen elkaar af en nemen minder op; de strengen scheiden stelt elke base aan het licht bloot en de absorptie stijgt met 40 %40\,\%. Een zuiver DNA smelt coöperatief binnen enkele graden van zijn ene TmT_m; een mengsel bevat DNA-moleculen met vele G+CG + C-gehalten, elk met een eigen TmT_m, zodat de som van hun curves over tientallen graden is uitgesmeerd.

Oefening 11.9 ★★

Een probe van twintig nucleotiden heeft met haar exacte complement Tm=62 ∘CT_m = 62\,{}^{\circ}\mathrm{C}; één mismatch verlaagt TmT_m met ongeveer 5 ∘C5\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Bij welke temperatuur moet de hybridisatie plaatsvinden om de exacte sequentie op te sporen en enkele mismatches te verwerpen? Wat gebeurt er bij 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C}?

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.9.

Net onder 62 ∘C62\,{}^{\circ}\mathrm{C} en boven 57 ∘C57\,{}^{\circ}\mathrm{C}, zeg 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C}: de perfecte hybride houdt stand, de mismatchende smelt. Bij 45 ∘C45\,{}^{\circ}\mathrm{C} zijn hybriden met tot drie mismatches stabiel en licht de probe ook verwante sequenties op.

Oefening 11.10 ★★★

De regels van Chargaff gelden voor dubbelstrengs DNA maar niet voor RNA of voor het DNA van bepaalde kleine virussen. Leg uit wat elke uitzondering over de bouw van die nucleïnezuren zegt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.10.

De regels volgen uit de basenparing tussen twee complementaire strengen. RNA, enkelstrengs, heeft geen partner die haar samenstelling beperkt, zodat in het algemeen A≠UA \neq U; de kleine virussen in kwestie hebben enkelstrengige DNA-genomen, die de regels evenmin hoeven te volgen — en dat zij dat niet deden, was een van de eerste aanwijzingen dat zij enkelstrengs waren.

Oefening 11.11 ★★★

Twee waterstofbruggen houden een A–T-paar bijeen, en toch is een helix van duizend A–T-paren stabiel bij 60 ∘C60\,{}^{\circ}\mathrm{C} terwijl één enkel paar helemaal niet ontstaat. Verklaar dat met de ideeën van Hoofdstuk 8 (zwakke bindingen, coöperativiteit, stapeling), en zeg wat dat betekent voor de betrouwbaarheid van een probe.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.11.

Elk paar op zichzelf is enkele kilojoules per mol waard, minder dan de thermische beweging, en het vormt en breekt binnen microseconden. In een helix vormen de paren zich samen: elk paar stapelt op het vorige en de eerste paren zetten de rest in gang, zodat de energieën optellen en de kans dat zij alle tegelijk breken verwaarloosbaar is — coöperativiteit. De stapeling draagt evenveel bij als de waterstofbruggen. Voor een probe betekent dat dat de stabiliteit met de lengte groeit en scherp daalt bij elke mismatch, die de coöperatieve reeks onderbreekt: specificiteit is een eigenschap van het hele stuk.

Oefening 11.12 ★★★

“De structuur van DNA is de verklaring van de erfelijkheid.” Bespreek dat in een alinea: wat de dubbele helix onmiddellijk verklaart (kopiëren, mutatie als een verandering van de sequentie), wat zij op zichzelf niet verklaart (hoe de sequentie een eiwit wordt), en waarom het model van Watson en Crick werd aanvaard voordat er enige biochemische toets van was.

Oplossing

Oplossing van Oefening 11.12.

De helix verklaart het kopiëren meteen: elke streng legt de andere vast, zodat het scheiden ervan en het paren van nieuwe nucleotiden op elk twee identieke moleculen geeft; een mutatie is een verkeerde base die in één kopie is vastgelegd en daarna trouw wordt meegekopieerd. Zij zegt op zichzelf niet hoe een reeks van vier basen een eiwit vastlegt — daar was een decennium voor nodig (code, mRNA, tRNA, ribosoom). Het model werd aanvaard omdat het bij elke meting paste (Chargaff, de röntgenafmetingen, de dichtheid) zonder dat er iets overbleef, en omdat zijn verklaring van de erfelijkheid zo zuinig was dat het alternatief — toeval — onaannemelijk was; Meselson en Stahl bevestigden vervolgens het kopiëren dat het voorspelde.

11.7 Vraagstuk: het genoom van een virus

Probleem 11.1

Weekendvraagstuk — het DNA van faag λ\lambda gemeten, gewogen, geteld, gesmolten en in zijn capside gepakt, eindigend op zijn smelttemperatuur en zijn contourlengte

Het genoom van bacteriofaag λ\lambda is één lineair dubbelstrengs DNA van 48 50248\,502 basenparen met een G+CG + C-gehalte van 49.9 %49.9\,\%. Het is gepakt in een icosaëdrische capside met een inwendige doorsnede van 55 nm55\,\mathrm{nm}. Neem 0.34 nm0.34\,\mathrm{nm} per basenpaar, 2.0 nm2.0\,\mathrm{nm} voor de doorsnede van de helix, 650 Da650\,\mathrm{Da} per basenpaar, en Tm=81.5+16.6log⁡10[Na+]+0.41 (% G+C)−500/LT_m = 81.5 + 16.6\log_{10}[\mathrm{Na^+}] + 0.41\,(\%\,G{+}C) - 500/L in graden Celsius, met [Na+][\mathrm{Na^+}] in mol/L\mathrm{mol}/\mathrm{L} en LL de lengte in basenparen.

Deel I — Gemeten en gewogen.

  1. Bereken de contourlengte van het molecuul in micrometers.
  2. Bereken het aantal windingen van de helix.
  3. Bereken de molaire massa ervan in dalton.
  4. Bereken de massa van één molecuul in gram.
  5. Bereken het aantal fosfaatgroepen en daarmee de netto lading van het molecuul.
  6. Bereken het aantal nucleotiden van elke base (A, T, G, C).
  7. Bereken het totale aantal waterstofbruggen dat de twee strengen bijeenhoudt.

Deel II — Gesmolten.

  1. Bereken TmT_m in 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} natrium.
  2. Bereken TmT_m in 0.01 mol/L0.01\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} natrium, en leg uit waarom zout de helix stabiliseert.
  3. Het genoom van λ\lambda bevat een gebied van 1000 1000\, paren met 35 %35\,\% G+CG + C en een met 62 %62\,\%. Bereken de TmT_m van elk gebied in 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} natrium en beschrijf de vorm van de smeltcurve van het hele molecuul.
  4. Een oplossing van λ\lambda-DNA heeft vóór het smelten A260=0.50A_{260} = 0.50. Wat is haar concentratie, en wat zal A260A_{260} na volledig smelten zijn?
  5. Hoeveel λ\lambda-moleculen zitten er in 1 mL1\,\mathrm{mL} van die oplossing?
  6. De twee uiteinden van het genoom van λ\lambda zijn enkelstrengige overhangen van 12 nucleotiden die complementair aan elkaar zijn en waarmee het molecuul zich in de gastheer tot een cirkel sluit. Bereken hun TmT_m (gebruik L=12L = 12) en zeg waarom de cirkel bij 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} in de cel toch standhoudt.

Deel III — Gepakt.

  1. Bereken het volume van het DNA als een cilinder.
  2. Bereken het inwendige volume van de capside.
  3. Welk deel van de capside vult het DNA? Vergelijk dat met de dichtste pakking van evenwijdige cilinders (91 %91\,\%).
  4. Het DNA draagt 97 00097\,000 negatieve ladingen in een bol van 55 nm55\,\mathrm{nm}. Leg uit wat het DNA de capside in moet vergezellen, en waarom het gepakte DNA een druk op de schil uitoefent (tientallen atmosferen) die helpt het in een bacterie te spuiten.
  5. Het molecuul moet tot lussen worden gebogen met een straal die vergelijkbaar is met die van de capside. DNA verzet zich tegen buiging onder een straal van ongeveer 50 nm50\,\mathrm{nm}. Becommentarieer dat.

Deel IV — Gelezen.

  1. Eén streng van het genoom begint met 5′5'-GGGCGGCGACCT-3′3'. Schrijf de complementaire streng 5′→3′5' \to 3'.
  2. Als een gen van 12001200 basenparen tot een mRNA wordt overgeschreven, hoe lang is dat mRNA dan in nucleotiden en, bij 330 Da330\,\mathrm{Da} per nucleotide, hoe groot is zijn massa?
  3. Het genoom heeft 75 75\, genen in 48 50248\,502 paren. Welk deel van het genoom codeert, als het gemiddelde gen 600600 paren telt? Vergelijk dat met een menselijk genoom (1.5 %1.5\,\%).
  4. Het genoom wordt in 20 min20\,\mathrm{min} bij 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} door de enzymen van de gastheer gerepliceerd. Bereken de snelheid in basenparen per seconde als de replicatie bij één oorsprong begint en in beide richtingen verloopt.
  5. Hoeveel waterstofbruggen worden er tijdens de replicatie per seconde bij de twee vorken verbroken (gebruik het gemiddelde per paar uit vraag 7)?
  6. Een mutatie verandert één G–C-paar in A–T. Met hoeveel verandert de TmT_m van het hele molecuul? Zou smelten dat kunnen opsporen?
  7. Geef het resultaat: de smelttemperatuur van λ\lambda-DNA in 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} natrium en zijn contourlengte, en de samenpakking die het in de capside laat passen.
Oplossing

Oplossing van Probleem 11.1.

1. 48 502×0.34=16 490 nm=16.5 µm48\,502\times 0.34 = 16\,490\,\mathrm{nm} = 16.5\,\text{µ}\mathrm{m}. 2. 48 502/10=485048\,502/10 = 4850 windingen. 3. 48 502×650=3.15×107 Da48\,502\times 650 = 3.15 \times 10^{7}\,\mathrm{Da}. 4. 3.15×107×1.66×10−24=5.2×10−17 g3.15 \times 10^{7}\times 1.66\times 10^{-24} = 5.2 \times 10^{-17}\,\mathrm{g}. 5. Twee per paar: 97 00497\,004 fosfaten, netto lading −97 004 e-97\,004\,e. 6. G+C=0.499×97 004=48 405G + C = 0.499\times97\,004 = 48\,405: G=C=24 203G = C = 24\,203; A=T=24 299A = T = 24\,299. 7. 3×24 203+2×24 299=121 2073\times24\,203 + 2\times24\,299 = 121\,207. 8. 81.5+16.6×(−1)+0.41×49.9−500/48502=81.5−16.6+20.5−0.01=85.4 ∘C81.5 + 16.6\times(-1) + 0.41\times 49.9 - 500/48502 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 0.01 = 85.4\,{}^{\circ}\mathrm{C}. 9. 81.5−33.2+20.5=68.8 ∘C81.5 - 33.2 + 20.5 = 68.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Kationen schermen de afstoting tussen de twee negatief geladen ruggengraten af; bij minder zout stoten de strengen elkaar sterker af en scheiden zij bij een lagere temperatuur. 10. 35 %35\,\%: 81.5−16.6+14.4−0.5=78.8 ∘C81.5 - 16.6 + 14.4 - 0.5 = 78.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}; 62 %62\,\%: 81.5−16.6+25.4−0.5=89.8 ∘C81.5 - 16.6 + 25.4 - 0.5 = 89.8\,{}^{\circ}\mathrm{C}. Het hele molecuul smelt in stappen: de gebieden die rijk zijn aan A–T gaan het eerst open, die met veel G–C het laatst, zodat de curve een brede stijging met schouders is en geen enkele scherpe stap. 11. 0.50×50=25 µg/mL0.50\times 50 = 25\,\text{µ}\mathrm{g}/\mathrm{mL}; na het smelten is A260=0.70A_{260} = 0.70. 12. 25×10−6/5.2×10−17=4.8×101125\times 10^{-6}/5.2\times 10^{-17} = 4.8 \times 10^{11} moleculen. 13. 81.5−16.6+0.41×50−500/12=81.5−16.6+20.5−41.7=43.7 ∘C81.5 - 16.6 + 0.41\times 50 - 500/12 = 81.5 - 16.6 + 20.5 - 41.7 = 43.7\,{}^{\circ}\mathrm{C} (de formule is ruw voor zulke korte stukken). Bij 37 ∘C37\,{}^{\circ}\mathrm{C} paren de uiteinden wel, maar zij zouden af en toe openen; in de cel sluit een enzym (ligase) de twee inkepingen covalent, en hangt de cirkel niet langer van de twaalf paren af. 14. π×(1.0)2×16 490=5.2×104 nm3\pi\times(1.0)^2\times16\,490 = 5.2 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 15. 43π×27.53=8.7×104 nm3\frac{4}{3}\pi\times 27.5^3 = 8.7 \times 10^{4}\,\mathrm{nm}^{3}. 16. 60 %60\,\%: twee derde van de dichtst mogelijke pakking van cilinders — het DNA is tot vrijwel kristallijne spiralen gewonden. 17. Tegenionen (polyaminen, Mg2+\mathrm{Mg^{2+}}) moeten het grootste deel van de lading neutraliseren, anders zou de afstoting niet te overwinnen zijn; de resterende afstoting en de buigenergie die in de strakke spiralen is opgeslagen duwen naar buiten tegen de schil, en wanneer de staart opengaat drijft die druk het eerste stuk van het genoom de bacterie in. 18. De lussen in een capside van 55 nm55\,\mathrm{nm} hebben stralen van 10 to 25 nm10\text{ to }25\,\mathrm{nm}, onder de 50 nm50\,\mathrm{nm} waarbij DNA vrij buigt: het buigen kost energie, betaald door de verpakkingsmotor (ATP) en opgeslagen als de druk uit vraag 17. 19. 5′5'-AGGTCGCCGCCC-3′3'. 20. 12001200 nucleotiden; 1200×330=4.0×105 Da1200\times 330 = 4.0 \times 10^{5}\,\mathrm{Da}. 21. 75×600=45 00075\times 600 = 45\,000 paren, 93 %93\,\% coderend — een compact genoom; het menselijk genoom is zestig keer minder dicht bezet met genen. 22. Twee vorken, die elk 24 25124\,251 paren in 1200 s1200\,\mathrm{s} kopiëren: 20 20\, paren per seconde per vork (het polymerase van de gastheer kan er 1000 1000\,; de tijd wordt door de hele cyclus bepaald en niet door het polymerase). 23. 121 207/48 502=2.5121\,207/48\,502 = 2.5 bruggen per paar; twee vorken bij 20 paren per seconde: 100 waterstofbruggen per seconde — en evenveel die erachter weer worden gevormd. 24. Eén paar op 48 50248\,502 verandert G+CG + C met 0.002 %0.002\,\% en TmT_m met 0.001 ∘C0.001\,{}^{\circ}\mathrm{C}: niet op te sporen door het hele molecuul te smelten; alleen een korte probe over de plek heen zou het laten zien. 25. Tm=85 ∘CT_m = 85\,{}^{\circ}\mathrm{C} in 0.1 mol/L0.1\,\mathrm{mol}/\mathrm{L} natrium; contourlengte 16.5 µm16.5\,\text{µ}\mathrm{m}, driehonderd keer de doorsnede van de capside, waarin het voor 60 %60\,\% van het volume is gepakt.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst