Universitaire biologie — jaar 1 · Bachelor Year 1

5De cel: eenheid van het leven

In 1665 legde Robert Hooke een schilfertje kurk onder een lens en zag het verdeeld in kleine kamertjes die hij cellen noemde, naar de kamers van een klooster. Tien jaar later zag een Delftse lakenhandelaar, Antoni van Leeuwenhoek, die zijn eigen lenzen slepen tot een sterkte die niemand anders haalde, levende wezens zwemmen in een druppel slootwater, in het schraapsel van zijn tanden en in zijn eigen zaad. Het duurde nog anderhalve eeuw om te verwoorden wat die twee hadden gezien: dat elk organisme uit cellen bestaat, en dat elke cel uit een cel voortkomt. Dit hoofdstuk formuleert de celtheorie met haar bewijsmateriaal, stelt de twee typen cel tegenover elkaar, en beschrijft de instrumenten — de microscopen, de centrifuge, de kweekfles — waarmee wij cellen kunnen zien, uit elkaar halen en buiten een organisme in leven houden.

5.1 De celtheorie

Definitie 5.1 (Cel)

Een cel is de kleinste eenheid van levende materie: een volume waterig cytoplasma begrensd door een plasmamembraan, met daarin het erfelijk materiaal (DNA) en de machinerie die het tot uitdrukking brengt, in staat om voedingsstoffen op te nemen, energie om te zetten, haar eigen ordening in stand te houden en, wanneer de omstandigheden het toelaten, in twee cellen te delen.

Propositie 5.2 (De celtheorie)

Elk organisme bestaat uit één of meer cellen, en de cel is de eenheid van bouw en werking van levende wezens (Schleiden en Schwann, 1838–1839).
Elke cel ontstaat door deling uit een reeds bestaande cel (Virchow, 1855: omnis cellula e cellula); er is geen spontane generatie.
Het erfelijk materiaal wordt bij de deling van cel op cel doorgegeven, zodat de continuïteit van het leven de continuïteit van cellen is.

Bewijsmateriaal. De kurk van Hooke (1665) en de plantendoorsneden van Grew en Malpighi toonden plantenweefsels als rijen kamertjes; de lenzen van Leeuwenhoek (jaren 1670) toonden eencellige organismen, bloedcellen en zaadcellen. Twee eeuwen van steeds betere lenzen vonden cellen in elk onderzocht weefsel, dierlijk zowel als plantaardig, zodra Schwann cellen met een kern herkende in kraakbeen en embryo’s. De deling werd rechtstreeks waargenomen bij algen en in embryo’s, en Virchow vond geen enkel weefsel, gezond of ziek, waarvan de cellen niet uit andere cellen kwamen. De zwanenhalskolven van Pasteur (1861) — bouillons die maandenlang steriel bleven zolang stof ze niet kon bereiken, en binnen enkele dagen krioelden zodra dat wel kon — sloten de kwestie van de spontane generatie af. De derde uitspraak is het werk van de late negentiende eeuw, die de chromosomen door de deling heen volgde (Hoofdstuk 18). ∎

Links: de tekening die Hooke in Micrographia (1665) van kurk maakte, de eerste cellen die ooit zijn afgebeeld — de lege wanden van dode cellen, in twee richtingen gezien. Rechts: Antoni van Leeuwenhoek, rond 1680 geschilderd door Jan Verkolje, wiens enkellensmicroscopen als eerste levende cellen lieten zien. — Links: de tekening die Hooke in *Micrographia* (1665) van kurk maakte, de eerste cellen die ooit zijn afgebeeld — de lege wanden van dode cellen, in twee richtingen gezien. Rechts: Antoni van Leeuwenhoek, rond 1680 geschilderd door Jan Verkolje, wiens enkellensmicroscopen als eerste levende cellen lieten zien.

Voorbeeld 5.3 (Eén cel, vele cellen)

Een bacterie, een gist en een amoebe zijn volledige organismen van één cel, die alles doen — eten, bewegen, delen — binnen enkele micrometers. Een mens telt zo’n $3 \times 10^{13}$ cellen van tweehonderd soorten, waarvan er geen enkele in een vijver alleen zou kunnen leven, en die elk door een ononderbroken reeks delingen afstammen van één bevruchte eicel. Het konijn van Hoofdstuk 2 en de eik van Hoofdstuk 3 zijn dezelfde theorie, twee keer toegepast.

5.2 Twee soorten cel

Definitie 5.4 (Prokaryote en eukaryote cellen)

Een prokaryote cel (bacteriën, archaea) heeft geen kern: haar DNA, meestal één ringvormig chromosoom, ligt in een gebied van het cytoplasma dat het nucleoïde heet, en zij heeft geen door membranen begrensde compartimenten. Zij is klein ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) en begrensd door een plasmamembraan en, daarbuiten, een celwand. Een eukaryote cel (protisten, schimmels, planten, dieren) houdt haar DNA, als verscheidene lineaire chromosomen, binnen een celkern die door een dubbel membraan wordt begrensd, en verdeelt haar cytoplasma in door membranen begrensde organellen (Hoofdstuk 6). Zij is groter ( $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) en heeft een inwendig skelet van eiwitfilamenten.

Een bacterie (Escherichia coli), opengesneden. Geen kern, geen organellen: een ringvormig chromosoom los opgevouwen in het cytoplasma tussen duizenden ribosomen, een wand buiten de plasmamembraan, flagellen om te zwemmen en pili om zich te hechten. Lengte ongeveer 2\, µ m. — Een bacterie (*Escherichia coli*), opengesneden. Geen kern, geen organellen: een ringvormig chromosoom los opgevouwen in het cytoplasma tussen duizenden ribosomen, een wand buiten de plasmamembraan, flagellen om te zwemmen en pili om zich te hechten. Lengte ongeveer $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Escherichia coli onder de rasterelektronenmicroscoop (het streepje onderaan het beeld is 2\, µ m). Staafjes van 2\, µ m lang, waarvan er duizend naast elkaar op een millimeter passen; één cel deelt in een rijk medium elke twintig minuten. Beeld: NIAID, publiek domein. — *Escherichia coli* onder de rasterelektronenmicroscoop (het streepje onderaan het beeld is $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ). Staafjes van $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ lang, waarvan er duizend naast elkaar op een millimeter passen; één cel deelt in een rijk medium elke twintig minuten. Beeld: NIAID, publiek domein.

Propositie 5.5 (De bacteriecel)

E. coli, de modelbacterie, is een staafje van $2\,\text{µ}\mathrm{m}$ lang en $0.8\,\text{µ}\mathrm{m}$ breed: een volume van ongeveer $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ met daarin één chromosoom van $4.6 \times 10^{6}$ basenparen ( $1.5\,\mathrm{mm}$ DNA, tienduizendvoudig opgevouwen), zo’n $20\,000$ ribosomen, enkele miljoenen eiwitmoleculen van $2000$ soorten, en vaak een of meer plasmiden — kleine ringvormige DNA-moleculen met extra genen. Haar omhulsel bestaat, van binnen naar buiten, uit de plasmamembraan, een dunne wand van peptidoglycaan (een netwerk van suikerketens dwarsverbonden door korte peptiden, dat de inwendige druk van de cel weerstaat), en een buitenmembraan. Bacteriën met een dikke peptidoglycaanwand en zonder buitenmembraan houden de kristalvioletkleuring van de gramkleuring vast (grampositief); die met een dunne wand onder een buitenmembraan verliezen haar (gramnegatief, zoals E. coli). Flagellen draaien als schroeven; pili hechten de cel aan oppervlakken en aan andere cellen.

Methode 5.6 (De gramkleuring)

Fixeer een dun uitstrijkje bacteriën met warmte op een glaasje.
Kleur met kristalviolet (alle cellen paars) en vervolgens met jodium, dat binnen de cellen een groot complex met de kleurstof vormt.
Spoel met alcohol: het dikke peptidoglycaan van grampositieve cellen krimpt en houdt het complex vast; de dunne wand van gramnegatieve cellen laat het uitspoelen zodra de alcohol de buitenmembraan heeft opgelost.
Kleur na met een roze kleurstof (safranine): grampositieve cellen zien er paars uit, gramnegatieve roze. De uitslag voorspelt de bouw van de wand en daarmee de gevoeligheid voor veel antibiotica.

De afmetingen van de dingen, op een logaritmische schaal, en de instrumenten die ze scheiden. Bacteriën liggen net boven de grens van de lichtmicroscoop; de eukaryote cel is in elke richting tien keer groter, in volume duizend keer.

Voorbeeld 5.7 (Waarom de eukaryote cel gecompartimenteerd is)

Een cel van $20\,\text{µ}\mathrm{m}$ heeft duizend keer het volume van een bacterie, maar slechts honderd keer haar membraanoppervlak (Propositie 1.6). Membranen zijn de plaats waar een cel haar energieomzettende ketens en haar transportsystemen draagt; de eukaryoot wint oppervlak terug door membranen in zichzelf te vouwen — het binnenmembraan van een mitochondrion, de bladen van het endoplasmatisch reticulum — en wint daarbovenop afzonderlijke kamers waarin onverenigbare chemie (vertering in het lysosoom, opbouw in het cytosol) naast elkaar kan verlopen.

5.3 Cellen zien: microscopie

Definitie 5.8 (Vergroting en oplossend vermogen)

Een microscoop vergroot (maakt het beeld groter) en scheidt (houdt naburige punten uit elkaar). Alleen het tweede begrenst wat er te zien is: het oplossend vermogen is de kleinste afstand $d$ tussen twee punten die nog afzonderlijk zichtbaar zijn,

d = \frac{0.61\,\lambda}{\mathrm{NA}},

waarin $\lambda$ de golflengte van de belichting is en $\mathrm{NA}$ de numerieke apertuur van het objectief (de sinus van zijn halve openingshoek maal de brekingsindex van het medium, hoogstens ongeveer $1.4$ met olie). Verder vergroten dan het oplossend vermogen vergroot de vaagheid en niet het detail.

Propositie 5.9 (Licht- en elektronenmicroscopen)

Met zichtbaar licht ( $\lambda \approx 550\,\mathrm{nm}$ ) en $\mathrm{NA} = 1.4$ scheidt de lichtmicroscoop $0.24\,\text{µ}\mathrm{m}$ : cellen, kernen, chloroplasten, mitochondriën als stipjes, bacteriën als staafjes — en levende, bewegende preparaten. Contrast in een doorzichtige cel wordt verkregen door kleuring (die meestal doodt), door fasecontrast (dat verschillen in brekingsindex in verschillen in helderheid omzet), of door fluorescentie (waarbij één molecuul met een kleurstof of een fluorescerend eiwit wordt gemerkt en alleen zijn licht wordt afgebeeld). De elektronenmicroscoop gebruikt elektronen met een golflengte van enkele picometers; zijn praktische oplossend vermogen, begrensd door zijn lenzen, is ongeveer $0.2\,\mathrm{nm}$ in transmissie (TEM: elektronen gaan door een coupe van $50\,\mathrm{nm}$ dik die met zware metalen is gekleurd, en geven de inwendige bouw van organellen) en enkele nanometers bij rastering (SEM: een bundel die over een met metaal bedekt oppervlak wordt gestreken en het reliëf in de diepte geeft). Elektronenmicroscopie vereist vacuüm en dode, gefixeerde, gedroogde preparaten.

De samengestelde lichtmicroscoop: het objectief vormt een vergroot, omgekeerd tussenbeeld, dat het oculair nog eens vergroot voor het oog. De numerieke apertuur van het objectief, en niet de totale vergroting, bepaalt wat er te scheiden valt.

Een samengestelde lichtmicroscoop: lamp en condensor onder de tafel, een revolver met objectieven erboven, binoculaire oculairen. Oplossend vermogen 0.2\, µ m, vergroting tot 1000\,, levende preparaten mogelijk. — Een samengestelde lichtmicroscoop: lamp en condensor onder de tafel, een revolver met objectieven erboven, binoculaire oculairen. Oplossend vermogen $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ , vergroting tot $1000\,$ , levende preparaten mogelijk.

Methode 5.10 (Het instrument kiezen)

Om een levend proces te volgen (celdeling, beweging, een fluorescerend eiwit dat tussen compartimenten verhuist): lichtmicroscopie, fasecontrast of fluorescentie, op ongefixeerde cellen.
Om cellen in een weefsel te tellen en te herkennen: een gefixeerd, gesneden, gekleurd preparaat onder de lichtmicroscoop.
Om de inwendige bouw van een organel, een membraan of een virus te zien: transmissie-elektronenmicroscopie van dunne coupes, of van negatief gekleurde deeltjes.
Om het oppervlaktereliëf van een cel of een weefsel te zien: rasterelektronenmicroscopie.
Om één eiwit te lokaliseren: immunofluorescentie (licht) of immunogoudmerking (elektronen), met een antistof ertegen.

Voorbeeld 5.11 (Een bacterie en een mitochondrion)

Onder de lichtmicroscoop bij $1000\times$ is een cel van E. coli op de schaal van het netvlies een staafje van $2\,\mathrm{mm}$ lang, zonder zichtbare binnenkant; een mitochondrion is een stip op de grens van het oplossend vermogen. In een TEM-coupe toont dezelfde bacterie haar twee membranen, haar wand, haar nucleoïde als een bleek vezelig gebied en haar ribosomen als donkere korrels; het mitochondrion toont zijn dubbele membraan en de plooien van het binnenste. Geen van beide leeft nog.

5.4 Cellen uit elkaar halen en in leven houden

Definitie 5.12 (Celfractionering)

Celfractionering scheidt de onderdelen van een cel voor nader onderzoek. Het weefsel wordt gehomogeniseerd — de cellen worden in een koude, isotone buffer opengebroken door malen of afschuiven, waarbij de organellen heel blijven — en het homogenaat wordt onderworpen aan differentiële centrifugatie: een reeks slingerbeurten met toenemende kracht en duur, die telkens de grootste en dichtste deeltjes die nog in suspensie zijn tot een pellet slaat. Elke fractie wordt herkend aan haar aanblik onder de elektronenmicroscoop en aan merkerenzymen, activiteiten waarvan bekend is dat zij in slechts één compartiment thuishoren.

Differentiële centrifugatie van een homogenaat. Elke slingerbeurt slaat neer wat groter of dichter is dan wat de vorige in suspensie liet: eerst de kernen, dan de mitochondriën, dan de membraanfragmenten, en ten slotte het oplosbare cytosol. Merkerenzymen vertellen welk organel waar terechtkwam.

Fracties na opeenvolgende slingerbeurten: de pellets van kernen, mitochondriën en microsomen, elk onder zijn opgehelderde supernatant.

Propositie 5.13 (Sedimentatie)

Een bolvormig deeltje met straal $r$ en dichtheid $\rho_p$ in een vloeistof met dichtheid $\rho_f$ en viscositeit $\eta$ , in een middelpuntvliedend veld $g_c$ (een veelvoud van $g$ ), sedimenteert met de constante snelheid

v = \frac{2}{9}\,\frac{r^2\,(\rho_p - \rho_f)\,g_c}{\eta}

(de wet van Stokes). De snelheid groeit met het kwadraat van de straal: een kern van $5\,\text{µ}\mathrm{m}$ valt honderd keer sneller dan een mitochondrion van $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , dat weer duizend keer sneller valt dan een ribosoom van $15\,\mathrm{nm}$ . Daarom scheidt dezelfde buis ze bij toenemende toerentallen.

Bewijs. Bij constante snelheid is de wrijvingskracht van Stokes, $6\pi\eta r v$ , in evenwicht met het netto gewicht van het deeltje in de vloeistof, $\frac{4}{3}\pi r^3(\rho_p - \rho_f)g_c$ ; oplossen naar $v$ geeft de formule. ∎

Definitie 5.14 (Celkweek)

Celkweek houdt cellen buiten het organisme in leven en aan het delen, in een steriel medium dat voedingsstoffen, zouten, groeifactoren en, voor dierlijke cellen, een oppervlak om aan te hechten levert, op de temperatuur van het organisme. Bacteriën en gisten groeien in eenvoudige media en verdubbelen in minuten tot uren; dierlijke cellen die rechtstreeks uit een weefsel komen (primaire kweken) delen een beperkt aantal keren, terwijl cellijnen afkomstig van tumoren of getransformeerde cellen zich onbeperkt delen. De kweek maakt van de cel een experimenteel object: één celtype, één medium, één variabele tegelijk.

Voorbeeld 5.15 (Een groeicurve)

Een kolf E. coli in een rijk medium bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : een aanloopfase van een half uur, dan exponentiële groei — het aantal verdubbelt elke $20\,\mathrm{min}$ , dus $N = N_0\,2^{t/20}$ — tot een voedingsstof opraakt of afvalstoffen zich ophopen en de kweek een plateau bereikt van bijna $10^9$ cellen per milliliter. Uit één cel ontstaan in tien uur $2^{30} \approx 10^9$ cellen. Dezelfde curve, met een verdubbelingstijd van een dag, beschrijft een kweek van menselijke cellen.

5.5 Opgaven

Oefening 5.1 ★

Formuleer de drie uitspraken van de celtheorie en noem voor elk een stuk bewijsmateriaal.

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.1.

Alle organismen bestaan uit cellen (elk onderzocht weefsel toont ze onder de microscoop, plantaardig zowel als dierlijk); elke cel komt uit een cel voort (deling waargenomen in embryo’s en bij algen; de kolven van Pasteur sluiten spontane generatie uit); het erfelijk materiaal wordt bij de deling doorgegeven (chromosomen gevolgd door de mitose heen).

Oefening 5.2 ★

Noem vier verschillen tussen een prokaryote en een eukaryote cel.

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.2.

Celkern (afwezig / aanwezig), door membranen begrensde organellen (afwezig / aanwezig), chromosoom (één ringvormig / verscheidene lineaire), grootte ( $0.5\text{ to }5\,\text{µ}\mathrm{m}$ / $10\text{ to }100\,\text{µ}\mathrm{m}$ ), celwand van peptidoglycaan (bacteriën) / van cellulose, chitine of geen, cytoskelet (rudimentair / uitgewerkt).

Oefening 5.3 ★

Hoeveel bacteriën, op een rij gelegd, overbruggen volgens de figuur van de groottes een kikkerei? Hoeveel dierlijke cellen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.3.

$1\,\mathrm{mm}/1\,\text{µ}\mathrm{m} = 1000$ bacteriën; $1000/20 = 50$ dierlijke cellen.

Oefening 5.4 ★

Waarom toont een lichtmicroscoop bij $2000\times$ niet meer detail dan een bij $1000\times$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.4.

Het oplossend vermogen hangt af van de golflengte en de numerieke apertuur, niet van de vergroting; boven ongeveer $1000\times$ vergroot het beeld de vaagheid van de diffractiegrens ( $0.2\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) zonder nog iets nieuws te scheiden.

Oefening 5.5 ★★

Bereken het oplossend vermogen van een objectief met $\mathrm{NA} = 0.65$ in groen licht ( $550\,\mathrm{nm}$ ) en in blauw licht ( $450\,\mathrm{nm}$ ). Kan het twee bacteriën op $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ van elkaar scheiden? En twee ribosomen op $30\,\mathrm{nm}$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.5.

$0.61\times 550/0.65 = 516\,\mathrm{nm}$ ; in blauw $422\,\mathrm{nm}$ . Twee bacteriën op $500\,\mathrm{nm}$ : net aan, in blauw licht; ribosomen op $30\,\mathrm{nm}$ : nee, een factor vijftien te weinig.

Oefening 5.6 ★★

Een gramkleuring van een gemengde kweek toont paarse kokken en roze staafjes. Wat zegt elke kleur over de celwand? Welke van de twee is E. coli?

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.6.

Paars: een dikke peptidoglycaanwand die het complex van kristalviolet en jodium vasthoudt, zonder buitenmembraan (grampositief). Roze: dun peptidoglycaan onder een buitenmembraan, kleurstof uitgespoeld, nagekleurd (gramnegatief). E. coli is een gramnegatief staafje: de roze staafjes.

Oefening 5.7 ★★

Bereken met de wet van Stokes, met $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ en $\rho_p - \rho_f = 100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ , de sedimentatiesnelheid van een mitochondrion ( $r = 0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) bij $10\,000\,g$ en de tijd om $5\,\mathrm{cm}$ af te leggen. Herhaal dat voor een kern ( $r = 4\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) bij $1000\,g$ .

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.7.

Mitochondrion: $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81\times 10^4/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ in $92\,\mathrm{s}$ . Kern bij $1000\,g$ : $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ in $14\,\mathrm{s}$ .

Oefening 5.8 ★★

De merkeractiviteiten van een homogenaat zijn: succinaatdehydrogenase $80\,\%$ in pellet 2, $15\,\%$ in pellet 1, $5\,\%$ in het supernatant; lactaatdehydrogenase $95\,\%$ in het laatste supernatant. Duid elk getal, inclusief de $15\,\%$ in pellet 1.

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.8.

Succinaatdehydrogenase is mitochondriaal: $80\,\%$ van de mitochondriën zit in pellet 2; de $15\,\%$ in pellet 1 zijn mitochondriën die in hele cellen en resten gevangen zitten of met de kernen zijn meegesleept; de $5\,\%$ in het supernatant komt van mitochondriën die tijdens het homogeniseren zijn stukgegaan. Lactaatdehydrogenase is cytosolisch en oplosbaar: het blijft in het laatste supernatant.

Oefening 5.9 ★★

Welke microscoop zou je gebruiken om (a) een witte bloedcel een bacterie te zien opslokken, (b) de mitochondriën in een coupe spier te tellen, (c) de poriën van een kernenvelop te zien, (d) de vorm van het oppervlak van een stuifmeelkorrel te zien? Verantwoord elke keuze.

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.9.

(a) Fasecontrastlichtmicroscopie op levende cellen (het proces duurt minuten en vraagt levende cellen). (b) Lichtmicroscopie van een gekleurde coupe, of TEM voor de zekerheid (mitochondriën liggen op de grens van het licht). (c) TEM (de poriën zijn $100\,\mathrm{nm}$ ). (d) SEM (oppervlaktereliëf).

Oefening 5.10 ★★★

De kolven van Pasteur: een bouillon die in een zwanenhalskolf is gekookt blijft onbeperkt helder; kantelt men de kolf zodat de bouillon het stof in de hals raakt, dan wordt zij binnen twee dagen troebel. Leg uit wat elke waarneming uitsluit en wat het paar bewijst, en zeg waarom koken in een afgesloten kolf op zichzelf de vraag niet had beslecht.

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.10.

De heldere kolf sluit uit dat de lucht zelf, of de gekookte bouillon zelf, leven voortbrengt: de lucht komt vrij door de open hals naar binnen. De troebele kolf toont, na contact met het stof, dat wat de hals had opgevangen — deeltjes uit de lucht — de bron van de organismen is. Samen bewijzen zij dat microben uit door stof aangevoerde microben voortkomen. Bij een afgesloten gekookte kolf bleef de tegenwerping open dat het afsluiten de lucht buitensloot die een “levenskracht” nodig had; de zwanenhals laat lucht toe en houdt alleen stof tegen.

Oefening 5.11 ★★★

Een kweek van E. coli begint met $10^3$ cellen per milliliter en verdubbelt elke $25\,\mathrm{min}$ . Wanneer bereikt zij $10^8$ per milliliter? Als elke cel een massa van $1\,\mathrm{pg}$ heeft, hoeveel bacteriemassa zit er dan op dat moment in een liter, en waarom stopt de groei kort daarna, zelfs bij een overmaat glucose?

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.11.

$10^5 = 2^{n}$ geeft $n = 16.6$ verdubbelingen, oftewel $415\,\mathrm{min}$ , ongeveer $7\,\mathrm{h}$ . $10^8\times 10^3\,\mathrm{mL}\times1\,\mathrm{pg} = 0.1\,\mathrm{g}$ per liter. De groei stopt omdat zuurstof (die het medium maar tot enkele milligrammen per liter kan leveren), een mineraal, of de ophoping van zuren en afvalstoffen beperkend wordt, en niet de glucose.

Oefening 5.12 ★★★

“De eukaryote cel is een bacterie die heeft leren vouwen.” Bespreek dat in een alinea, aan de hand van de verhouding tussen oppervlak en volume, de membranen van organellen, en wat compartimenten mogelijk maken.

Oplossing

Oplossing van Oefening 5.12.

Een cel die in elke richting tien keer groter is, heeft per volume-eenheid een tiende van het membraanoppervlak; omdat membranen de energieomzettende en transporterende machinerie dragen, zou de grote cel verhongeren. De eukaryoot vermenigvuldigt haar membraan door het in zichzelf te vouwen (endoplasmatisch reticulum, binnenmembraan van het mitochondrion, thylakoïden) en schept daarmee tevens gesloten compartimenten waarin onverenigbare processen — zure vertering, oxidatieve chemie, opslag van DNA — elk onder eigen omstandigheden verlopen. Het beeld klopt voor zover het over membranen gaat, en is onvolledig: de eukaryoot won ook een cytoskelet en een kern, en haar mitochondriën zijn afstammelingen van opgeslokte bacteriën, geen plooien.

5.6 Vraagstuk: een lever fractioneren

Probleem 5.1

Weekendvraagstuk — tien gram rattenlever uit elkaar gehaald door centrifugatie: pellets, merkers, de wet van Stokes en de balans van een enzym, eindigend op de zuiveringsfactor van de mitochondriale fractie

$10\,\mathrm{g}$ rattenlever wordt gehomogeniseerd in $50\,\mathrm{mL}$ koude isotone sucrose en in drie stappen geslingerd: $1000\,g$ gedurende $10\,\mathrm{min}$ (pellet 1), $10\,000\,g$ gedurende $20\,\mathrm{min}$ (pellet 2), $100\,000\,g$ gedurende $60\,\mathrm{min}$ (pellet 3), waarna het laatste supernatant overblijft. Het eiwitgehalte en twee enzymactiviteiten worden gemeten in het homogenaat en in elke fractie:

fractie	eiwit (mg)	succinaatdehydrogenase (U)	lactaatdehydrogenase (U)
homogenaat	2000	100	400
pellet 1	500	15	20
pellet 2	200	60	12
pellet 3	300	5	8
laatste supernatant	950	4	350

Neem $\eta = 1 \times 10^{-3}\,\mathrm{Pa}\,\mathrm{s}$ voor het medium, een sedimentatieweg van $5\,\mathrm{cm}$ , en $g = 9.81\,\mathrm{m}/\mathrm{s}^{2}$ .

Deel I — Wat waar zit.

Noem het belangrijkste organel in elke pellet.
Waarom moet het homogenisatiemedium koud en isotoon zijn?
Succinaatdehydrogenase is een merker van welk compartiment? En lactaatdehydrogenase van welk?
Bereken de terugvinding van het eiwit: de som over de fracties als percentage van het homogenaat. Becommentarieer dat.
Bereken op dezelfde manier de terugvinding van elke enzymactiviteit.
Bereken het eiwitgehalte per gram lever en de fractie van de verse massa van de lever die uit eiwit bestaat.

Deel II — De wet van Stokes. Mitochondriën: straal $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , dichtheidsoverschot $100\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ . Kernen: straal $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ , hetzelfde overschot. Ribosomen: straal $12\,\mathrm{nm}$ , dichtheidsoverschot $600\,\mathrm{kg}/\mathrm{m}^{3}$ .

Bereken de sedimentatiesnelheid van een mitochondrion bij $10\,000\,g$ en de tijd om $5\,\mathrm{cm}$ af te leggen. Is $20\,\mathrm{min}$ genoeg?
Bereken de afstand die een mitochondrion tijdens de eerste slingerbeurt aflegt ( $1000\,g$ , $10\,\mathrm{min}$ ). Welk deel van de mitochondriën, bij aanvang gelijkmatig verdeeld, zou in de eerste stap worden neergeslagen?
Vergelijk dat met de $15\,\%$ succinaatdehydrogenase die in pellet 1 wordt gevonden. Wat kan mitochondriën nog meer mee naar pellet 1 slepen?
Bereken de tijd die een kern nodig heeft om bij $1000\,g$ $5\,\mathrm{cm}$ af te leggen.
Bereken de tijd die een ribosoom nodig heeft om bij $100\,000\,g$ $5\,\mathrm{cm}$ af te leggen. Zou een ribosoom bij $10\,000\,g$ in $20\,\mathrm{min}$ worden neergeslagen?
Leg uit waarom de reeks slingerbeurten oploopt in kracht en waarom elke stap lang genoeg maar niet te lang moet duren.

Deel III — Specifieke activiteit en zuivering. De specifieke activiteit van een enzym in een fractie is zijn activiteit per milligram eiwit. De zuiveringsfactor van een fractie voor een enzym is zijn specifieke activiteit gedeeld door die in het homogenaat; de opbrengst is de activiteit van de fractie gedeeld door die van het homogenaat.

Bereken de specifieke activiteit van succinaatdehydrogenase in het homogenaat en in elke fractie.
Bereken de zuiveringsfactor en de opbrengst van succinaatdehydrogenase in pellet 2.
Bereken de zuiveringsfactor van succinaatdehydrogenase in pellet 3 en duid de waarde ervan.
Bereken de specifieke activiteit van lactaatdehydrogenase in het homogenaat en in het laatste supernatant, en de bijbehorende zuiveringsfactor en opbrengst.
Waarom is de zuiveringsfactor van het cytosolische enzym lager dan die van het mitochondriale enzym, hoewel zijn opbrengst hoger is?
Pellet 2 bevat $12\,\mathrm{U}$ lactaatdehydrogenase. Is het enzym gedeeltelijk mitochondriaal? Stel een betere verklaring voor en een manier om die te toetsen.
Welk deel van het levereiwit is mitochondriaal, als alle succinaatdehydrogenase mitochondriaal is en pellet 2 voor $60\,\%$ zuiver is? (Aanwijzing: gebruik de specifieke activiteit van zuivere mitochondriën, afgeleid uit pellet 2, en de totale activiteit.)

Deel IV — De fracties controleren.

Pellet 2 wordt met elektronenmicroscopie bekeken: welk instrument en welke bereiding, en wat zou er te zien moeten zijn?
Hoe zou je pellet 1 op hele cellen controleren, en wat zou je doen als je er veel vond?
Pellet 2 wordt opnieuw in suspensie gebracht, op een sucrosedichtheidsgradiënt gelaagd en vervolgens geslingerd tot elk deeltje stilstaat waar zijn dichtheid gelijk is aan die van het medium. Mitochondriën vormen een band bij $1.18\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ , lysosomen bij $1.22\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ , peroxisomen bij $1.24\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . Leg uit waarom deze scheiding werkt terwijl differentiële centrifugatie haar niet tot stand kon brengen.
De activiteit van zure fosfatase in pellet 2 stijgt scherp zodra er een detergens aan de bepaling wordt toegevoegd. Verklaar dat, en zeg wat het zegt over de toestand van de lysosomen in de pellet.
Een student homogeniseert in zuiver water in plaats van in isotone sucrose. Voorspel het effect op pellet 2 en op de verdeling van succinaatdehydrogenase en zure fosfatase.
Vat het resultaat samen: de zuiveringsfactor en de opbrengst van de mitochondriale fractie, en wat elk van beide begrenst.

Oplossing

Oplossing van Probleem 5.1.

1. Pellet 1: kernen (en hele cellen, resten). Pellet 2: mitochondriën (met lysosomen en peroxisomen). Pellet 3: microsomen (fragmenten van endoplasmatisch reticulum) en ribosomen. 2. De kou vertraagt de enzymen (waaronder de proteasen en fosfolipasen die bij het breken vrijkomen) en behoudt de organellen; isotoon opdat de organellen niet opzwellen en barsten en ook niet krimpen. 3. Mitochondriën (binnenmembraan); cytosol. 4. $500 + 200 + 300 + 950 = 1950\,\mathrm{mg}$ , $97.5\,\%$ : verliezen op de buiswanden en bij het overbrengen. 5. SDH: $15 + 60 + 5 + 4 = 84$ , $84\,\%$ (een deel van de activiteit gaat verloren door schade aan de mitochondriën). LDH: $20 + 12 + 8 + 350 = 390$ , $97.5\,\%$ . 6. $2000/10 = 200\,\mathrm{mg}/\mathrm{g}$ : $20\,\%$ van de verse massa (de rest is grotendeels water). 7. $v = \frac{2}{9}\times(5\times 10^{-7})^2\times 100\times 9.81 \times 10^{4}/10^{-3} = 5.4 \times 10^{-4}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ in $92\,\mathrm{s}$ : $20\,\mathrm{min}$ is ruim voldoende. 8. Bij $1000\,g$ is $v = 5.4 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; in $600\,\mathrm{s}$ , $3.3\,\mathrm{cm}$ . Gelijkmatig over $5\,\mathrm{cm}$ verdeeld bereiken de mitochondriën die binnen $3.3\,\mathrm{cm}$ van de bodem zitten die bodem: $65\,\%$ , als er niets anders tussenkwam. 9. In werkelijkheid slaat maar $15\,\%$ neer: een echte pellet houdt niet alles vast wat haar bereikt (de opeengepakte kernen worden voorzichtig weer in suspensie gebracht en de losse bovenlaag blijft in het supernatant), en de formule overschat de snelheid van niet-bolvormige, gehydrateerde organellen. Mitochondriën in hele cellen en mitochondriën die aan kernen kleven komen eveneens in pellet 1 terecht. 10. $v = \frac{2}{9}\times(4\times 10^{-6})^2\times 100\times 9810/10^{-3} = 3.5 \times 10^{-3}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $14\,\mathrm{s}$ . 11. $v = \frac{2}{9}\times(1.2\times 10^{-8})^2\times 600\times 9.81 \times 10^{5}/10^{-3} = 1.9 \times 10^{-5}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ ; $5\,\mathrm{cm}$ in $2650\,\mathrm{s}$ , $44\,\mathrm{min}$ . Bij $10\,000\,g$ is de snelheid $1.9 \times 10^{-6}\,\mathrm{m}/\mathrm{s}$ : in $20\,\mathrm{min}$ $2.3\,\mathrm{mm}$ , zodat ribosomen in supernatant 2 blijven. 12. De snelheid gaat als $r^2$ : bij lage kracht bewegen alleen de grootste deeltjes merkbaar, zodat elke stap één klasse neerslaat en de kleinere achterlaat. Te kort, en de klasse slaat onvolledig neer; te lang, en de volgende klasse begint de pellet te verontreinigen. 13. Homogenaat $100/2000 = 0.05\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; pellet 1 $15/500 = 0.03$ ; pellet 2 $60/200 = 0.30$ ; pellet 3 $5/300 = 0.017$ ; supernatant $4/950 = 0.004$ . 14. Zuivering $0.30/0.05 = 6$ ; opbrengst $60/100 = 60\,\%$ . 15. $0.017/0.05 = 0.33$ : pellet 3 is arm aan mitochondriën; de geringe activiteit die zij bevat komt van fragmenten mitochondriaal membraan die bij het homogeniseren zijn ontstaan en die met de microsomen sedimenteren. 16. LDH: homogenaat $400/2000 = 0.2\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; supernatant $350/950 = 0.37\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; zuivering $1.8$ ; opbrengst $87.5\,\%$ . 17. Het cytosol is de helft van het celeiwit, zodat zelfs een zuiver cytosol de specifieke activiteit hooguit kan verdubbelen; de mitochondriën zijn een zesde of minder, zodat het isoleren ervan hun enzymen zesvoudig of sterker concentreert. De opbrengst is hoog voor het oplosbare enzym omdat het niet met beschadigde organellen verloren gaat. 18. Nee: pellet 2 bevat $200\,\mathrm{mg}$ eiwit en houdt supernatant tussen haar deeltjes vast; $12\,\mathrm{U}$ is $3\,\%$ van het totaal, wat past bij ingesloten cytosol. Toets: was de pellet (opnieuw in suspensie brengen en opnieuw slingeren): een ingesloten enzym verdwijnt, een gebonden enzym blijft. 19. Als pellet 2 voor $60\,\%$ uit mitochondriën bestaat, hebben zuivere mitochondriën $0.30/0.6 = 0.5\,\mathrm{U}/\mathrm{mg}$ ; de $100\,\mathrm{U}$ van de lever komt dan overeen met $200\,\mathrm{mg}$ mitochondriaal eiwit, $10\,\%$ van de $2000\,\mathrm{mg}$ . 20. TEM van een gefixeerde, ingebedde, dun gesneden en met zware metalen gekleurde pellet: boonvormige profielen met een dubbele membraan en cristae, met daartussen enkele lysosomen (dichte lichaampjes) en peroxisomen. 21. Bekijk een druppel van de opnieuw gesuspendeerde pellet onder de fasecontrastmicroscoop en tel de hele cellen tussen de vrije kernen; zijn het er veel, homogeniseer dan grondiger (meer slagen, een strakkere stamper) en slinger opnieuw, want ingesloten organellen drukken elke opbrengst. 22. Differentiële centrifugatie scheidt op grootte (snelheid $\propto r^2$ ) en de drie organellen hebben vergelijkbare afmetingen; in een dichtheidsgradiënt stopt een deeltje bij zijn eigen dichtheid, ongeacht zijn grootte, en de drie dichtheden verschillen wel. 23. Intacte lysosomen houden het enzym achter een membraan waar het substraat niet doorheen komt (latentie); het detergens breekt de membraan en stelt het bloot. De lysosomen in de pellet zijn dus grotendeels intact. 24. Water is hypotoon: de organellen zwellen op en barsten. Mitochondriën en lysosomen scheuren, zodat pellet 2 kleiner wordt; succinaatdehydrogenase (membraangebonden) gaat deels als membraanfragment naar pellet 3; zure fosfatase (oplosbaar binnen het lysosoom) komt vrij in het laatste supernatant. 25. Zuiveringsfactor $6$ , opbrengst $60\,\%$ . De factor wordt begrensd door verontreiniging (lysosomen, peroxisomen, ingesloten cytosol: pellet 2 is voor $60\,\%$ mitochondriën); de opbrengst door mitochondriën die aan pellet 1 verloren gaan (ingesloten) en die tijdens het homogeniseren stukgaan.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst