Universitaire biologie — jaar 1 · Bachelor Year 1

13Enzymen en biochemische katalyse

Giet waterstofperoxide op een doorgesneden aardappel en het schuimt: één enkel molecuul katalase in de cellen van de aardappel splitst elke seconde veertig miljoen moleculen peroxide, een reactie die aan zichzelf overgelaten jaren zou duren. Het peroxide zou toch al uiteenvallen — de reactie gaat bergaf — maar niet in een bruikbare tijd. Elke reactie van de cel is zo: de thermodynamica zegt welke kant zij op kan, en een enzym zegt of zij nu gebeurt. Dit hoofdstuk beschrijft wat een enzym met een reactie doet, de kinetiek waarmee enzymen worden gemeten en vergeleken, de manieren waarop zij worden geremd, en de manieren waarop de cel ze aan- en uitzet.

13.1 Katalyse

Definitie 13.1 (Enzym, substraat, actieve plaats)

Een enzym is een eiwit (zelden een RNA) dat een reactie katalyseert: het verhoogt de snelheid zonder zelf te worden verbruikt en zonder het evenwicht te verschuiven. De moleculen waarop het inwerkt zijn zijn substraten; die binden in de actieve plaats, een spleet die door enkele residuen wordt bekleed en waar de chemie gebeurt. Enzymen zijn specifiek — voor één substraat of een familie, voor één binding, voor één stereo-isomeer — en zij worden genoemd naar hun substraat en reactie met het achtervoegsel -ase (lactase, DNA-polymerase, succinaatdehydrogenase), in zes klassen: oxidoreductasen, transferasen, hydrolasen, lyasen, isomerasen, ligasen. Vele hebben een niet-eiwitachtige cofactor nodig: een metaalion (Zn, Mg, Fe), of een organisch co-enzym — $\mathrm{NAD^+}$ , FAD, co-enzym A, die vrijwel allemaal uit vitaminen worden gemaakt, en daar dienen vitaminen voor.

Propositie 13.2 (Wat een enzym verandert en wat niet)

Een reactie gaat door een overgangstoestand, een gespannen rangschikking van de atomen die in vrije energie hoger ligt dan de reactanten of de producten, met het verschil de activeringsenergie $E_a$ ; alleen de moleculen die de thermische beweging over deze barrière tilt reageren, in een aandeel dat evenredig is met $e^{-E_a/RT}$ . Een enzym bindt de overgangstoestand steviger dan het substraat — zijn actieve plaats is complementair aan de gespannen vorm — en verlaagt zo $E_a$ : haar bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ met $34\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ verlagen (de waarde van enkele waterstofbruggen) vermenigvuldigt de snelheid met $e^{34\,000/2580} \approx 10^6$ . Het verandert $\Delta G$ of de evenwichtsconstante niet, die alleen van de reactanten en producten afhangen: een enzym versnelt de voorwaartse en de achterwaartse reactie evenveel en brengt het systeem sneller naar hetzelfde evenwicht.

De vrije energie langs een reactie. Het enzym (rood) verlaagt de barrière van de overgangstoestand en laat het verschil tussen substraat en product — en daarmee het evenwicht — onaangeroerd.

Waterstofperoxide op een doorgesneden aardappel: katalase in de cellen splitst het per enzymmolecuul veertig miljoen keer per seconde in water en zuurstof, en de zuurstof schuimt eruit.

Propositie 13.3 (Hoe de actieve plaats werkt)

Een actieve plaats versnelt haar reactie op verscheidene manieren tegelijk: zij bindt en richt de substraten zodat de reagerende groepen elkaar in de juiste meetkunde ontmoeten, waarmee een zeldzame botsing door een zekere wordt vervangen; zij spant het substraat naar de overgangstoestand toe (induced fit: het enzym sluit zich om het substraat, en de pasvorm is het best voor de overgangstoestand); haar zijketens werken als zuren en basen en geven op het juiste moment protonen aan het substraat en nemen ze weer op (histidine, met haar p $K_a$ dicht bij 7, doet dat in veel enzymen); sommige vormen een tijdelijke covalente binding met het substraat (serineproteasen); en haar metaalionen polariseren bindingen en stabiliseren ladingen. Water wordt grotendeels uit de plaats geweerd, zodat ladingen en waterstofbruggen op volle sterkte werken.

Voorbeeld 13.4 (Drie enzymen)

Lysozym, in tranen en eiwit, spant een suikerring van de bacteriewand tot de vorm van de overgangstoestand en knipt de keten: een versnelling met een factor $10^8$ . Koolzuuranhydrase, in rode cellen, houdt een zinkion vast dat water omzet in een hydroxide dat klaarstaat om $\mathrm{CO_2}$ aan te vallen: een miljoen moleculen per seconde, het snelste enzym na katalase. Chymotrypsine, in het alvleeskliersap, gebruikt een serine die door een histidine reactief is gemaakt om eiwitten na aromatische residuen te knippen: honderd per seconde, met een covalent tussenproduct.

13.2 Enzymkinetiek

Definitie 13.5 (Beginsnelheid, verzadiging)

De snelheid $v$ van een enzymreactie is de hoeveelheid product die per tijdseenheid wordt gevormd ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , of enzymeenheden: $1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). Zij wordt gemeten als de beginsnelheid $v_0$ , voordat het substraat op raakt of het product zich ophoopt. Bij een vaste enzymconcentratie stijgt $v_0$ met de substraatconcentratie $[S]$ en verzadigt zij dan bij een maximum $V_{\max}$ : het enzym is volledig bezet en kan niet sneller.

Stelling 13.6 (Michaelis–Menten)

Voor een enzym $E$ dat zijn substraat omkeerbaar bindt en omzet,

E + S \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} ES \overset{k_{\text{cat}}}{\longrightarrow} E + P ,

de beginsnelheid bij substraatconcentratie $[S]$ is

v_0 = \frac{V_{\max}\,[S]}{K_m + [S]}, \qquad V_{\max} = k_{\text{cat}}\,[E]_{\text{tot}}, \qquad K_m = \frac{k_{-1} + k_{\text{cat}}}{k_1} .

$K_m$ , de michaelisconstante, is de substraatconcentratie waarbij de snelheid de helft van haar maximum is, en meet hoeveel substraat het enzym nodig heeft; $k_{\text{cat}}$ , het omzetgetal, is het aantal substraatmoleculen dat één enzym per seconde omzet wanneer het verzadigd is; de verhouding $k_{\text{cat}}/K_m$ is de katalytische efficiëntie, de snelheidsconstante bij weinig substraat, van boven begrensd door de snelheid waarmee substraat het enzym door diffusie kan bereiken, ongeveer $10^8$ – $10^9$ $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ .

Bewijs. Neem een stationaire toestand aan waarin $ES$ even snel wordt gevormd als het verdwijnt (geldig na de eerste milliseconden, zolang $[S] \gg [E]$ ): $k_1[E][S] = (k_{-1} + k_{\text{cat}})[ES]$ , dus $[E][S] = K_m[ES]$ met $K_m$ zoals gedefinieerd. Behoud geeft $[E] = [E]_{\text{tot}} - [ES]$ ; invullen geeft $([E]_{\text{tot}} - [ES])[S] = K_m[ES]$ , dus $[ES] = [E]_{\text{tot}}[S]/(K_m + [S])$ . De snelheid is $v_0 = k_{\text{cat}}[ES]$ , wat de formule geeft; bij $[S] \gg K_m$ is $v_0 \to k_{\text{cat}}[E]_{\text{tot}} = V_{\max}$ , en bij $[S] = K_m$ is $v_0 = V_{\max}/2$ . ∎

Links: de michaelis-mentenhyperbool voor K_m = 2\, mmol/ L en V_ = 1\, µ mol/ min, met de zes gemeten punten van het weekendvraagstuk. Rechts: dezelfde gegevens als lineweaver-burkplot, 1/v_0 tegen 1/[S]: een rechte lijn waarvan de snijpunten V_ en K_m geven. — Links: de michaelis-mentenhyperbool voor $K_m = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ en $V_{\max} = 1\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , met de zes gemeten punten van het weekendvraagstuk. Rechts: dezelfde gegevens als lineweaver-burkplot, $1/v_0$ tegen $1/[S]$ : een rechte lijn waarvan de snijpunten $V_{\max}$ en $K_m$ geven.

Methode 13.7 ( $K_m$ en $V_{\max}$ meten)

Maak een reeks substraatconcentraties van $K_m/4$ tot $10K_m$ , met telkens dezelfde enzymconcentratie; volg het product (kleur, absorptie, gas) de eerste minuut en neem de helling als $v_0$ .
Zet $v_0$ uit tegen $[S]$ : de hyperbool geeft een ruwe $V_{\max}$ (het plateau) en $K_m$ (de concentratie bij de helft daarvan).
Keer voor meer precisie om: $1/v_0 = (K_m/V_{\max})(1/[S]) + 1/V_{\max}$ (Lineweaver–Burk). Het snijpunt van de lijn met de $y$ -as is $1/V_{\max}$ , dat met de $x$ -as $-1/K_m$ , en de helling is $K_m/V_{\max}$ .
Deel $V_{\max}$ door de enzymconcentratie om $k_{\text{cat}}$ te krijgen; deel door $K_m$ voor de efficiëntie. Herhaal met een remmer om te zien welke parameter die verandert.

Een enzymbepaling: het product neemt licht op, en de spectrofotometer registreert het verschijnen ervan seconde na seconde; de beginhelling is v_0. — Een enzymbepaling: het product neemt licht op, en de spectrofotometer registreert het verschijnen ervan seconde na seconde; de beginhelling is $v_0$ .

Voorbeeld 13.8 (Enzymen vergeleken)

enzym	$K_m$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ )	$k_{\text{cat}}$ ( $\mathrm{s}^{-1}$ )	$k_{\text{cat}}/K_m$ ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ )
katalase	$2.5 \times 10^{-2}$	$4 \times 10^{7}$	$1.6 \times 10^{9}$
koolzuuranhydrase	$1.2 \times 10^{-2}$	$1 \times 10^{6}$	$8 \times 10^{7}$
chymotrypsine	$1.5 \times 10^{-2}$	100	$7 \times 10^{3}$
lysozym	$6 \times 10^{-6}$	0.5	$8 \times 10^{4}$
DNA-polymerase	$1 \times 10^{-5}$	15	$1.5 \times 10^{6}$

Katalase en koolzuuranhydrase werken op de diffusiegrens: elke botsing met substraat is vruchtbaar. Chymotrypsine is traag, maar dat moet ook — het knipt een peptidebinding door, een veel zwaardere klus dan peroxide splitsen.

13.3 Remming

Definitie 13.9 (Remmers)

Een remmer verlaagt de snelheid van een enzym. Onomkeerbare remmers binden covalent en vernietigen de activiteit van het enzym voorgoed (zenuwgassen op acetylcholinesterase, penicilline op het enzym dat de bacteriewand dwarsverbindt, aspirine op het enzym dat prostaglandinen maakt). Omkeerbare remmers binden met zwakke bindingen en kunnen worden weggewassen; naar de plaats waar zij binden:

competitief: de remmer lijkt op het substraat en bezet de actieve plaats; hij verhoogt de schijnbare $K_m$ (met de factor $1 + [I]/K_i$ ) en laat $V_{\max}$ ongemoeid — genoeg substraat verdringt hem;
niet-competitief: de remmer bindt elders en bederft de katalyse, of er nu substraat is gebonden of niet; hij verlaagt $V_{\max}$ en laat $K_m$ ongemoeid — geen hoeveelheid substraat overwint hem;
ancompetitief: de remmer bindt alleen het $ES$ -complex; zowel $V_{\max}$ als $K_m$ dalen.

$K_i$ , de dissociatieconstante van de remmer, meet zijn kracht: hoe lager, hoe sterker.

Lineweaver-burkplots met de twee gebruikelijke remmers. Een competitieve remmer draait de lijn om het snijpunt met de y-as (V_ onveranderd, K_m verhoogd); een niet-competitieve draait haar om het snijpunt met de x-as (K_m onveranderd, V_ verlaagd). — Lineweaver-burkplots met de twee gebruikelijke remmers. Een competitieve remmer draait de lijn om het snijpunt met de $y$ -as ( $V_{\max}$ onveranderd, $K_m$ verhoogd); een niet-competitieve draait haar om het snijpunt met de $x$ -as ( $K_m$ onveranderd, $V_{\max}$ verlaagd).

Voorbeeld 13.10 (Concurrentie als geneesmiddel)

Methanol is onschadelijk tot het alcoholdehydrogenase van de lever het in formaldehyde en mierenzuur omzet, die blind maken en doden. De behandeling is ethanol: een concurrerend substraat met een lagere $K_m$ , dat het enzym bezig houdt terwijl het methanol onveranderd wordt uitgescheiden. Statinen zijn competitieve remmers, die op de overgangstoestand lijken, van het enzym dat koolstof aan cholesterol vastlegt; sulfonamiden lijken op het substraat van een bacterieel enzym dat folaat maakt, dat de mens niet maakt en dus ook niet mist.

13.4 Regeling

Definitie 13.11 (Allosterische enzymen)

Een allosterisch enzym heeft verscheidene subeenheden en, naast zijn actieve plaatsen, regelplaatsen waar effectoren binden: activatoren verschuiven het naar zijn actieve conformatie, remmers naar de inactieve. Zijn snelheid tegen $[S]$ is sigmoïde en niet hyperbolisch (coöperativiteit tussen de actieve plaatsen, zoals bij hemoglobine, Hoofdstuk 12), zodat een kleine verandering van het substraat dicht bij het steile deel de snelheid sterk verandert; effectoren verschuiven de curve zijwaarts (waarmee de benodigde substraatconcentratie verandert) of omhoog en omlaag (waarmee de maximale snelheid verandert). Allosterische enzymen staan op de vertakkingspunten van de stofwisseling, en de effectoren zijn de eigen producten van de route en de energiesignalen van de cel (ATP, ADP, AMP).

Een allosterisch enzym. De sigmoïde curve maakt de snelheid rond het middelpunt gevoelig voor het substraat; een activator schuift haar naar links (actiever bij een gegeven [S]), een remmer naar rechts. Rond [S] = 3 kan de snelheid van een tiende tot negen tiende van het maximum uitslaan. — Een allosterisch enzym. De sigmoïde curve maakt de snelheid rond het middelpunt gevoelig voor het substraat; een activator schuift haar naar links (actiever bij een gegeven $[S]$ ), een remmer naar rechts. Rond $[S] = 3$ kan de snelheid van een tiende tot negen tiende van het maximum uitslaan.

Propositie 13.12 (Vier manieren waarop de cel een enzym regelt)

Feedbackremming: het eindproduct van een route is een allosterische remmer van het eerste vastleggende enzym ervan, zodat de route niet sneller loopt dan het product wordt verbruikt (isoleucine op threoninedeaminase; ATP op fosfofructokinase, Hoofdstuk 15). Reactietijd: milliseconden.
Covalente modificatie: een kinase hangt een fosfaat aan een serine, threonine of tyrosine van het enzym, een fosfatase haalt het eraf, en de twee vormen verschillen in activiteit (glycogeenfosforylase wordt door fosforylering aangezet, glycogeensynthase uitgezet, door hetzelfde hormonale signaal). Seconden tot minuten; omkeerbaar; in cascades te versterken.
Proteolytische activering: sommige enzymen worden als inactieve voorlopers gemaakt (zymogenen: trypsinogeen, pepsinogeen, de stollingsfactoren) en aangezet door er een peptide af te knippen, eens en voorgoed, waar en wanneer zij gewenst zijn.
Hoeveelheid: de cel maakt meer of minder van het enzym door zijn gen te sturen (Hoofdstuk 20) en breekt het sneller of trager af. Minuten tot uren.

Voorbeeld 13.13 (Iso-enzymen)

Lactaatdehydrogenase bestaat in vijf vormen, tetrameren van twee typen subeenheid in alle combinaties; de vorm van het hart heeft een lage $K_m$ voor lactaat en wordt door pyruvaat geremd (zij oxideert lactaat om de krebscyclus te voeden), die van de spier heeft een hoge $V_{\max}$ en verdraagt pyruvaat (zij maakt lactaat tijdens een sprint). Het patroon van de vormen in het bloed verraadt welk orgaan beschadigd is — bij een hartinfarct komt die van het hart vrij.

13.5 Temperatuur en pH

Propositie 13.14 (Enzymen en hun omgeving)

De snelheid van een enzymreactie verdubbelt ruwweg per $10\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ ( $Q_{10} \approx 2$ ) naarmate de thermische energie meer moleculen over de barrière tilt, tot het enzym begint te ontvouwen ( $40\text{ to }60\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ bij de meeste; $100\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ bij de enzymen van bacteriën uit hete bronnen) en de snelheid instort. Elk enzym heeft een pH-optimum, waar de ionisatie van zijn katalytische residuen en van zijn substraat juist goed is: pepsine, in de maag, rond pH 2; trypsine, in de darm, rond 8; de meeste enzymen binnen de cel rond 7. Weg van het optimum daalt de snelheid, en ver ervandaan denatureert het eiwit. Temperatuur en pH werken op het eiwit in; de cel houdt beide binnen het gebied waarin haar duizend enzymen alle werken.

Voorbeeld 13.15 (Koorts en een hete bron)

Koorts van $40\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ versnelt elke reactie van het lichaam met een kwart en begint de kwetsbaarste eiwitten te ontvouwen; bij $42\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ begeven die van de hersenen het. Het DNA-polymerase van een bacterie uit een bron van $75\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ overleeft $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , en daarom kan het duizenden keren door het smelten van DNA heen worden gecycled en werd het het enzym van de polymerasekettingreactie (het deel van jaar 3): thermostabiliteit is een eigenschap van de sequentie, niet van de gekatalyseerde chemie.

13.6 Opgaven

Oefening 13.1 ★

Wat verandert een enzym aan een reactie, en wat laat het ongemoeid? Illustreer dat met het energieprofiel.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.1.

Het verlaagt de activeringsenergie (de hoogte van de overgangstoestand), en daarmee de snelheid, in beide richtingen; het laat $\Delta G$ , de evenwichtsconstante en de ligging van het evenwicht ongemoeid. Op het profiel wordt de piek verlaagd, de twee uiteinden niet.

Oefening 13.2 ★

Definieer $K_m$ , $V_{\max}$ , $k_{\text{cat}}$ en $k_{\text{cat}}/K_m$ , met eenheden.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.2.

$K_m$ : de substraatconcentratie bij de helft van $V_{\max}$ ( $\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ ). $V_{\max}$ : de snelheid bij verzadigend substraat ( $\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ , of $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ). $k_{\text{cat}}$ : het aantal substraatmoleculen dat per seconde per enzym bij verzadiging wordt omgezet ( $\mathrm{s}^{-1}$ ). $k_{\text{cat}}/K_m$ : de efficiëntie, de tweede-ordesnelheidsconstante bij weinig substraat ( $\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ ).

Oefening 13.3 ★

Lees uit de lineweaver-burkfiguur van de remmers $V_{\max}$ en $K_m$ af voor het ongeremde enzym en voor elke remmer.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.3.

Zonder remmer: snijpunt 1, dus $V_{\max} = 1$ ; snijpunt met de $x$ -as $-0.5$ , dus $K_m = 2$ . Competitief: $V_{\max} = 1$ , snijpunt met de $x$ -as $-0.25$ , $K_m = 4$ . Niet-competitief: snijpunt 2, $V_{\max} = 0.5$ ; snijpunt met de $x$ -as $-0.5$ , $K_m = 2$ .

Oefening 13.4 ★

Noem de vier manieren waarop een cel de activiteit van een enzym regelt en geef de tijdschaal van elk.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.4.

Allosterische (feedback)regeling, milliseconden; covalente modificatie (fosforylering), seconden tot minuten; proteolytische activering van een zymogeen, eenmalig en op afroep; sturing van de hoeveelheid via genexpressie en afbraak, minuten tot uren.

Oefening 13.5 ★★

Een enzym heeft $K_m = 0.1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ en $V_{\max} = 50\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . Bereken $v_0$ bij $[S] = 0.02$ , $0.1$ , $1$ en $10\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Bij welke $[S]$ is $v_0 = 0.9\,V_{\max}$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.5.

$v_0 = 50[S]/(0.1 + [S])$ : 8.3, 25, 45.5 en $49.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ . $0.9 = [S]/(0.1 + [S])$ geeft $[S] = 0.9\,K_m/0.1 = 0.9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

Oefening 13.6 ★★

Met welke factor vermenigvuldigt het verlagen van $E_a$ met $20\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ de snelheid? Met hoeveel moet $E_a$ dalen om een factor $10^{10}$ te winnen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.6.

$e^{20\,000/2580} = e^{7.75} = 2300$ . Voor $10^{10}$ : $\Delta E_a = RT\ln 10^{10} = 2.58\times 23.0 = 59\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ .

Oefening 13.7 ★★

$2\,\mathrm{pmol}$ koolzuuranhydrase in $1\,\mathrm{mL}$ geeft $V_{\max} = 120\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ per minuut. Bereken $k_{\text{cat}}$ en, met $K_m = 12\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , de efficiëntie. Vergelijk dat met de diffusiegrens.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.7.

$V_{\max} = 0.12\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}$ per minuut in $1\,\mathrm{mL}$ : $1.2 \times 10^{-4}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ $= 2.0 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ product; enzym $2 \times 10^{-12}\,\mathrm{mol}$ : $k_{\text{cat}} = 2\times 10^{-6}/2\times 10^{-12} = 1 \times 10^{6}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Efficiëntie $10^6/0.012 = 8 \times 10^{7}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ , binnen een factor tien van de diffusiegrens: vrijwel elke ontmoeting met een substraatmolecuul is vruchtbaar.

Oefening 13.8 ★★

Een competitieve remmer bij $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ verdubbelt de schijnbare $K_m$ . Bereken $K_i$ . Welke substraatconcentratie herstelt de snelheid tot $90\,\%$ van $V_{\max}$ met en zonder de remmer, als $K_m = 1\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.8.

$1 + 2/K_i = 2$ : $K_i = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Voor $90\,\%$ : $[S] = 9K_m^{\text{app}}$ : $9\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ zonder, $18\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ met de remmer.

Oefening 13.9 ★★

Leg uit waarom feedbackremming op de eerste vastleggende stap van een route aangrijpt en niet op de laatste, en waarom de remmer gewoonlijk het eindproduct is en geen tussenproduct.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.9.

Het remmen van de eerste vastleggende stap legt de hele route in één keer stil en verspilt geen tussenproducten, die zich anders zouden ophopen; het eindproduct is het signaal dat ertoe doet — de overvloed ervan is precies de informatie dat de route niet langer nodig is — terwijl het gehalte van een tussenproduct niets over de vraag zegt.

Oefening 13.10 ★★★

Trypsinogeen wordt in de darm geactiveerd en niet in de alvleesklier die het maakt; wordt er te vroeg een klein deel geactiveerd, dan vernietigt dat de alvleesklier. Leg de logica van zymogenen uit, de rol van het enzym dat trypsinogeen activeert, en waarom de alvleesklier ook een trypsineremmer maakt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.10.

Een protease dat actief zou zijn in de cel die het maakt, zou die cel verteren; als inactief zymogeen gemaakt is het onschadelijk tot enteropeptidase, een enzym van de darmbekleding, trypsinogeen in de twaalfvingerige darm tot trypsine knipt, waar de vertering gewenst is; trypsine activeert vervolgens de overige zymogenen (een cascade). Omdat een spoortje trypsine de cascade te vroeg op gang kan brengen, verpakt de alvleesklier voor de zekerheid een specifieke trypsineremmer in haar korrels; faalt die regeling, dan volgt een alvleesklierontsteking.

Oefening 13.11 ★★★

Een allosterisch enzym met $n = 3$ en halve verzadiging bij $[S]_{0.5} = 3$ krijgt zijn curve door een remmer verschoven naar $[S]_{0.5} = 5.5$ . Bereken de snelheid bij $[S] = 3$ met en zonder de remmer, en vergelijk dat met de verandering die een competitieve remmer met dezelfde $K_m$ -verschuiving bij een michaelis-mentenenzym zou geven. Wat voegt coöperativiteit aan de regeling toe?

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.11.

Zonder: $3^3/(3^3 + 3^3) = 0.50$ . Met: $27/(166 + 27) = 0.14$ : de snelheid daalt tot $28\,\%$ van haar waarde. Bij een michaelis-mentenenzym met $K_m$ verhoogd van 3 naar 5.5: van $3/6 = 0.50$ naar $3/8.5 = 0.35$ , oftewel $70\,\%$ . Coöperativiteit maakt dezelfde verschuiving van de curve rond het werkpunt meer dan twee keer zo doeltreffend: een schakelaar in plaats van een dimmer.

Oefening 13.12 ★★★

“Een enzym is een katalysator die te horen heeft gekregen wat hij moet doen.” Bespreek dat in een alinea: katalyse tegenover specificiteit, regeling als de toegevoegde informatie, en de kosten van een geregeld enzym vergeleken met een kale katalysator.

Oplossing

Oplossing van Oefening 13.12.

Een kale katalysator (een platina-oppervlak, een zuur) versnelt zonder onderscheid vele reacties; een enzym versnelt één reactie op één substraat — de specificiteit van zijn actieve plaats is al informatie over wat de cel gedaan wil hebben. De regeling voegt een tweede laag toe: allosterische plaatsen, fosforyleringsplaatsen en zymogeenpeptiden vertellen het enzym wanneer en waar het moet werken, naar gelang de toestand van de cel. De kosten zijn een groot eiwit (honderden residuen voor een plaats van een tiental), een tragere omzet dan bij de beste anorganische katalysatoren, en de machinerie om het te maken, te wijzigen en af te breken; de winst is een chemie die alleen loopt waar en wanneer zij nuttig is, en dat is wat een stofwisseling is.

13.7 Vraagstuk: een enzym gemeten

Probleem 13.1

Weekendvraagstuk — een esterase gemeten bij zes substraatconcentraties, alleen en met twee remmers, zijn constanten eruit gehaald en zijn gedrag in de cel voorspeld, eindigend op zijn $K_m$ , $V_{\max}$ en $K_i$

Een esterase wordt gemeten in $1.0\,\mathrm{mL}$ bij $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , pH 7.5, met $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ enzym. De beginsnelheden ( $\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ) bij zes substraatconcentraties, alleen en in aanwezigheid van $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ remmer I of $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ remmer J:

$[S]$ ( $\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ )	0.5	1	2	5	10	20
$v_0$ , zonder remmer	0.200	0.333	0.500	0.714	0.833	0.909
$v_0$ , met I	0.111	0.200	0.333	0.556	0.714	0.833
$v_0$ , met J	0.100	0.167	0.250	0.357	0.417	0.455

Deel I — Het enzym alleen.

Bereken $1/[S]$ en $1/v_0$ voor de zes punten zonder remmer.
Toon aan dat de punten op een rechte lijn liggen en bepaal de helling en het snijpunt ervan.
Leid $V_{\max}$ en $K_m$ af.
Controleer dat met de michaelis-mentenvergelijking bij $[S] = 5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .
Bereken de hoeveelheid enzym in de bepaling (mol) en $k_{\text{cat}}$ in $\mathrm{s}^{-1}$ .
Bereken $k_{\text{cat}}/K_m$ en vergelijk dat met de diffusiegrens.
Bij welke substraatconcentratie werkt het enzym op $95\,\%$ van $V_{\max}$ ?

Deel II — Remmer I.

Bereken $1/v_0$ voor de zes punten met I en bepaal de helling en het snijpunt van hun lijn.
Leid de schijnbare $V_{\max}$ en $K_m$ met I af.
Welke parameter is veranderd? Deel de remmer in.
Bereken $K_i$ uit $K_m^{\text{app}} = K_m(1 + [I]/K_i)$ .
Welke concentratie I halveert bij $[S] = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ de snelheid? En bij $[S] = 20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ?
Stel voor wat I qua bouw zou kunnen zijn, en waar hij bindt.

Deel III — Remmer J.

Bereken de helling en het snijpunt van de lijn met J en leid de schijnbare $V_{\max}$ en $K_m$ af.
Deel J in en bereken zijn $K_i$ uit $V_{\max}^{\text{app}} = V_{\max}/(1 + [J]/K_i)$ .
Leg uit waarom meer substraat J niet kan overwinnen.
Wat doet het verdubbelen van de enzymconcentratie in aanwezigheid van J met de snelheid? En in aanwezigheid van I?

Deel IV — In de cel. De cel houdt het substraat op $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ en het enzym op $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ in een volume van $1000\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , met $Q_{10} = 2$ .

Bereken de snelheid in de cel (productmoleculen per seconde in de hele cel).
Het product is nodig met $3 \times 10^{6}\,$ moleculen per seconde. Met welke factor moet de cel de snelheid verhogen, en noem twee manieren waarop zij dat zou kunnen.
Het product is een competitieve remmer van het enzym met $K_i = 0.2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , en hoopt zich op tot $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Bereken dan de snelheid, en becommentarieer wat dat bereikt.
Het enzym wordt door een kinase gefosforyleerd, wat zijn $K_m$ tot $0.4\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ verlaagt. Bereken de snelheid bij $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ substraat vóór en na.
Het pH-optimum van het enzym is 7.5 en zijn activiteit halveert bij pH 6.5. Een lysosoom zit op pH 5. Voorspel zijn activiteit daar in grote lijnen en verklaar dat aan de hand van ioniseerbare residuen.
Een mutatie vervangt de histidine van de actieve plaats door alanine. Voorspel het effect op $K_m$ en op $k_{\text{cat}}$ , met van elk een reden.
Leg uit waarom de cel het substraat dicht bij $K_m$ houdt in plaats van er ver boven.
Geef het resultaat: $K_m$ , $V_{\max}$ en $k_{\text{cat}}$ van het esterase, en het type en de $K_i$ van elke remmer.

Oplossing

Oplossing van Probleem 13.1.

1. $1/[S]$ : 2, 1, 0.5, 0.2, 0.1, 0.05. $1/v_0$ : 5.0, 3.0, 2.0, 1.4, 1.2, 1.1. 2. Elke stap in $1/[S]$ verandert $1/v_0$ evenredig: helling $(5.0 - 1.1)/(2 - 0.05) = 2.0$ ; snijpunt $1.0$ . 3. $V_{\max} = 1/1.0 = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ ; $K_m = \text{helling}\times V_{\max} = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 4. $1.0\times 5/(2 + 5) = 0.714$ : zoals gemeten. 5. $10 \times 10^{-9}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}\times1 \times 10^{-3}\,\mathrm{L} = 1 \times 10^{-11}\,\mathrm{mol}$ ; $V_{\max} = 1 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{min} = 1.67 \times 10^{-8}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ ; $k_{\text{cat}} = 1.67\times 10^{-8}/10^{-11} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ . 6. $1670/(2\times 10^{-3}) = 8.3 \times 10^{5}\,\mathrm{L}\,\mathrm{mol}^{-1}\,\mathrm{s}^{-1}$ : duizend keer onder de diffusiegrens; slechts één botsing op de duizend is vruchtbaar. 7. $0.95 = [S]/(2 + [S])$ : $[S] = 19\,K_m = 38\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 8. $1/v_0$ : 9.0, 5.0, 3.0, 1.8, 1.4, 1.2. Helling $(9.0 - 1.2)/1.95 = 4.0$ ; snijpunt $1.0$ . 9. $V_{\max}^{\text{app}} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (onveranderd); $K_m^{\text{app}} = 4.0\times 1.0 = 4.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 10. $K_m$ verdubbeld, $V_{\max}$ onveranderd: competitief. 11. $4 = 2(1 + 1/K_i)$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 12. Met de remmer geldt $v = V_{\max}[S]/(K_m(1 + [I]/K_i) + [S])$ ; de snelheid halveren vraagt $K_m(1 + [I]/K_i) + [S] = 2(K_m + [S])$ , oftewel $[I] = K_i(K_m + [S])/K_m$ : bij $2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ is $[I] = 1\times 4/2 = 2\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; bij $20\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ is $[I] = 22/2 = 11\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . Hoe meer substraat, hoe meer remmer er nodig is. 13. Een molecuul dat op het substraat (of op zijn overgangstoestand) lijkt — een esteranaloog dat niet kan worden gehydrolyseerd — en dat in de actieve plaats bindt. 14. $1/v_0$ : 10.0, 6.0, 4.0, 2.8, 2.4, 2.2; helling $4.0$ , snijpunt $2.0$ : $V_{\max}^{\text{app}} = 0.5\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ , $K_m^{\text{app}} = 4.0\times 0.5 = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 15. $V_{\max}$ gehalveerd, $K_m$ onveranderd: niet-competitief; $2 = 1 + 1/K_i$ : $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ . 16. J bindt op een andere plaats dan de actieve, zowel op het vrije enzym als op $ES$ , met dezelfde affiniteit: substraat concurreert niet met hem, en bij elke $[S]$ is de helft van de enzymmoleculen uitgeschakeld. 17. Met J verdubbelt de snelheid (de helft van twee keer zoveel enzym is nog altijd actief); met I verdubbelt zij ook (de snelheid is bij elke $[S]$ evenredig met het enzym): het verdubbelen van het enzym onderscheidt de remmers nooit. 18. Snelheid bij $25\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $V_{\max}[S]/(K_m + [S])$ met $V_{\max} = k_{\text{cat}}[E]$ : per liter $1670\times 10^{-8} = 1.67 \times 10^{-5}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; $\times 0.5/2.5 = 3.3 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ $\times 2^{1.2} = 2.3$ : $7.7 \times 10^{-6}\,\mathrm{mol}/\mathrm{L}/\mathrm{s}$ ; in $1 \times 10^{-12}\,\mathrm{L}$ : $7.7 \times 10^{-18}\,\mathrm{mol}/\mathrm{s}$ $= 4.6 \times 10^{6}$ moleculen per seconde. 19. Er is geen verhoging nodig: de snelheid ( $4.6 \times 10^{6}$ ) overtreft de vraag ( $3 \times 10^{6}$ ); moest zij toch stijgen, dan kon de cel het substraat verhogen, het enzym fosforyleren om zijn $K_m$ te verlagen, of meer enzym maken. 20. $K_m^{\text{app}} = 2(1 + 0.4/0.2) = 6\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ : de snelheid wordt $\times 0.5/6.5$ in plaats van $0.5/2.5$ : $38\,\%$ van daarvoor, $1.8 \times 10^{6}$ per seconde — het product knijpt zijn eigen synthese af tot onder de vraag, zodat het wordt verbruikt en zijn gehalte daalt, wat het enzym weer vrijgeeft: een zichzelf bijstellende aanvoer. 21. Vóór: $0.5/2.5 = 0.20$ van $V_{\max}$ ; na: $0.5/0.9 = 0.56$ : bijna drievoudig. 22. Vrijwel nul: bij pH 5 is de histidine van de actieve plaats geprotoneerd en kan zij niet als base werken, en zijn de zure residuen van de plaats geneutraliseerd; de ionisatietoestand van het enzym, en misschien ook zijn vouwing, deugen niet. Het is voor het cytosol gebouwd, niet voor het lysosoom. 23. $K_m$ verandert weinig (het binden gebeurt grotendeels door de rest van de plaats); $k_{\text{cat}}$ stort met ordes van grootte in, want de histidine was de katalytische base die het water of de serine activeerde. 24. Dicht bij $K_m$ reageert de snelheid op veranderingen van het substraat (de helling ligt rond $V_{\max}/2K_m$ ); ver erboven is het enzym verzadigd en ongevoelig, en zou het overtollige substraat een osmotische en chemische last zijn. Dicht bij $K_m$ werken maakt de route via de aanvoer stuurbaar. 25. $K_m = 2.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ , $V_{\max} = 1.0\,\text{µ}\mathrm{mol}/\mathrm{min}$ (bij $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ enzym), $k_{\text{cat}} = 1670\,\mathrm{s}^{-1}$ ; I competitief, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ; J niet-competitief, $K_i = 1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ .

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst