Universitaire biologie — jaar 1 · Bachelor Year 1

20Regeling van de genexpressie

Een bacterie die op glucose groeit draagt vijf moleculen van het enzym dat lactose verteert; geef haar lactose en zij draagt er binnen enkele minuten vijfduizend. Een levercel en een neuron dragen dezelfde twintigduizend genen en maken vrijwel geheel verschillende stellen eiwitten, en geen van beide zal ooit die van de ander maken. Niets in Hoofdstuk 19 verklaart dat: de machinerie van de expressie is voor elk gen dezelfde. Wat verschilt is of een gen wordt gelezen, hoe vaak, en hoe lang — beslissingen die bij de promotor worden genomen door eiwitten die aan DNA binden, en daarna door het lot van de boodschapper en het eiwit. Dit hoofdstuk beschrijft hoe bacteriën genen aan- en uitzetten naar gelang hun voedsel, hoe eukaryoten hun genen sturen via het chromatine, verre enhancers en combinaties van factoren, en hoe diezelfde sturing, op verschillende genen in verschillende cellen toegepast, uit één genoom een lichaam maakt.

20.1 Waarom en waar genen worden geregeld

Propositie 20.1 (De expressie wordt op elk niveau geregeld)

Sommige genen zijn constitutief — zij komen altijd op een gelijkmatig niveau tot expressie omdat hun producten altijd nodig zijn (de eiwitten van het ribosoom, de enzymen van de glycolyse). De meeste zijn geregeld: zij komen alleen in bepaalde omstandigheden, bepaalde cellen en bepaalde momenten tot expressie. De regeling grijpt bij elke stap van de stroom aan — vooral bij het begin van de transcriptie, de goedkoopste plaats om te beslissen, maar ook bij de bewerking, de uitvoer, de stabiliteit en de vertaling van de boodschapper, en bij de wijziging en de afbraak van het eiwit — en de reactietijden lopen van seconden (een eiwit dat wordt gewijzigd) via minuten (een bacterieel gen dat wordt aangezet) tot dagen (een chromatinetoestand die verandert).

Voorbeeld 20.2 (Alleen enzymen maken wanneer zij nodig zijn)

Het enzym $\beta$ -galactosidase, dat lactose splitst, is een tetrameer van vier ketens van $1024\,$ residuen: vijfduizend kopieën zijn $3\,\%$ van het eiwit van een cel en kosten $8 \times 10^{7}\,$ ATP per generatie. Een bacterie die ze zou maken zonder lactose om te verteren, zou ongeveer een procent trager groeien dan een concurrent die dat niet deed, en zou binnen enkele honderden generaties in de minderheid zijn. Regeling wordt geselecteerd omdat expressie duur is.

20.2 Het lac-operon

Definitie 20.3 (Operon, repressor en operator)

Een operon is een groep bacteriële genen die vanaf één promotor samen tot één boodschapper worden overgeschreven, en dus samen worden geregeld. Het lac-operon van E. coli bestaat uit drie genen voor het gebruik van lactose — lacZ ( $\beta$ -galactosidase), lacY (de lactosepermease die haar invoert) en lacA — achter een promotor en een operator, een korte sequentie die de promotor overlapt. Een apart gen, lacI, maakt de lac-repressor, een eiwit dat de operator bindt en het polymerase blokkeert. Lactose, in de cel tot allolactose omgezet, is de inductor: zij bindt de repressor, verandert diens vorm, en laat hem de operator loslaten. Het operon staat dus uit tenzij er lactose aanwezig is — negatieve regeling die door inductie wordt opgeheven.

Het lac-operon. Zonder lactose zit de repressor op de operator en kan het polymerase niet beginnen; met lactose trekt de inductor de repressor eraf en worden de drie genen tot één boodschapper overgeschreven.

Propositie 20.4 (Het operonmodel)

De lac-genen worden geregeld door een diffundeerbare repressor die aangrijpt op een plaats naast de genen: de regeling is negatief, de repressor werkt in trans (vanuit de hele cel), en de operator werkt in cis (alleen op de genen ernaast).

Bewijsmateriaal. Jacob en Monod (1959–1961) redeneerden vanuit mutanten. Stammen met een mutatie in lacI ( $I^-$ ) maakten het enzym met of zonder lactose (constitutief); een normaal lacI-gen dat op een tweede kopie van het gebied werd ingebracht, herstelde de regeling, dus is het product van dat gen een diffundeerbare repressor die een mutant mist. Stammen met een mutatie in de operator ( $O^c$ ) waren eveneens constitutief, maar een tweede normale operator op een andere kopie herstelde de regeling niet — de operator regelt alleen de genen die er fysiek aan vastzitten, en is dus een plaats, geen product. Een derde klasse ( $I^s$ ) kon in het geheel niet worden geïnduceerd en was dominant: een repressor die de inductor niet meer bindt. In de PaJaMo-proef (1959) legde een normaal lacI-gen dat door conjugatie in een $I^-$ -cel werd overgebracht de enzymsynthese binnen enkele minuten stil: de repressor werkt snel, en op de transcriptie — van de boodschapper werd later aangetoond dat zij een halveringstijd van minuten heeft. ∎

Definitie 20.5 (Positieve regeling: CAP en cAMP)

De lac-promotor is zwak: zelfs zonder de repressor begint het polymerase er zelden tenzij een tweede eiwit, CAP (catabolite activator protein), er vlak vóór is gebonden, het DNA buigt en het polymerase op zijn plaats houdt. CAP bindt alleen aan DNA wanneer het cyclisch AMP draagt, waarvan het gehalte in de cel daalt zodra er veel glucose is. Het operon staat dus pas volledig aan wanneer er lactose aanwezig is en glucose ontbreekt: twee signalen, een negatief en een positief, worden bij één promotor samengebracht. Krijgt E. coli beide suikers, dan eet zij eerst de glucose, pauzeert zij terwijl het cAMP stijgt en de lac-enzymen worden gemaakt, en eet zij daarna de lactose — de tweefasige groeicurve die diauxie heet, die Monod in 1941 beschreef en die hem op het spoor van het operon zette.

Diauxische groei van E. coli op glucose plus lactose. De kweek groeit op glucose alleen, stopt zodra die op is, en hervat op lactose na het half uur dat het induceren van het lac-operon kost. — Diauxische groei van *E. coli* op glucose plus lactose. De kweek groeit op glucose alleen, stopt zodra die op is, en hervat op lactose na het half uur dat het induceren van het lac-operon kost.

Het lac-operon zichtbaar gemaakt: kolonies op een plaat met X-gal, een kleurloos substraat dat -galactosidase blauw maakt. Blauwe kolonies brengen lacZ tot expressie; witte dragen een kapot gen — de reporter die in duizend proeven is gebruikt. — Het lac-operon zichtbaar gemaakt: kolonies op een plaat met X-gal, een kleurloos substraat dat $\beta$ -galactosidase blauw maakt. Blauwe kolonies brengen *lacZ* tot expressie; witte dragen een kapot gen — de reporter die in duizend proeven is gebruikt.

Methode 20.6 (Een lac-fenotype voorspellen)

Schrijf het genotype van elke kopie van het gebied op: $I$ , $P$ , $O$ , $Z$ ( $^+$ normaal, $^-$ inactief, $O^c$ operator-constitutief, $I^s$ superrepressor).
De repressor werkt in trans: één $I^+$ waar dan ook onderdrukt elke normale operator; $I^s$ onderdrukt ongeacht de inductor.
De operator en de promotor werken in cis: een $O^c$ bevrijdt alleen de $Z$ op zijn eigen DNA; een $P^-$ legt alleen zijn eigen genen stil.
Vraag, met en zonder inductor, of elk $Z^+$ -gen wordt overgeschreven; het fenotype is dienovereenkomstig induceerbaar, constitutief of niet-induceerbaar. Voeg daarna glucose toe: zonder cAMP–CAP is de transcriptie laag, wat de repressor ook doet.

Voorbeeld 20.7 (Twee partiële diploïden)

$I^-\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^-$ : de $I^+$ -kopie maakt repressor die de $O^+$ naast $Z^+$ bindt; induceerbaar — de mutatie wordt gecomplementeerd. $I^+\,O^c\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^-$ : de enige werkende $Z$ zit achter een operator die de repressor niet kan binden; constitutief — de normale operator op de andere kopie kan niet helpen, want zij regelt alleen de kapotte $Z$ .

20.3 Andere strategieën van bacteriën

Propositie 20.8 (Repressie, attenuatie en sigmafactoren)

Operons voor biosynthese worden in de omgekeerde zin geregeld: het trp-operon, vijf genen om tryptofaan te maken, wordt overgeschreven tenzij er tryptofaan aanwezig is — het aminozuur bindt de trp-repressor en stelt hem in staat de operator te binden (een corepressor). Een tweede, fijnere regeling, de attenuatie, gebruikt de koppeling van transcriptie en translatie bij bacteriën: het begin van de boodschapper codeert voor een kort peptide met twee tryptofanen achter elkaar; is er veel tRNA met tryptofaan geladen, dan vertaalt een ribosoom dat snel en vouwt het RNA erachter zich tot een terminatorhaarspeld die het polymerase vóór de genen stilzet; is tryptofaan schaars, dan blijft het ribosoom bij de tryptofaancodons steken en vouwt het RNA zich anders, waardoor de transcriptie doorloopt. Bacteriën schakelen ook hele stellen genen om door de $\sigma$ -subeenheid van hun polymerase te wisselen: een hitteschok- $\sigma$ stuurt het naar de promotors van chaperonnegenen; een sporulatie- $\sigma$ naar die van de sporenvorming.

20.4 Regeling bij eukaryoten

Definitie 20.9 (Transcriptiefactoren, enhancers)

Bij eukaryoten begint het polymerase nooit uit zichzelf: de algemene factoren bij de promotor (Hoofdstuk 19) halen het erbij, en de snelheid wordt bepaald door transcriptiefactoren die aan regelsequenties zijn gebonden — sommige dicht bij de promotor, vele in enhancers die duizenden basenparen verderop kunnen liggen, stroomopwaarts, stroomafwaarts of in een intron, in beide richtingen, en die werken doordat het DNA een lus maakt waardoor de eraan gebonden factoren het complex bij de promotor via mediatoreiwitten aanraken. Een transcriptiefactor is modulair opgebouwd: een DNA-bindend domein dat een korte sequentie herkent (de families helix-turn-helix, zinkvinger, leucinerits) en een activerings- of onderdrukkingsdomein dat de machinerie erbij haalt of tegenhoudt. Een gen wordt gelezen wanneer de juiste combinatie factoren aanwezig is: enkele honderden factoren sturen, in combinaties, twintigduizend genen.

De werking van een enhancer. Activatoren die aan een verre enhancer zijn gebonden worden door een lus in het DNA bij de promotor gebracht, en een mediatorcomplex geeft hun signaal aan het polymerase door.

Propositie 20.10 (Het chromatine hoort bij de regeling)

Een gen dat in nucleosomen is gewikkeld en tot heterochromatine is gepakt kan niet worden gelezen: de factoren kunnen er niet bij. Activatoren halen enzymen erbij die de histonen acetyleren, waardoor die het DNA losser vasthouden en het gebied als open wordt gemerkt; repressoren halen enzymen erbij die de acetylgroepen verwijderen en merken aanbrengen die het chromatine samenpakken. Methylgroepen op cytosinen van een promotor leggen die duurzaam stil, en de merken worden bij de replicatie meegekopieerd, zodat het patroon van open en gesloten genen van een cel door haar dochters wordt geërfd — het geheugen waardoor de dochters van een levercel levercellen blijven (het deel van jaar 3 behandelt deze epigenetische mechanismen uitgebreid).

Bewijsmateriaal. In de reuzenchromosomen (polyteenchromosomen) van vliegenlarven (duizend kopieën van elk chromosoom zij aan zij, met banden) verschijnen genen die worden overgeschreven als puffs waar het chromatine zich heeft ontvouwen; het hormoon ecdyson, dat de vervelling op gang brengt, laat binnen enkele minuten een bepaald stel puffs verschijnen en uren later andere, in een vaste volgorde — de transcriptie rechtstreeks zichtbaar, en door een signaal geschakeld. Genen die door een chromosoomherschikking naast heterochromatine belanden worden in sommige cellen stilgelegd en in andere niet, en de toestand wordt door hun dochters geërfd. ∎

Een polyteenchromosoom uit de speekselklier van een vlieg: gebandeerd, met twee puffs waar het chromatine zich voor de transcriptie heeft geopend. Puffs verschijnen en verdwijnen naarmate genen worden aan- en uitgezet.

Voorbeeld 20.11 (Een signaal wordt een expressiepatroon)

Cortisol komt een levercel binnen en bindt zijn receptor, een transcriptiefactor die in het cytosol inactief wordt gehouden; het complex gaat de celkern in, bindt een sequentie van vijftien basen die bij een honderdtal genen voorkomt — waaronder die van de gluconeogenese (Hoofdstuk 16) — en haalt acetylasen en mediator erbij: binnen een uur worden de enzymen van de glucosesynthese gemaakt. Hetzelfde hormoon zet in een lymfocyt, waarvan het open chromatine een ander stel van die sequenties blootlegt, genen aan die de cel doden. Eén signaal, één receptor, twee antwoorden: het verschil is welke genen toegankelijk waren.

20.5 Na de transcriptie, en het maken van een lichaam

Propositie 20.12 (Regeling voorbij de promotor)

Een eukaryote cel beslist ook hoe een transcript wordt gespliced (alternatieve splicing geeft een spier en een brein uit één gen verschillende eiwitten), of het wordt uitgevoerd, hoe lang het meegaat (halveringstijden van minuten voor de boodschappen van regeleiwitten tot dagen voor die van hemoglobine, vastgelegd door sequenties in de niet-vertaalde gebieden die eiwitten en kleine regulerende RNA’s binden), en of het wordt vertaald (cellen met ijzergebrek blokkeren de vertaling van de ferritineboodschap met een eiwit dat aan haar $5'$ -uiteinde is gebonden, en laten haar los zodra er ijzer is). Het eiwit wordt, eenmaal gemaakt, geregeld door wijziging en afbraak (Hoofdstuk 13). Elk later niveau is sneller en plaatselijker dan het vorige, en duurder: de transcriptie beslist wat de cel kan doen, de latere niveaus wat zij nu doet.

Propositie 20.13 (Verschillen in expressie maken een lichaam)

Elke cel van een meercellig organisme draagt hetzelfde genoom; de cellen verschillen doordat zij er verschillende delen van tot expressie brengen. Huishoudgenen — enkele duizenden voor de stofwisseling, het ribosoom, het cytoskelet — staan in elke cel aan; de rest wordt in sommige cellen aan- en in andere uitgezet door de combinaties transcriptiefactoren die elke cel draagt en de chromatinetoestanden die zij heeft geërfd. De voorloper van een rode cel zet globine aan en vrijwel al het overige uit; een neuron zet zijn kanalen aan en deelt nooit meer. Differentiatie is het verwerven van een stabiel expressiepatroon, en de ontwikkeling (het deel van jaar 2) is het proces waarmee signalen tussen cellen die patronen op de juiste plaatsen vastleggen.

Bewijsmateriaal. Een kern die uit een gedifferentieerde kikkercel wordt gehaald en in een eicel wordt gebracht waarvan de eigen kern is verwijderd, kan de ontwikkeling van een hele kikkervis aansturen (Gurdon, 1962; bekend uit het deel over de bovenbouw): de gedifferentieerde cel had geen genen verloren, alleen uitgezet, en het cytoplasma van de eicel zette de schakelaars terug. De eiwitten van een celtype, op een gel gescheiden, verschillen van die van een ander type; zijn boodschappers zijn, eenmaal gesequencet, een voor dat type kenmerkende deelverzameling van het genoom; en een handvol transcriptiefactoren die in een huidcel worden gebracht, kunnen die tot stamcel of neuron herprogrammeren. ∎

Voorbeeld 20.14 (Eén gen in twee organen gelezen)

Het gen voor het enzym dat glucose uit glucose-6-fosfaat maakt komt tot expressie in de lever en de nier en in geen enkel ander weefsel: zijn promotor draagt plaatsen voor factoren die alleen daar aanwezig zijn, en in andere cellen is zijn promotor gemethyleerd en zijn chromatine gesloten. Een spier, die het gen ongeschonden draagt, kan geen glucose aan het bloed afgeven (Hoofdstuk 16) — niet bij gebrek aan het gen maar omdat het gen niet wordt gelezen. Het genoom is hetzelfde; de expressie is het orgaan.

20.6 Opgaven

Oefening 20.1 ★

Noem de onderdelen van het lac-operon en geef de toestand van het operon met en zonder lactose, met en zonder glucose.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.1.

lacI (het repressorgen), de promotor, de operator, lacZ, lacY, lacA, en de CAP-plaats. Geen lactose: uit (de repressor zit erop). Lactose met glucose erbij: nauwelijks aan (de repressor is los, maar er is geen cAMP–CAP). Lactose zonder glucose: volledig aan. Geen van beide suikers: uit.

Oefening 20.2 ★

Leg het verschil uit tussen een genproduct dat in trans werkt en een plaats die in cis werkt, met van elk één voorbeeld uit het operon.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.2.

Een product dat in trans werkt is een diffundeerbaar molecuul dat op elke kopie van zijn doel in de cel kan aangrijpen: de repressor. Een plaats die in cis werkt is een DNA-sequentie die alleen de genen beïnvloedt die er fysiek aan vastzitten: de operator.

Oefening 20.3 ★

Lees uit de diauxiefiguur de duur van de aanloop af en de verdubbelingstijden op elke suiker.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.3.

De aanloop duurt ongeveer $36\,\mathrm{min}$ (van $2\,\mathrm{h}$ tot $2.6\,\mathrm{h}$ ); de verdubbeling $20\,\mathrm{min}$ op glucose, $30\,\mathrm{min}$ op lactose.

Oefening 20.4 ★

Definieer enhancer, transcriptiefactor en huishoudgen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.4.

Enhancer: een regelsequentie, vaak ver weg, die de transcriptie van een gen verhoogt zodra er factoren aan binden. Transcriptiefactor: een eiwit met een DNA-bindend domein en een activerings- of onderdrukkingsdomein dat de transcriptie regelt. Huishoudgen: een gen dat in elke cel op een gelijkmatig niveau tot expressie komt.

Oefening 20.5 ★★

Geef het fenotype (induceerbaar, constitutief, niet-induceerbaar) van: $I^-$ ; $O^c$ ; $I^s$ ; $I^-\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^+$ ; $I^s\,O^+\,Z^+ / I^+\,O^+\,Z^+$ ; $I^+\,O^c\,Z^- / I^+\,O^+\,Z^+$ .

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.5.

$I^-$ : constitutief. $O^c$ : constitutief. $I^s$ : niet-induceerbaar. $I^-/I^+$ : induceerbaar (de $I^+$ -repressor werkt in trans). $I^s/I^+$ : niet-induceerbaar ( $I^s$ is dominant). $I^+\,O^c\,Z^- / I^+\,O^+\,Z^+$ : induceerbaar — de enige werkende $Z$ zit achter een normale operator.

Oefening 20.6 ★★

Vergelijk het lac- en het trp-operon: wat het kleine molecuul in elk met de repressor doet, en waarom de logica omgekeerd is.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.6.

Lac: de suiker (inductor) bindt de repressor en maakt hem los van de operator — de enzymen worden gemaakt wanneer hun substraat aanwezig is. Trp: het aminozuur (corepressor) bindt de repressor en stelt hem in staat te binden — de enzymen worden gemaakt wanneer hun product ontbreekt. Katabole routes worden door hun invoer aangezet, anabole door hun uitvoer uitgezet.

Oefening 20.7 ★★

Een mutant kan geen cAMP maken. Voorspel haar groei op glucose, op alleen lactose, en op beide, en het gehalte aan $\beta$ -galactosidase in elk geval.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.7.

Op glucose: normale groei (glucose heeft geen CAP nodig). Op alleen lactose: vrijwel geen groei — zonder cAMP kan CAP de lac-promotor niet activeren, zodat het enzym zelfs met een losgelaten repressor op enkele procenten van het geïnduceerde niveau blijft. Op beide: groei op glucose, daarna stilstand; geen tweede fase. Het enzym blijft in alle gevallen laag.

Oefening 20.8 ★★

Leg uit waarom attenuatie bij eukaryoten onmogelijk is, vanuit de bouw van de eukaryote cel.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.8.

De attenuatie vereist dat het ribosoom de boodschapper vertaalt terwijl het polymerase haar nog overschrijft, zodat de plaats van het ribosoom de vorm bepaalt van het RNA achter het polymerase. Bij eukaryoten vindt de transcriptie in de celkern plaats en de translatie in het cytosol, en wordt de boodschap pas vertaald nadat zij is bewerkt en uitgevoerd.

Oefening 20.9 ★★

Een enhancer wordt van $5\,\mathrm{kb}$ vóór zijn gen naar $5\,\mathrm{kb}$ erachter verplaatst en omgekeerd; het gen komt nog steeds tot expressie. Leg uit wat dat laat zien over de werking van enhancers.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.9.

Enhancers werken op afstand, in beide richtingen en aan beide kanten, en kunnen dus niet werken doordat zij worden gelezen of doordat zij het polymerase rechtstreeks plaatsen; zij werken doordat zij factoren binden die de promotor via een lus in het DNA aanraken, waarvoor afstand en richting weinig uitmaken.

Oefening 20.10 ★★★

Hoeveel ATP kosten vijfduizend $\beta$ -galactosidasetetrameren van $4096\,$ residuen (vier per residu)? De begroting van een cel per generatie is ongeveer $1 \times 10^{10}\,$ ATP. Bereken het groeinadeel van een constitutieve mutant, en het aantal generaties waarin haar aandeel in een gemengde populatie van een helft tot een honderdste daalt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.10.

$5000\times 4096\times 4 = 8.2 \times 10^{7}$ ATP: $0.8\,\%$ van de begroting. De groeisnelheid is $0.8\,\%$ lager: per generatie daalt het aandeel van de mutant met de factor $2^{-0.008} = 0.9945$ . Van $1:1$ naar $1:99$ : $0.9945^n = 1/99$ , $n = \ln 99/0.00555 = 830$ generaties — enkele weken continu kweken.

Oefening 20.11 ★★★

Een levercel en een neuron van dezelfde persoon worden vergeleken: hetzelfde genoom, andere eiwitten, en elke deling van de levercel geeft levercellen. Leg met het chromatine, de factoren en de vererving van merken uit hoe het verschil ontstaat en hoe het in stand blijft.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.11.

Elk celtype draagt een eigen stel transcriptiefactoren, die de enhancers van zijn genen binden en acetylasen erbij halen die hun chromatine openen, terwijl de genen van andere types zijn gemethyleerd en in heterochromatine zijn gepakt waar geen factor bij kan. De factoren houden elkaars expressie in stand (een netwerk met stabiele toestanden), en de chromatinemerken worden bij de replicatie meegekopieerd, zodat de dochters zowel de factoren als de open en gesloten gebieden erven. Het genoom is hetzelfde; het toegankelijke genoom niet, en de ontoegankelijkheid wordt geërfd.

Oefening 20.12 ★★★

“Een bacterie leest haar omgeving; een cel van een lichaam leest haar geschiedenis.” Bespreek in een alinea de twee typen regeling, hun signalen, hun tijdschalen en hun omkeerbaarheid.

Oplossing

Oplossing van Oefening 20.12.

De regelingen van een bacterie zijn op het medium afgestemd: een suiker, een aminozuur, een temperatuur bindt een repressor of een sigmafactor en de reactie is binnen minuten volledig en wordt teruggedraaid zodra het signaal verdwijnt — de expressie volgt de omgeving. Een cel van een lichaam luistert ook naar signalen, maar haar belangrijkste beslissingen zijn tijdens de ontwikkeling genomen en in het chromatine vastgelegd: wat zij tot expressie kan brengen is bepaald door de factoren die zij heeft geërfd en de merken op haar DNA, en verandert alleen door deling en meestal onomkeerbaar. De bacterie is een lezer van het heden; de gedifferentieerde cel heeft een geheugen dat haar identiteit is.

20.7 Vraagstuk: diauxie

Probleem 20.1

Weekendvraagstuk — de tweefasige groeicurve van Monod cel voor cel gereconstrueerd: glucose uitgeput, lactose geïnduceerd, enzymen geteld, mutanten voorspeld en de kosten van de regeling becijferd, eindigend op de inductiefactor van $\beta$ -galactosidase

Een kweek van E. coli begint met $10^7$ cellen per milliliter in een medium met $0.5\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ glucose en $1.0\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ lactose. Op glucose verdubbelen de cellen elke $20\,\mathrm{min}$ , op lactose elke $30\,\mathrm{min}$ ; een cel heeft per deling $1.5 \times 10^{-12}\,\mathrm{g}$ suiker nodig ( $180\,\mathrm{g}/\mathrm{mol}$ voor glucose; lactose, $342\,\mathrm{g}/\mathrm{mol}$ , telt als twee glucosen). Niet-geïnduceerde cellen bevatten 5 moleculen $\beta$ -galactosidase; volledig geïnduceerd $5000$ . De inductie duurt $30\,\mathrm{min}$ . Het enzym is een tetrameer van $4\times 1024$ residuen; elk residu kost 4 ATP; de ATP-begroting van een cel is $10^{10}$ per deling en haar eiwit $1.5 \times 10^{-13}\,\mathrm{g}$ ( $110\,\mathrm{Da}$ per residu).

Deel I — De glucosefase.

Bereken de beschikbare glucose per milliliter, in gram.
Hoeveel delingen per milliliter kan die dragen?
Hoeveel cellen zijn er, uitgaande van $10^7$ cellen, wanneer de glucose op is? (Eén deling maakt één nieuwe cel.)
Hoeveel verdubbelingen is dat, en hoe lang duurt de glucosefase?
Wat is in deze fase de toestand van het lac-operon, en waarom, in moleculaire termen (repressor en CAP)?

Deel II — De omschakeling.

Wat stijgt er in de cellen zodra de glucose op is, en wat bindt het?
Er was de hele tijd lactose aanwezig. Waarom stond het operon in de glucosefase toch vrijwel uit?
Tijdens de aanloop van $30\,\mathrm{min}$ maakt elke cel haar $5000$ enzymen. Bereken het aantal enzymmoleculen per seconde per cel, en het aantal residuen per seconde.
Een cel bevat $20\,000$ ribosomen bij $20\,$ residuen per seconde. Welk deel van haar translatie gaat er tijdens de aanloop naar $\beta$ -galactosidase?
Bereken de massa van $5000$ tetrameren en het deel van het celeiwit dat zij vormen.
Bereken de inductiefactor.
Waarom is de permease (lacY) voor groei op lactose even noodzakelijk als het enzym, en wat gebeurt er met een lacY $^-$ -mutant die lactose krijgt?

Deel III — De lactosefase.

Bereken de beschikbare lactose per milliliter in glucose-equivalenten, in gram.
Hoeveel verdere delingen draagt die, en wat is het uiteindelijke celaantal?
Hoe lang duurt de lactosefase?
Stel de tijdlijn op: glucosefase, aanloop, lactosefase, totaal.
Leg uit waarom de verdubbelingstijd op lactose langer is (twee redenen: één over de enzymstap, één over de permease).

Deel IV — Mutanten en kosten.

Een $I^-$ -mutant: beschrijf haar groeicurve op hetzelfde medium en haar enzymgehalte gedurende de hele tijd.
Een CAP $^-$ -mutant: beschrijf haar curve en haar enzymgehalte.
Een $O^c$ -mutant in een medium met alleen lactose: enig verschil met het wildtype? En met alleen glucose?
Bereken de ATP-kosten per generatie van het maken van $5000$ tetrameren, en het deel van de begroting van de cel.
Als dat deel de generatietijd met datzelfde deel verlengt, hoeveel loopt de groeisnelheid van de $I^-$ -mutant op glucose dan achter bij die van het wildtype?
Na hoeveel generaties op glucose is de mutant, uitgaande van gelijke aantallen, een tiende van de populatie? ( $r^n = 0.1/0.9$ met $r$ de verhouding van de groeisnelheden per generatie, oftewel $2^{-\delta}$ bij een achterstand $\delta$ in verdubbelingen.)
Leg uit waarom $I^-$ -mutanten desondanks veel voorkomen in laboratoriumstammen die op lactose worden gekweekt.
Geef het resultaat: de inductiefactor van $\beta$ -galactosidase, de kosten van het onnodig maken ervan als deel van de ATP-begroting, en de totale duur van de diauxieproef.

Oplossing

Oplossing van Probleem 20.1.

1. $0.5\times 10^{-3}\times 180 = 0.09\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 9 \times 10^{-5}\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . 2. $9\times 10^{-5}/1.5\times 10^{-12} = 6 \times 10^{7}$ delingen. 3. $10^7 + 6 \times 10^{7} = 7 \times 10^{7}$ cellen per mL. 4. $7 = 2^n$ : $n = 2.8$ verdubbelingen, $56\,\mathrm{min}$ . 5. Uit: lactose (allolactose) heeft de repressor losgelaten, maar glucose houdt het cAMP laag, zodat CAP niet is gebonden en de promotor vrijwel zwijgt; bovendien is de permease schaars, zodat er weinig lactose binnenkomt. 6. Het cAMP stijgt en bindt CAP, dat de promotor bindt. 7. De negatieve regeling was opgeheven maar de positieve ontbrak: een zwakke promotor zonder CAP begint zelden (katabolietrepressie). 8. $5000/1800 = 2.8$ tetrameren per seconde; $2.8\times 4096 = 11\,400$ residuen per seconde. 9. Capaciteit $20\,000\times 20 = 4 \times 10^{5}$ residuen per seconde: $3\,\%$ van de ribosomen. 10. $5000\times 4096\times 110\times 1.66\times 10^{-24} = 3.7 \times 10^{-15}\,\mathrm{g}$ : $2.5\,\%$ van het celeiwit. 11. $5000/5 = 1000$ . 12. Lactose kan de membraan zonder de permease niet passeren; een lacY $^-$ -mutant heeft het enzym maar geen substraat binnenin en groeit niet op lactose (en induceert ook slecht, want de inductor wordt binnen de cel uit lactose gemaakt). 13. $1.0\times 10^{-3}\times 342 = 0.342\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , ter waarde van $2\times 180 = 360\,\mathrm{g}$ glucose per mol, oftewel $0.36\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ $= 3.6 \times 10^{-4}\,\mathrm{g}/\mathrm{mL}$ . 14. $3.6\times 10^{-4}/1.5\times 10^{-12} = 2.4 \times 10^{8}$ delingen; uiteindelijk $7 \times 10^{7} + 2.4 \times 10^{8} = 3.1 \times 10^{8}$ per mL. 15. $3.1/0.7 = 4.4 = 2^n$ : $n = 2.1$ verdubbelingen, $64\,\mathrm{min}$ . 16. Glucose $56\,\mathrm{min}$ , aanloop $30\,\mathrm{min}$ , lactose $64\,\mathrm{min}$ : samen $150\,\mathrm{min}$ . 17. De lactose moet eerst worden gehydrolyseerd, een extra enzymatische stap waarvan de snelheid de aanvoer van glucose begrenst; en de permease gebruikt de protonengradiënt om haar in te voeren, een kostenpost die het glucosetransport niet kent. 18. $I^-$ : het enzym staat de hele tijd op $5000$ (constitutief, zodra de glucose op is; op glucose begrenst CAP het nog, zodat het niveau ertussenin ligt); haar aanloop is korter of afwezig, zodat de curve een kleinere pauze toont; de kosten vertragen haar op glucose licht. 19. CAP $^-$ : groeit op glucose tot $7 \times 10^{7}$ en stopt dan: het lac-operon kan niet worden geactiveerd, het enzym blijft rond 5 moleculen, en de lactose wordt nooit gebruikt. 20. Op alleen lactose: geen verschil in enzymgehalte zodra er is geïnduceerd (beide volledig aan) en vrijwel geen in groei; $O^c$ mist alleen de vertraging van de inductie. Op alleen glucose: $O^c$ maakt het enzym nutteloos (voor zover CAP dat toelaat), het wildtype niet. 21. $5000\times 4096\times 4 = 8.2 \times 10^{7}$ ATP: $0.8\,\%$ van $10^{10}$ . 22. De generatietijd is $0.8\,\%$ langer: de groeisnelheid is $0.8\,\%$ lager, $\delta = 0.008$ verdubbeling per generatie. 23. $r = 2^{-0.008} = 0.99447$ ; $r^n = 0.111$ : $n = \ln 0.111/\ln 0.99447 = 2.20/0.00555 = 400$ generaties. 24. Op lactose is het enzym toch nodig, zodat de mutant niets betaalt en de aanloop wint: er wordt niet tegen haar geselecteerd en soms zelfs vóór haar; en laboratoriumstammen worden om het gemak gekweekt, niet om de concurrentie. 25. Inductiefactor 1000 (van 5 naar $5000$ moleculen); het onnodig maken kost $0.8\,\%$ van de ATP-begroting; de proef duurt ongeveer tweeënhalf uur.

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst