Universitaire biologie — jaar 1 · Bachelor Year 1

12Aminozuren en eiwitten

Kook een ei en het heldere wit wordt ondoorzichtig en stevig; er is niets toegevoegd of weggenomen, maar elk eiwitmolecuul erin is ontvouwen en met zijn buren verstrengeld geraakt. Koel het af en het blijft gekookt. Toch vouwt een klein enzym dat in een reageerbuis voorzichtig is ontvouwen en daarna in een kale buffer wordt gelaten, zich binnen minuten terug in zijn precieze werkvorm, zonder hulp van wat dan ook: de vorm stond in de keten geschreven. Eiwitten zijn de werkmoleculen van de cel — haar enzymen, pompen, motoren, geraamtes, antistoffen, hormonen — en elk ervan is een keten van aminozuren, gevouwen tot een vorm die haar sequentie voorschrijft. Dit hoofdstuk beschrijft de twintig aminozuren, de binding die hen verbindt, de vier niveaus van eiwitstructuur, de vouwing die van een keten een machine maakt, het coöperatieve gedrag van eiwitten met verscheidene subeenheden, en de methoden waarmee eiwitten worden gescheiden en zichtbaar gemaakt.

12.1 Aminozuren

Definitie 12.1 (Aminozuur)

Een aminozuur heeft een centrale $\alpha$ -koolstof met een aminogroep ( $-\mathrm{NH_2}$ ), een carboxylgroep ( $-\mathrm{COOH}$ ), een waterstof en een zijketen $R$ die de twintig standaardaminozuren van eiwitten onderscheidt. Bij de pH van de cel is de aminogroep geprotoneerd en de carboxylgroep geïoniseerd: het molecuul is een zwitterion, $\mathrm{^+H_3N{-}CHR{-}COO^-}$ , zonder netto lading. De $\alpha$ -koolstof is bij alle aminozuren behalve glycine chiraal, en levende wezens gebruiken alleen de L-enantiomeer. De zijketens groeperen zich naar hun chemie:

klasse	aminozuren (drie- en éénlettercodes)	zijketen
apolair, alifatisch	Gly G, Ala A, Val V, Leu L, Ile I, Met M, Pro P	koolwaterstof; Pro een ring
aromatisch	Phe F, Tyr Y, Trp W	ringen; Tyr en Trp nemen UV op
polair, ongeladen	Ser S, Thr T, Cys C, Asn N, Gln Q	$-$ OH, $-$ SH, amide
positief geladen	Lys K, Arg R, His H	basen; His p $K_a$ 6.0
negatief geladen	Asp D, Glu E	carboxylaten, p $K_a$ 4

Negen ervan (His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val) zijn voor de mens essentieel: wij kunnen ze niet maken en moeten ze eten.

Propositie 12.2 (Ionisatie)

Elke ioniseerbare groep van een aminozuur heeft haar eigen p $K_a$ : ongeveer 2 voor de $\alpha$ -carboxylgroep, 9.5 voor de $\alpha$ -aminogroep, en voor de zijketens 3.9 (Asp), 4.1 (Glu), 6.0 (His), 8.3 (Cys), 10.1 (Tyr), 10.5 (Lys), 12.5 (Arg). Het iso-elektrisch punt p $I$ is de pH waarbij de netto lading nul is — het gemiddelde van de twee p $K_a$ die de neutrale vorm omsluiten; de p $I$ van een eiwit wordt bepaald door zijn gehalte aan geladen zijketens, en bij die pH is het het minst oplosbaar en beweegt het niet in een elektrisch veld. Histidine, met een p $K_a$ dicht bij 7, is het residu dat binnen het fysiologische bereik van lading verandert, en het zit in de actieve plaats van veel enzymen.

Titratie van glycine. Twee bufferende plateaus, bij de pK_a van de carboxylgroep en van de aminogroep; ertussenin, bij het iso-elektrisch punt, draagt het zwitterion geen netto lading. — Titratie van glycine. Twee bufferende plateaus, bij de p $K_a$ van de carboxylgroep en van de aminogroep; ertussenin, bij het iso-elektrisch punt, draagt het zwitterion geen netto lading.

12.2 De peptidebinding

Definitie 12.3 (Peptidebinding, polypeptide)

De peptidebinding verbindt door condensatie de carboxylgroep van het ene aminozuur met de aminogroep van het volgende (een amidebinding, $\mathrm{-CO{-}NH-}$ ). Een zo verbonden keten aminozuren is een polypeptide: een ruggengraat van zich herhalende $\mathrm{N{-}C_\alpha{-}C}$ -eenheden waaruit de zijketens steken, met een N-uiteinde (vrije aminogroep) en een C-uiteinde (vrije carboxylgroep). Sequenties worden van N naar C geschreven, de volgorde van de synthese (Hoofdstuk 19). Een eiwit is een of meer polypeptiden gevouwen tot een bepaalde vorm; gebruikelijke ketens tellen $100\text{ to }1000\,$ residuen met een gemiddelde massa van $110\,\mathrm{Da}$ , zodat een eiwit van $300\,$ residuen $33\,\mathrm{kDa}$ weegt.

Propositie 12.4 (Meetkunde van de peptidebinding)

De C–N-binding van een peptide heeft gedeeltelijk het karakter van een dubbele binding (de amideresonantie): zij is kort, kan niet draaien, en houdt de zes atomen $\mathrm{C_\alpha{-}C(=O){-}N(H){-}C_\alpha}$ in één vlak, vrijwel altijd met de twee $\alpha$ -koolstoffen trans. De ruggengraat is daardoor een keten van stijve vlakken die aan de $\alpha$ -koolstoffen scharnieren, waarbij elk scharnier twee draaiingen heeft, $\phi$ (om N– $\mathrm{C_\alpha}$ ) en $\psi$ (om $\mathrm{C_\alpha}$ –C), en botsingen tussen zijketens en ruggengraat de meeste combinaties van $\phi$ en $\psi$ verbieden. De conformatie van een eiwit is in wezen de lijst van zijn $\phi$ - en $\psi$ -hoeken.

Twee peptidebindingen. Elk gearceerd vlak houdt zes atomen stijf bijeen; de keten buigt alleen bij de -koolstoffen, over de hoeken en . — Twee peptidebindingen. Elk gearceerd vlak houdt zes atomen stijf bijeen; de keten buigt alleen bij de $\alpha$ -koolstoffen, over de hoeken $\phi$ en $\psi$ .

12.3 Secundaire structuur

Definitie 12.5 (Secundaire structuur)

De secundaire structuur van een eiwit is de plaatselijke, regelmatige vouwing van zijn ruggengraat, vastgehouden door waterstofbruggen tussen de C=O- en N–H-groepen van de ruggengraat. Twee patronen overheersen. De $\alpha$ -helix: een rechtsdraaiende spiraal van 3.6 residuen per winding, die $0.15\,\mathrm{nm}$ per residu stijgt ( $0.54\,\mathrm{nm}$ per winding), waarbij elke C=O is gebonden aan de N–H vier residuen verderop en de zijketens naar buiten wijzen. De $\beta$ -plaat: ketens die vrijwel volledig zijn gestrekt ( $0.35\,\mathrm{nm}$ per residu) en zij aan zij liggen, evenwijdig of antiparallel, met bruggen tussen naburige strengen en zijketens die om en om boven en onder de plaat uitsteken. Daartussen keren bochten en lussen de richting van de keten om. Proline, waarvan de ring $\phi$ vastlegt, breekt helices; glycine, zonder zijketen, laat bochten toe die geen ander residu kan maken.

De ramachandranplot: de combinaties van en die een residu kan aannemen. Twee grote toegestane gebieden komen overeen met de -plaat en de rechtsdraaiende -helix; het grootste deel van het vlak is verboden door botsingen tussen atomen. — De ramachandranplot: de combinaties van $\phi$ en $\psi$ die een residu kan aannemen. Twee grote toegestane gebieden komen overeen met de $\beta$ -plaat en de rechtsdraaiende $\alpha$ -helix; het grootste deel van het vlak is verboden door botsingen tussen atomen.

Linus Pauling (1901–1994), die in 1951 de -helix en de -plaat afleidde uit de vlakheid van de peptidebinding en de meetkunde van waterstofbruggen, voordat een van beide in een eiwit was waargenomen. Foto: Nobelstichting, 1962, publiek domein. — Linus Pauling (1901–1994), die in 1951 de $\alpha$ -helix en de $\beta$ -plaat afleidde uit de vlakheid van de peptidebinding en de meetkunde van waterstofbruggen, voordat een van beide in een eiwit was waargenomen. Foto: Nobelstichting, 1962, publiek domein.

Voorbeeld 12.6 (Helix en plaat in getallen)

Een $\alpha$ -helix die een membraan doorkruist moet $3\,\mathrm{nm}$ hydrofobe kern overbruggen: $3/0.15 = 20$ residuen, en inderdaad zijn de transmembraansegmenten van Hoofdstuk 7 reeksen van ongeveer twintig hydrofobe residuen. Een $\beta$ -streng van dezelfde lengte overspant $7\,\mathrm{nm}$ : zijdefibroïne bestaat uit gestapelde antiparallelle platen van glycine en alanine, en een zijdedraad is sterker dan staal van hetzelfde gewicht omdat de covalente ruggengraten in de lengte van de vezel liggen.

12.4 Tertiaire en quaternaire structuur

Definitie 12.7 (Tertiaire en quaternaire structuur)

De tertiaire structuur is de volledige driedimensionale schikking van één polypeptide: zijn helices, platen en lussen samengepakt, vaak in verscheidene compacte domeinen die zich onafhankelijk vouwen. Zij wordt vastgehouden door niet-covalente krachten — het hydrofobe effect dat apolaire zijketens in een kern weg van het water begraaft, waterstofbruggen, zoutbruggen tussen geladen zijketens, vanderwaalspakking — en soms door disulfidebruggen, covalente S–S-bindingen tussen twee cysteïnen, in eiwitten die naar de oxiderende buitenwereld worden afgescheiden. De quaternaire structuur is de samenvoeging van verscheidene polypeptiden (subeenheden) tot één eiwit: hemoglobine bestaat uit twee $\alpha$ - en twee $\beta$ -ketens. Globulaire eiwitten zijn compact en wateroplosbaar (enzymen, carriers); fibrillaire eiwitten zijn langgerekt en onoplosbaar (de drievoudige helix van collageen, de gewonden spiralen van keratine en myosine, zijde).

Hemoglobine: vier subeenheden, twee (blauw) en twee (rood), elk een bundel -helices rond een heemgroep (donker) waarvan het ijzer één O_2 bindt. De vier plaatsen werken niet onafhankelijk van elkaar. — Hemoglobine: vier subeenheden, twee $\alpha$ (blauw) en twee $\beta$ (rood), elk een bundel $\alpha$ -helices rond een heemgroep (donker) waarvan het ijzer één $\mathrm{O_2}$ bindt. De vier plaatsen werken niet onafhankelijk van elkaar.

Stelling 12.8 (De sequentie bepaalt de vouwing)

De driedimensionale structuur van een eiwit wordt bepaald door zijn aminozuursequentie: de natieve vouwing is de conformatie met de laagste vrije energie die de keten in haar cellulaire omgeving kan bereiken, en de informatie die daarvoor nodig is zit in de keten zelf.

Bewijsmateriaal. Anfinsen (1961) ontvouwde ribonuclease A, een enzym van $124\,$ residuen met vier disulfidebruggen, in geconcentreerd ureum met een reducerend middel dat de bruggen verbrak: de keten verloor alle activiteit. Door het ureum te verwijderen en de cysteïnen in lucht langzaam opnieuw te laten oxideren, kreeg hij het enzym volledig actief terug, met zijn vier bruggen opnieuw gevormd tussen dezelfde acht cysteïnen uit de $105\,$ mogelijke paringen — de keten had haar eigen vouwing gevonden. Opnieuw geoxideerd terwijl zij nog in ureum zat, vormde zij willekeurige bruggen en bleef zij inactief; een spoor van het reducerende middel liet haar die vervolgens herschikken tot de natieve, meest stabiele reeks was bereikt. Sindsdien zijn duizenden sequenties in de reageerbuis vanuit het niets gevouwen, en kan de vouwing van een nieuwe sequentie eruit worden berekend. ∎

Propositie 12.9 (Denaturatie)

Warmte, extreme pH, ureum, detergentia of organische oplosmiddelen ontvouwen eiwitten door de zwakke bindingen te overweldigen die de vouwing bijeenhouden: de keten verliest haar vorm en haar functie, legt haar hydrofobe kern bloot en klontert met haar buren. Kleine eiwitten vouwen zich terug wanneer het denaturerende middel wordt verwijderd; grote, en eiwitten in een volgepakte cel, kunnen dat vaak niet, en de cel houdt er chaperonnes op na — eiwitten die ontvouwen ketens binden, hun hydrofobe oppervlakken afschermen en hun herhaalde kansen geven om correct te vouwen — en breekt af wat verkeerd gevouwen blijft. Koorts van enkele graden, en de $42\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ waarbij herseneiwitten beginnen te ontvouwen, tekenen de smalle marge van stabiliteit: een gebruikelijke vouwing is maar $20\text{ to }60\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ stabieler dan de ontvouwen keten, de waarde van enkele waterstofbruggen.

Eiwit rauw en gekookt: dezelfde eiwitten, links gevouwen en oplosbaar, rechts ontvouwen en samengeklonterd tot een ondoorzichtige vaste stof. Er is niets toegevoegd dan warmte.

Voorbeeld 12.10 (Collageen)

Een kwart van het eiwit van een zoogdier is collageen: drie ketens, elk een linksdraaiende helix van duizend residuen met glycine op elke derde plaats (Gly–X–Y, met Y vaak hydroxyproline), die samen tot een rechtsdraaiende drievoudige helix van $300\,\mathrm{nm}$ lang zijn gewonden en daarna zij aan zij tot fibrillen worden gepakt die covalent zijn dwarsverbonden. Dat glycine geen zijketen heeft, is wat de drie ketens bij de as laat samenkomen; één vervanging van glycine door welk ander residu ook knikt de helix en geeft brosse botten. Vitamine C is nodig om de prolinen te hydroxyleren; zonder haar is de helix onstabiel en falen de fibrillen: scheurbuik.

12.5 Allosterie: hemoglobine

Definitie 12.11 (Allosterie, coöperativiteit)

Een eiwit is allosterisch wanneer het binden van een ligand op de ene plaats de conformatie van het eiwit verandert en daarmee zijn affiniteit op een andere plaats. Wanneer de plaatsen gelijk zijn en de verandering de affiniteit van de andere verhoogt, is het binden coöperatief: de verzadigingscurve is sigmoïde in plaats van hyperbolisch, en het eiwit schakelt over een smal bereik van ligandconcentratie van vrijwel leeg naar vrijwel vol. De hillvergelijking beschrijft dat:

Y = \frac{P^n}{P_{50}^n + P^n},

waarin $Y$ het deel van de bezette plaatsen is, $P$ de ligandconcentratie (of partiële druk), $P_{50}$ de waarde bij halve verzadiging, en $n$ de hillcoëfficiënt — 1 voor onafhankelijke plaatsen, tot het aantal plaatsen bij volmaakte coöperativiteit.

Propositie 12.12 (Hemoglobine en myoglobine)

Myoglobine, één keten met één heem, bindt $\mathrm{O_2}$ langs een hyperbool ( $n = 1$ , $P_{50} = 0.37\,\mathrm{kPa}$ ): het is verzadigd bij elke druk die de weefsels bieden en dient als voorraad in de spier. Hemoglobine, vier subeenheden, bindt coöperatief ( $n \approx 2.8$ , $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ ): de eerste gebonden $\mathrm{O_2}$ verschuift het viertal van een T-toestand met lage affiniteit naar een R-toestand met hoge affiniteit, zodat het bij de $13\,\mathrm{kPa}$ van de long vrijwel volledig laadt en bij de $5\,\mathrm{kPa}$ van de weefsels een groot deel lost. De affiniteit wordt verder verlaagd, en het lossen bevorderd, door zuur en $\mathrm{CO_2}$ (het bohreffect) en door 2,3-bisfosfoglyceraat (BPG), dat de T-toestand bindt: in een werkende spier, of op hoogte, komt bij dezelfde druk meer zuurstof vrij. De foetus maakt een hemoglobine dat BPG zwak bindt, zodat zijn bloed zuurstof over de placenta van de moeder aantrekt.

Zuurstofbinding door myoglobine (hyperbolisch) en hemoglobine (sigmoïde). Tussen de longen en de weefsels geeft myoglobine vrijwel niets af; hemoglobine geeft een vijfde van zijn lading af, en meer wanneer het weefsel zuur is.

Methode 12.13 (De hillvergelijking gebruiken)

Lees $P_{50}$ af uit de curve bij $Y = 0.5$ ; schat $n$ uit de helling van $\log[Y/(1-Y)]$ tegen $\log P$ (de hillplot), die een rechte lijn met helling $n$ is in de buurt van $P_{50}$ .
Bereken $Y$ bij de laaddruk (longen) en bij de losdruk (weefsels); het verschil is het deel van de draagcapaciteit dat wordt afgeleverd.
Vermenigvuldig met de capaciteit: bloed bevat $150\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ hemoglobine, waarbij elke gram $1.34\,\mathrm{mL}$ $\mathrm{O_2}$ bindt, oftewel $200\,\mathrm{mL}$ $\mathrm{O_2}$ per liter bij verzadiging.
Om het bohreffect of BPG mee te nemen, gebruik de verschoven $P_{50}$ alleen bij de weefsels, waar het zuur zit.

12.6 Eiwitten zien en scheiden

Methode 12.14 (Eiwitten scheiden)

Elektroforese in SDS: het detergens bekleedt elke keten met negatieve lading naar rato van haar lengte, zodat de ketens alleen op grootte door een polyacrylamidegel migreren; een ladder van bekende massa’s ijkt de gel, en de plaats van een gekleurde band geeft de massa op enkele procenten nauwkeurig.
Chromatografie: door een kolom met korrels die eiwitten ophouden op grootte (gelfiltratie: de grote komen het eerst naar buiten), op lading (ionenwisseling), of op specifieke binding (affiniteit: een vastgezet ligand houdt één eiwit vast en laat de rest door). Een zuivering wordt gevolgd aan de stijging van de specifieke activiteit (Hoofdstuk 5).
Sequencing: de sequentie van het gen, vertaald; of het eiwit zelf, in peptiden geknipt en met massaspectrometrie gelezen.
Structuur: röntgendiffractie van een kristal, of elektronenmicroscopie van bevroren losse deeltjes, geeft de plaats van elk atoom; de lintdiagrammen van dit hoofdstuk zijn daarvan de samenvattingen.

Een gekleurde SDS-polyacrylamidegel. Elke baan is een monster; elke band een eiwit van één grootte; de linkerbaan een ladder van merkers met bekende massa. Kleine eiwitten lopen verder door.

Voorbeeld 12.15 (Een gel lezen)

Een ruw extract vertoont tientallen banden; na affiniteitschromatografie blijft er één band over op de plaats van de merker van $33\,\mathrm{kDa}$ . Zonder SDS en zonder reducerend middel gelopen, migreert hetzelfde eiwit als een deeltje van $66\,\mathrm{kDa}$ : het is een dimeer van twee identieke ketens, bijeengehouden door een disulfidebrug die het reducerende middel verbreekt en het detergens scheidt. Twee gels, één redenering, en de quaternaire structuur is bekend.

12.7 Opgaven

Oefening 12.1 ★

Teken of beschrijf de algemene bouw van een aminozuur bij pH 7, en deel Leu, Ser, Lys, Glu en Phe in naar zijketen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.1.

$\mathrm{^+H_3N{-}CH(R){-}COO^-}$ : een zwitterion. Leu apolair alifatisch; Ser polair ongeladen; Lys positief geladen; Glu negatief geladen; Phe aromatisch.

Oefening 12.2 ★

Definieer de vier niveaus van eiwitstructuur en de bindingen die elk niveau bijeenhouden.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.2.

Primair: de sequentie, peptidebindingen. Secundair: de plaatselijke vouwing van de ruggengraat (helix, plaat), waterstofbruggen van de ruggengraat. Tertiair: de vouwing van de hele keten; hydrofoob effect, waterstofbruggen, zoutbruggen, vanderwaalscontacten, disulfidebruggen. Quaternair: de samenvoeging van subeenheden, door dezelfde niet-covalente krachten.

Oefening 12.3 ★

Een eiwit telt $450\,$ residuen. Schat zijn massa. Hoe lang zou het zijn als het één $\alpha$ -helix was? En als één $\beta$ -streng?

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.3.

$450\times 110 = 50\,\mathrm{kDa}$ . Helix: $450\times 0.15 = 68\,\mathrm{nm}$ . Streng: $450\times 0.35 = 158\,\mathrm{nm}$ .

Oefening 12.4 ★

Lees uit de figuur van de zuurstofbinding de verzadiging van hemoglobine bij $13.3\,\mathrm{kPa}$ en bij $5.3\,\mathrm{kPa}$ af, en het afgeleverde deel.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.4.

Ongeveer $0.98$ en $0.76$ : een vijfde van de lading ( $22\,\%$ ) wordt afgeleverd.

Oefening 12.5 ★★

Bereken de netto lading van het peptide Lys–Gly–Asp–Ala bij pH 7, bij pH 2 en bij pH 12, met de p $K_a$ -waarden van het hoofdstuk, en schat zijn iso-elektrisch punt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.5.

Groepen: de N-terminale aminogroep (9.5), de zijketen van Lys (10.5), de zijketen van Asp (3.9), de C-terminale carboxylgroep (2). pH 7: $+1 + 1 - 1 - 1 = 0$ . pH 2: $+1 + 1 + 0 - 0.5 = +1.5$ (de eindstandige carboxylgroep half geïoniseerd). pH 12: $0 + 0 - 1 - 1 = -2$ (Lys grotendeels gedeprotoneerd). De netto lading is nul tussen de p $K_a$ van Asp (3.9) en die van de aminogroep (9.5), waar de lading overal $0$ is: p $I \approx 6.7$ (het gemiddelde van 3.9 en 9.5).

Oefening 12.6 ★★

Leg uit waarom proline zelden binnen $\alpha$ -helices voorkomt en waarom glycine bij scherpe bochten wordt aangetroffen, vanuit de meetkunde van de ruggengraat.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.6.

De zijketen van proline is aan zijn eigen stikstof terug gebonden: de stikstof draagt geen waterstof om de waterstofbrug van de helix te geven, en $\phi$ ligt vast op ongeveer $-60^\circ$ , wat alleen in de eerste winding van een helix wordt verdragen. Glycine, met een waterstof als zijketen, ondervindt geen botsing en kan waarden van $\phi$ en $\psi$ aannemen die elk ander residu verboden zijn, ook die van scherpe bochten.

Oefening 12.7 ★★

Welk deel van de willekeurige heroxidaties zou in de proef van Anfinsen de natieve reeks van vier disulfiden geven? (Tel de manieren om acht cysteïnen te paren.) Wat bewees het feit dat de volledige activiteit werkelijk terugkeerde?

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.7.

Paringen van acht cysteïnen: $7\times 5\times 3\times 1 = 105$ ; willekeurige heroxidatie geeft de natieve reeks in ongeveer $1\,\%$ van de gevallen. Dat de activiteit vrijwel volledig terugkeerde, toonde aan dat de keten en niet het toeval de paring koos: de sequentie legt de vouwing vast en de disulfiden zetten haar alleen maar vast.

Oefening 12.8 ★★

Bereken met de hillvergelijking, met $n = 2.8$ en $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ , de waarde van $Y$ bij $2\,\mathrm{kPa}$ , $3.5\,\mathrm{kPa}$ en $8\,\mathrm{kPa}$ . Herhaal dat met $n = 1$ . Welk eiwit levert meer af tussen $8\,$ en $2\,\mathrm{kPa}$ ?

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.8.

$P_{50}^{2.8} = 33.4$ . Bij 2: $2^{2.8} = 6.96$ , $Y = 0.17$ ; bij 3.5: $0.50$ ; bij 8: $8^{2.8} = 337$ , $Y = 0.91$ . Met $n = 1$ geldt $Y = P/(3.5 + P)$ : $0.36$ , $0.50$ , $0.70$ . Aflevering tussen 8 en 2: coöperatief $0.74$ , niet-coöperatief $0.34$ : het coöperatieve eiwit levert twee keer zoveel af.

Oefening 12.9 ★★

Een eiwit loopt op een SDS-gel als één band van $50\,\mathrm{kDa}$ en komt bij $200\,\mathrm{kDa}$ uit een gelfiltratiekolom. Geef zijn quaternaire structuur en zeg hoe je zou nagaan of er disulfidebruggen tussen de subeenheden zitten.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.9.

Een tetrameer van vier identieke subeenheden van $50\,\mathrm{kDa}$ . Laat de SDS-gel zonder reducerend middel lopen: verschijnen er banden bij 100, 150 of $200\,\mathrm{kDa}$ , dan verbinden disulfidebruggen de subeenheden; blijft alleen de band van $50\,\mathrm{kDa}$ over, dan worden zij niet-covalent bijeengehouden.

Oefening 12.10 ★★★

Sikkelcelhemoglobine heeft op plaats 6 van de $\beta$ -keten valine in plaats van glutamaat, aan het oppervlak. Leg vanuit de chemie van de twee zijketens uit waarom het mutante eiwit polymeriseert wanneer het gedeoxygeneerd is, en waarom de ziekte zich in de weefsels toont en niet in de longen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.10.

Glutamaat is geladen en gehydrateerd aan het oppervlak; valine is hydrofoob en schept een kleverige plek die water uitsluit. In de gedeoxygeneerde T-toestand ligt op een naburig molecuul een complementaire hydrofobe holte bloot, zodat de moleculen kop aan staart tot vezels aaneenplakken die de rode cel vervormen. In de longen verbergt de R-toestand de holte en lossen de vezels op; in de weefsels, waar hemoglobine gedeoxygeneerd is, ontstaan zij — daarom sikkelen de cellen daar en verstoppen zij de kleine bloedvaten.

Oefening 12.11 ★★★

Een vouwing is maar $40\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ stabiel. Bereken het deel van de moleculen dat bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ in evenwicht ontvouwen is ( $K = e^{-\Delta G/RT}$ ), en bij $45\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ als $\Delta G$ tot $10\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ is gedaald. Waarom is zo’n krappe stabiliteit nuttig voor een cel?

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.11.

Bij $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ is $RT = 2.58\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ : $K = e^{-40/2.58} = e^{-15.5} = 1.8 \times 10^{-7}$ : één molecuul op vijf miljoen is ontvouwen. Bij $45\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ met $10\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ is $RT = 2.64$ : $K = e^{-3.8} = 0.022$ : $2\,\%$ ontvouwen, en dat loopt steil op. Een krappe stabiliteit laat eiwitten van vorm veranderen wanneer zij werken (allosterie, katalyse), ontvouwd worden voor transport door membranen, en snel worden afgebroken en vervangen wanneer zij beschadigd of overbodig zijn.

Oefening 12.12 ★★★

“Een eiwit is een sequentie die zich tot een vorm vouwt, en de vorm is de functie.” Bespreek dat in een alinea met Anfinsen, chaperonnes, sikkelcel en allosterie: waar de zin opgaat en waar de cel moet ingrijpen.

Oplossing

Oplossing van Oefening 12.12.

Anfinsen toonde dat de sequentie volstaat om de vouwing vast te leggen, en de allosterie toont dat de vorm — en de verandering ervan — de functie is. Maar de cel grijpt bij elke stap in: chaperonnes redden ketens die anders zouden klonteren voordat zij gevouwen zijn, want het volgepakte cytosol is geen verdunde reageerbuis; één enkele vervanging (sikkelcel) geeft een correct gevouwen eiwit waarvan het oppervlak verkeerd is, zodat “vorm” de oppervlaktechemie moet omvatten en niet alleen de ruggengraat; en veel eiwitten hebben na de vouwing nog modificaties, partners of liganden nodig voordat zij werken. De zin verwoordt het beginsel; de cel levert de voorwaarden.

12.8 Vraagstuk: hemoglobine aan het werk

Probleem 12.1

Weekendvraagstuk — zuurstof van long naar spier gedragen, in rust, in een sprint, op een berg en vóór de geboorte, eindigend op de zuurstof die per liter bloed wordt afgeleverd

Bloed bevat $150\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ hemoglobine; $1\,\mathrm{g}$ bindt $1.34\,\mathrm{mL}$ $\mathrm{O_2}$ . Hemoglobine gehoorzaamt bij pH 7.4 aan de hillvergelijking met $n = 2.8$ en $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ ; myoglobine heeft $n = 1$ en $P_{50} = 0.37\,\mathrm{kPa}$ . Partiële drukken van $\mathrm{O_2}$ : $13.3\,\mathrm{kPa}$ in de longen op zeeniveau, $5.3\,\mathrm{kPa}$ in rustende weefsels. Neem $2.8\ln 3.5 = 3.51$ , $2.8\ln 5.3 = 4.67$ , $2.8\ln 13.3 = 7.25$ , $2.8\ln 2.7 = 2.78$ , $2.8\ln 4.5 = 4.21$ , $2.8\ln 7 = 5.45$ , $2.8\ln 4 = 3.88$ , $2.8\ln 2.6 = 2.68$ .

Deel I — In rust.

Bereken de zuurstofcapaciteit van een liter bloed.
Bereken $P^{2.8}$ voor $P = 3.5$ , $5.3$ en $13.3$ kPa (als $e^{2.8\ln P}$ ).
Bereken de verzadiging $Y$ van hemoglobine in de longen en in de weefsels.
Bereken het afgeleverde deel van de lading en de zuurstof die per liter bloed wordt afgeleverd, in milliliters.
Een mens in rust verbruikt $250\,\mathrm{mL}$ $\mathrm{O_2}$ per minuut. Welk hartminuutvolume vraagt die aflevering?
Bereken de verzadiging van myoglobine bij dezelfde twee drukken en de zuurstof die het per liter zou afleveren als het hemoglobine verving. Trek een conclusie.
Leg in één zin uit wat coöperativiteit oplevert.

Deel II — Een sprint. In een sprintende spier daalt de pH tot 7.2 en de plaatselijke $\mathrm{O_2}$ -druk tot $2.7\,\mathrm{kPa}$ ; het bohreffect verhoogt $P_{50}$ daar tot $4.5\,\mathrm{kPa}$ .

Bereken $Y$ bij $2.7\,\mathrm{kPa}$ met $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ (zonder bohreffect).
Bereken $Y$ bij $2.7\,\mathrm{kPa}$ met $P_{50} = 4.5\,\mathrm{kPa}$ .
Bereken de zuurstof die in beide gevallen per liter wordt afgeleverd (het laden in de longen blijft gelijk) en de winst van het bohreffect.
Het myoglobine van de spier zit op $P = 2.7\,\mathrm{kPa}$ . Hoe verzadigd is het, en wat gebeurt ermee als de druk tijdens een samentrekking tot $0.5\,\mathrm{kPa}$ daalt?
Leg uit waarom het bohreffect een vorm van allosterie is en waar de protonen aangrijpen.

Deel III — Een berg. Op $4000\,\mathrm{m}$ is de $\mathrm{O_2}$ -druk in de longen $7\,\mathrm{kPa}$ . Binnen dagen verhogen de rode cellen hun BPG, wat $P_{50}$ naar $4.0\,\mathrm{kPa}$ verschuift; binnen weken brengt het beenmerg het hemoglobine op $180\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ .

Bereken de verzadiging in de longen bij $7\,\mathrm{kPa}$ met $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ , en de aflevering per liter (weefsels op $5.3\,\mathrm{kPa}$ ). Vergelijk dat met zeeniveau.
Bereken de verzadiging in longen en weefsels met $P_{50} = 4.0\,\mathrm{kPa}$ , en de aflevering.
Leg uit waarom het verlagen van de affiniteit helpt, hoewel het het laden in de longen verlaagt.
Bereken de aflevering per liter met $P_{50} = 4.0\,\mathrm{kPa}$ en $180\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ hemoglobine.
Zou een nog lagere affiniteit ( $P_{50} = 6\,\mathrm{kPa}$ ) bij $7\,\mathrm{kPa}$ helpen? Bereken de twee verzadigingen en beslis.

Deel IV — Vóór de geboorte. Foetaal hemoglobine heeft $P_{50} = 2.6\,\mathrm{kPa}$ ; in de placenta is de $\mathrm{O_2}$ -druk aan beide zijden $4\,\mathrm{kPa}$ .

Bereken de verzadiging van het hemoglobine van de moeder bij $4\,\mathrm{kPa}$ .
Bereken de verzadiging van foetaal hemoglobine bij $4\,\mathrm{kPa}$ .
Leg uit hoe zuurstof van moeder naar foetus gaat hoewel de druk aan beide zijden gelijk is.
Foetaal hemoglobine heeft $\gamma$ -ketens in plaats van $\beta$ , die BPG zwak binden. Leg uit hoe dat de lagere $P_{50}$ oplevert.
Bij de geboorte moet het foetale bloed lossen in weefsels op $5.3\,\mathrm{kPa}$ . Bereken de foetale aflevering per liter vanuit longen op $13.3\,\mathrm{kPa}$ , en zeg waarom de overgang naar volwassen hemoglobine in de eerste maanden nuttig is.
Een mutatie brengt de volwassen $P_{50}$ op $5\,\mathrm{kPa}$ . Voorspel de slagaderlijke verzadiging van die persoon op zeeniveau, en het gevolg voor de aflevering.
Leg uit waarom een drager met $P_{50} = 3.5\,\mathrm{kPa}$ en zonder coöperativiteit ( $n = 1$ ) een slechte zuurstofdrager zou zijn: bereken zijn aflevering.
Geef het resultaat: de zuurstof die per liter bloed wordt afgeleverd in rust en in een sprintende spier, en de twee eigenschappen van hemoglobine die het verschil maken.

Oplossing

Oplossing van Probleem 12.1.

1. $150\times 1.34 = 201\,\mathrm{mL}$ $\mathrm{O_2}$ per liter. 2. $e^{3.51} = 33.4$ ; $e^{4.67} = 106.7$ ; $e^{7.25} = 1408$ . 3. Longen: $1408/(33.4 + 1408) = 0.977$ . Weefsels: $106.7/(33.4 + 106.7) = 0.762$ . 4. $0.977 - 0.762 = 0.215$ : $0.215\times 201 = 43\,\mathrm{mL}$ per liter. 5. $250/43 = 5.8\,\mathrm{L}/\mathrm{min}$ — dicht bij het hartminuutvolume in rust. 6. Myoglobine: longen $13.3/13.67 = 0.973$ ; weefsels $5.3/5.67 = 0.935$ ; het levert $0.038\times 201 = 7.7\,\mathrm{mL}$ per liter af, zes keer minder: een hyperbolische drager die goed laadt kan bij weefseldrukken niet lossen. 7. Coöperativiteit legt het steile deel van de curve tussen de twee werkdrukken, zodat een kleine drukdaling een groot deel van de lading vrijgeeft. 8. $e^{2.78} = 16.1$ ; $Y = 16.1/(33.4 + 16.1) = 0.325$ . 9. $e^{4.21} = 67.4$ ; $Y = 16.1/(67.4 + 16.1) = 0.193$ . 10. Zonder Bohr: $(0.977 - 0.325)\times 201 = 131\,\mathrm{mL}$ ; met: $(0.977 - 0.193)\times 201 = 158\,\mathrm{mL}$ per liter; winst $27\,\mathrm{mL}$ , $20\,\%$ . 11. $2.7/3.07 = 0.88$ verzadigd; bij $0.5\,\mathrm{kPa}$ is $0.5/0.87 = 0.57$ : het geeft tijdens de samentrekking een derde van zijn voorraad aan de mitochondriën af, en laadt tussen de samentrekkingen weer bij. 12. Protonen binden op plaatsen (histidinen, de N-uiteinden) weg van de heemgroepen, en stabiliseren door dat binden de T-toestand, waardoor de affiniteit bij de heemgroepen daalt: een ligand op de ene plaats verandert de affiniteit op een andere — allosterie. 13. $e^{5.45} = 233$ ; longen $233/(33.4 + 233) = 0.875$ ; weefsels $0.762$ ; aflevering $0.113\times 201 = 23\,\mathrm{mL}$ : ongeveer de helft van zeeniveau. 14. $e^{3.88} = 48.4$ : longen $233/(48.4 + 233) = 0.828$ ; weefsels $106.7/(48.4 + 106.7) = 0.688$ ; aflevering $0.140\times 201 = 28\,\mathrm{mL}$ . 15. Het laden daalt een beetje (0.875 naar 0.828) maar het lossen daalt meer (0.762 naar 0.688), zodat het verschil groeit: bij $7\,\mathrm{kPa}$ liggen de longen nog op de vlakke top van de curve terwijl de weefsels op het steile deel zitten. 16. Capaciteit $180\times 1.34 = 241\,\mathrm{mL}$ ; $0.140\times 241 = 34\,\mathrm{mL}$ per liter — drie kwart van zeeniveau hersteld. 17. $6^{2.8} = e^{2.8\times 1.79} = e^{5.02} = 151$ : longen $233/384 = 0.607$ , weefsels $106.7/258 = 0.414$ : aflevering $0.193$ , op papier nog beter — maar het slagaderlijk bloed zou dan slechts $61\,\%$ verzadigd zijn, en elke verdere daling van de longdruk of elke vraag om een hogere weefseldruk zou de hersenen tekortdoen; de werkelijke aanpassing houdt op rond $4\,\mathrm{kPa}$ . 18. $48.4/(33.4 + 48.4) = 0.59$ . 19. $e^{2.68} = 14.6$ ; $48.4/(14.6 + 48.4) = 0.77$ . 20. Bij dezelfde druk bindt het foetale eiwit meer: terwijl het bloed van de moeder tot $59\,\%$ lost en het foetale bloed tot $77\,\%$ laadt, stroomt zuurstof de drukgradiënt af die het verschil in affiniteit over het placentamembraan in stand houdt. 21. BPG bindt de T-toestand en verlaagt de affiniteit; de $\gamma$ -ketens binden het zwak, zodat foetaal hemoglobine dichter bij zijn eigen hoge affiniteit blijft: een lagere $P_{50}$ . 22. Longen: $1408/(14.6 + 1408) = 0.990$ ; weefsels $106.7/(14.6 + 106.7) = 0.880$ ; aflevering $0.110\times 201 = 22\,\mathrm{mL}$ , de helft van die van de volwassene: goed om zuurstof van de moeder over te nemen, slecht om haar af te leveren zodra de longen werken, vandaar de omschakeling. 23. $5^{2.8} = e^{2.8\times 1.609} = e^{4.51} = 90.6$ : longen $1408/1499 = 0.94$ , weefsels $106.7/197 = 0.54$ : aflevering $0.40$ , bijna het dubbele van normaal — de persoon is licht blauw aan de lippen maar verdraagt dat goed; de prijs is een kleinere reserve op hoogte. 24. $Y = P/(3.5 + P)$ : longen $0.79$ , weefsels $0.60$ : aflevering $0.19\times 201 = 38\,\mathrm{mL}$ — en in de sprintende spier bij $2.7\,\mathrm{kPa}$ : $0.44$ ; aflevering $0.35\times 201 = 70\,\mathrm{mL}$ tegen $158\,\mathrm{mL}$ . Zonder coöperativiteit laadt de drager slecht en lost hij slecht. 25. $43\,\mathrm{mL}$ $\mathrm{O_2}$ per liter in rust, $158\,\mathrm{mL}$ per liter in een sprintende spier; het verschil komt van de coöperativiteit (de sigmoïde curve) en van het bohreffect (de verschuiving van $P_{50}$ in zuur).

Begrippen gedefinieerd in dit hoofdstuk

Bekijk alle 479 begrippen in de begrippenlijst