Biologia universitária — 2.º ano · Bachelor Year 2

3Mutações e diversificação dos genomas

Espalhe um bilhão de bactérias numa placa impregnada de antibiótico e, na manhã seguinte, um punhado de colônias terá crescido. O fármaco ensinou essas células a resistir a ele, ou elas já eram resistentes antes de encontrá-lo? A pergunta parece filosófica e foi resolvida em 1943 por um experimento de grande elegância: as células resistentes já estavam lá antes, produzidas por mutações que ocorreram ao acaso, sem nenhuma relação com sua utilidade. Este capítulo trata das fontes dessa variação — os erros de cópia, os acidentes químicos, os genes saltadores, os genes trocados entre células, as duplicações de genes e de genomas inteiros — e da velocidade com que operam. A seleção, que tria a variação, é o assunto do Capítulo 22; aqui o assunto é de onde vem a matéria-prima.

3.1 As mutações

Definição 3.1 (A mutação e seus tipos)

Uma mutação é uma mudança hereditária na sequência do genoma. As mutações pontuais alteram uma ou poucas bases: uma substituição troca uma base por outra (uma transição troca purina por purina ou pirimidina por pirimidina, A $\leftrightarrow$ G ou C $\leftrightarrow$ T; uma transversão troca as classes); uma inserção ou uma deleção acrescenta ou remove bases. Numa sequência codificante, uma substituição é silenciosa se o novo códon especifica o mesmo aminoácido, de sentido trocado se especifica outro, sem sentido se cria um códon de parada; uma inserção ou deleção que não seja múltipla de três desloca o quadro de leitura (deslocamento do quadro de leitura) e embaralha todos os códons a jusante. Os rearranjos cromossômicos deslocam grandes segmentos: deleção, duplicação, inversão, translocação entre cromossomos. As mutações genômicas alteram o número de cromossomos: aneuploidia (um cromossomo a mais ou a menos, como na trissomia do 21) e poliploidia (conjuntos inteiros a mais). Uma mutação numa célula somática é herdada apenas pelos descendentes dessa célula; uma mutação na linhagem germinativa é herdada pelos descendentes do organismo, e só estas contam para a evolução.

Mutações pontuais numa sequência codificante curta (a mudança em vermelho). Uma substituição silenciosa conserva a proteína; uma de sentido trocado muda um resíduo; uma sem sentido a trunca; uma única base inserida desloca o quadro de leitura e reescreve tudo a jusante.

Proposição 3.2 (De onde vêm as mutações)

Há três fontes. Erros de replicação: a DNA-polimerase coloca uma base errada cerca de uma vez em $10^{5}$ ; sua exonuclease de revisão remove a maioria, deixando uma em $10^{7}$ ; o reparo de pareamento incorreto, que segue a forquilha de replicação e corrige a fita nova com base na antiga, leva a taxa final de erro a cerca de $10^{-9}$ a $10^{-10}$ por base por replicação. Química espontânea: todos os dias, em cada célula humana, cerca de $10\,000$ purinas se soltam de seus açúcares (depurinação) e uma centena de citosinas perde um grupo amino (desaminação, que transforma C em U, que pareia com A); ambas são reparadas, mas nem sempre. Mutágenos: a luz ultravioleta solda timinas adjacentes em dímeros; a radiação ionizante quebra as fitas; os agentes alquilantes e o ácido nitroso alteram bases; os corantes intercalantes se insinuam entre os pares de bases e causam deslocamentos do quadro de leitura; os radicais de oxigênio da respiração oxidam a guanina. A taxa por base é minúscula; multiplicada pelo tamanho de um genoma e pelo número de células, deixa de ser.

Teorema 3.3 (Mutações por genoma e por população)

Se a taxa de mutação é $u$ por par de bases por replicação e o genoma contém $G$ pares de bases, cada replicação produz em média $U = uG$ mutações novas, e uma população de $N$ células produz $UN$ por geração. Para E. coli ( $u \approx 5 \times 10^{-10}\,$ , $G = 4.6 \times 10^{6}\,$ ): $U \approx 0.002$ , de modo que uma célula em cada quinhentas carrega uma mutação nova — mas uma cultura de $10^{9}$ células produz dois milhões por geração, e cada uma das $3G \approx 1.4\times 10^{7}$ substituições de base única possíveis surge em algum lugar dela a cada poucas gerações. Para um ser humano ( $u \approx 1.2 \times 10^{-8}\,$ por geração, $G = 3.2 \times 10^{9}\,$ por conjunto haploide, dois conjuntos): cada criança carrega cerca de $75$ mutações novas, uma ou duas delas em sequência codificante.

Demonstração. Cada base é copiada de modo independente, com probabilidade $u$ de erro, de modo que o número de erros por cópia do genoma é uma soma de $G$ eventos raros independentes, de média $uG$ (e com distribuição aproximadamente de Poisson). $N$ células fazem $N$ cópias. O valor humano multiplica $u$ por $2G$ para o genoma diploide; a taxa por geração é por geração, e não por replicação, porque as células germinativas passam por muitas replicações entre uma fecundação e a seguinte. ∎

Teorema 3.4 (Mutantes numa cultura em crescimento)

Uma cultura que cresce de $N_0$ a $N$ células, na qual uma dada mutação ocorre com probabilidade $m$ a cada divisão celular, contém no final um número médio de eventos de mutação $m(N - N_0)$ e um número médio de células mutantes

\langle M\rangle = m\,N\,\ln\frac{N}{N_0},

maior que o número de eventos porque uma mutação precoce funda um clone. O número de células mutantes varia enormemente de uma cultura para outra (os raros eventos precoces dão “prêmios acumulados”), ao passo que, se as mutações fossem induzidas no plaqueamento, ele seguiria uma lei de Poisson com variância igual à média. A fração de culturas sem nenhum mutante é $p_0 = e^{-m(N - N_0)}$ , o que dá $m$ diretamente.

Demonstração. O crescimento de $n$ para $n + \mathrm{d}n$ células exige $\mathrm{d}n$ divisões, cada uma uma oportunidade para a mutação, de modo que ocorrem $m\,\mathrm{d}n$ eventos nesse intervalo; somando, $m(N - N_0)$ eventos ao todo. Uma mutação que ocorre quando a cultura tem $n$ células funda um clone que cresce em sincronia com a cultura e conta $N/n$ células no final; o número esperado de células mutantes é, portanto, $\int_{N_0}^{N} m\,(N/n)\,\mathrm{d}n = mN\ln(N/N_0)$ . Os eventos são raros e independentes, de modo que seu número segue uma lei de Poisson de média $m(N - N_0)$ , e a probabilidade de nenhum é $e^{-m(N - N_0)}$ . ∎

Evidências. Luria e Delbrück (1943) cultivaram vinte pequenas culturas de E. coli, cada uma a partir de poucas células, e em paralelo retiraram vinte amostras de uma única cultura grande; plaquearam as quarenta com um bacteriófago que mata toda célula sensível e contaram as colônias resistentes. As amostras da cultura única deram contagens próximas da média, como prevê uma lei de Poisson; as culturas independentes deram contagens de 0, 0, 1, 0, 3, 0, 107, 0, 5… — uma variância muitas vezes maior que a média. As mutações para a resistência tinham ocorrido em momentos aleatórios antes de as células encontrarem o fago, e as precoces produziram os prêmios acumulados. Lederberg e Lederberg (1952) confirmaram o resultado sem nunca expor as células selecionadas ao agente: pressionando um tampão de veludo sobre uma placa e carimbando cópias, encontraram colônias resistentes nas mesmas posições em todas as réplicas, e as isolaram da placa-mestra não tratada. ∎

O teste de flutuação. Se as mutações (vermelho) ocorrem ao acaso durante o crescimento, o número de mutantes depende de quando a mutação aconteceu, e culturas independentes diferem enormemente; se o agente seletivo as induzisse no plaqueamento, todas as culturas mostrariam um número pequeno e parecido. — O teste de flutuação. Se as mutações (vermelho) ocorrem ao acaso durante o crescimento, o número de mutantes depende de *quando* a mutação aconteceu, e culturas independentes diferem enormemente; se o agente seletivo as induzisse no plaqueamento, todas as culturas mostrariam um número pequeno e parecido.

Um disco de antibiótico sobre um tapete de bactérias: a zona clara é onde o fármaco que se difunde do disco matou as células sensíveis, e as colônias dentro dela cresceram a partir de mutantes resistentes que já estavam presentes antes de o disco ser colocado.

Proposição 3.5 (O reparo e seus limites)

Uma célula corrige a maior parte dos danos antes que se tornem mutações. O reparo de pareamento incorreto remove a base errada da fita recém-sintetizada. O reparo por excisão de bases corta uma única base danificada (uma uracila, uma guanina oxidada) e preenche a lacuna; é por isso que o DNA usa timina e não uracila: uma uracila no DNA só pode ser uma citosina desaminada, e é reconhecida como estranha. O reparo por excisão de nucleotídeos remove um trecho de uma dúzia de bases em torno de uma lesão volumosa, como um dímero de timina; as pessoas que não o têm (xeroderma pigmentoso) desenvolvem cânceres de pele com a luz solar comum. O reparo por recombinação reconstrói um cromossomo quebrado a partir de sua cópia irmã. O que escapa ao reparo, ou é reparado de forma errada, é uma mutação — e uma célula que perdeu um sistema de reparo (uma mutadora) muta cem vezes mais depressa, o que é uma vantagem a curto prazo sob estresse e um fardo a longo prazo. Os mecanismos de reparo são tratados em profundidade no volume do Ano 3.

3.2 Genes que se movem

Definição 3.6 (Elementos transponíveis)

Um elemento transponível é um segmento de DNA capaz de se mover para uma nova posição no genoma. Os transpósons de DNA codificam uma transposase que recorta o elemento e o cola em outro lugar (ou o copia ali); as sequências de inserção bacterianas são as mais simples (um gene de transposase entre duas repetições invertidas), e os transpósons compostos carregam genes adicionais — muitas vezes de resistência a antibióticos — entre duas delas. Os retrotranspósons se movem por uma via de copiar e colar através de um intermediário de RNA, copiado de volta em DNA por uma transcriptase reversa; nunca deixam o sítio antigo e, por isso, se acumulam. Um elemento que cai dentro de um gene o interrompe; caindo perto de um, pode alterar sua expressão; duas cópias num mesmo cromossomo oferecem sítios para um crossing-over desigual. Os transpósons e suas relíquias constituem metade do genoma humano e oitenta por cento do genoma do milho; a maioria está hoje imóvel.

Evidências. McClintock (décadas de 1940 e 1950) estudou grãos de milho cujo pigmento púrpura se perdia em algumas células e se restabelecia em outras, produzindo grãos pintados. Mostrou, por cruzamentos e pela observação dos cromossomos, que a instabilidade era causada por um elemento (Dissociation) que quebrava o cromossomo onde estava e se movia entre posições sob o controle de um segundo elemento (Activator), e que um gene era silenciado quando o elemento estava nele e reativado quando o elemento saía. Os genes, concluiu ela, podiam mudar de posição; a ideia só foi aceita vinte anos depois, quando se descobriram as sequências de inserção bacterianas, e lhe valeu um Prêmio Nobel em 1983. ∎

Barbara McClintock e os grãos que a levaram aos elementos transponíveis: um gene de pigmento púrpura desligado por um elemento inserido e religado, célula por célula, quando o elemento salta para fora, deixando pintas e setores.

Duas maneiras de se mover. Um transpóson de DNA é excisado e reinserido; um retrotranspóson é transcrito, copiado de volta em DNA e inserido em outro lugar, de modo que suas cópias se acumulam.

Definição 3.7 (Transferência horizontal de genes)

Os procariotos adquirem genes de células que não são seus genitores por três vias. Transformação: uma célula capta DNA nu do meio (liberado por células mortas) e o recombina em seu cromossomo; algumas espécies são naturalmente competentes, e é por essa via que os pneumococos trocam genes da cápsula. Conjugação: uma doadora portadora de um plasmídeo conjugativo (o fator F de E. coli) constrói um pilus, puxa uma receptora para perto e passa uma única fita do plasmídeo por um poro enquanto o replica pelo mecanismo do círculo rolante; se o plasmídeo se integrou ao cromossomo (uma linhagem Hfr), genes cromossômicos são transferidos em ordem atrás dele, e o momento em que cada um entra permite mapear o cromossomo. Transdução: um bacteriófago empacota por engano um pedaço do DNA do hospedeiro e o injeta na próxima célula que infecta. Juntas, essas vias transferem genes de resistência entre espécies dentro dos hospitais em poucos anos, e transferiram genes metabólicos por toda a árvore bacteriana ao longo do tempo geológico, de modo que a ascendência de um procarioto é tanto uma rede quanto uma árvore (Capítulo 24).

Evidências. Lederberg e Tatum (1946) misturaram duas linhagens de E. coli, cada uma incapaz de produzir dois nutrientes diferentes, e plaquearam a mistura num meio mínimo em que nenhuma das duas podia crescer sozinha: apareceram colônias, à razão de cerca de uma por dez milhões de células, capazes de produzir os quatro — recombinantes. Davis (1950) repetiu o experimento com as linhagens separadas por um filtro que deixava passar moléculas, mas não células: nenhum recombinante, logo o contato era necessário. Hayes mostrou em seguida que a transferência era unidirecional, de uma doadora para uma receptora, e Wollman e Jacob (1956) interromperam os cruzamentos num liquidificador a intervalos regulares e encontraram os genes da doadora entrando na receptora numa ordem fixa, um após o outro, ao longo de cerca de cem minutos. ∎

À esquerda: a conjugação — a doadora passa uma fita de seu plasmídeo F através da junção do pilus enquanto a copia. À direita: o experimento de cruzamento interrompido com uma doadora Hfr: cada gene cromossômico começa a aparecer entre os recombinantes num momento característico, o que mapeia o cromossomo em minutos.

Duas bactérias unidas por um pilus conjugativo, vistas em microscopia eletrônica de transmissão: a ponte ao longo da qual passa o plasmídeo.

Exemplo 3.8 (A resistência em movimento)

Um gene de resistência costuma surgir uma única vez, por mutação ou a partir da bactéria do solo que produz o antibiótico, e depois viaja: de um cromossomo para um transpóson, do transpóson para um plasmídeo conjugativo, do plasmídeo para outras espécies por conjugação e para outras linhagens por transdução, e de volta a um cromossomo por transformação. Plasmídeos com cinco ou seis resistências ao mesmo tempo (reunidas em integrons, que capturam cassetes gênicos) foram encontrados no Japão na década de 1950, poucos anos depois de os fármacos entrarem em uso; o gene da carbapenemase NDM-1, visto pela primeira vez em 2008, chegou a todos os continentes em três anos, levado por um plasmídeo. A evolução da resistência é, em grande parte, não a evolução de genes novos, mas o deslocamento de genes antigos.

3.3 Duplicação: genes e genomas

Proposição 3.9 (Duplicação gênica e famílias gênicas)

Quando duas sequências semelhantes estão em tandem num cromossomo, os homólogos podem parear fora de registro na meiose e fazer um crossing-over desigual, de modo que um produto carrega três cópias e o outro, uma. Um gene duplicado é redundante: uma cópia pode manter a função antiga enquanto a outra acumula mutações livremente — geralmente degenerando num pseudogene, ocasionalmente adquirindo uma nova função (neofuncionalização) ou uma parte da antiga (subfuncionalização). Repetido ao longo de centenas de milhões de anos, esse processo constrói as famílias gênicas: as globinas (um único gene ancestral deu origem à mioglobina, ao agrupamento $\alpha$ e ao agrupamento $\beta$ , com membros embrionários, fetais e adultos expressos sucessivamente), os receptores olfativos (mil genes num camundongo), os genes homeobox, as cristalinas do cristalino. A maioria dos genes de um genoma pertence a uma família, e a duplicação é a principal fonte de genes novos.

Evidências. O agrupamento da $\beta$ -globina humana, no cromossomo 11, contém cinco genes funcionais ( $\varepsilon$ , $^{G}\gamma$ , $^{A}\gamma$ , $\delta$ , $\beta$ ) e um pseudogene, na ordem em que são ativados durante o desenvolvimento, todos com a mesma estrutura de éxons e íntrons, com sequências tanto mais parecidas quanto mais recente sua divergência; o agrupamento $\alpha$ , no cromossomo 16, tem a mesma arquitetura. As deleções de um ou mais genes $\alpha$ , produzidas por crossing-over desigual entre as cópias quase idênticas, são comuns e causam a $\alpha$ -talassemia; o produto recíproco, um cromossomo com três genes $\alpha$ , é encontrado nas mesmas populações. ∎

Acima: o crossing-over desigual entre cópias em tandem mal pareadas produz um cromossomo com três cópias e outro com uma só. Abaixo: a família das globinas, construída por duplicações e divergências sucessivas.

Definição 3.10 (Poliploidia)

Um poliploide tem mais de dois conjuntos cromossômicos completos. Um autopoliploide tem vários conjuntos de uma mesma espécie (uma meiose falha dá um gameta diploide; dois desses gametas dão um tetraploide); um alopoliploide reúne os conjuntos de duas espécies após uma hibridização. O híbrido diploide AB, sem homólogo para nenhum cromossomo, não consegue pareá-los na meiose e é estéril; se seu genoma se duplica em AABB, cada cromossomo volta a ter um par, a meiose funciona e a nova planta é fértil — mas não consegue se cruzar de volta com nenhum dos genitores (um descendente AAB é estéril). A poliploidia faz, assim, uma nova espécie num único passo, e cerca de um terço das espécies de plantas com flores surgiu dessa maneira: o trigo-mole é um hexaploide AABBDD de três gramíneas, o morango cultivado um octoploide, o algodão e o tabaco alotetraploides, e a própria linhagem dos vertebrados duplicou seu genoma duas vezes perto de sua origem. Os poliploides costumam ser maiores que seus ancestrais diploides (mais DNA, células maiores) e são muito apreciados pelos melhoristas.

A origem do trigo-mole: duas hibridizações, cada uma seguida de uma duplicação do genoma, construíram um hexaploide a partir de três gramíneas diploides em cerca de dez mil anos.

Um morango silvestre diploide e o octoploide cultivado: o poliploide, com quatro vezes mais DNA em cada célula, é a planta maior, de fruto maior.

3.4 Acaso e taxa

Proposição 3.11 (A mutação é aleatória em relação à necessidade)

O teste de flutuação e o plaqueamento em réplica mostram que uma mutação útil num ambiente novo surge com a mesma taxa, esteja o ambiente presente ou não: o ambiente seleciona entre as mutações, não as provoca. A mutação não é aleatória em todos os sentidos — as transições são mais numerosas que as transversões, os dinucleotídeos CpG mutam dez vezes mais depressa que os outros sítios (sua citosina metilada se desamina em timina, que o reparo não reconhece como estranha), algumas regiões são pontos quentes, e o estresse pode elevar a taxa global —, mas é cega às consequências. A própria taxa de mutação é um caráter hereditário, e a seleção a ajusta: alta demais, cada geração herda mudanças nocivas; baixa demais, a população não consegue acompanhar um mundo em mudança. As linhagens mutadoras vencem por pouco tempo num hospital e perdem a longo prazo, e a taxa de $10^{-9}$ por base em que a maioria das células se estabiliza é um compromisso entre o custo dos erros e o custo da revisão.

3.5 Exercícios

Exercício 3.1 ★

Classifique cada mudança no códon GAA (glutamato): GAG; GTA; TAA; inserção de um C após a primeira base. Qual é uma transição, e qual uma transversão?

Solução

Solução de Exercício 3.1.

GAG: silenciosa (continua glutamato), uma transição (A $\to$ G). GTA: de sentido trocado (valina), uma transversão (A $\to$ T). TAA: sem sentido (parada), uma transversão (G $\to$ T). Inserção de uma base: um deslocamento do quadro de leitura, que reescreve todos os códons seguintes.

Exercício 3.2 ★

Com $u = 5 \times 10^{-10}\,$ por par de bases por replicação e $G = 4.6 \times 10^{6}\,$ , quantas mutações novas uma divisão de E. coli produz em média? Quantas por geração numa cultura de $10^{9}$ células?

Solução

Solução de Exercício 3.2.

$U = 5\times 10^{-10}\times 4.6\times 10^{6} = 2.3\times 10^{-3}$ : uma divisão em cerca de 430 produz uma mutação. Em $10^{9}$ células: $2.3\times 10^{6}$ mutações novas por geração.

Exercício 3.3 ★

Cite as três vias de transferência horizontal de genes e diga, para cada uma, o que ela exige (contato, um vírus, DNA livre) e o que costuma transferir.

Solução

Solução de Exercício 3.3.

Transformação: captação de DNA livre de células lisadas; exige uma receptora competente; transfere fragmentos cromossômicos (genes da cápsula nos pneumococos). Conjugação: contato célula a célula através de um pilus; exige um plasmídeo conjugativo na doadora; transfere plasmídeos (genes de resistência) e, a partir de uma Hfr, genes cromossômicos. Transdução: um bacteriófago que empacotou DNA do hospedeiro; transfere um fragmento qualquer (generalizada) ou os genes vizinhos ao sítio do prófago (especializada).

Exercício 3.4 ★

Distinga autopoliploidia de alopoliploidia, com um exemplo de cada, e explique por que um híbrido diploide de duas espécies costuma ser estéril.

Solução

Solução de Exercício 3.4.

Autopoliploide: conjuntos a mais de uma mesma espécie, por um gameta diploide (a batata tetraploide, muitos trevos autotetraploides). Alopoliploide: os conjuntos de duas espécies reunidos por hibridização e depois duplicados (trigo-mole, algodão, tabaco). O híbrido diploide AB não tem dois cromossomos iguais, de modo que nenhum consegue parear na meiose I; os cromossomos segregam ao acaso, e os gametas são desbalanceados e inviáveis.

Exercício 3.5 ★★

Uma linhagem germinativa humana acumula $u = 1.2 \times 10^{-8}\,$ mutações por par de bases por geração num genoma haploide de $3.2 \times 10^{9}\,$ pares de bases. Quantas mutações novas uma criança carrega? Se $1.5\,\%$ do genoma codifica proteínas e $70\,\%$ das substituições codificantes mudam um aminoácido, quantas mudanças novas de aminoácido a criança carrega?

Solução

Solução de Exercício 3.5.

$2\times 3.2\times 10^{9}\times 1.2\times 10^{-8} = 77$ mutações novas. Em sequência codificante: $77\times 0.015 = 1.2$ ; que mudam um aminoácido: $1.2\times 0.7 = 0.8$ — a maioria das crianças carrega cerca de uma substituição nova de aminoácido.

Exercício 3.6 ★★

Uma cultura cresce de $10^{3}$ a $10^{9}$ células; uma dada mutação ocorre a $m = 2 \times 10^{-8}\,$ por divisão. Calcule o número esperado de eventos de mutação e de células mutantes. Por que a fração de culturas sem mutante é inútil aqui para medir $m$ , e que tamanho de cultura a tornaria útil?

Solução

Solução de Exercício 3.6.

Eventos: $m(N - N_0) = 2\times 10^{-8}\times 10^{9} = 20$ . Células mutantes: $mN\ln(N/N_0) = 20\times \ln 10^{6} = 20\times 13.8 = 276$ . $p_0 = e^{-20} \approx 2\times 10^{-9}$ : todas as culturas têm mutantes, de modo que contar as culturas sem nenhum não mede nada. É preciso $m(N - N_0) \approx 1$ , isto é, $N \approx 5\times 10^{7}$ , caso em que $p_0 \approx 0.37$ e algumas dezenas de culturas dão $m$ com precisão de um fator dois.

Exercício 3.7 ★★

A citosina se desamina em uracila; a 5-metilcitosina se desamina em timina. Explique por que a primeira lesão é reparada com eficiência e a segunda não, e deduza por que os sítios CpG (onde a citosina é metilada) são pontos quentes de mutação e são mais raros no genoma do que o acaso preveria.

Solução

Solução de Exercício 3.7.

A uracila não pertence ao DNA, de modo que uma uracila-DNA glicosilase pode remover toda uracila que encontra, sem ambiguidade. A timina é uma base normal: depois que a 5-metilcitosina se desamina, o pareamento incorreto G $\cdot$ T é detectado, mas a maquinaria de reparo não tem como saber qual fita está errada e, na metade das vezes, “corrige” o G, fixando uma transição C $\to$ T. Os sítios CpG metilados mutam, portanto, cerca de dez vezes mais depressa que os outros sítios e, ao longo do tempo evolutivo, foram convertidos em TpG e CpA: os genomas de mamíferos contêm apenas cerca de um quinto dos CpG que a composição de bases preveria.

Exercício 3.8 ★★

Num experimento de cruzamento interrompido, quatro genes entram na receptora aos 8, 17, 25 e $40\,\mathrm{min}$ ; o cromossomo inteiro ( $4.6\,\mathrm{Mb}$ ) levaria $100\,\mathrm{min}$ . Converta os tempos em posições em quilobases e calcule as distâncias entre genes consecutivos.

Solução

Solução de Exercício 3.8.

$46\,\mathrm{kb}$ por minuto. Posições: 368, 782, 1150 e $1840\,\mathrm{kb}$ ; distâncias de 414, 368 e $690\,\mathrm{kb}$ .

Exercício 3.9 ★★

Desenhe o pareamento e o crossing-over que transformam dois cromossomos com dois genes de $\alpha$ -globina em tandem cada um num cromossomo com três e noutro com um. Uma pessoa herda um cromossomo com um só gene de cada genitor: quantos genes $\alpha$ ela tem, e o que se espera de sua hemoglobina?

Solução

Solução de Exercício 3.9.

A segunda cópia de um cromossomo pareia com a primeira cópia do outro; um crossing-over entre elas produz uma cromátide com a cópia 1, a cópia 2 e a cópia 2 $'$ (três genes) e outra apenas com a cópia 1 $'$ . Uma pessoa com um cromossomo de um só gene vindo de cada genitor tem dois genes $\alpha$ em vez de quatro ( $-\alpha/-\alpha$ ): as cadeias $\alpha$ são produzidas à metade da taxa, as hemácias são pequenas e pálidas, com anemia leve ou ausente — é o traço $\alpha$ -talassêmico.

Exercício 3.10 ★★★

O trigo-mole é AABBDD, com $2n = 42$ . Dê o número de cromossomos de seus gametas, dos híbridos estéreis em cada etapa de sua origem e de um cruzamento entre o trigo-mole e o trigo emmer (AABB). Explique, em termos de pareamento meiótico, por que cada duplicação restaurou a fertilidade e por que o hexaploide não consegue se cruzar de volta com seus genitores.

Solução

Solução de Exercício 3.10.

Gametas: $n = 21$ (um conjunto de cada, A, B, D). Híbridos: AB, 14 cromossomos; ABD, 21. Trigo-mole $\times$ trigo emmer: AABBD, 35 cromossomos — os conjuntos A e B pareiam, o conjunto D não tem par, e a planta é em grande parte estéril. Cada duplicação deu a cada cromossomo um homólogo idêntico, de modo que se formam bivalentes e os gametas são balanceados; o retrocruzamento com um genitor produz plantas com um conjunto sem par, cujos gametas são desbalanceados, de modo que o hexaploide fica reprodutivamente isolado de seus ancestrais — uma espécie num único passo.

Exercício 3.11 ★★★

Numa população intestinal de $N = 10^{9}$ bactérias, um plasmídeo de resistência se espalha por conjugação a uma taxa proporcional aos encontros entre portadoras $R$ e não portadoras $N - R$ : $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma R (N - R)$ com $\gamma N = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ . Resolva, partindo de uma portadora, e calcule o tempo para que metade da população carregue o plasmídeo. O que acontece se o antibiótico for então retirado e o plasmídeo custar a sua hospedeira $5\,\%$ da taxa de crescimento?

Solução

Solução de Exercício 3.11.

Crescimento logístico: $R(t) = N/\bigl(1 + (N - 1)e^{-\gamma Nt}\bigr)$ . Metade da população quando $(N - 1)e^{-\gamma Nt} = 1$ : $t = \ln(N - 1)/\gamma N = 20.7/0.5 = 41\,\mathrm{h}$ . Sem o antibiótico, as células sem plasmídeo crescem $5\,\%$ mais depressa, de modo que a razão entre portadoras e não portadoras decai como $e^{-st}$ , com $s = 0.05\ln 2 = 0.035\,\mathrm{h}^{-1}$ por hora (tempo de geração de $1\,\mathrm{h}$ ): passar de $99\,\%$ a $1\,\%$ leva $\ln(99^2)/0.035 = 260\,\mathrm{h}$ , onze dias — e a transferência contínua pode manter o plasmídeo indefinidamente numa frequência baixa, pronto para o próximo tratamento com o fármaco.

Exercício 3.12 ★★★

“A mutação é aleatória; a evolução não.” Discuta, usando o teste de flutuação, o plaqueamento em réplica e o fato de que a própria taxa de mutação está sob seleção.

Solução

Solução de Exercício 3.12.

O teste de flutuação mostrou que as mutações de resistência surgem antes e na ausência do agente seletivo, em momentos aleatórios, de modo que a mutação é cega ao que seria útil; o plaqueamento em réplica mostrou o mesmo sem expor as células selecionadas em momento algum. A evolução não é aleatória porque a seleção tria essas variantes cegas por suas consequências, de modo consistente e cumulativo. O único ponto em que a própria aleatoriedade é moldada é a taxa: as linhagens com erros demais ou de menos perdem, de modo que a taxa de mutação é um compromisso adaptado — mas o que cada mutação faz continua imprevisível e não escolhido.

3.6 Problema: Um teste de flutuação

Problema 3.1

Problema de fim de semana — um teste de flutuação é realizado e analisado, a taxa de mutação de uma linhagem é extraída dele e levada à escala de seu genoma e de sua população, a disseminação de um plasmídeo de resistência é modelada e o custo de uma mutadora é avaliado, até a taxa de mutação por base da linhagem e o tempo que o plasmídeo leva para dominar

Vinte culturas de E. coli são iniciadas, cada uma, com $100$ células em $0.2\,\mathrm{mL}$ e cultivadas até $N = 2 \times 10^{8}\,$ células; cada uma é então espalhada numa placa com um bacteriófago, e as colônias resistentes são contadas: 0, 0, 0, 1, 0, 0, 3, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0, 107, 0, 2, 0, 0, 5. Em paralelo, vinte amostras de $0.2\,\mathrm{mL}$ são retiradas de uma única cultura grande, com a mesma densidade, e plaqueadas da mesma forma: 14, 15, 13, 21, 15, 14, 26, 16, 20, 13, 17, 12, 18, 14, 16, 19, 15, 13, 17, 16. Genoma: $4.6 \times 10^{6}\,$ pares de bases, $88\,\%$ codificante. A resistência ao fago pode surgir por qualquer uma de $20$ substituições de base única distintas num gene de receptor.

Parte I — O teste.

Calcule a média e a variância das vinte culturas independentes.
Calcule a média e a variância das vinte amostras.
Para uma distribuição de Poisson, a variância é igual à média. Qual conjunto segue Poisson, e o que a distribuição de cada conjunto diz sobre quando as mutações ocorreram?
Explique a contagem de 107.
Quantas das culturas independentes não contêm nenhum mutante? Use $p_0 = e^{-m(N - N_0)}$ para estimar $m$ , a taxa de mutação para a resistência por divisão celular.
Calcule o número esperado de células mutantes por cultura a partir de $mN\ln(N/N_0)$ e compare com a média observada.
Por que as amostras da cultura única teriam sido inúteis para estimar $m$ pelo método de $p_0$ ?

Parte II — Levando à escala do genoma.

Deduza a taxa de mutação $u$ por par de bases por replicação a partir de $m$ e do número de mudanças que conferem resistência.
Calcule o número médio de mutações novas por genoma por replicação, $U$ .
Uma cultura de um litro a $10^{9}$ células por mililitro se duplica uma vez. Quantas mutações novas surgem na população?
Quantas substituições de base única distintas são possíveis nesse genoma? Em média, quantas vezes cada uma surge nessa única duplicação?
Explique por que, numa população assim, a resistência a qualquer antibiótico isolado que uma única mutação possa vencer está praticamente garantida.
Explique por que combinar dois antibióticos que exigem duas mutações independentes muda a situação, com um número.

Parte III — Um plasmídeo se espalha. Num intestino com $N = 10^{9}$ células, uma célula adquire um plasmídeo de resistência conjugativo. As portadoras $R$ o transmitem por contato: $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma R(N - R)$ , com $\gamma N = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Mostre que $R(t) = N/\bigl(1 + (N - 1)e^{-\gamma N t}\bigr)$ é solução da equação com $R(0) = 1$ .
Calcule o instante em que metade das células carrega o plasmídeo.
Calcule o instante em que $99\,\%$ o carregam.
Quantos eventos de conjugação por hora ocorrem no momento em que metade das células é portadora?
Compare com o tempo para que um mutante resistente alcance metade da população crescendo $10\,\%$ mais depressa que o restante sob o antibiótico (tempo de geração de $1\,\mathrm{h}$ para as células sensíveis): partindo de uma célula, quanto tempo isso leva?
Conclua por que a resistência se espalha sobretudo por transferência, e não por descendência.

Parte IV — Uma mutadora. Uma linhagem sem reparo de pareamento incorreto muta $100$ vezes mais depressa. Suponha que $30\,\%$ das mutações em sequência codificante sejam nocivas.

Calcule seu $U$ e o número médio de mutações nocivas por célula por geração.
Após $200$ gerações, que fração dos descendentes de uma linhagem não carrega nenhuma mutação nociva (Poisson)?
Calcule o mesmo para o tipo selvagem.
No teste de flutuação acima, que contagem média a mutadora teria dado, e que fração de culturas sem mutante?
Explique em duas frases por que as mutadoras são encontradas entre os isolados hospitalares e são raras na natureza.
Enuncie o resultado: $m$ , $u$ , $U$ da linhagem, e os tempos para que o plasmídeo alcance metade e $99\,\%$ do intestino.

Solução

Solução de Problema 3.1.

1. Soma 119, média $5.95$ ; média dos quadrados $11489/20 = 574$ ; variância $574 - 35 = 540$ . 2. Soma 324, média $16.2$ ; média dos quadrados $5462/20 = 273$ ; variância $273 - 262 = 11$ . 3. As amostras de uma só cultura seguem Poisson (variância próxima da média): são sorteios aleatórios de uma mesma fração fixa de mutantes. As culturas independentes têm uma variância noventa vezes maior que a média: seus mutantes surgiram em momentos diferentes e aleatórios durante o crescimento, e quanto mais precoce a mutação, maior seu clone. 4. Um prêmio acumulado: uma mutação numa das primeiras divisões, cujo clone cresceu depois com a cultura até cem células. 5. Quatorze de vinte: $p_0 = 0.70$ ; $m(N - N_0) = -\ln 0.70 = 0.36$ ; $m = 0.36/2\times 10^{8} = 1.8 \times 10^{-9}\,$ por divisão. 6. $1.8\times 10^{-9}\times 2\times 10^{8}\times \ln(2\times 10^{6}) = 0.36\times 14.5 = 5.2$ células mutantes; observado $5.95$ — concordância dentro do ruído de vinte culturas. 7. Nenhuma amostra estava vazia (todas compartilham os mutantes da cultura de origem), de modo que $p_0 = 0$ não dá nenhuma estimativa; as amostras medem a fração de mutantes de uma única cultura, que depende de quando suas mutações ocorreram. 8. $u = m/20 = 9 \times 10^{-11}\,$ por par de bases por replicação. 9. $U = 9\times 10^{-11}\times 4.6\times 10^{6} = 4.1 \times 10^{-4}\,$ . 10. $10^{12}$ células $\times$ $4.1\times 10^{-4}$ $= 4.1\times 10^{8}$ mutações novas. 11. $3\times 4.6\times 10^{6} = 1.4\times 10^{7}$ mudanças possíveis; cada uma surge $4.1\times 10^{8}/1.4\times 10^{7} \approx 30$ vezes. 12. Toda substituição de base única, inclusive cada uma das que conferem resistência a um fármaco vencido por uma única mutação, está presente em dezenas de células antes de o fármaco ser adicionado; o fármaco apenas as seleciona. 13. Duas mutações independentes na mesma célula ocorrem a $m^2 \approx (2\times 10^{-9})^2 = 4\times 10^{-18}$ por divisão: em $10^{12}$ células, $4\times 10^{-6}$ por geração — uma célula duplamente resistente praticamente nunca preexiste, e é por isso que a tuberculose é tratada com vários fármacos ao mesmo tempo. 14. Com $a = N - 1$ e $E = e^{-\gamma Nt}$ : $R = N/(1 + aE)$ , $\mathrm{d}R/\mathrm{d}t = \gamma N\cdot NaE/(1 + aE)^2$ ; e $\gamma R(N - R) = \gamma\,\frac{N}{1 + aE}\cdot\frac{NaE}{1 + aE}$ , o mesmo; $R(0) = N/(1 + N - 1) = 1$ . 15. $(N - 1)E = 1$ : $t = \ln(N - 1)/\gamma N = 20.7/0.5 = 41\,\mathrm{h}$ . 16. $1 + aE = 1/0.99$ , $aE = 0.0101$ : $t = \ln(10^{9}/0.0101) /0.5 = (20.7 + 4.6)/0.5 = 51\,\mathrm{h}$ . 17. $\gamma (N/2)^2 = \gamma N\cdot N/4 = 0.5\times 2.5\times 10^{8} = 1.25\times 10^{8}$ transferências por hora. 18. Taxas de crescimento $\ln 2 = 0.693\,\mathrm{h}^{-1}$ e $0.762\,\mathrm{h}^{-1}$ ; a razão mutante/sensível cresce como $e^{st}$ com $s = 0.069\,\mathrm{h}^{-1}$ ; passar de $1/N$ a 1 leva $\ln N/s = 20.7/0.069 = 300\,\mathrm{h}$ , doze dias. 19. A transferência é proporcional ao produto de portadoras e não portadoras e ocorre ao ritmo dos encontros, não das divisões; a descendência é limitada pela vantagem de crescimento do mutante, que é pequena. Um plasmídeo atravessa a população em dois dias; um mutante favorecido, em duas semanas. 20. $U = 4.1\times 10^{-2}$ ; nocivas: $0.041\times 0.88\times 0.3 = 0.011$ por geração. 21. Média $2.2$ : $e^{-2.2} = 0.11$ , um descendente em cada nove ileso. 22. Tipo selvagem: $1.1\times 10^{-4}$ por geração, $0.022$ em 200: $e^{-0.022} = 0.98$ . 23. Média de $520$ células mutantes; $p_0 = e^{-36} \approx 10^{-16}$ : nenhuma cultura vazia. 24. Sob seleção intensa e variável (os antibióticos em rodízio de um hospital), o suprimento cem vezes maior de variantes novas supera a carga, e as mutadoras pegam carona nas resistências que geram. Num ambiente estável, não há nada a ganhar e uma mutação nociva a cada cem gerações a perder, de modo que as linhagens mutadoras são eliminadas. 25. $m = 1.8 \times 10^{-9}\,$ por divisão para a resistência, $u = 9 \times 10^{-11}\,$ por par de bases por replicação, $U = 4.1 \times 10^{-4}\,$ mutações por genoma por replicação; o plasmídeo alcança metade do intestino em $41\,\mathrm{h}$ e $99\,\%$ dele em $51\,\mathrm{h}$ .

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