Biologia universitária — 2.º ano · Bachelor Year 2

2Metabolismo microbiano e biofilmes

Encha um cilindro de vidro com lama de lagoa, um pouco de papel picado, uma gema de ovo e água, e deixe-o no parapeito de uma janela. Em poucas semanas, ele se estratifica em faixas coloridas: algas verdes no topo, uma camada cor de ferrugem, uma faixa púrpura, uma verde mais abaixo e lama negra de sulfeto no fundo. Nada foi acrescentado além da luz. Cada faixa é uma população que vive de uma química diferente — de oxigênio, de nitrato, de sulfato, de sulfeto, de hidrogênio — e cada uma alimenta a seguinte. A coluna é o mundo microbiano em miniatura: células que obtêm sua energia de quase qualquer par de substâncias capazes de trocar elétrons e que, juntas, fazem funcionar os ciclos químicos do planeta. Este capítulo expõe a lógica dessa energética, a cinética do crescimento microbiano e a vida coletiva dos micróbios sobre superfícies, que é como a maioria deles de fato vive.

2.1 Maneiras de ganhar a vida

Definição 2.1 (Tipos tróficos)

Um organismo é classificado por três respostas. Sua fonte de energia: a luz (fototrófico) ou reações químicas (quimiotrófico). Sua fonte de elétrons: substâncias inorgânicas — $\mathrm{H_2}$ , $\mathrm{H_2S}$ , $\mathrm{NH_4^+}$ , $\mathrm{Fe^{2+}}$ , água — (litotrófico) ou moléculas orgânicas (organotrófico). Sua fonte de carbono: o $\mathrm{CO_2}$ (autotrófico) ou o carbono orgânico (heterotrófico). As plantas e as cianobactérias são fotolitoautotróficas; os animais, os fungos e E. coli são quimiorganoheterotróficos; as bactérias nitrificantes e as oxidantes de enxofre são quimiolitoautotróficas: produzem sua matéria orgânica a partir do $\mathrm{CO_2}$ com a energia tirada da oxidação de minerais, no escuro. Quase todas as combinações existem em algum lugar entre os procariotos; os eucariotos ocupam apenas duas.

Teorema 2.2 (A energia de um par redox)

Todo metabolismo que fornece energia desloca elétrons de um par doador para um par aceptor. Cada par tem um potencial padrão $E^{\circ\prime}$ (a pH 7): quanto mais negativo, mais facilmente cede elétrons. Transferir $n$ mols de elétrons de um doador a $E_d$ para um aceptor a $E_a$ libera uma energia livre padrão

\Delta G^{\circ\prime} = -\,n F\,(E_a - E_d), \qquad F = 96.5\,\mathrm{kJ}/\mathrm{V}/\mathrm{mol},

de modo que o rendimento é proporcional à distância vertical entre os dois pares na torre de elétrons. Com $\mathrm{O_2/H_2O}$ a $+0.82\,\mathrm{V}$ e $\mathrm{CO_2}$ /glicose a $-0.43\,\mathrm{V}$ , os 24 elétrons de uma molécula de glicose fornecem $24\times 96.5\times 1.25 = 2900\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ; entregues ao sulfato ( $\mathrm{SO_4^{2-}/H_2S}$ , $-0.22\,\mathrm{V}$ ), os mesmos elétrons fornecem apenas $24\times 96.5\times 0.21 = 490\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ .

Demonstração. Para a reação doador $_{\text{red}}$ + aceptor $_{\text{ox}}$ $\to$ doador $_{\text{ox}}$ + aceptor $_{\text{red}}$ , a variação de energia livre é o trabalho realizado por $n$ mols de carga eletrônica $nF$ que caem pela diferença de potencial $E_a - E_d$ , com a convenção de sinal de que uma transferência espontânea (elétrons em direção ao par mais positivo) tem $\Delta G < 0$ . É a relação de Nernst do volume do Ano 1 aplicada a duas semirreações. ∎

A torre de elétrons. Os doadores (azul) estão dispostos em seus potenciais padrão; os aceptores (vermelho), do mesmo modo. Um metabolismo é uma queda de um doador até um aceptor situado acima dele, e seu rendimento energético é proporcional à altura da queda: da glicose ao oxigênio é uma queda longa; da glicose ao sulfato, uma queda curta.

Proposição 2.3 (Quimiolitotrofia)

Algumas bactérias tiram toda a sua energia de oxidações inorgânicas, usando o oxigênio (ou o nitrato) como aceptor, e fixam o $\mathrm{CO_2}$ com o ATP e o poder redutor assim obtidos. Nitrificantes: as oxidantes de amônio (Nitrosomonas) transformam o $\mathrm{NH_4^+}$ em nitrito ( $\Delta G^{\circ\prime} = -275\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ), as oxidantes de nitrito (Nitrobacter) transformam o nitrito em nitrato ( $-74\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ); juntas, convertem o amônio da decomposição no nitrato que as plantas absorvem (Capítulo 25). As oxidantes de enxofre (Thiobacillus, Beggiatoa) oxidam o $\mathrm{H_2S}$ a enxofre e sulfato; as oxidantes de ferro oxidam o $\mathrm{Fe^{2+}}$ a ferrugem; as oxidantes de hidrogênio queimam o $\mathrm{H_2}$ . Como seus doadores de elétrons ficam no alto da torre, o rendimento por molécula é pequeno, e como esses doadores são redutores mais fracos que o NADH, elas precisam gastar energia para empurrar elétrons ladeira acima a fim de produzir o NADH de que a fixação do carbono necessita: uma nitrificante oxida cerca de trinta íons amônio para fixar um $\mathrm{CO_2}$ , e cresce devagar.

Evidências. Winogradsky (1887–1890) cultivou bactérias sulfurosas filamentosas numa gota de água na qual deixava o sulfeto difundir-se de um lado e o ar do outro: elas se reuniam na fronteira, acumulavam glóbulos de enxofre e os consumiam quando o sulfeto era cortado. Depois, isolou bactérias nitrificantes num meio puramente mineral, contendo amônio e nenhum carbono orgânico, no qual elas cresciam e produziam nitrato — a primeira demonstração de que a vida pode ser construída a partir do $\mathrm{CO_2}$ e da energia de uma reação inorgânica, sem luz. Ele chamou isso de quimiossíntese. ∎

Sergei Winogradsky, que descobriu a quimiolitotrofia, e a coluna que leva seu nome: um cilindro de lama e água que, sob a luz, se estratifica em faixas de algas, de oxidantes de ferro e de enxofre, de bactérias sulfurosas púrpuras e verdes, e de redutoras de sulfato na lama negra.

Definição 2.4 (Fotossíntese anoxigênica)

As bactérias púrpuras e verdes fazem fotossíntese com um único fotossistema e uma bacterioclorofila que absorve no infravermelho próximo, usando $\mathrm{H_2S}$ , $\mathrm{H_2}$ ou ácidos orgânicos como doadores de elétrons em vez da água: liberam enxofre ou sulfato, nunca oxigênio, e precisam de luz de comprimentos de onda que atravessam a camada verde e de cianobactérias acima delas. As bactérias sulfurosas púrpuras crescem, por isso, na faixa púrpura da coluna de Winogradsky, exatamente onde o sulfeto que vem de baixo encontra a luz que vem de cima; as bactérias sulfurosas verdes, que toleram mais sulfeto e menos luz, crescem logo abaixo delas. A fotossíntese oxigênica, com seus dois fotossistemas em série, é uma invenção posterior de uma linhagem — as cianobactérias — que aprendeu a tirar elétrons da água.

2.2 Respirações anaeróbias e fermentações

Definição 2.5 (Respiração anaeróbia)

A respiração anaeróbia é uma respiração — uma cadeia transportadora de elétrons que bombeia prótons e produz ATP por quimiosmose — com um aceptor terminal diferente do oxigênio. Os desnitrificantes (Pseudomonas, Paracoccus) reduzem o nitrato a nitrito, óxido nítrico, óxido nitroso e por fim $\mathrm{N_2}$ , que escapa para o ar; usam sua cadeia aeróbia com algumas enzimas a mais e passam ao nitrato apenas quando o oxigênio acaba. Os redutores de sulfato (Desulfovibrio) reduzem o sulfato a sulfeto, enegrecem a lama com sulfeto de ferro e lhe dão seu cheiro. Os metanogênicos, que são arqueias, reduzem o $\mathrm{CO_2}$ com $\mathrm{H_2}$ a metano ( $4\mathrm{H_2} + \mathrm{CO_2} \to \mathrm{CH_4} + 2\mathrm{H_2O}$ , $\Delta G^{\circ\prime} = -131\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ), ou quebram o acetato em metano e $\mathrm{CO_2}$ ; o oxigênio os mata, e eles vivem no rúmen das vacas, nos arrozais, nos pântanos e nos aterros sanitários, de onde liberam um gás de efeito estufa que é objeto do Capítulo 27. Os óxidos de ferro e de manganês servem a outros grupos. O volume do Ano 1 tratou o oxigênio como o aceptor; durante a maior parte da história da Terra, e em todo sedimento hoje, ele é apenas o primeiro de uma série.

Proposição 2.6 (A sequência dos aceptores num sedimento)

Descendo num sedimento encharcado, os aceptores de elétrons se esgotam na ordem da energia que fornecem: o oxigênio nos primeiros milímetros, depois o nitrato, depois os óxidos de manganês e de ferro, depois o sulfato e, por fim, o $\mathrm{CO_2}$ (metanogênese) na camada anóxica mais profunda. A ordem é a da torre: em cada profundidade, os organismos que usam o melhor aceptor restante crescem mais depressa, superam os demais na competição pelos doadores orgânicos e esgotam seu aceptor antes que o grupo seguinte assuma. No mar, onde o sulfato é abundante ( $28\,\mathrm{mmol}/\mathrm{L}$ ), a zona do sulfato é espessa e a metanogênese começa apenas a alguns metros de profundidade; num pântano de água doce, pobre em sulfato, o metano se forma logo abaixo da superfície.

A sucessão dos aceptores de elétrons com a profundidade num sedimento, na ordem da energia que cada um fornece por glicose. Os organismos de cada zona superam os da zona seguinte na competição pela matéria orgânica até que seu aceptor se esgote.

Definição 2.7 (A fermentação revisitada)

Uma fermentação não usa aceptor externo: o substrato orgânico é quebrado num produto mais oxidado e num mais reduzido, o ATP é produzido apenas por fosforilação em nível de substrato, e o NADH da glicólise é reoxidado pela redução de um metabólito. As leveduras produzem etanol e $\mathrm{CO_2}$ ; as bactérias lácticas produzem lactato (iogurte, chucrute, músculos doloridos); E. coli produz uma mistura de ácidos, etanol e gases; os clostrídios produzem butirato, butanol e acetona; as propionibactérias produzem o propionato e o $\mathrm{CO_2}$ do queijo suíço. O rendimento é de dois ATP por glicose contra cerca de trinta na respiração, de modo que um fermentador precisa processar quinze vezes mais açúcar para o mesmo crescimento, e seus produtos — ácidos, álcool — envenenam seu próprio meio: as fermentações conservam os alimentos porque o fermentador torna o alimento inabitável, inclusive para si mesmo.

Exemplo 2.8 (Sintrofia: viver das sobras)

Num sedimento anóxico, os fermentadores deixam para trás acetato, propionato, butirato e $\mathrm{H_2}$ . Oxidar o propionato a acetato e $\mathrm{H_2}$ tem uma energia livre padrão positiva ( $+76\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ) e é impossível — a menos que um metanogênico vizinho consuma o hidrogênio tão depressa quanto ele se forma, mantendo sua pressão parcial abaixo de $1 \times 10^{-4}\,\mathrm{atm}$ , valor em que a reação se torna exergônica. Nenhum dos parceiros consegue crescer sozinho em propionato; juntos, eles o transformam em metano. Essa transferência interespecífica de hidrogênio explica por que a digestão anaeróbia é sempre obra de um consórcio, e por que a arqueia e sua parceira bacteriana são frequentemente encontradas encostadas uma na outra.

2.3 Crescimento sobre um substrato

Teorema 2.9 (Lei de Monod)

Uma população que cresce sobre um único substrato limitante, de concentração $S$ , tem uma taxa específica de crescimento

\mu = \mu_{\max}\,\frac{S}{K_s + S}, \qquad \frac{\mathrm{d}X}{\mathrm{d}t} = \mu X,

em que $X$ é a concentração de biomassa, $\mu_{\max}$ a taxa máxima (o inverso do menor tempo de geração dividido por $\ln 2$ ) e $K_s$ a constante de meia saturação, a concentração de substrato na qual o crescimento se dá à metade da velocidade — alguns miligramas de glicose por litro para E. coli. O substrato é consumido em proporção ao crescimento, $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = -\mu X/Y$ , sendo $Y$ o rendimento: gramas de biomassa por grama de substrato, cerca de $0.5$ no crescimento aeróbio sobre açúcar e $0.1$ num fermentador.

Evidências. Monod (1942) cultivou E. coli em lotes numa série de concentrações de glicose e mediu a taxa exponencial de cada um: as taxas subiam com a concentração e saturavam, como uma curva de Michaelis–Menten, o que se espera se a taxa for fixada por um sistema de absorção saturável. A lei é empírica — uma célula tem milhares de enzimas, não uma só —, mas se ajusta a quase toda cultura limitada por substrato, e é a base da tecnologia das fermentações e da engenharia de tratamento de águas residuais. ∎

Teorema 2.10 (O quimiostato)

Um quimiostato é um recipiente de volume $V$ alimentado com meio fresco (substrato $S_{\text{ent}}$ ) a uma vazão $F$ e esvaziado à mesma vazão, de modo que a taxa de diluição é $D = F/V$ . A biomassa e o substrato obedecem a

\frac{\mathrm{d}X}{\mathrm{d}t} = (\mu - D)\,X, \qquad \frac{\mathrm{d}S}{\mathrm{d}t} = D\,(S_{\text{ent}} - S) - \frac{\mu X}{Y}.

Em regime estacionário, $\mu = D$ : a cultura cresce exatamente tão depressa quanto é lavada, qualquer que seja $D$ abaixo de um valor crítico, e o operador fixa a taxa de crescimento girando o botão da bomba. O substrato e a biomassa em regime estacionário são

S^* = \frac{K_s\,D}{\mu_{\max} - D}, \qquad X^* = Y\,(S_{\text{ent}} - S^*),

e, acima da taxa de lavagem $D_c = \mu_{\max} S_{\text{ent}}/(K_s + S_{\text{ent}})$ , nenhuma população consegue se manter.

Demonstração. Fazendo $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t = 0$ com $X \neq 0$ , obtém-se $\mu = D$ ; invertendo a lei de Monod, $D(K_s + S^*) = \mu_{\max} S^*$ , donde $S^* = K_s D/(\mu_{\max} - D)$ . Fazendo $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = 0$ e substituindo $\mu$ por $D$ : $D(S_{\text{ent}} - S^*) = DX^*/Y$ , donde $X^*$ . A solução só existe enquanto $S^* < S_{\text{ent}}$ , isto é, $D < \mu_{\max} S_{\text{ent}}/(K_s + S_{\text{ent}})$ ; além disso, $\mu < D$ para todo $S \le S_{\text{ent}}$ e $X$ decai a zero. O estado estacionário é estável: se $X$ aumenta, $S$ diminui, $\mu$ cai abaixo de $D$ e $X$ é lavado de volta para baixo. ∎

$À esquerda: a lei de Monod com _ = 1\, h-1 e K_s = 0.02\, g/ L. À direita: o quimiostato alimentado com 2\, g/ L de substrato (Y = 0.5): a biomassa permanece quase constante e o substrato residual quase nulo até a taxa de lavagem, perto da qual o substrato escapa e a população entra em colapso; a produção de biomassa por hora é máxima logo antes disso.$

À esquerda: a lei de Monod com

\mu_{\max} = 1\,\mathrm{h}^{-1}

K_s = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}

. À direita: o quimiostato alimentado com

2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}

de substrato (

Y = 0.5

): a biomassa permanece quase constante e o substrato residual quase nulo até a taxa de lavagem, perto da qual o substrato escapa e a população entra em colapso; a produção de biomassa por hora é máxima logo antes disso.

Um quimiostato de laboratório: meio fresco bombeado do reservatório à esquerda, cultura transbordando à direita; a bomba fixa a taxa de crescimento.

Exemplo 2.11 (Como ler um quimiostato)

Com $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_s = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{\text{ent}} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ e $Y = 0.5$ , a $D = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ : $S^* = 0.02\times 0.5/0.5 = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ e $X^* = 0.5\times 1.98 = 0.99\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; a cultura deixa $1\,\%$ do açúcar sem uso. A taxa de lavagem é $1.0\times 2/2.02 = 0.99\,\mathrm{h}^{-1}$ . Um biodigestor ou um intestino funciona pelo mesmo princípio: o cólon humano, alimentado três vezes por dia e esvaziado uma vez, mantém suas bactérias a uma taxa de diluição próxima de $0.04\,\mathrm{h}^{-1}$ , e toda espécie incapaz de se duplicar em um dia é lavada — a menos que se prenda à parede.

2.4 Biofilmes

Definição 2.12 (Biofilme)

Um biofilme é uma comunidade de microrganismos presa a uma superfície e imersa numa matriz que ela mesma produz, feita de polissacarídeos, proteínas e DNA extracelular. Forma-se em etapas: adesão reversível de células isoladas (flagelos, pili), adesão irreversível e crescimento de microcolônias, maturação num filme estruturado com torres e canais de água, e dispersão de células que saem nadando para colonizar novas superfícies. A matriz retém água e nutrientes, protege as células da dessecação, dos predadores, dos antibióticos e das células imunes, e cria gradientes químicos que fazem do filme uma paisagem de nichos. A maioria das bactérias da Terra vive assim: sobre as rochas dos riachos, nas raízes, nos dentes (a placa bacteriana), em cateteres e implantes, nos pulmões de pacientes com fibrose cística, em cascos de navios e em tubulações.

O ciclo de vida de um biofilme: células isoladas aderem, crescem em microcolônias que secretam uma matriz (cinza), amadurecem num filme estruturado com torres e canais de água, e liberam células nadadoras que colonizam novas superfícies.

Um biofilme sobre um cateter, visto em microscopia eletrônica de varredura: bactérias em bastonete imersas na matriz fibrosa que secretaram, com canais abertos entre os aglomerados.

Teorema 2.13 (Gradientes no interior de um biofilme)

Num filme de espessura $L$ cujas células consomem oxigênio a uma taxa volumétrica constante $q$ , com a concentração mantida em $c_0$ na superfície e nenhum fluxo através do substrato de fixação, o perfil estacionário de oxigênio é uma parábola e, se o filme for espesso o bastante para o oxigênio se esgotar, isso ocorre na profundidade de penetração

L_p = \sqrt{\frac{2 D_e\, c_0}{q}},

em que $D_e$ é o coeficiente de difusão efetivo na matriz. Com $D_e = 1.5 \times 10^{-9}\,\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , $c_0 = 0.25\,\mathrm{mol}/\mathrm{m}^{3}$ e $q = 0.17\,\mathrm{mol}/\mathrm{m}^{3}/\mathrm{s}$ (um filme denso de células que respiram), $L_p \approx 66\,\text{µ}\mathrm{m}$ : abaixo de um décimo de milímetro, um biofilme é anóxico, e desnitrificantes, fermentadores e redutores de sulfato vivem sob um teto de aeróbios.

Demonstração. Seja $x$ a profundidade abaixo da superfície. Em regime estacionário, o fluxo difusivo $-D_e\,\mathrm{d}c/\mathrm{d}x$ varia com a profundidade apenas pelo consumo: $D_e\,\mathrm{d}^2c/\mathrm{d}x^2 = q$ . Integrando duas vezes, $c = c_0 + a x + q x^2/2D_e$ . Se o oxigênio se anula na profundidade $L_p$ com fluxo nulo ali (nada chega de baixo), $c(L_p) = 0$ e $c'(L_p) = 0$ : a segunda condição dá $a = -qL_p/D_e$ , e a primeira dá então $c_0 - qL_p^2/D_e + qL_p^2/2D_e = 0$ , isto é, $L_p^2 = 2D_e c_0/q$ . O perfil é $c = (q/2D_e)(L_p - x)^2$ . ∎

O oxigênio no interior de um biofilme que respira: uma queda parabólica do valor do meio na superfície até zero na profundidade de penetração, 66\, µ m para os valores do teorema. Tudo o que fica mais fundo é anóxico. — O oxigênio no interior de um biofilme que respira: uma queda parabólica do valor do meio na superfície até zero na profundidade de penetração, $66\,\text{µ}\mathrm{m}$ para os valores do teorema. Tudo o que fica mais fundo é anóxico.

Proposição 2.14 (Percepção de quórum)

As bactérias contam a si mesmas (quorum sensing). Cada célula secreta, a uma taxa baixa e constante, uma pequena molécula sinalizadora, um autoindutor (lactonas de acil-homosserina nas Gram-negativas, peptídeos curtos nas Gram-positivas). Numa suspensão diluída, o sinal se dispersa por difusão; numa população densa ou num biofilme, ele se acumula e, acima de uma concentração limiar, liga-se a um receptor que ativa um conjunto de genes — inclusive o gene do próprio autoindutor, daí o nome. Os genes assim controlados são aqueles que só compensam quando muitas células agem juntas: a luminescência, a secreção de enzimas digestivas e de toxinas, a produção da matriz, a virulência de patógenos que precisam dominar um hospedeiro de uma só vez em vez de alertá-lo célula por célula.

Evidências. Nealson, Platt e Hastings (1970) verificaram que a bactéria marinha Vibrio fischeri, que ilumina o órgão luminoso de uma lula, é escura em cultura diluída e só brilha acima de cerca de $10^{7}$ células por mililitro; o meio livre de células, retirado de uma cultura densa e luminosa, fazia uma cultura diluída brilhar imediatamente. O meio continha o sinal; sua estrutura, uma lactona de acil-homosserina, foi determinada em 1981, e mutantes incapazes de produzi-la nunca brilham, por mais densos que se tornem. ∎

Exemplo 2.15 (Por que um biofilme sobrevive aos antibióticos)

As células de um biofilme sobrevivem a concentrações de antibiótico cem a mil vezes maiores que as que matam a mesma linhagem em suspensão, sem nenhum gene de resistência. A matriz retarda a difusão do fármaco e retém parte dele; os gradientes deixam as células profundas famintas, anóxicas e quase sem crescer, e a maioria dos antibióticos só mata células em crescimento (as penicilinas precisam da síntese da parede, os aminoglicosídeos precisam de transporte ativo); algumas células persistentes estão totalmente dormentes e reconstituem o filme quando o tratamento para. Uma infecção crônica sobre um implante é, por isso, geralmente tratada com a remoção do implante.

2.5 Comunidades microbianas

Exemplo 2.16 (A coluna de Winogradsky explicada)

A luz e o ar entram por cima; a matéria orgânica e o sulfato vêm da lama. Cianobactérias e algas crescem no topo e liberam oxigênio. Mais abaixo, os heterótrofos esgotam o oxigênio sobre a matéria orgânica, depois o nitrato; mais fundo, os redutores de sulfato transformam o sulfato em sulfeto, que se difunde para cima e enegrece a lama com sulfeto de ferro. Onde o sulfeto que sobe encontra a luz que desce, as bactérias sulfurosas púrpuras o oxidam pela fotossíntese (a faixa púrpura), com as bactérias sulfurosas verdes logo abaixo; onde o sulfeto encontra o oxigênio, no escuro, oxidantes de enxofre incolores como Beggiatoa ganham a vida pela quimiolitotrofia (o véu branco); onde o ferro reduzido encontra o oxigênio, os oxidantes de ferro deixam uma faixa cor de ferrugem. O enxofre circula entre sulfeto e sulfato dentro da coluna; o carbono, entre o $\mathrm{CO_2}$ e a matéria orgânica; só a luz entra e só o calor sai. É um ecossistema fechado com um balanço energético aberto, e um modelo em escala do fundo do oceano.

Tapetes microbianos em torno de uma fonte termal: cada cor é uma população que vive na temperatura e na química de sua faixa — cianobactérias termófilas e bactérias verdes no escoamento mais frio, quimiolitotróficos incolores na água mais quente.

Observação 2.17 (Os tapetes microbianos e a Terra primitiva)

Em torno de fontes termais e em planícies de maré, tapetes microbianos estratificados de alguns milímetros de espessura concentram a coluna inteira numa espessura que a luz consegue atravessar: cianobactérias em cima, bactérias púrpuras embaixo, redutores de sulfato na base, cada camada consumindo o que a de cima produz, e o tapete migrando para cima através do sedimento que retém. Os tapetes fósseis — os estromatólitos — são a mais antiga evidência de vida, com $3.5$ bilhões de anos. Durante dois bilhões de anos, antes das plantas e dos animais, a biosfera foi esses tapetes e o plâncton acima deles, e foram eles que encheram o ar de oxigênio (Capítulo 25).

2.6 Exercícios

Exercício 2.1 ★

Classifique segundo a fonte de energia, a fonte de elétrons e a fonte de carbono: uma cianobactéria; Nitrosomonas; E. coli em glicose; uma bactéria púrpura não sulfurosa que cresce na luz sobre succinato; Thiobacillus sobre $\mathrm{H_2S}$ no escuro.

Solução

Solução de Exercício 2.1.

Cianobactéria: fotolitoautotrófica (luz, água, $\mathrm{CO_2}$ ). Nitrosomonas: quimiolitoautotrófica (oxidação do amônio, $\mathrm{CO_2}$ ). E. coli em glicose: quimiorganoheterotrófica. Bactéria púrpura não sulfurosa sobre succinato na luz: fotorganoheterotrófica. Thiobacillus sobre sulfeto no escuro: quimiolitoautotrófica.

Exercício 2.2 ★

Liste os aceptores de elétrons da respiração em ordem decrescente de rendimento energético, e diga em que ponto de um sedimento cada um é usado.

Solução

Solução de Exercício 2.2.

Oxigênio (os milímetros da superfície), nitrato (logo abaixo, onde o oxigênio acabou), óxidos de manganês e de ferro (a transição do marrom para o cinza), sulfato (a camada negra de sulfeto, espessa nos sedimentos marinhos), $\mathrm{CO_2}$ para a metanogênese (o mais profundo, ou logo abaixo da superfície na água doce pobre em sulfato).

Exercício 2.3 ★

Balanceie a oxidação da glicose a $\mathrm{CO_2}$ pelo nitrato reduzido a $\mathrm{N_2}$ (em solução ácida, com água como o outro produto). Quantos íons nitrato por glicose?

Solução

Solução de Exercício 2.3.

$5\,\mathrm{C_6H_{12}O_6} + 24\,\mathrm{NO_3^-} + 24\,\mathrm{H^+} \to 30\,\mathrm{CO_2} + 12\,\mathrm{N_2} + 42\,\mathrm{H_2O}$ : 4.8 íons nitrato por glicose (cada nitrato aceita 5 elétrons, cada glicose fornece 24).

Exercício 2.4 ★

Defina biofilme e cite suas quatro etapas. Dê três situações em que os biofilmes importam para a saúde humana ou para a indústria.

Solução

Solução de Exercício 2.4.

Uma comunidade microbiana presa a uma superfície e imersa numa matriz de polissacarídeos, proteínas e DNA que ela mesma produz. Etapas: adesão, microcolônia e secreção da matriz, maturação com torres e canais, dispersão. A placa bacteriana e as cáries; as infecções de cateteres e implantes (e dos pulmões na fibrose cística); a incrustação e a corrosão de tubulações e cascos — ou, de modo útil, os filtros biológicos percoladores do tratamento de água.

Exercício 2.5 ★★

Calcule $\Delta G^{\circ\prime}$ para $4\mathrm{H_2} + \mathrm{CO_2} \to \mathrm{CH_4} + 2\mathrm{H_2O}$ a partir dos potenciais $\mathrm{2H^+/H_2}$ ( $-0.42\,\mathrm{V}$ ) e $\mathrm{CO_2/CH_4}$ ( $-0.24\,\mathrm{V}$ ). Quantos ATP (a $50\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ) um metanogênico pode produzir, no máximo, por $\mathrm{H_2}$ ? Comente sua taxa de crescimento.

Solução

Solução de Exercício 2.5.

Oito elétrons caem de $-0.42\,\mathrm{V}$ para $-0.24\,\mathrm{V}$ : $\Delta G^{\circ\prime} = -8\times 96.5\times 0.18 = -139\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ de metano (valor tabelado $-131\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ), isto é, $35\,\mathrm{kJ}$ por $\mathrm{H_2}$ : no máximo 0.7 ATP por hidrogênio, na prática cerca de meio. A energia por molécula de substrato é tão pequena que os metanogênicos crescem devagar (tempos de geração de horas a dias) e convertem quase todo o seu substrato em gás, e não em células.

Exercício 2.6 ★★

Uma bactéria tem $\mu_{\max} = 1.2\,\mathrm{h}^{-1}$ e $K_s = 5\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ de glicose. Calcule $\mu$ e o tempo de geração a 1, 5 e $50\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ . Em que concentração ela cresce a $90\,\%$ de seu máximo?

Solução

Solução de Exercício 2.6.

$\mu = 1.2\,S/(5 + S)$ : $0.20\,\mathrm{h}^{-1}$ ( $T = \ln 2/\mu = 3.5\,\mathrm{h}$ ), $0.60\,\mathrm{h}^{-1}$ ( $1.2\,\mathrm{h}$ ), $1.09\,\mathrm{h}^{-1}$ ( $0.64\,\mathrm{h}$ ). Noventa por cento: $S = 9K_s = 45\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ .

Exercício 2.7 ★★

Um quimiostato com $\mu_{\max} = 0.8\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_s = 0.05\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{\text{ent}} = 5\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $Y = 0.4$ opera a $D = 0.4\,\mathrm{h}^{-1}$ . Calcule $S^*$ , $X^*$ , a produção de biomassa por litro por hora e a taxa de lavagem.

Solução

Solução de Exercício 2.7.

$S^* = 0.05\times 0.4/(0.8 - 0.4) = 0.05\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; $X^* = 0.4\times(5 - 0.05) = 1.98\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; produção $DX^* = 0.4\times 1.98 = 0.79\,\mathrm{g}/\mathrm{L}/\mathrm{h}$ ; lavagem $D_c = 0.8\times 5/5.05 = 0.79\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Exercício 2.8 ★★

A oxidação de um $\mathrm{NH_4^+}$ a nitrito fornece $275\,\mathrm{kJ}$ ; uma nitrificante captura um quarto disso como ATP ( $50\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ), e fixar um $\mathrm{CO_2}$ em biomassa custa o equivalente a 12 ATP. Quantos íons amônio ela precisa oxidar por carbono fixado? Por que o rendimento de uma nitrificante é tão baixo comparado ao de um heterótrofo?

Solução

Solução de Exercício 2.8.

Capturado: $0.25\times 275 = 69\,\mathrm{kJ}$ , isto é, 1.4 ATP por amônio; $12/1.4 = 8.7$ , cerca de nove íons amônio por carbono — e várias vezes mais quando se conta o custo de produzir NADH empurrando elétrons ladeira acima a partir do nitrito. Um heterótrofo recebe seu carbono já reduzido e organizado, e trinta ATP por glicose; uma nitrificante precisa comprar tanto sua energia quanto seu poder redutor de um doador pobre e construir cada carbono a partir do $\mathrm{CO_2}$ , de modo que converte em células uma fração ínfima do substrato que processa.

Exercício 2.9 ★★

Calcule a profundidade de penetração do oxigênio num biofilme com $D_e = 1.2 \times 10^{-9}\,\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , $c_0 = 0.20\,\mathrm{mol}/\mathrm{m}^{3}$ e $q = 0.5\,\mathrm{mol}/\mathrm{m}^{3}/\mathrm{s}$ . O que acontece com $L_p$ se o oxigênio do meio dobrar? E se as células respirarem quatro vezes mais depressa?

Solução

Solução de Exercício 2.9.

$L_p = \sqrt{2\times 1.2\times 10^{-9}\times 0.2/0.5} = \sqrt{9.6\times 10^{-10}} = 31\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Dobrar $c_0$ multiplica $L_p$ por $\sqrt 2$ : $44\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; quadruplicar $q$ o reduz à metade: $15\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Exercício 2.10 ★★★

Preveja as faixas de uma coluna de Winogradsky de cima para baixo, indicando o metabolismo de cada uma, e explique (a) por que a faixa púrpura se forma onde se forma, (b) por que a lama fica negra, (c) em que sentido a coluna é um sistema fechado e em que sentido é aberto.

Solução

Solução de Exercício 2.10.

De cima para baixo: água com algas e cianobactérias (fotossíntese oxigênica); uma faixa cor de ferrugem de oxidantes de ferro, onde o $\mathrm{Fe^{2+}}$ encontra o oxigênio; um véu branco de oxidantes de enxofre incolores (quimiolitotróficos), onde o sulfeto encontra o oxigênio; uma faixa púrpura de bactérias sulfurosas púrpuras (fotossíntese anoxigênica sobre sulfeto); uma faixa verde de bactérias sulfurosas verdes (o mesmo, tolerando mais sulfeto e menos luz); lama negra de fermentadores e redutores de sulfato. (a) As bactérias sulfurosas púrpuras precisam ao mesmo tempo da luz que vem de cima e do sulfeto que vem de baixo, por isso ficam na interface onde os dois gradientes se cruzam. (b) Os redutores de sulfato produzem $\mathrm{H_2S}$ , que precipita o ferro como FeS negro. (c) Fechada para a matéria: o enxofre, o carbono e o nitrogênio circulam entre formas oxidadas e reduzidas sem sair; aberta para a energia: a luz entra, o calor sai, e sem luz todos os ciclos param.

Exercício 2.11 ★★★

Cada célula de uma população de densidade $n$ (células por litro) secreta um autoindutor a $p = 5$ moléculas por segundo; a molécula é degradada a uma taxa $k = 5 \times 10^{-4}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Escreva a concentração estacionária $A^*$ em função de $n$ . O receptor é ativado a $A_c = 10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ : calcule a densidade limiar em células por mililitro. Compare com uma cultura densa ( $10^{9}$ por mililitro) e com a água do mar ( $10^{5}$ por mililitro), e explique por que um biofilme atinge o quórum num volume em que uma suspensão nunca o atingiria.

Solução

Solução de Exercício 2.11.

Produção $pn$ , perda $kA$ : $A^* = pn/k$ . $A_c = 10^{-8}\times 6.02\times 10^{23} = 6.0\times 10^{15}$ moléculas por litro; $n_c = kA_c/p = 5\times 10^{-4}\times 6.0\times 10^{15}/5 = 6\times 10^{11}$ por litro, $6\times 10^{8}$ por mililitro. A cultura densa ( $10^{9}$ ) está acima do limiar; a água do mar ( $10^{5}$ ), quatro ordens de grandeza abaixo. Num biofilme, as células ficam a $10^{11}$ por mililitro de matriz, e a matriz retarda a saída do sinal (o que equivale a reduzir $k$ ), de modo que uma microcolônia de alguns milhares de células num nanolitro atinge o quórum, ao passo que as mesmas células dispersas num litro nunca o atingiriam.

Exercício 2.12 ★★★

“Os procariotos comandam a química do planeta.” Discuta com base em três processos deste capítulo que nenhum eucarioto é capaz de realizar, dizendo para cada um o que aconteceria com a biosfera se ele parasse.

Solução

Solução de Exercício 2.12.

Fixação de nitrogênio (só os procariotos têm nitrogenase): se ela parasse, o nitrogênio combinado da biosfera escoaria por desnitrificação e a produção entraria em colapso em poucas décadas. Nitrificação e desnitrificação (apenas procariotos): se parassem, o amônio se acumularia, o nitrato desapareceria e o nitrogênio nunca voltaria ao ar. Metanogênese e respiração anaeróbia (apenas procariotos): se parassem, a matéria orgânica dos sedimentos anóxicos, dos rúmens e dos pântanos se acumularia sem ser mineralizada e o carbono sairia do ciclo; do mesmo modo, a fotossíntese oxigênica foi uma invenção bacteriana, e sem ela não haveria oxigênio para respirar. Os eucariotos são um acréscimo tardio e quimicamente estreito a um planeta procariótico.

2.7 Problema: Uma estação de tratamento de esgoto

Problema 2.1

Problema de fim de semana — o tratamento de esgoto de uma cidade analisado como um conjunto de reatores microbianos, da energética de suas bactérias ao metano que o abastece, até o balanço energético da estação

Uma estação trata $Q = 10\,000\,\mathrm{m}^{3}$ de esgoto por dia, com $300\,\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ de matéria orgânica, medida pelo oxigênio necessário para queimá-la (sua demanda química de oxigênio, DQO), e $40\,\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ de nitrogênio amoniacal. Ela tem um tanque aerado de lodo ativado, um tanque anóxico para a desnitrificação e um digestor anaeróbio para o lodo. Dados: os heterótrofos aeróbios convertem a matéria orgânica com um rendimento $Y = 0.4$ (quilograma de DQO de biomassa por quilograma de DQO de substrato; o restante é oxidado); a nitrificação exige $4.57\,\mathrm{kg}$ de $\mathrm{O_2}$ por quilograma de nitrogênio; a desnitrificação exige $2.86\,\mathrm{kg}$ de DQO de substrato por quilograma de nitrogênio de nitrato; a aeração fornece $2\,\mathrm{kg}$ de $\mathrm{O_2}$ por quilowatt-hora; a DQO do lodo é convertida em metano no digestor a $60\,\%$ , cada quilograma de DQO convertido dando $0.35\,\mathrm{m}^{3}$ de metano de conteúdo energético $36\,\mathrm{MJ}/\mathrm{m}^{3}$ , queimado num gerador de $35\,\%$ de eficiência elétrica. Nitrificantes: $\mu_{\max} = 0.5\,\mathrm{d}^{-1}$ , $K_s = 1\,\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ de nitrogênio amoniacal.

Parte I — A energética.

Usando a torre de elétrons, calcule $\Delta G^{\circ\prime}$ para a oxidação de um mol de glicose (24 elétrons a $-0.43\,\mathrm{V}$ ) pelo oxigênio ( $+0.82\,\mathrm{V}$ ).
Calcule-o para o nitrato reduzido a $\mathrm{N_2}$ ( $+0.74\,\mathrm{V}$ ) e para o sulfato reduzido a sulfeto ( $-0.22\,\mathrm{V}$ ).
Por que a desnitrificação só começa no tanque anóxico, e por que a redução do sulfato (com seu cheiro) é sinal de uma estação mal operada?
Se as células capturam $40\,\%$ da energia livre como ATP ( $50\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ), quantos ATP por glicose fornece cada um dos três metabolismos?
Quanto mais glicose um redutor de sulfato precisa processar, em relação a um aeróbio, para o mesmo crescimento?
Os fermentadores do digestor obtêm 2 ATP por glicose. Explique por que, ainda assim, o digestor produz quase nenhuma biomassa e sobretudo gás.

Parte II — O tanque aerado.

Calcule a carga diária de matéria orgânica, em quilogramas de DQO.
Calcule a biomassa produzida por dia (em DQO) e o oxigênio necessário para oxidar o restante.
Calcule a energia de aeração para a matéria orgânica, em quilowatts-hora por dia.
Calcule a carga diária de nitrogênio e o oxigênio necessário para nitrificá-la.
O lodo fica retido no tanque por um tempo médio $\theta$ (o inverso de sua taxa de diluição). Abaixo de que $\theta$ as nitrificantes são lavadas, qualquer que seja a concentração de amônio?
Com $\theta = 10\,\mathrm{d}$ , calcule a concentração residual de amônio no efluente.
O inverno reduz $\mu_{\max}$ a $0.25\,\mathrm{d}^{-1}$ . Recalcule o amônio residual e diga o que o operador deve fazer.

Parte III — A desnitrificação e o digestor. O nitrato produzido no tanque aerado é recirculado para o tanque anóxico, onde heterótrofos o reduzem com a matéria orgânica que chega.

Calcule a matéria orgânica (quilogramas de DQO por dia) consumida na desnitrificação de todo o nitrogênio.
Calcule a massa de nitrogênio liberada para o ar como $\mathrm{N_2}$ por dia, e a massa que sai no efluente como amônio (questão 12), como fração da carga.
Essa matéria orgânica deixa de precisar de aeração. Calcule o oxigênio economizado e a demanda total de oxigênio da estação (matéria orgânica restante mais nitrificação).
O lodo produzido (questão 8, contado como DQO) vai para o digestor. Calcule o metano produzido por dia.
Calcule a energia desse metano e a eletricidade que ele fornece.
Calcule a eletricidade de aeração para a demanda total de oxigênio da questão 16, e compare.

Parte IV — O reator de biofilme. Um filtro biológico percolador cultiva um biofilme sobre pedras; a água contém $0.2\,\mathrm{mol}/\mathrm{m}^{3}$ de oxigênio, $D_e = 1.5 \times 10^{-9}\,\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , e o filme respira a $q = 0.3\,\mathrm{mol}/\mathrm{m}^{3}/\mathrm{s}$ .

Deduza o perfil de oxigênio $c(x)$ num filme espesso o bastante para se tornar anóxico.
Calcule a profundidade de penetração.
O filme tem $300\,\text{µ}\mathrm{m}$ de espessura. Que fração dele é aeróbia, e o que as células de baixo fazem com o nitrato que se difunde a partir da camada aeróbia?
Explique por que um único biofilme consegue nitrificar e desnitrificar ao mesmo tempo, o que o tanque aerado não consegue.
Adiciona-se cloro para desinfetar o efluente. Dê duas razões pelas quais o biofilme sobrevive a uma dose que mata as mesmas bactérias em suspensão.
Enuncie o resultado: a demanda diária de oxigênio da estação, sua produção de metano e a fração da eletricidade de aeração que o metano fornece.

Solução

Solução de Problema 2.1.

1. $-24\times 96.5\times (0.82 + 0.43) = -2900\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ . 2. Nitrato: $-24\times 96.5\times 1.17 = -2700\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ; sulfato: $-24\times 96.5\times 0.21 = -490\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ . 3. O oxigênio rende mais, de modo que os aeróbios superam os desnitrificantes na competição pela matéria orgânica enquanto houver oxigênio, e o oxigênio reprime as nitrato-redutases; a redução do sulfato exige anoxia e ausência de nitrato, de modo que seu cheiro indica que o tanque está subaerado e o nitrato esgotado — e o $\mathrm{H_2S}$ é tóxico e corrói o concreto. 4. $0.4\times 2900/50 = 23$ ATP; $0.4\times 2700/50 = 22$ ; $0.4\times 490/50 = 4$ . 5. Cerca de seis vezes mais ( $23/4$ ). 6. Dois ATP por glicose significam um rendimento de cerca de $0.1$ , de modo que $90\,\%$ da energia do substrato permanece nos produtos (ácidos, álcoois, $\mathrm{H_2}$ ), que os metanogênicos convertem em metano com um ganho igualmente pequeno; pouca energia, pouca biomassa, e o carbono sai como gás. 7. $10^4\times 0.3 = 3000\,\mathrm{kg}$ de DQO por dia. 8. Biomassa $0.4\times 3000 = 1200\,\mathrm{kg}$ de DQO; os $1800\,\mathrm{kg}$ de DQO restantes são oxidados e exigem $1800\,\mathrm{kg}$ de $\mathrm{O_2}$ . 9. $1800/2 = 900\,\mathrm{kWh}$ por dia. 10. $10^4\times 0.04 = 400\,\mathrm{kg}$ de nitrogênio; $4.57\times 400 = 1830\,\mathrm{kg}$ de $\mathrm{O_2}$ . 11. Em regime estacionário, $\mu = 1/\theta \le \mu_{\max}$ : lavagem abaixo de $\theta = 1/\mu_{\max} = 2\,\mathrm{d}$ . 12. $D = 0.1\,\mathrm{d}^{-1}$ : $S^* = 1\times 0.1/(0.5 - 0.1) = 0.25\,\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ . 13. $S^* = 0.1/(0.25 - 0.1) = 0.67\,\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ , e o limite de lavagem sobe para $4\,\mathrm{d}$ ; o operador precisa aumentar a idade do lodo (descartar menos lodo): com $\theta = 20\,\mathrm{d}$ , $S^* = 0.05/0.2 = 0.25\,\mathrm{g}/\mathrm{m}^{3}$ de novo. 14. $2.86\times 400 = 1144\,\mathrm{kg}$ de DQO por dia. 15. Amônio no efluente $0.25\times 10^4 = 2.5\,\mathrm{kg}/\mathrm{d}$ , $0.6\,\%$ da carga; o restante, $397\,\mathrm{kg}$ de nitrogênio, sai como $\mathrm{N_2}$ : $99\,\%$ . 16. Economizados: $1144\,\mathrm{kg}$ de $\mathrm{O_2}$ . Demanda total: $(1800 - 1144) + 1830 = 2490\,\mathrm{kg}$ de $\mathrm{O_2}$ por dia. 17. $1200\times 0.6\times 0.35 = 252\,\mathrm{m}^{3}$ de metano por dia. 18. $252\times 36 = 9070\,\mathrm{MJ} = 2520\,\mathrm{kWh}$ ; eletricidade $0.35\times 2520 = 880\,\mathrm{kWh}$ por dia. 19. Aeração $2490/2 = 1245\,\mathrm{kWh}$ por dia: o metano cobre $880/1245 = 71\,\%$ dela. 20. $D_e\,c'' = q$ , logo $c = c_0 + ax + qx^2/2D_e$ ; com $c(L_p) = 0$ e $c'(L_p) = 0$ : $a = -qL_p/D_e$ e $c = (q/2D_e)(L_p - x)^2$ , com $L_p^2 = 2D_ec_0/q$ . 21. $L_p = \sqrt{2\times 1.5\times 10^{-9}\times 0.2/0.3} = \sqrt{2\times 10^{-9}} = 45\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 22. $45/300 = 15\,\%$ aeróbia. Abaixo, os desnitrificantes reduzem a $\mathrm{N_2}$ o nitrato que se difunde a partir da camada nitrificante da superfície, usando a matéria orgânica que se difunde para dentro. 23. Num mesmo filme, o gradiente de oxigênio cria uma camada aeróbia (nitrificação) sobre uma anóxica (desnitrificação), a algumas dezenas de micrômetros de distância; o tanque aerado é óxico em toda a sua extensão, de modo que a desnitrificação exige um tanque anóxico separado. 24. O cloro reage com os polímeros da matriz e é consumido por eles antes de alcançar as células profundas; as células profundas estão famintas, crescem devagar ou estão dormentes e são muito menos sensíveis; só a camada superficial morre, e o filme volta a crescer a partir de baixo. 25. Demanda de oxigênio de $2490\,\mathrm{kg}$ por dia; metano, $252\,\mathrm{m}^{3}$ por dia; o metano fornece $71\,\%$ da eletricidade de aeração ( $880\,\mathrm{kWh}$ de $1245\,\mathrm{kWh}$ ).

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