Biología universitaria — tercer año · Bachelor Year 3

8Tráfico de membranas y clasificación de proteínas

Una célula del páncreas fabrica unos diez millones de moléculas de enzima digestiva por minuto, las empaqueta en gránulos y las libera a un conducto cuando el intestino da la señal — sin dejar suelta jamás una sola molécula de tripsina en su propio citoplasma. Una célula hepática retira colesterol de la sangre tragándose enteras las partículas que lo transportan, a razón de miles por minuto, y devuelve cada receptor a la superficie para el siguiente. Una proteína recién fabricada destinada a la mitocondria, al núcleo, al lisosoma, a la membrana o al exterior llega a su dirección entre una docena de compartimentos con una tasa de error que avergonzaría a un servicio de correos. Este capítulo trata de esa clasificación: las señales escritas en las proteínas, las máquinas que las leen, las vesículas que llevan membrana y carga entre compartimentos, las cubiertas que dan forma a las vesículas y las proteínas que las hacen fusionarse con la diana correcta, y el tráfico en dos sentidos — secreción hacia fuera, endocitosis hacia dentro — que una célula eucariota mantiene cada segundo de su vida.

8.1 Señales y direcciones

Definición 8.1 (Señales de clasificación)

Una señal de clasificación es un segmento de una proteína, o una modificación suya, que lee un receptor que entrega la proteína a un compartimento. El péptido señal, un tramo de $15\text{ a }30$ residuos del extremo amino con un núcleo hidrófobo, envía una proteína al retículo endoplasmático mientras se está fabricando; desde allí la ruta por defecto lleva a través del Golgi hasta la membrana plasmática o el exterior, y otras señales la desvían al lisosoma (un azúcar fosforilado) o de vuelta al retículo (la secuencia carboxiterminal KDEL). Una señal de localización nuclear, un parche básico corto como PKKKRKV, la unen importinas que llevan la proteína plegada a través del poro nuclear; una presecuencia mitocondrial, una hélice anfipática de $20\text{ a }50$ residuos, la reconocen receptores de la membrana externa y se enhebra, desplegada, por las translocasas de ambas membranas; las enzimas peroxisómicas acaban en SKL. Las proteínas sin ninguna de estas señales se quedan en el citosol. Toda señal se encontró del mismo modo: suprimirla deja la proteína en el citosol, e injertarla en una proteína citosólica envía a esa proteína al compartimento.

Evidencia. Blobel y Dobberstein (1975) tradujeron el ARN mensajero de una cadena ligera de anticuerpo en un sistema libre de células. Sin membranas el producto era unos veinte residuos más largo que la proteína secretada; con fragmentos de retículo endoplasmático añadidos durante la traducción, el producto tenía el tamaño de la secretada y estaba protegido de la proteasa añadida — estaba dentro de las vesículas —, mientras que las membranas añadidas después de la traducción no hacían nada. El segmento aminoterminal adicional, el péptido señal, hace falta para entrar en el retículo, se retira dentro de él y solo funciona mientras se fabrica la cadena: la hipótesis de la señal, confirmada en todos sus detalles cuando se purificaron el receptor (la partícula de reconocimiento de la señal, Walter y Blobel, 1981) y el canal (Sec61). ∎

La hipótesis de la señal. La partícula de reconocimiento de la señal une el péptido señal situado al principio de la cadena naciente, pausa la traducción y acopla el ribosoma al canal Sec61; la cadena cruza entonces la membrana a medida que se sintetiza, la señal se corta en la luz y se añaden azúcares.

Proposición 8.2 (Proteínas de membrana y topología)

Un tramo hidrófobo de unos veinte residuos situado en medio de una cadena que se está translocando actúa como secuencia de parada de transferencia: el canal se abre lateralmente y lo suelta en la bicapa como hélice transmembranaria, con la parte ya translocada en la luz y el resto fabricado hacia el citosol. Un segundo tramo de este tipo reanuda la translocación, y una proteína con $n$ señales alternantes acaba con $n$ hélices que atraviesan la membrana. La orientación fijada en el retículo no cambia nunca: lo que da a la luz del retículo da a la luz del Golgi y de toda vesícula posterior, y al exterior de la célula tras la fusión con la membrana plasmática. De ahí que los azúcares, añadidos solo en la luz, estén siempre en la cara extracelular de una proteína de superficie, y que la topología de un receptor pueda leerse a partir de dónde caen sus sitios de glicosilación.

Método 8.3 (Pulso y caza)

Para seguir una población de moléculas recién fabricadas por la célula: (1) expóngase brevemente a las células (el pulso, de unos pocos minutos) a un precursor radiactivo o marcado de otro modo — leucina tritiada para las proteínas; (2) sustitúyase por un exceso de precursor sin marcar (la caza), de modo que no se incorpore marca nueva; (3) fíjense muestras de células a intervalos y localícese la marca por autorradiografía en micrografías electrónicas, o aislando los compartimentos y contando; (4) represéntese la fracción de marca de cada compartimento frente al tiempo. El orden en que los compartimentos se llenan y se vacían es la ruta; los tiempos dan la permanencia en cada uno. El laboratorio de Palade (años sesenta) lo aplicó a la célula acinar pancreática y encontró la marca en el retículo rugoso a los $3\,\mathrm{min}$ , en el Golgi a los $20\,\mathrm{min}$ , en vacuolas de condensación y gránulos a los $40\,\mathrm{min}$ y en el conducto al cabo de una hora y de una señal: la vía secretora, desplegada en el tiempo.

Teorema 8.4 (Compartimentos sucesivos y las curvas de pulso y caza)

Supóngase que un pulso de proteína marcada sale del compartimento $A$ hacia $B$ con velocidad de primer orden $k_{1}$ y sale de $B$ hacia $C$ con velocidad $k_{2}$ , y que $C$ la retiene. Con toda la marca en $A$ en $t = 0$ ,

A(t) = e^{-k_{1}t},\qquad B(t) = \frac{k_{1}}{k_{2} - k_{1}}\bigl(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t}\bigr), \qquad C(t) = 1 - A - B,

y la marca de $B$ alcanza su máximo en $t^{*} = \ln(k_{2}/k_{1})/(k_{2} - k_{1})$ . El tiempo medio de permanencia en $A$ es $1/k_{1}$ y en $B$ es $1/k_{2}$ , sea cual sea el orden de las dos velocidades.

Demostración. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = -k_{1}A$ da la exponencial. Para $B$ , $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k_{1}A - k_{2}B = k_{1}e^{-k_{1}t} - k_{2}B$ ; pruébese $B = \beta(e^{-k_{1}t} - e^{-k_{2}t})$ : la derivada es $\beta(-k_{1}e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ y $-k_{2}B = \beta(-k_{2} e^{-k_{1}t} + k_{2}e^{-k_{2}t})$ , de modo que la ecuación exige $\beta(k_{2} - k_{1})e^{-k_{1}t} = k_{1}e^{-k_{1}t}$ , $\beta = k_{1}/(k_{2} - k_{1})$ , y $B(0) = 0$ como se pedía. Igualando $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = 0$ : $k_{1}e^{-k_{1}t} = k_{2}e^{-k_{2}t}$ , de donde $t^{*}$ . El tiempo medio que una molécula pasa en un compartimento del que sale a velocidad $k$ es $\int_{0}^{ \infty} t\,k e^{-kt}\,\mathrm{d}t = 1/k$ . ∎

Ejemplo 8.5 (La célula de Palade en números)

Tómense $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ (diez minutos en el retículo) y $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ (veinte en el Golgi). El Golgi alcanza su máximo en $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , y contiene entonces $B = 2(e^{-1.39} - e^{-0.69}) = 2(0.25 - 0.50)\cdot(-1) = 0.50$ : la mitad de la marca. A los $40\,\mathrm{min}$ , $A = 0.018$ , $B = 2(0.018 - 0.135) \to 0.23$ y $C = 0.75$ : tres cuartas partes de la proteína han llegado a los gránulos. Las curvas observadas en el laboratorio de Palade tienen esta forma, y ajustarlas fue como se midieron por primera vez los tiempos de permanencia.

Curvas de pulso y caza del modelo de dos velocidades con k_1 = 0.1\, min-1 y k_2 = 0.05\, min-1: la marca sale del retículo exponencialmente, pasa por el Golgi con un máximo a los 14\, min y se acumula en los gránulos. — Curvas de pulso y caza del modelo de dos velocidades con $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ y $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ : la marca sale del retículo exponencialmente, pasa por el Golgi con un máximo a los $14\,\mathrm{min}$ y se acumula en los gránulos.

8.2 El retículo endoplasmático: plegamiento, azúcares y calidad

Definición 8.6 (N-glicosilación y control de calidad)

Al entrar la cadena en la luz se transfiere desde un transportador lipídico a las asparaginas de la secuencia Asn-X-Ser/Thr un oligosacárido preensamblado de catorce azúcares (dos N-acetilglucosaminas, nueve manosas, tres glucosas): la N-glicosilación. Las tres glucosas se recortan luego una a una, y ese recorte es un reloj del plegamiento: una proteína que aún lleva una glucosa la retiene la chaperona calnexina; una proteína a la que se ha quitado la última glucosa pero que todavía no está plegada la vuelve a glucosilar una enzima que reconoce parches hidrófobos expuestos, y regresa a la calnexina — el ciclo de la calnexina. Las proteínas que fracasan una y otra vez se devuelven al citosol, se ubiquitinan y las destruye el proteasoma: la degradación asociada al RE (ERAD). Cuando las proteínas desplegadas se acumulan más deprisa de lo que pueden plegarse o destruirse, unos sensores de la membrana del retículo lanzan la respuesta a proteínas desplegadas: se frena la traducción, se inducen los genes de chaperonas, se expande el retículo y, si el estrés persiste, se mata la célula. La mutación más frecuente de la fibrosis quística ( $\Delta$ F508 en CFTR) produce un canal que funcionaría pero que se pliega demasiado despacio, lo atrapa la ERAD y nunca llega a la superficie; los fármacos que le ayudan a plegarse son hoy un tratamiento.

Una célula acinar pancreática al microscopio electrónico: el retículo endoplasmático rugoso apilado y tachonado de ribosomas llena la base, el Golgi se sitúa sobre el núcleo y los densos gránulos de secreción de enzima digestiva se apiñan bajo la superficie apical, a la espera de una señal.

8.3 Vesículas: gemación, direccionamiento, fusión

Definición 8.7 (Cubiertas y gemación de vesículas)

Una vesícula de transporte la moldea una cubierta de proteínas ensamblada en la cara citosólica de una membrana, que la curva formando una yema de $60\text{ a }100\,\mathrm{nm}$ , recoge la carga mediante receptores que atraviesan la membrana y se desprende una vez que la vesícula se ha estrangulado. Tres cubiertas sirven a las rutas principales: COPII para las vesículas que salen del retículo hacia el Golgi, COPI para el tráfico de regreso del Golgi al retículo y entre cisternas del Golgi, y la clatrina — una proteína de tres patas que polimeriza en una jaula de hexágonos y pentágonos — para las vesículas que salen del Golgi trans hacia los endosomas y para la endocitosis en la membrana plasmática, donde unas proteínas adaptadoras enlazan la jaula con los receptores que se internalizan. Cada cubierta la recluta una GTPasa pequeña (Sar1 para COPII, Arf1 para COPI y la clatrina) que se inserta en la membrana en su forma con GTP y que, al hidrolizar el GTP tras la gemación, deja caer la cubierta. Las señales de recuperación mantienen distintos los compartimentos: a las proteínas del retículo que se escapan llevando KDEL las une en el Golgi un receptor y las devuelve en vesículas COPI.

Izquierda: una jaula de clatrina, la red poliédrica de unidades de tres patas que da forma a una vesícula endocítica (recortada para mostrar la membrana del interior). Derecha: una pila de Golgi al microscopio electrónico, un montón de cisternas aplanadas con vesículas gemando en los bordes.

Definición 8.8 (Direccionamiento y fusión)

Una vesícula encuentra su diana por dos capas de reconocimiento. Las GTPasas Rab — unas sesenta en una célula humana, cada una en las membranas de un compartimento — reclutan proteínas de amarre largas que atrapan la vesícula entrante que lleva la Rab correspondiente. Actúan después las SNARE: una v-SNARE de la vesícula y unas t-SNARE de la diana, proteínas helicoidales ancladas en sus membranas, se enrollan una en torno a otra desde sus extremos distales hacia las membranas, y la energía del haz de cuatro hélices que forman junta las dos bicapas hasta que se fusionan. Cada emparejamiento de SNARE es específico, una segunda comprobación de la dirección. Tras la fusión el haz lo separa la ATPasa NSF para reutilizarlo. La fusión puede hacerse esperar a una señal: en el terminal nervioso las SNARE quedan enrolladas a medias por la complexina hasta que la sinaptotagmina, al unir el calcio que entra cuando llega un potencial de acción, completa el enrollamiento en menos de un milisegundo — la liberación de neurotransmisor tratada en el volumen de segundo año. Las neurotoxinas del tétanos y del botulismo son proteasas que cortan SNARE.

Evidencia. Novick y Schekman (1980) aislaron mutantes de levadura sensibles a la temperatura que dejaban de secretar a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ y acumulaban proteína en el compartimento que su defecto bloqueara — retículo, Golgi o vesículas apiladas bajo la superficie; los $23$ genes sec definieron los pasos y, una vez clonados, resultaron codificar las cubiertas, las GTPasas y las SNARE. Rothman reconstituyó el transporte entre cisternas del Golgi en un tubo de ensayo con membranas purificadas, citosol y ATP, y de ahí purificó la NSF y las SNARE; los dos enfoques convergieron en las mismas proteínas, y las máquinas de la levadura y del mamífero resultaron ser la misma. ∎

La fusión en tres pasos. Una Rab de la vesícula y un amarre de la diana ponen las dos membranas al alcance; las SNARE de la vesícula y de la diana (rojo y verde) se enrollan en un haz de cuatro hélices que arrastra las bicapas una contra otra; se fusionan y la carga entra en el compartimento de destino.

Proposición 8.9 (El Golgi)

El Golgi es una pila de cuatro a ocho cisternas aplanadas, con la cara cis hacia el retículo y la cara trans hacia la membrana plasmática, y cada cisterna alberga un conjunto distinto de enzimas que recortan y reconstruyen los azúcares de las glicoproteínas que pasan y añaden azúcares unidos por O, sulfato y fosfato. La carga avanza sobre todo por maduración cisternal: una cisterna nueva se forma en la cara cis a partir de las vesículas que llegan, recorre la pila como lo hicieron las anteriores y madura a medida que las vesículas COPI llevan hacia atrás las enzimas de cada cisterna a la más joven que la sigue; en la cara trans se deshace en vesículas con destino propio. Allí se decide la clasificación: las hidrolasas lisosómicas, marcadas en el Golgi cis con manosa-6-fosfato, las une su receptor y se empaquetan en vesículas de clatrina hacia el endosoma; las proteínas de secreción regulada se agregan al pH ligeramente ácido en gránulos de condensación; y todo lo demás sale en la corriente constitutiva hacia la superficie. En la enfermedad de las células I falta la enzima que fosforila, las hidrolasas se secretan en lugar de entregarse y los lisosomas se llenan de material sin digerir.

El mapa del tráfico de membranas. Hacia fuera (verde): del retículo al Golgi en vesículas COPII, y del Golgi a la superficie de forma constitutiva o a través de gránulos que esperan una señal. Hacia atrás (rojo): las vesículas COPI devuelven las proteínas del retículo que se escaparon. Hacia abajo (naranja): las enzimas lisosómicas marcadas con manosa-6-fosfato van al endosoma y al lisosoma. Hacia dentro (azul): endocitosis desde la superficie, con la mayoría de los receptores reciclados.

8.4 Endocitosis y lisosoma

Definición 8.10 (Endocitosis)

La endocitosis mediada por receptor concentra un ligando unido a receptores de superficie en fositas recubiertas de clatrina, que se estrangulan (la GTPasa dinamina constriñe el cuello) como vesículas de unos $100\,\mathrm{nm}$ — mil por minuto en un fibroblasto, lo que renueva toda la membrana de superficie en una hora. Las vesículas se fusionan en endosomas tempranos, cuya luz acidifica hasta pH 6 una bomba de protones; la mayoría de los ligandos sueltan allí sus receptores, los receptores vuelven a la superficie en vesículas de reciclado y el ligando sigue viaje mientras el endosoma madura hasta endosoma tardío (pH 5.5) y se fusiona con un lisosoma: un compartimento a pH 4.5–5 que contiene unas sesenta hidrolasas — proteasas, nucleasas, lipasas, glicosidasas — activas solo a ese pH, de modo que una fuga al citosol neutro hace poco daño. El lisosoma digiere además el propio material de la célula que le entrega la autofagia: una membrana doble crece alrededor de una porción de citoplasma o de un orgánulo gastado, se cierra en un autofagosoma y se fusiona con el lisosoma; los productos se devuelven al citosol. La autofagia la induce el ayuno (recicla la propia sustancia de la célula para obtener energía) y limpia agregados y mitocondrias dañadas; su fallo se ha implicado en la neurodegeneración.

Evidencia. Brown y Goldstein (años setenta) siguieron la lipoproteína de baja densidad (LDL), la partícula que transporta el colesterol en la sangre, hasta el interior de fibroblastos en cultivo. La LDL se unía de forma saturable a unos $20\,000$ sitios de superficie por célula, se internalizaba en minutos en fositas recubiertas, y su colesterol se liberaba en los lisosomas y apagaba la síntesis de colesterol de la propia célula. Los fibroblastos de pacientes con hipercolesterolemia familiar no unían LDL (receptor ausente) o la unían pero no la internalizaban (una mutación de la cola citosólica del receptor que impide que la capturen los adaptadores de clatrina): la enfermedad era un defecto de la endocitosis, la cola del receptor contenía la señal de internalización, y el receptor reciclado — cada uno con centenares de viajes de ida y vuelta — quedó establecido como el mecanismo general de captación. ∎

Proposición 8.11 (Captación mediante receptores reciclados)

Supóngase que una célula tiene $R$ receptores en total, de los cuales $S$ están en la superficie y $R - S$ dentro, de regreso. Un receptor de superficie está ocupado con probabilidad $\theta = [L]/(K_{d} + [L])$ , un receptor ocupado se internaliza a velocidad $k_{i}$ , y un receptor internalizado regresa a velocidad $k_{r}$ . En el estado estacionario el flujo de ligando hacia la célula es

J = \frac{R\,k_{i}k_{r}\,\theta}{k_{r} + k_{i}\theta},

que satura, a medida que sube la concentración de ligando, en $J_{\max} = R\,k_{i}k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ : la captación de una célula no la limitan sus receptores por sí solos, sino la rapidez con que puede traerlos de vuelta.

Demostración. Los receptores de superficie se pierden a velocidad $k_{i}\theta S$ y se recuperan a velocidad $k_{r}(R - S)$ ; en el estado estacionario ambas se compensan, luego $S = R\,k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta)$ . Cada internalización lleva un ligando, de modo que $J = k_{i}\theta S$ , lo que da la fórmula. Cuando $\theta \to 1$ el flujo tiende a $R\,k_{i}k_{r}/(k_{r} + k_{i})$ — los receptores ciclan tan deprisa como permiten las dos velocidades, con una fracción $k_{r}/(k_{i} + k_{r})$ de ellos en la superficie en cada instante. ∎

Ejemplo 8.12 (Colesterol partícula a partícula)

Un fibroblasto con $R = 20\,000$ receptores de LDL, un tiempo de internalización de $5\,\mathrm{min}$ ( $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ ) y un tiempo de regreso de $10\,\mathrm{min}$ ( $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ ) capta, con LDL saturante, $J_{\max} = 20\,000\times 0.2\times 0.1/0.3 \approx 1300$ partículas por minuto, con un tercio de sus receptores en la superficie en cada instante; cada partícula trae unas $1500$ moléculas de colesterol, dos millones por minuto, suficientes para construir alrededor de una décima de micrómetro cuadrado de membrana. Un heterocigoto para la hipercolesterolemia familiar, con la mitad de los receptores, capta la mitad; el colesterol en sangre se duplica y la cardiopatía llega veinte años antes. Las estatinas suben $R$ al privar a la célula hepática de su propio colesterol.

Captación de LDL mediante receptores reciclados, con la fórmula de la proposición y k_i = 0.2\, min-1 y k_r = 0.1\, min-1: satura con el ligando, y se reduce a la mitad cuando falta la mitad de los receptores. — Captación de LDL mediante receptores reciclados, con la fórmula de la proposición y $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ y $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ : satura con el ligando, y se reduce a la mitad cuando falta la mitad de los receptores.

Observación 8.13 (Una membrana, muchos compartimentos)

Toda membrana del sistema secretor y endocítico es, topológicamente, una sola membrana: la luz del retículo es continua, a través de vesículas, con el exterior de la célula, y un lípido o una proteína fabricados en el retículo pueden llegar a la superficie sin cruzar nunca una bicapa. Lo que mantiene distintos los compartimentos no son paredes sino tráfico — empaquetado selectivo hacia fuera, recuperación selectiva hacia atrás y un par específico de moléculas de reconocimiento en cada fusión. Los compartimentos son estados estacionarios de flujos, como las pozas de un río, y una célula que deja de traficar pierde su geografía en cuestión de horas.

8.5 Ejercicios

Ejercicio 8.1 ★

Dense la señal y el destino de cada una: un tramo de veinte residuos hidrófobos en el extremo amino; PKKKRKV; una hélice anfipática aminoterminal; KDEL en el extremo carboxilo; una manosa-6-fosfato en los azúcares.

Solución

Solución de Ejercicio 8.1.

Tramo hidrófobo aminoterminal: péptido señal, al retículo endoplasmático (y por defecto de ahí a la superficie). PKKKRKV: señal de localización nuclear, al núcleo a través del poro. Hélice anfipática aminoterminal: presecuencia mitocondrial, a la matriz mitocondrial. KDEL: recuperación desde el Golgi de vuelta al retículo. Manosa-6-fosfato: del Golgi trans al endosoma y al lisosoma.

Ejercicio 8.2 ★

Descríbanse las tres observaciones clave del experimento de Blobel y Dobberstein y qué mostró cada una.

Solución

Solución de Ejercicio 8.2.

(1) Sin membranas, la cadena traducida era unos veinte residuos más larga que la proteína secretada: se retira un segmento durante la secreción. (2) Con membranas presentes durante la traducción, el producto tenía el tamaño maduro y estaba protegido de la proteasa: había entrado en las vesículas y perdido el segmento dentro de ellas. (3) Las membranas añadidas después de la traducción no hacían ni lo uno ni lo otro: la entrada va acoplada a la síntesis — es cotraduccional — y el segmento, el péptido señal, solo funciona en una cadena naciente.

Ejercicio 8.3 ★

Nómbrense la cubierta y el sentido del transporte para: del retículo al Golgi; del Golgi al retículo; del Golgi trans al endosoma; de la membrana plasmática al endosoma.

Solución

Solución de Ejercicio 8.3.

Del retículo al Golgi: COPII, hacia delante. Del Golgi al retículo: COPI, retrógrado. Del Golgi trans al endosoma: clatrina con sus adaptadores, hacia delante en dirección al lisosoma. De la membrana plasmática al endosoma: clatrina, hacia dentro (endocitosis).

Ejercicio 8.4 ★

¿Por qué los azúcares de una proteína de la membrana plasmática están siempre en el exterior de la célula?

Solución

Solución de Ejercicio 8.4.

Los azúcares solo se añaden dentro de la luz del retículo y del Golgi. La cara luminal de toda vesícula sigue siendo luminal a lo largo de la gemación y la fusión, y cuando una vesícula se fusiona con la membrana plasmática su cara luminal pasa a ser el exterior de la célula; la orientación no se invierte nunca, de modo que lo que se glicosiló dentro acaba fuera.

Ejercicio 8.5 ★★

En el modelo del Teorema 8.4 con $k_{1} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ y $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ , hállese cuándo alcanza su máximo la marca del Golgi y cuánta hay en el máximo; después, la fracción en los gránulos a los $60\,\mathrm{min}$ .

Solución

Solución de Ejercicio 8.5.

$t^{*} = \ln(0.05/0.2)/(0.05 - 0.2) = \ln 4/0.15 = 9.2\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.2/(-0.15))(e^{-1.85} - e^{-0.46}) = 0.63$ . A los $60\,\mathrm{min}$ , $A \approx 0$ , $B = 1.33\,(e^{-3} - e^{-12}) = 0.066$ , luego $C = 0.93$ .

Ejercicio 8.6 ★★

Una proteína de membrana tiene tramos hidrófobos de $22$ residuos en las posiciones 30, 90, 150 y 210 y un péptido señal aminoterminal. Dibújese o descríbase su topología: cuántas hélices, y a qué lado da cada segmento entre ellas. ¿Dónde puede glicosilarse?

Solución

Solución de Ejercicio 8.6.

El péptido señal mete el extremo amino en la luz; cada tramo hidrófobo es alternativamente una parada o un inicio de transferencia, de modo que hay cuatro hélices transmembranarias (aproximadamente los residuos 30–52, 90–112, 150–172 y 210–232). Segmentos: extremo amino, luminal; 52–90, citosólico; 112–150, luminal; 172–210, citosólico; extremo carboxilo, luminal. Glicosilación solo en los segmentos luminales — el extremo amino, 112–150 y el extremo carboxilo —, que pasan a ser extracelulares en la superficie.

Ejercicio 8.7 ★★

Con la Proposición 8.11 y $R = 30\,000$ , $k_{i} = 0.25\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ , calcúlense $J_{\max}$ y la fracción de receptores en la superficie en saturación. ¿Qué único cambio duplicaría la captación?

Solución

Solución de Ejercicio 8.7.

$J_{\max} = 30\,000\times 0.25\times 0.05/0.30 = 1250$ por minuto; fracción de superficie $k_{r}/(k_{i} + k_{r}) = 0.05/0.30 = 0.17$ . Duplicar $R$ duplica $J$ exactamente; el cuello de botella es la velocidad de regreso (la mayoría de los receptores están dentro), y duplicar $k_{r}$ daría $30\,000\times 0.25 \times 0.1/0.35 \approx 2140$ , un factor $1.7$ .

Ejercicio 8.8 ★★

Predíganse el destino de las hidrolasas lisosómicas, y el fenotipo, en (a) una célula sin receptor de manosa-6-fosfato, (b) una célula sin la fosfotransferasa que añade la marca, (c) una célula tratada con un fármaco que neutraliza el pH endosómico.

Solución

Solución de Ejercicio 8.8.

(a) Sin receptor: las hidrolasas marcadas siguen la ruta por defecto y se secretan; los lisosomas se quedan sin enzimas y se llenan de material sin digerir — una enfermedad de depósito. (b) Sin fosfotransferasa: el mismo fenotipo por otra lesión (la enfermedad de las células I), con las enzimas sin marcar y secretadas. (c) Endosomas neutralizados: el receptor no puede soltar su carga, de modo que no se recicla y las hidrolasas se entregan mal o se secretan; los receptores de LDL y otros también dejan de ciclar.

Ejercicio 8.9 ★★

La mutación JD del receptor de LDL cambia una tirosina de la cola citosólica. Las células unen la LDL con normalidad pero no la captan. Explíquese el mecanismo y predígase dónde se encuentran los receptores en la superficie celular respecto a las fositas recubiertas.

Solución

Solución de Ejercicio 8.9.

La tirosina pertenece al motivo de la cola que reconoce el adaptador de clatrina; sin ella el receptor no se reúne en las fositas recubiertas. Los receptores unen la LDL con normalidad pero están repartidos uniformemente por la superficie, excluidos de las fositas, y el ligando se queda fuera — una enfermedad de clasificación, no de unión.

Ejercicio 8.10 ★★★

Resuélvase el modelo de pulso y caza para el caso $k_{1} = k_{2} = k$ (la fórmula del teorema es singular ahí): muéstrese que $B(t) = kt\,e^{-kt}$ y hállese el máximo. Explíquese después por qué medir solo la fracción de los gránulos $C(t)$ no puede determinar las dos velocidades por separado.

Solución

Solución de Ejercicio 8.10.

Con $k_{1} = k_{2} = k$ , pruébese $B = kt\,e^{-kt}$ : $\mathrm{d}B/\mathrm{d}t = k e^{-kt} - k^{2}t e^{-kt} = kA - kB$ , como se pedía, con $B(0) = 0$ . El máximo está donde $1 - kt = 0$ : $t^{*} = 1/k$ , $B = e^{-1} = 0.37$ . En general $C(t) = 1 - (k_{2}e^{-k_{1}t} - k_{1}e^{-k_{2}t})/(k_{2} - k_{1})$ , que es simétrico al intercambiar $k_{1}$ y $k_{2}$ : la curva de los gránulos por sí sola no puede decir cuál de los dos compartimentos es el rápido.

Ejercicio 8.11 ★★★

Un fibroblasto internaliza $1000$ vesículas de clatrina de $100\,\mathrm{nm}$ de diámetro por minuto y tiene una superficie de $3000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . ¿Cuánto tarda en internalizar el equivalente de toda la superficie? ¿Por qué no se encoge la célula, y qué implica el balance sobre la velocidad de exocitosis y sobre el volumen de líquido captado por hora?

Solución

Solución de Ejercicio 8.11.

Cada vesícula tiene un área $4\pi(50\,\text{nm})^{2} = 0.031\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; mil por minuto son $31\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{min}$ , de modo que toda la superficie en $3000/31 \approx 95\,\mathrm{min}$ . La célula no se encoge porque la membrana vuelve por exocitosis (vesículas de reciclado) al mismo ritmo — un equilibrio de flujos. Cada vesícula contiene $5\times 10^{-19}$ L; mil por minuto durante una hora son $3\times 10^{-14}$ L, alrededor del $1.5\,\%$ del volumen de una célula de $2\,\mathrm{pL}$ por hora.

Ejercicio 8.12 ★★★

La toxina botulínica corta una SNARE en los terminales nerviosos motores; la toxina tetánica corta la misma SNARE en las interneuronas inhibidoras de la médula espinal. Explíquese por qué la primera causa una parálisis flácida y la segunda una espástica, y por qué una toxina que bloquea la fusión resulta útil en medicina a dosis minúsculas.

Solución

Solución de Ejercicio 8.12.

La toxina botulínica actúa en el terminal motor: no se libera acetilcolina, el músculo no recibe orden y queda fláccido — parálisis flácida. La toxina tetánica sube por el axón motor y pasa a las interneuronas inhibidoras que normalmente frenan a las motoneuronas; con su SNARE cortada no se libera glicina ni GABA, las motoneuronas disparan sin oposición y todos los músculos se contraen — parálisis espástica. Unos pocos nanogramos de toxina botulínica inyectados en un músculo hiperactivo lo silencian localmente durante meses (hasta que se fabrica SNARE nueva y el terminal se recupera): un tratamiento para distonías, espasticidad, estrabismo y arrugas.

8.6 Problema: un día de una célula pancreática

Problema 8.1

Problema de fin de semana — el rendimiento de una célula secretora contado en moléculas, vesículas y micrómetros cuadrados, sus curvas de pulso y caza resueltas, la captación de colesterol de una célula hepática calculada con receptores reciclados y un lisosoma acidificado protón a protón, hasta llegar al momento del máximo del Golgi, a las vesículas que geman por minuto y a las partículas de LDL captadas por hora

Datos: una célula acinar fabrica $10^{7}$ moléculas de enzima por minuto, de $25\,\mathrm{kDa}$ cada una y $4\,\mathrm{nm}$ de diámetro. Las vesículas de transporte son esferas de $70\,\mathrm{nm}$ de diámetro; un gránulo es una esfera de $1\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Área de membrana por molécula de lípido, $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ , con dos monocapas. El retículo de la célula tiene un área de $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . Pulso y caza: $k_{1} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{2} = 0.05\,\mathrm{min}^{-1}$ . Una célula hepática: $R = 50\,000$ receptores de LDL, $k_{i} = 0.2\,\mathrm{min}^{-1}$ , $k_{r} = 0.1\,\mathrm{min}^{-1}$ , $K_{d} = 2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ , concentración plasmática de partículas de LDL $2\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ; $1500$ moléculas de colesterol por partícula. Un lisosoma: esfera de $0.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ , pH de $7.2$ a $4.7$ , con una capacidad tampón tal que hay que bombear $50$ protones por cada uno que queda libre; una bomba de protones mueve $200$ protones por segundo.

Parte I — Rendimiento.

¿Qué masa de enzima fabrica la célula por minuto, y por día? Compárese con el propio contenido proteico de la célula, unos $300\,\mathrm{pg}$ .
¿Cuántas moléculas de enzima caben en una vesícula si llenan el $30\,\%$ de su volumen (esfera de $4\,\mathrm{nm}$ )? ¿Cuántas vesículas por minuto salen del retículo?
¿Cuánta área de membrana llevan esas vesículas por minuto, y en cuánto tiempo consumirían todo el retículo si no volviera nada?
¿Cuántas moléculas de lípido son eso por minuto? ¿Qué ha de hacer la célula para conservar su retículo?
¿Cuántas moléculas de enzima caben en un gránulo con el mismo empaquetamiento, y cuántos gránulos llena la célula por hora?
Una comida vacía $300$ gránulos en diez minutos por fusión con la membrana apical y añade su membrana a una superficie de $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ . ¿Por qué factor crece la superficie apical, y qué ha de venir después?

Parte II — Tiempos.

Con las velocidades dadas, ¿cuándo alcanza su máximo la marca del Golgi, y qué fracción hay?
¿Qué fracción de un pulso está en el retículo, en el Golgi y en los gránulos a los $30\,\mathrm{min}$ ?
¿Tiempos medios de permanencia en los dos compartimentos? ¿Cuál es el tiempo total medio desde la síntesis hasta el gránulo?
Un fármaco frena la salida del Golgi a $k_{2} = 0.01\,\mathrm{min}^{-1}$ . ¿Nuevo momento y nueva fracción del máximo? ¿Qué aspecto tiene el Golgi al microscopio?
Explíquese por qué la fracción máxima del Golgi es $k_{1}/k_{2}$ elevado a una potencia (dese la potencia) y por tanto siempre menor que $1$ .
Si el paso del retículo fuera mucho más rápido que el del Golgi, ¿a qué tendería $B(t)$ ? Interprétese.

Parte III — Colesterol.

Calcúlense $\theta$ a la concentración plasmática de LDL y la captación $J$ en partículas por minuto y por hora.
¿Cuántas moléculas de colesterol por hora? Las membranas de la célula contienen $5\times 10^{9}$ moléculas de colesterol; ¿cuánto se tardaría en reemplazarlas todas solo a partir de la LDL?
Calcúlense la fracción de receptores en la superficie y el número de viajes de ida y vuelta que hace cada receptor en sus $20\,\mathrm{h}$ de vida.
Un heterocigoto tiene $R = 25\,000$ : recalcúlese $J$ . La LDL plasmática sube hasta que la captación iguala a la producción: ¿por qué factor, si $\theta$ está muy por debajo de la saturación?
Una estatina duplica $R$ en las células hepáticas del heterocigoto. ¿Qué le ocurre a la LDL plasmática, con el mismo razonamiento?
Explíquese por qué el homocigoto sin receptores, con la LDL plasmática cinco veces la normal, está aún peor de lo que sugiere la aritmética de la pregunta 16 por sí sola.

Parte IV — Ácido.

Calcúlense el volumen del lisosoma en litros y el número de protones libres a pH $7.2$ y a pH $4.7$ .
¿Cuántos protones hay que bombear en total, con el tampón? ¿Cuánto se tarda con $50$ bombas?
La bomba mete protones en contra del gradiente. ¿Qué problema eléctrico surge, y cómo se resuelve (piénsese en un contraión)?
¿Por qué las hidrolasas solo son activas a pH 5, y qué protege esto?
¿Por qué el receptor de LDL suelta la LDL a pH 6 mientras que el receptor de manosa-6-fosfato suelta su carga al mismo pH? ¿Qué deben tener en común las dos proteínas?
La cloroquina es una base débil que cruza las membranas sin carga y queda atrapada una vez protonada. ¿Por qué factor se concentra en un lisosoma a pH $4.7$ respecto al citosol a pH $7.2$ (la razón de las concentraciones de protones), y qué le hace eso al lisosoma?
Resúmase: el momento del máximo del Golgi (pregunta 7), las vesículas que salen del retículo por minuto (pregunta 2) y las partículas de LDL captadas por hora (pregunta 13).

Solución

Solución de Problema 8.1.

1. $10^{7}\times 25\,000\,\mathrm{Da}\times 1.66\times 10^{-24}$ g $= 0.42\,\mathrm{pg}$ por minuto, $600\,\mathrm{pg}$ al día — el doble de su propio contenido proteico. 2. Volumen de la vesícula, $\tfrac{4}{3}\pi\,35^{3} = 1.8\times 10^{5}$ nm $^{3}$ , y el $30\,\%$ de él, $5.4\times 10^{4}$ ; una molécula de enzima, $\tfrac{4}{3}\pi\,2^{3} = 34$ nm $^{3}$ : unas $1600$ moléculas por vesícula; $10^{7}/1600 \approx 6200$ vesículas por minuto. 3. Área $4\pi\,35^{2} = 0.0154\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ cada una, $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ por minuto: los $6000\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ del retículo en alrededor de una hora si no volviera nada. 4. $95\,\text{µ}\mathrm{m}^{2} = 9.5\times 10^{7}$ nm $^{2}$ , con dos monocapas a $0.7\,\mathrm{nm}^{2}$ : $2.7\times 10^{8}$ lípidos por minuto. La célula devuelve membrana con vesículas COPI y reciclado, y sintetiza lípido para reponer lo que se va para siempre en los gránulos. 5. Volumen del gránulo, $5.2\times 10^{8}$ nm $^{3}$ , y el $30\,\%$ de él, $1.6\times 10^{8}$ : $4.7\times 10^{6}$ moléculas por gránulo; $6\times 10^{8}$ moléculas por hora llenan unos $130$ gránulos. 6. Cada gránulo añade $\pi d^{2} = 3.1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ ; $300$ añaden $940\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ a $50\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ : veinte veces más. La membrana ha de recuperarse por endocitosis compensadora en cuestión de minutos. 7. $t^{*} = \ln 2/0.05 = 13.9\,\mathrm{min}$ , $B = 0.50$ . 8. $A = e^{-3} = 0.05$ ; $B = 2(e^{-1.5} - e^{-3}) = 0.35$ ; $C = 0.60$ . 9. $10\,\mathrm{min}$ y $20\,\mathrm{min}$ ; total medio $30\,\mathrm{min}$ . 10. $t^{*} = \ln(0.1)/(-0.09) = 25.6\,\mathrm{min}$ ; $B(t^{*}) = (0.1/(-0.09))(e^{-2.56} - e^{-0.256}) = 0.77$ : el Golgi se hincha, atiborrado con tres cuartas partes de la carga. 11. En el máximo, $k_{1}e^{-k_{1}t^{*}} = k_{2}e^{-k_{2}t^{*}}$ ; al sustituir en $B$ resulta $B_{\max} = (k_{1}/k_{2})^{\,k_{2}/(k_{2} - k_{1})}$ : la potencia es $k_{2}/(k_{2} - k_{1})$ . Para $k_{1} > k_{2}$ el exponente es negativo y la base mayor que $1$ ; para $k_{1} < k_{2}$ la base es menor que $1$ y el exponente positivo — en ambos casos el valor es menor que $1$ (compruébese: aquí $2^{-1} = 0.5$ ). 12. Para $k_{1} \gg k_{2}$ , $B(t) \to e^{-k_{2}t}$ : la marca está en el Golgi de inmediato y sale a $k_{2}$ — el paso del retículo es invisible y la curva del Golgi es una simple caída. 13. $\theta = 2/(2+2) = 0.5$ ; $J = 50\,000\times 0.2\times 0.1\times 0.5/(0.1 + 0.1) = 2500$ partículas por minuto, $150\,000$ por hora. 14. $1.5\times 10^{5}\times 1500 = 2.3\times 10^{8}$ moléculas de colesterol por hora; $5\times 10^{9}/2.3\times 10^{8} \approx 22$ horas. 15. Fracción en superficie, $k_{r}/(k_{r} + k_{i}\theta) = 0.5$ ; un viaje de ida y vuelta cuesta $1/(k_{i}\theta) + 1/k_{r} = 10 + 10 = 20\,\mathrm{min}$ : unos $60$ viajes en veinte horas. 16. $J = 1250$ por minuto. Por debajo de la saturación $J \propto R\,[L]$ , de modo que con la mitad de los receptores la LDL plasmática ha de duplicarse para el mismo aclaramiento. 17. $R$ vuelve a $50\,000$ : se restaura el aclaramiento y la LDL plasmática baja hacia lo normal — el efecto de la estatina. 18. Sin receptores, la LDL solo se aclara por vías inespecíficas y lentas, de modo que circula durante días en lugar de horas, se oxida y la captan los receptores basureros de los macrófagos, que se convierten en las células espumosas de las placas ateroscleróticas; y las estatinas, que actúan induciendo receptores, no tienen nada que inducir. 19. $V = \tfrac{4}{3}\pi(0.25)^{3} = 0.065\,\text{µ}\mathrm{m}^{3} = 6.5\times 10^{-17}$ L. A pH $7.2$ : $6.3\times 10^{-8}\times 6.5\times 10^{-17} = 4\times 10^{-24}$ mol — unos $2$ protones libres. A pH $4.7$ : $2\times 10^{-5}\times 6.5\times 10^{-17} = 1.3\times 10^{-21}$ mol, unos $780$ . 20. $50\times 780 \approx 39\,000$ protones; $50$ bombas a $200$ por segundo mueven $10\,000$ por segundo: unos $4\,\mathrm{s}$ . 21. Meter carga positiva deja la luz positiva, y unos pocos miles de cargas detendrían la bomba; entra cloruro por un canal (o salen cationes) para neutralizar la carga. 22. Las enzimas inactivas a pH neutro no hacen daño si un lisosoma tiene una fuga o si se clasifican mal hacia el citosol o la superficie: la exigencia de acidez confina la digestión al compartimento construido para ella. 23. Ambos han de llevar un sensor de pH — histidinas, cuya protonación cerca de pH 6 cambia la superficie de unión: el receptor de LDL pliega un dominio sobre su propio sitio de unión al protonarse, y el receptor de manosa-6-fosfato pierde afinidad de forma análoga. 24. $10^{7.2 - 4.7} = 10^{2.5} \approx 300$ veces más concentrada; la base atrapada consume protones, sube el pH lisosómico e inactiva las hidrolasas — que es como la cloroquina mata a los parásitos del paludismo en su vacuola alimentaria y como bloquea la autofagia en los experimentos. 25. Máximo del Golgi a los $14\,\mathrm{min}$ ; unas $6200$ vesículas salen del retículo por minuto; y $150\,000$ partículas de LDL captadas por hora.

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