Biología universitaria — tercer año · Bachelor Year 3

7Biología estructural de las proteínas

Max Perutz empezó a trabajar en la estructura de la hemoglobina en 1937 y la publicó en 1960: veintidós años para ver, con una resolución de medio nanómetro, cómo cuatro cadenas de ciento cincuenta aminoácidos se pliegan en torno a cuatro hemos. Una molécula de hemoglobina se pliega sola en unos pocos milisegundos. Entre estos dos hechos está el asunto de este capítulo: qué es la forma de una proteína, por qué una cadena de aminoácidos tiene una forma y no otra, cómo la encuentra tan deprisa entre un número astronómico de alternativas, qué falla cuando no lo hace, cómo se ven las formas — con rayos X, con resonancia magnética, con electrones y ahora con cálculo — y cómo una proteína se mueve entre formas para hacer su trabajo, con el conmutador de la hemoglobina entre una forma tensa y otra relajada como modelo de toda proteína alostérica desde entonces.

7.1 Qué es la estructura de una proteína

Definición 7.1 (Niveles de estructura)

La estructura primaria es la secuencia de residuos. La estructura secundaria es la conformación regular local del esqueleto, estabilizada por puentes de hidrógeno entre los carbonilos y las amidas del esqueleto: la hélice $\alpha$ , una espiral dextrógira de $3.6$ residuos por vuelta que sube $0.15\,\mathrm{nm}$ por residuo ( $0.54\,\mathrm{nm}$ por vuelta), con cada carbonilo unido a la amida situada cuatro residuos más allá; y la lámina $\beta$ , en la que hebras extendidas se disponen lado a lado, paralelas o antiparalelas, unidas a sus vecinas, con las cadenas laterales alternando por encima y por debajo de la lámina. La estructura terciaria es el plegamiento de toda una cadena en tres dimensiones; una unidad compacta de $50\text{ a }250$ residuos que se pliega de forma independiente dentro de ella es un dominio, y la disposición de los elementos secundarios de un dominio es su plegamiento. La estructura cuaternaria es el ensamblaje de varias cadenas: el $\alpha_{2}\beta_{2}$ de la hemoglobina. Unos $1300$ plegamientos dan cuenta de todos los dominios conocidos, y unas pocas decenas de ellos — el plegamiento de Rossmann, el barril TIM, el plegamiento de las inmunoglobulinas — de una gran parte de todas las proteínas: la naturaleza reutiliza plegamientos y varía sus secuencias.

El diagrama de Ramachandran. Las regiones sombreadas son las combinaciones de los ángulos y del esqueleto permitidas estéricamente; la hélice dextrógira y la hebra corresponden cada una a una región pequeña, y la mayoría de los residuos de una proteína plegada caen en una de ellas. — El diagrama de Ramachandran. Las regiones sombreadas son las combinaciones de los ángulos $\phi$ y $\psi$ del esqueleto permitidas estéricamente; la hélice $\alpha$ dextrógira y la hebra $\beta$ corresponden cada una a una región pequeña, y la mayoría de los residuos de una proteína plegada caen en una de ellas.

Proposición 7.2 (Qué mantiene unido un plegamiento)

Una proteína plegada la estabilizan el efecto hidrófobo — enterrar las cadenas laterales apolares en un núcleo lejos del agua, lo que libera las moléculas de agua que de otro modo quedarían ordenadas a su alrededor —, los puentes de hidrógeno de la estructura secundaria y de los grupos polares enterrados, el empaquetamiento de van der Waals de un núcleo tan denso como un cristal, algún que otro puente salino y, en las proteínas secretadas, los puentes disulfuro. El efecto hidrófobo aporta la mayor parte del impulso; los puentes de hidrógeno se pagan sobre todo a sí mismos (un esqueleto unido al agua en el estado desplegado queda unido a sí mismo en el plegado) y lo que dictan es cuál es el plegamiento. La energía libre neta del plegamiento es pequeña, $\Delta G \approx -20$ a $-60\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ — la fuerza de un puñado de puentes de hidrógeno en una molécula que tiene centenares —, porque la pérdida de entropía conformacional al plegarse casi cancela la ganancia de entalpía. Las proteínas son de estabilidad marginal: unos pocos grados, un cambio de pH o una sola mutación en el núcleo pueden desplegarlas, y esa marginalidad es lo que les permite moverse.

Evidencia. Anfinsen (1961) desplegó la ribonucleasa A con urea y un agente reductor, rompió sus cuatro puentes disulfuro y destruyó su actividad; al quitar ambos, la enzima se replegó, volvió a formar los cuatro emparejamientos correctos de entre los $105$ posibles y recuperó toda su actividad. No había molde, ni enzima, ni más información que la secuencia: la estructura nativa es el estado termodinámicamente más estable accesible a la cadena, y la secuencia la codifica. Reoxidar los puentes disulfuro mientras la cadena seguía en urea dio una mezcla desordenada con un $1\,\%$ de actividad, que después se ordenó hasta la forma nativa cuando se la dejó plegarse: la cadena encuentra el mínimo por sí sola. ∎

7.2 Cómo encuentra una cadena su plegamiento

Teorema 7.3 (La paradoja de Levinthal)

Si cada uno de los $n$ residuos de una proteína pudiera adoptar $k$ conformaciones de esqueleto de forma independiente, la cadena tendría $k^{n}$ conformaciones. Con $k = 3$ y $n = 100$ eso son $3^{100} \approx 5\times 10^{47}$ ; muestrearlas a una por picosegundo ( $10^{12}$ por segundo) costaría $5\times 10^{35}$ segundos, unos $10^{28}$ años. Las proteínas de ese tamaño se pliegan en milisegundos o segundos. Por tanto el plegamiento no es una búsqueda al azar entre conformaciones: la superficie de energía es un embudo en el que casi toda conformación parcial está sesgada hacia el estado nativo, y la cadena desciende mediante movimientos locales que en promedio van cuesta abajo.

Demostración. El recuento es el principio de multiplicación; el tiempo es el recuento dividido por la velocidad de muestreo, $5\times 10^{47}/10^{12} = 5\times 10^{35}$ s, y un año son $3\times 10^{7}$ s. La conclusión es el contrarrecíproco: una búsqueda al azar de ese tamaño es imposible en el tiempo observado, luego la búsqueda no es al azar. Lo que la hace no aleatoria es que una interacción formada en una parte de la cadena persiste mientras se forman otras (el colapso hidrófobo y la formación de hélices ocurren en microsegundos y reducen el espacio que hay que explorar), y que las estructuras parcialmente correctas tienen en promedio menos energía que las erróneas, de modo que el descenso está guiado — un embudo y no un campo de golf con un solo hoyo. ∎

El embudo de plegamiento. La energía libre cae y el número de conformaciones disponibles se encoge a medida que la cadena se acerca al estado nativo; las paredes son rugosas, de modo que una cadena puede quedar atrapada en un intermediario mal plegado en parte, pero la pendiente global la lleva abajo en milisegundos.

Definición 7.4 (Chaperonas)

Una chaperona molecular es una proteína que ayuda al plegamiento de otras sin formar parte de ellas ni aportar información sobre el plegamiento: impide la agregación que compite con el plegamiento en el citoplasma abarrotado. La Hsp70 se une a segmentos hidrófobos expuestos de cadenas nacientes o desplegadas y los suelta al hidrolizar ATP para otro intento; la chaperonina GroEL (Hsp60 en las mitocondrias, TRiC en el citosol eucariota) es un barril doble de catorce subunidades cuya cavidad central, tapada por GroES, encierra en aislamiento una sola cadena de hasta $60\,\mathrm{kDa}$ durante unos diez segundos — una jaula de Anfinsen — y la expulsa esté plegada o no, para que lo intente de nuevo. Cerca de la décima parte de las proteínas bacterianas recién fabricadas pasan por GroEL, y una célula cuyas chaperonas se ven desbordadas — por el calor, que es por lo que la mayoría son proteínas de choque térmico inducidas por una subida de temperatura — se llena de agregados.

Definición 7.5 (Amiloide)

El amiloide es un agregado ordenado de proteína en el que las cadenas se apilan en fibrillas no ramificadas de $5\text{ a }10\,\mathrm{nm}$ de ancho, con las hebras de cada cadena perpendiculares al eje de la fibrilla y unidas por puentes de hidrógeno a las hebras de la siguiente — la estructura $\beta$ cruzada, la misma sea cual sea la proteína. Casi cualquier proteína puede formarlo en condiciones desestabilizadoras; en las enfermedades por mal plegamiento lo hacen en el cuerpo proteínas concretas: el amiloide $\beta$ y la tau en la enfermedad de Alzheimer, la $\alpha$ -sinucleína en la de Parkinson, la huntingtina, la transtiretina y el amiloide de los islotes en la diabetes de tipo 2. Un prion es un amiloide que se propaga: la forma mal plegada de la proteína priónica PrP convierte por contacto la forma normal en más de sí misma, de modo que la “infección” no lleva ácido nucleico alguno, solo una forma — el mecanismo de la tembladera, de la encefalopatía espongiforme bovina y de la enfermedad de Creutzfeldt–Jakob, establecido por Prusiner desde 1982 contra una larga resistencia.

Izquierda: fibrillas de amiloide al microscopio electrónico — rectas, no ramificadas, a veces retorcidas y estructuralmente parecidas sea cual sea la proteína de la que estén hechas. Derecha: el tetrámero de la hemoglobina, dos cadenas y dos , cada una acunando un hemo. — Izquierda: fibrillas de amiloide al microscopio electrónico — rectas, no ramificadas, a veces retorcidas y estructuralmente parecidas sea cual sea la proteína de la que estén hechas. Derecha: el tetrámero de la hemoglobina, dos cadenas $\alpha$ y dos $\beta$ , cada una acunando un hemo.

7.3 Ver una proteína

Definición 7.6 (Métodos estructurales)

La cristalografía de rayos X hace crecer un cristal de la proteína, lo expone a un haz de rayos X y registra el patrón de difracción; las posiciones de las manchas dan la red, y sus intensidades, una vez recuperadas las fases de las ondas, dan la densidad electrónica de la celda unidad, dentro de la cual se construye la cadena. La resonancia magnética nuclear (RMN) mide, en disolución, los acoplamientos entre los núcleos de átomos próximos en el espacio, de los que se calculan distancias y con ellas una estructura; sirve para proteínas de menos de unos $40\,\mathrm{kDa}$ e informa de sus movimientos. La criomicroscopia electrónica fotografía de miles a millones de moléculas sueltas congeladas en una película fina de hielo vítreo, cada una en una orientación al azar, y reconstruye la densidad tridimensional combinándolas; desde los detectores directos de electrones (2013) alcanza resolución atómica y no necesita cristal, de modo que hoy se resuelven de rutina grandes complejos, proteínas de membrana y ensamblajes flexibles que nunca cristalizaron. La resolución de una estructura es la menor separación a la que dos rasgos quedan distinguidos: a $0.35\,\mathrm{nm}$ se sitúan el esqueleto y las cadenas laterales grandes, a $0.2\,\mathrm{nm}$ todos los átomos y a $0.1\,\mathrm{nm}$ los hidrógenos.

Evidencia. Kendrew (1958) obtuvo la primera estructura de una proteína, la mioglobina de cachalote, a $0.6\,\mathrm{nm}$ — una salchicha de una irregularidad inesperada, “más complicada y menos simétrica de lo que nadie había predicho” — y a $0.2\,\mathrm{nm}$ en 1960, cuando se vieron por primera vez las hélices $\alpha$ que Pauling había propuesto construyendo modelos en 1951. Perutz (1960) resolvió la hemoglobina a $0.55\,\mathrm{nm}$ usando el método de átomos pesados que había ideado para obtener las fases: unos átomos de mercurio unidos a la proteína cambian las intensidades de un modo que revela la información que falta. Comparando las formas oxigenada y desoxigenada (1970) vio que las subunidades giran unas contra otras $15{}^{\circ}$ al unir oxígeno, la primera transición alostérica observada a escala atómica. ∎

Max Perutz en 1962, el año de su premio Nobel por la estructura de la hemoglobina (Associated Press, dominio público). Centro: cristales de proteína en una gota colgante, el punto de partida de la cristalografía. Derecha: un criomicroscopio electrónico, el instrumento que hizo innecesarios los cristales.

Método 7.7 (Resolver una estructura por cristalografía)

(1) Purifíquense miligramos de la proteína y críbense centenares de condiciones (precipitante, pH, sal) buscando cristales; (2) congélese de golpe un cristal y recójanse imágenes de difracción en un sincrotrón mientras gira en el haz; (3) indícense las manchas para obtener la celda unidad y la simetría; el ángulo mayor al que se ven manchas fija la resolución por la ley de Bragg, $d = \lambda/(2\sin\theta)$ ; (4) resuélvase el problema de las fases — el detector registra intensidades pero no fases — con átomos pesados, con la dispersión anómala del selenio de la selenometionina o, para una proteína parecida a otra conocida, por sustitución molecular, colocando el modelo conocido en la celda; (5) calcúlese la densidad electrónica, constrúyase la cadena dentro de ella y refínese el modelo contra los datos hasta que el desacuerdo (el factor $R$ ) sea pequeño; (6) valídese: geometría, valores atípicos de Ramachandran y el ajuste a datos contra los que el modelo no se refinó.

Del cristal al modelo. La red regular dispersa los rayos X en manchas discretas; la mancha situada al ángulo mayor fija la resolución; recuperar las fases convierte las intensidades en un mapa de densidad electrónica, dentro del cual se construye la cadena.

Observación 7.8 (La predicción se ha sumado a los métodos)

Desde 2020 la estructura de una proteína se predice a partir de su secuencia con una exactitud que a menudo rivaliza con una estructura experimental de $0.3\,\mathrm{nm}$ (Capítulo 5). La predicción es una hipótesis sobre un estado nativo estático; los métodos experimentales siguen siendo el árbitro y la única fuente de información sobre ligandos, cambios conformacionales, complejos y la dinámica de más abajo. Sus papeles han cambiado — un modelo predicho resuelve el problema de las fases por sustitución molecular y orienta qué experimentos vale la pena hacer — más que sustituirse el uno al otro.

7.4 Alosterismo: la hemoglobina como modelo

Definición 7.9 (Alosterismo y cooperatividad)

Una proteína es alostérica cuando la unión de un ligando en un sitio cambia la afinidad de otro, mediante un cambio de conformación transmitido a través de la molécula. Cuando los dos sitios unen el mismo ligando y el efecto es positivo, la unión es cooperativa: la saturación fraccionaria $Y$ sube con la concentración de ligando como una sigmoide y no como una hipérbola, descrita empíricamente por la ecuación de Hill $Y = [S]^{n_{H}}/(K^{n_{H}} + [S]^{n_{H}})$ con un coeficiente de Hill $n_{H} > 1$ (hemoglobina: $n_{H} \approx 2.8$ para sus cuatro sitios; mioglobina, con un solo sitio: $n_{H} = 1$ ). La hemoglobina existe en dos conformaciones cuaternarias, el estado T (tenso, de baja afinidad, favorecido cuando no hay oxígeno unido) y el estado R (relajado, de alta afinidad), y conmuta entre ellas como un todo; los protones, el dióxido de carbono y el 2,3-bisfosfoglicerato estabilizan el T y bajan así la afinidad — el efecto Bohr, por el que un tejido en trabajo, ácido y caliente, toma más oxígeno de la sangre.

Teorema 7.10 (El modelo de Monod–Wyman–Changeux)

Considérese una proteína de $n$ sitios idénticos que existe en dos conformaciones, $T$ y $R$ , en equilibrio $L = [T_{0}]/[R_{0}]$ en ausencia de ligando, con cada sitio de $R$ uniendo el ligando con constante de disociación $K_{R}$ y cada sitio de $T$ con $K_{T}$ , $c = K_{R}/K_{T} < 1$ . Todos los sitios de una molécula conmutan a la vez (la transición es concertada). Entonces, con $\alpha = [S]/K_{R}$ , la saturación fraccionaria es

Y = \frac{\alpha(1+\alpha)^{n-1} + Lc\alpha(1+c\alpha)^{n-1}} {(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}},

y la fracción de moléculas en el estado $R$ es $\bar R = (1+\alpha)^{n}/\bigl[(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}\bigr]$ . Para $L \gg 1$ y $c \ll 1$ la curva es sigmoide: los primeros ligandos se unen a las escasas moléculas $R$ , de alta afinidad, e inclinan el equilibrio, de modo que la unión recluta más $R$ y la afinidad de los sitios restantes sube — cooperatividad sin interacción directa alguna entre sitios.

Demostración. La especie con $i$ ligandos unidos en la forma $R$ tiene concentración $[R_{0}]\binom{n}{i}\alpha^{i}$ (cada una de las $\binom{n}{i}$ elecciones de sitios ocupados aporta $([S]/K_{R})^{i}$ por la ley de acción de masas), y en la forma $T$ , $[T_{0}]\binom{n}{i}(c\alpha)^{i}$ , ya que $[S]/K_{T} = c\alpha$ . Sumando sobre $i$ con el teorema del binomio, la proteína total es $[R_{0}]\bigl[(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}\bigr]$ y el ligando total unido es $[R_{0}]\sum_{i} i\binom{n}{i}\bigl[ \alpha^{i} + L(c\alpha)^{i}\bigr] = [R_{0}]\,n\bigl[\alpha(1+\alpha)^{n-1} + Lc\alpha(1+c\alpha)^{n-1}\bigr]$ , usando $\sum_{i} i\binom{n}{i}x^{i} = nx(1+x)^{n-1}$ . Dividiendo el ligando unido por $n$ veces la proteína total se obtiene $Y$ ; la fracción $R$ son los términos de $R$ sobre el total. Cuando $\alpha$ es pequeño los términos de $T$ dominan el denominador (porque $L \gg 1$ ) y $Y \approx c\alpha$ , la baja afinidad de $T$ ; cuando $\alpha$ es lo bastante grande como para que $(1+\alpha)^{n} > L(1+c\alpha)^{n}$ , los términos de $R$ toman el mando y la afinidad es $K_{R}$ : el paso entre los dos regímenes es la sigmoide. ∎

Ejemplo 7.11 (La hemoglobina en números)

Tómense $n = 4$ , $K_{R} = 1\,\mathrm{mmHg}$ , $c = 0.01$ (de modo que $K_{T} = 100\,\mathrm{mmHg}$ ) y $L = 3\times 10^{5}$ . A la presión parcial de oxígeno de la sangre arterial, $100\,\mathrm{mmHg}$ , $\alpha = 100$ y $Y = 0.97$ ; a $40\,\mathrm{mmHg}$ , el valor venoso en reposo, $Y = 0.78$ ; a $26\,\mathrm{mmHg}$ , $Y = 0.52$ — el modelo reproduce la presión de semisaturación de $26\,\mathrm{mmHg}$ —; y a $20\,\mathrm{mmHg}$ , en un músculo en ejercicio, $Y = 0.35$ . Un transportador no cooperativo con la misma presión de semisaturación daría $100/126 = 0.79$ en los pulmones y $20/46 = 0.43$ en el músculo, y descargaría $0.36$ de su capacidad allí donde la hemoglobina descarga $0.62$ . La cooperatividad es lo que produce un transportador que se carga del todo a una presión y se descarga casi del todo a una presión solo cinco veces menor.

Saturación de oxígeno de la hemoglobina calculada con la ecuación de Monod–Wyman–Changeux y los parámetros del ejemplo (rojo), frente a un transportador de un solo sitio con la misma presión de semisaturación (azul). Entre el pulmón y el músculo en trabajo, el transportador cooperativo descarga casi el doble.

Proposición 7.12 (Mecanismo del conmutador)

En la desoxihemoglobina el hierro queda algo fuera del plano del hemo, atraído hacia la histidina proximal, y el hemo está abombado. La unión del oxígeno aplana el hemo y arrastra el hierro, y con él la histidina y la hélice a la que pertenece, unos $0.06\,\mathrm{nm}$ hacia el hemo; ese desplazamiento se amplifica en la interfaz entre los dímeros $\alpha_{1}\beta_{1}$ y $\alpha_{2}\beta_{2}$ , que giran $15{}^{\circ}$ y rompen los puentes salinos que sostienen el estado T. Los efectores actúan sobre esos mismos puentes: los protones se unen a histidinas cuyos puentes solo existen en T (el efecto Bohr), el dióxido de carbono forma carbamatos con los extremos amino que estabilizan el T, y el 2,3-bisfosfoglicerato, una molécula pequeña muy negativa, se aloja en la cavidad central entre las cadenas $\beta$ , que solo es lo bastante ancha en T. La hemoglobina fetal, con cadenas $\gamma$ que lo unen peor, tiene más afinidad que la de la madre y atrae el oxígeno a través de la placenta.

7.5 Proteínas en movimiento

Definición 7.13 (Desorden y dinámica)

Una región intrínsecamente desordenada no tiene plegamiento estable por sí sola y existe como un conjunto de conformaciones que se interconvierten deprisa, y a menudo se pliega solo al encontrarse con su compañera; alrededor de un tercio de las proteínas humanas llevan una región desordenada de más de treinta residuos, y están enriquecidas en la señalización y la regulación, donde un segmento flexible puede fosforilarse en muchos sitios, unirse por turnos a varias compañeras y actuar de enlace. Las proteínas plegadas también se mueven: las cadenas laterales giran en picosegundos, los bucles se abren en nanosegundos o microsegundos, los dominios bisagran en microsegundos o milisegundos, y el ciclo catalítico de una enzima es una coreografía de tales movimientos más que una llave estática en su cerradura. Una estructura cristalina es una instantánea de un conjunto conformacional; la RMN y la simulación molecular ven el resto. Las proteínas desordenadas multivalentes y los ARN pueden además separarse del citoplasma en gotas líquidas — los condensados biomoleculares, como los nucléolos, los gránulos de estrés y los cuerpos P — que concentran reacciones sin membrana, y cuyo envejecimiento hasta agregados sólidos es una de las vías hacia las enfermedades amiloides.

Observación 7.14 (Estructura y función)

La lección de sesenta años de estructuras es doble. Un plegamiento es una solución a un problema físico — unir esto, catalizar aquello, transmitir una señal a lo largo de cuatro nanómetros — y conocer la estructura deja a menudo claro el mecanismo, como ocurrió con el hierro del hemo y con el giro de los dímeros de la hemoglobina impulsado por el oxígeno. Y un plegamiento es un objeto histórico: las mismas pocas centenas de arquitecturas, retocadas, duplicadas y fusionadas, sirven para toda la diversidad de la función proteica, de modo que la estructura de una proteína de una bacteria dirá, a menudo, cómo funciona la prima humana.

7.6 Ejercicios

Ejercicio 7.1 ★

Defínanse los cuatro niveles de estructura de una proteína y dese el ejemplo de cada uno en la hemoglobina.

Solución

Solución de Ejercicio 7.1.

Primaria: la secuencia de los $141$ residuos de una cadena $\alpha$ . Secundaria: sus ocho hélices $\alpha$ . Terciaria: el plegamiento de globina de una cadena envolviendo su hemo. Cuaternaria: el tetrámero $\alpha_{2}\beta_{2}$ y la manera en que sus dímeros giran uno contra otro.

Ejercicio 7.2 ★

Una hélice $\alpha$ contiene $36$ residuos. ¿Qué longitud tiene, cuántas vueltas da y cuántos puentes de hidrógeno del esqueleto la sostienen (el carbonilo de cada residuo se une a la amida cuatro residuos más allá)?

Solución

Solución de Ejercicio 7.2.

$36\times 0.15\,\mathrm{nm} = 5.4\,\mathrm{nm}$ ; $36/3.6 = 10$ vueltas; $36 - 4 = 32$ puentes de hidrógeno.

Ejercicio 7.3 ★

¿Qué mostró el replegamiento de la ribonucleasa de Anfinsen, y por qué era importante hacer el experimento sin ningún componente celular presente?

Solución

Solución de Ejercicio 7.3.

Que la estructura nativa, incluido el emparejamiento correcto de cuatro puentes disulfuro de entre $105$ posibilidades, se recupera espontáneamente a partir de la cadena desplegada: la secuencia contiene toda la información necesaria y el estado nativo es el mínimo termodinámico. Hacerlo en un tubo de ensayo con proteína pura excluía cualquier molde, enzima o maquinaria celular como fuente de la información.

Ejercicio 7.4 ★

Ordénense la cristalografía, la RMN y la criomicroscopia electrónica según el tamaño de proteína que cada una maneja mejor, y dígase cuál da información sobre el movimiento.

Solución

Solución de Ejercicio 7.4.

RMN: proteínas pequeñas, por debajo de unos $40\,\mathrm{kDa}$ , en disolución. Cristalografía: cualquier tamaño que cristalice, de los péptidos a los ribosomas. Criomicroscopia electrónica: complejos grandes, por encima de unos $50\,\mathrm{kDa}$ , sin cristales. La RMN informa directamente del movimiento (y la crio-ME puede ordenar las moléculas en clases conformacionales); una estructura cristalina es un promedio estático.

Ejercicio 7.5 ★★

Rehágase el recuento de Levinthal para una proteína de $150$ residuos con $k = 2$ , y para un péptido de $20$ residuos con $k = 3$ . ¿Para cuál de los dos es concebible una búsqueda al azar en un segundo a $10^{12}$ intentos por segundo?

Solución

Solución de Ejercicio 7.5.

$2^{150} \approx 1.4\times 10^{45}$ conformaciones, $1.4\times 10^{33}$ s $\approx 5\times 10^{25}$ años. $3^{20} \approx 3.5\times 10^{9}$ , $3.5$ ms: el péptido podría buscar de forma exhaustiva en un segundo; la proteína no podría en la edad del universo.

Ejercicio 7.6 ★★

Con la ecuación de MWC y $n = 2$ , $L = 100$ , $c = 0.01$ , calcúlese $Y$ en $\alpha = 1$ , $10$ y $100$ , y compárese con un solo sitio de constante de disociación $K_{R}$ ( $Y = \alpha/(1+\alpha)$ ). ¿Dónde se manifiesta la cooperatividad?

Solución

Solución de Ejercicio 7.6.

$Y = [\alpha(1+\alpha) + Lc\alpha(1+c\alpha)]/[(1+\alpha)^{2} + L(1+c\alpha)^{2}]$ . $\alpha = 1$ : $3.01/106 = 0.028$ (un solo sitio, $0.50$ ). $\alpha = 10$ : $121/242 = 0.50$ ( $0.91$ ). $\alpha = 100$ : $10\,300/10\,601 = 0.97$ ( $0.99$ ). La curva de MWC va muy por detrás del sitio único con poco ligando y sube después bruscamente — de $0.03$ a $0.97$ a lo largo de dos décadas en las que el sitio único va de $0.5$ a $0.99$ : esa pendiente es la cooperatividad.

Ejercicio 7.7 ★★

Explíquese, con el modelo de MWC, por qué el 2,3-bisfosfoglicerato baja la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno, qué parámetro del modelo cambia y por qué la sangre almacenada, que pierde el compuesto, entrega mal el oxígeno al transfundirse.

Solución

Solución de Ejercicio 7.7.

El bisfosfoglicerato se une solo al estado T (en la cavidad central), de modo que lo estabiliza: en el modelo sube $L$ , la razón $T/R$ de la proteína sin ligando, y desplaza así la curva a la derecha — menos afinidad y más oxígeno liberado a las presiones de los tejidos. Los glóbulos rojos almacenados pierden el compuesto, $L$ baja, la curva se desplaza a la izquierda, y la sangre transfundida retiene su oxígeno en lugar de cederlo en los tejidos, hasta que las células lo resintetizan a lo largo de un día.

Ejercicio 7.8 ★★

Un cristal difracta hasta un ángulo máximo $\theta = 15{}^{\circ}$ con rayos X de longitud de onda $0.1\,\mathrm{nm}$ . ¿Cuál es la resolución? ¿Qué rasgos de la proteína serán visibles? ¿Qué ángulo haría falta para $0.12\,\mathrm{nm}$ ?

Solución

Solución de Ejercicio 7.8.

$d = \lambda/(2\sin\theta) = 0.1/(2\times 0.259) = 0.19\,\mathrm{nm}$ : el esqueleto y todas las cadenas laterales quedan situados, con los átomos individuales resueltos. Para $0.12\,\mathrm{nm}$ : $\sin\theta = 0.1/0.24 = 0.417$ y $\theta = 25{}^{\circ}$ .

Ejercicio 7.9 ★★

Una mutación sustituye una leucina enterrada por una lisina. Predígase su efecto sobre la estabilidad, con la Proposición 7.2, y explíquese por qué la misma sustitución en la superficie sería inocua. Explíquese después por qué una proteína con $\Delta G_{\text{pleg}} = -30\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ no es “muy estable” aunque el número parezca grande.

Solución

Solución de Ejercicio 7.9.

Una lisina cargada enterrada entre cadenas laterales apolares cuesta decenas de kilojulios por mol (su carga sin solvatar, perdido el enterramiento hidrófobo de la leucina), más que todo el $\Delta G$ del plegamiento: la proteína se despliega o el núcleo se reorganiza. En la superficie la lisina queda hidratada igual que lo estaría en el estado desplegado y no se pierde nada. $-30\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol} \approx -12RT$ significa $K = e^{12} \approx 1.6\times 10^{5}$ : una molécula de cada $160\,000$ está desplegada en cada instante, y todo el margen equivale a dos o tres puentes de hidrógeno de entre centenares — lo que vale una sola mutación.

Ejercicio 7.10 ★★★

Dedúzcase la fracción de moléculas en el estado $R$ , $\bar R$ , a partir de las especies contadas en la demostración del Teorema 7.10, y muéstrese que para $c \to 0$ la concentración de ligando a la que la mitad de las moléculas están en $R$ cumple $(1+\alpha)^{n} = L$ . Calcúlese este $\alpha$ con los parámetros de la hemoglobina y compárese con $P_{50}$ .

Solución

Solución de Ejercicio 7.10.

Las especies $R$ suman $[R_{0}](1+\alpha)^{n}$ y las $T$ , $[R_{0}]L(1+c\alpha)^{n}$ , de modo que $\bar R = (1+\alpha)^{n}/[(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}]$ . Para $c \to 0$ el término de $T$ es $L$ , y $\bar R = 1/2$ cuando $(1+\alpha)^{n} = L$ , es decir, $\alpha = L^{1/n} - 1$ . Para la hemoglobina $(3\times 10^{5})^{1/4} = 23.4$ , luego $\alpha \approx 22$ : $22\,\mathrm{mmHg}$ , cerca del $P_{50}$ de $26\,\mathrm{mmHg}$ — el conmutador conformacional y la semisaturación casi coinciden.

Ejercicio 7.11 ★★★

Los priones transmiten una forma. Explíquese por qué se resistió la hipótesis de “solo proteína”, qué experimento la refutaría y qué pruebas la apoyan (la resistencia de la infectividad a las nucleasas y a la luz ultravioleta, la sensibilidad a los desnaturalizantes de proteínas, los priones sintéticos). ¿Por qué necesita semilla un prion?

Solución

Solución de Ejercicio 7.11.

Se resistió porque todo agente infeccioso conocido se replicaba mediante ácido nucleico, y una proteína no puede copiar su secuencia. Encontrar un ácido nucleico necesario, o mostrar que la proteína purificada no transmite, la refutaría. Apoyos: la infectividad sobrevive a las nucleasas y a la radiación ultravioleta e ionizante a dosis que destruyen cualquier genoma, pero la destruyen los desnaturalizantes de proteínas y las proteasas; la PrP recombinante plegada in vitro en fibrillas transmite la enfermedad a animales, con las mismas propiedades de cepa al pasarla. Hace falta una semilla porque la conversión de un monómero normal es prohibitivamente lenta por sí sola — primero ha de formarse el núcleo de la estructura $\beta$ cruzada, que es el suceso limitante —, mientras que el extremo de una fibrilla ya formada convierte monómeros deprisa: la forma se copia por crecimiento sobre molde.

Ejercicio 7.12 ★★★

Una familia de proteínas ha conservado su plegamiento mientras sus secuencias divergían hasta un $15\,\%$ de identidad. Explíquese por qué la estructura se conserva más que la secuencia, qué clase de residuos son los conservados y cómo lo aprovechan tanto los métodos de perfil (Capítulo 5) como el diseño de proteínas nuevas.

Solución

Solución de Ejercicio 7.12.

Muchas secuencias se pliegan en la misma estructura: lo que un plegamiento necesita es un patrón de posiciones hidrófobas y polares, unas pocas glicinas y prolinas en los giros y los residuos que hacen el trabajo; todo lo demás de la superficie puede cambiar sin penalización, de modo que las mutaciones se acumulan ahí mientras la selección conserva el plegamiento y la función. Los residuos conservados son por tanto los del núcleo (más como patrón que como identidades), los catalíticos y de unión, y las glicinas, prolinas y cisteínas estructurales. Los métodos de perfil ponderan justamente esas columnas y reconocen así miembros de la familia al $15\,\%$ de identidad; el diseño de proteínas recorre la lógica al revés, eligiendo un patrón hidrófobo para un plegamiento diana y dejando que la superficie sea cualquier cosa.

7.7 Problema: el plegamiento de una globina

Problema 7.1

Problema de fin de semana — las hélices de una globina medidas, su plegamiento cronometrado frente a Levinthal, su unión del oxígeno calculada con el modelo de dos estados y su estructura resuelta a partir de un cristal, hasta llegar a la diferencia de saturación entre el pulmón y el músculo, al tiempo de Levinthal y a la resolución del mapa

Datos: una cadena de globina de $150$ residuos, de masa media por residuo $110\,\mathrm{Da}$ , con el $75\,\%$ de los residuos en ocho hélices $\alpha$ ; subida de la hélice, $0.15\,\mathrm{nm}$ por residuo, con $3.6$ residuos por vuelta. Volumen específico parcial de la proteína, $0.73\,\mathrm{cm}^{3}/\mathrm{g}$ . Parámetros MWC de la hemoglobina: $n = 4$ , $K_{R} = 1\,\mathrm{mmHg}$ , $c = 0.01$ , $L = 3\times 10^{5}$ . Longitud de onda de los rayos X, $0.1\,\mathrm{nm}$ ; celda unidad, un cubo de arista $6\,\mathrm{nm}$ ; cristal, un cubo de arista $100\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Parte I — Anatomía de una cadena.

¿Cuántos residuos están en hélices? ¿Qué longitud total de hélice suman, y cuántas vueltas?
¿Cuántos puentes de hidrógeno del esqueleto contienen las hélices, contando uno por residuo más allá de los cuatro primeros de cada hélice?
La masa de la cadena y su volumen a partir del volumen específico parcial; el radio de una esfera de ese volumen.
La cadena extendida mediría $0.36\,\mathrm{nm}$ por residuo. Compárese su longitud con el diámetro de la esfera: ¿por qué factor compacta el plegamiento a la cadena?
Las ocho hélices promedian $14$ residuos. Si los residuos se pusieran uno tras otro, ¿qué fracción de la longitud extendida es helicoidal, y cuánto la acorta la hélice?
Una globina entierra unas $40$ cadenas laterales apolares en su núcleo. Tomando $4\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ de estabilización hidrófoba por cadena lateral enterrada y un coste de entropía conformacional de $0.9\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ por residuo al plegarse (los $150$ ), estímese el $\Delta G$ neto del plegamiento y compárese con el intervalo de la Proposición 7.2.

Parte II — Encontrar el plegamiento.

Calcúlense el recuento de Levinthal para $150$ residuos con $k = 3$ y el tiempo de muestrearlo a $10^{12}$ por segundo.
La globina se pliega en $10\,\mathrm{ms}$ . ¿Cuántas conformaciones, como mucho, puede haber visitado? ¿Qué fracción del recuento es eso?
Supóngase en cambio que cada hélice se forma de manera independiente en $1\,\text{µ}\mathrm{s}$ , y que las ocho hélices ya formadas buscan después su empaquetamiento entre $8!$ ordenaciones muestreadas a $10^{6}$ por segundo. Estímese el tiempo de plegamiento. ¿Es esto un embudo?
Una chaperonina encierra una cadena $10\,\mathrm{s}$ por ciclo y la libera plegada con probabilidad $0.3$ por ciclo. ¿Cuál es el número esperado de ciclos, y el tiempo esperado, para plegar un sustrato difícil? ¿Qué fracción sigue sin plegarse al cabo de un minuto?
Una mutación desestabilizadora sube la fracción desplegada a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ de $10^{-4}$ a $10^{-2}$ . Con $\Delta G = -RT\ln(K)$ y $K = [\text{plegada}]/[\text{desplegada}]$ , ¿cuánto cambió $\Delta G_{\text{pleg}}$ ?
Explíquese por qué cien veces más proteína desplegada puede ser la diferencia entre la salud y una enfermedad amiloide, usando la necesidad de una semilla.

Parte III — Unir oxígeno.

Calcúlese $Y$ con la ecuación de MWC en $\alpha = 100$ (pulmón) y $\alpha = 20$ (músculo en trabajo).
Calcúlese la fracción de moléculas en el estado $R$ a esas dos presiones.
¿Cuánto del oxígeno cargado se descarga entre el pulmón y el músculo? Compárese con un transportador de un solo sitio con presión de semisaturación $26\,\mathrm{mmHg}$ .
La sangre lleva $150\,\mathrm{g}$ de hemoglobina por litro, y cada gramo une $1.34\,\mathrm{mL}$ de oxígeno. ¿Cuántos mililitros de oxígeno por litro entrega la hemoglobina al músculo, según la pregunta 15? Un cuerpo en reposo consume $250\,\mathrm{mL}/\mathrm{min}$ : ¿qué flujo sanguíneo exige eso en reposo (descargando de $0.97$ a $0.78$ )?
El bisfosfoglicerato sube $L$ hasta $3\times 10^{6}$ . Recalcúlese $Y$ en $\alpha = 40$ y dígase qué le hace esto a la entrega en reposo.
La hemoglobina fetal tiene, en la práctica, $L = 3\times 10^{4}$ . Calcúlese su $Y$ a la presión placentaria de $30\,\mathrm{mmHg}$ , compárese con la de la madre y explíquese la transferencia.

Parte IV — Verlo.

¿Cuántas celdas unidad contiene el cristal? Si cada celda contiene cuatro cadenas de globina, ¿cuántas moléculas difractan juntas?
Se ven manchas hasta $\theta = 14.5{}^{\circ}$ . ¿Cuál es la resolución, y quedarán situadas las cadenas laterales?
¿Qué ángulo daría $0.15\,\mathrm{nm}$ ? ¿Por qué un cristal mal ordenado difracta solo a ángulos bajos?
En criomicroscopia electrónica la señal de la imagen promediada crece como la raíz cuadrada del número de partículas. Si $10\,000$ partículas dan $0.6\,\mathrm{nm}$ , y la resolución mejora como la inversa de la señal, ¿cuántas partículas dan $0.3\,\mathrm{nm}$ ?
La criomicroscopia electrónica no necesita cristal. Nómbrense dos clases de proteína o de complejo para las que esto decide si puede obtenerse una estructura siquiera, y explíquese por qué.
Un modelo predicho de la globina difiere de la estructura cristalina en $0.1\,\mathrm{nm}$ de media en el esqueleto. Nómbrense dos cosas que la predicción no puede aportar y el cristal sí aportó.
Resúmase: la descarga entre el pulmón y el músculo (pregunta 15), el tiempo de Levinthal para $150$ residuos (pregunta 7) y la resolución del mapa (pregunta 20).

Solución

Solución de Problema 7.1.

1. $0.75\times 150 \approx 112$ residuos helicoidales; $112\times 0.15\,\mathrm{nm} = 17\,\mathrm{nm}$ ; $112/3.6 \approx 31$ vueltas. 2. $112 - 8\times 4 = 80$ puentes de hidrógeno. 3. Masa $150\times 110 = 16\,500\,\mathrm{Da} = 2.7\times 10^{-20}$ g; volumen $2.7\times 10^{-20}\times 0.73 = 2.0\times 10^{-20}$ cm $^{3}$ $= 20\,\mathrm{nm}^{3}$ ; radio $(3V/4\pi)^{1/3} = 1.7\,\mathrm{nm}$ . 4. Extendida, $150\times 0.36 = 54\,\mathrm{nm}$ frente a un diámetro de $3.4\,\mathrm{nm}$ : un factor de $16$ . 5. Los residuos helicoidales son el $75\,\%$ de la longitud extendida, $112\times 0.36 = 40\,\mathrm{nm}$ ; la hélice los comprime a $17\,\mathrm{nm}$ , un factor $0.36/0.15 = 2.4$ . 6. $40\times 4 = 160\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ganados, $150\times 0.9 = 135\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ perdidos: en neto, $\Delta G \approx -25\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , dentro del intervalo marginal. 7. $3^{150} \approx 4\times 10^{71}$ ; $4\times 10^{59}$ s $\approx 10^{52}$ años. 8. $10^{-2}\times 10^{12} = 10^{10}$ conformaciones, una fracción $3\times 10^{-62}$ del recuento. 9. Las hélices, en $1\,\text{µ}\mathrm{s}$ (en paralelo); los $8! = 40\,320$ empaquetamientos a $10^{6}$ por segundo tardan $40\,\mathrm{ms}$ : en total unos $40\,\mathrm{ms}$ , el orden de magnitud observado. Sí: resolver las partes por separado y luego el conjunto es un embudo — el espacio de búsqueda se factoriza, no se agota. 10. Ciclos esperados, $1/0.3 = 3.3$ , unos $33\,\mathrm{s}$ ; tras seis ciclos queda sin plegar $0.7^{6} = 0.12$ . 11. $\Delta G = -RT\ln K$ con $K = 10^{4} \to 10^{2}$ : de $-23.7$ a $-11.9\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , una pérdida de $12\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ de estabilidad ( $RT = 2.58\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , $\ln 100 = 4.6$ ). 12. La agregación empieza con un núcleo, cuya velocidad de formación sube como una potencia alta de la concentración de la especie desplegada propensa a agregarse; cien veces más de esa especie eleva varios órdenes de magnitud la probabilidad de que se forme una semilla dentro de una vida, y una vez que existe una semilla el crecimiento es rápido y se automoldea. 13. $\alpha = 100$ : $Y = 1.054\times 10^{8}/1.089\times 10^{8} = 0.97$ . $\alpha = 20$ : numerador $185\,220 + 103\,680 = 288\,900$ , denominador $194\,481 + 622\,080 = 816\,561$ : $Y = 0.35$ . 14. $\bar R = 1.041\times 10^{8}/1.089\times 10^{8} = 0.96$ en el pulmón; $194\,481/816\,561 = 0.24$ en el músculo. 15. $0.97 - 0.35 = 0.62$ de la capacidad descargada (dos tercios de la carga). Un solo sitio: $100/126 - 20/46 = 0.79 - 0.43 = 0.36$ . 16. Capacidad $150\times 1.34 = 200\,\mathrm{mL}/\mathrm{L}$ ; al músculo, $0.62\times 200 \approx 125\,\mathrm{mL}/\mathrm{L}$ . En reposo, $(0.97 - 0.78)\times 200 = 38\,\mathrm{mL}/\mathrm{L}$ ; $250/38 \approx 6.5\,\mathrm{L}/\mathrm{min}$ de flujo sanguíneo — el orden de un gasto cardíaco en reposo. 17. $L = 3\times 10^{6}$ , $\alpha = 40$ : numerador $2.76\times 10^{6} + 3.29\times 10^{6} = 6.05\times 10^{6}$ , denominador $2.83\times 10^{6} + 11.5\times 10^{6} = 14.4\times 10^{6}$ : $Y = 0.42$ en lugar de $0.78$ — mucho más oxígeno descargado en reposo, la adaptación de la sangre a la altitud y del músculo al trabajo. 18. Fetal, $L = 3\times 10^{4}$ , $\alpha = 30$ : numerador $893\,730 + 19\,770 = 913\,500$ , denominador $923\,520 + 85\,680 = 1\,009\,200$ : $Y = 0.91$ . Materna a la misma presión: numerador $893\,730 + 197\,730 = 1\,091\,460$ , denominador $923\,520 + 856\,830 = 1\,780\,350$ : $Y = 0.61$ . A igual presión la sangre fetal retiene más oxígeno, de modo que el oxígeno fluye de la madre al feto a través de la placenta. 19. $(10^{5}\,\text{nm}/6\,\text{nm})^{3} = 4.6\times 10^{12}$ celdas; $1.9\times 10^{13}$ moléculas. 20. $d = 0.1/(2\sin 14.5^{\circ}) = 0.20\,\mathrm{nm}$ : sí, todas las cadenas laterales y todos los átomos quedan situados. 21. $\sin\theta = 0.1/0.3$ , $\theta = 19.5{}^{\circ}$ . En un cristal desordenado las moléculas no están en registro exacto, las ondas dispersadas a ángulo alto — que codifican el detalle fino — ya no se suman en fase y las manchas se desvanecen a ángulo alto; solo sobreviven las manchas de baja resolución. 22. Reducir $d$ a la mitad exige el doble de señal y por tanto cuatro veces más partículas: unas $40\,000$ (más en la práctica, pues entran otros errores). 23. Las proteínas de membrana, que rara vez cristalizan a partir de disoluciones de detergente y pueden fotografiarse en un nanodisco lipídico; y los complejos grandes y flexibles — ribosomas, espliceosomas, canales iónicos con sus reguladores —, cuya heterogeneidad impide la cristalización pero cuyas partículas sí pueden ordenarse en clases conformacionales. 24. El hemo y el oxígeno unidos y su geometría exacta, el agua y los iones ordenados, la segunda conformación (T frente a R) y la prueba de que el plegamiento es correcto — una predicción es un único modelo sin ligando y sin comprobación experimental. 25. Se descarga $0.62$ de la capacidad (un solo sitio, $0.36$ ); el tiempo de Levinthal, unos $10^{52}$ años; y un mapa a $0.20\,\mathrm{nm}$ .

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