Biología universitaria — tercer año · Bachelor Year 3

1Cromatina y epigenética

Dos ratones de la misma camada, genéticamente idénticos hasta la última base, se sientan uno al lado del otro: uno es delgado y pardo, el otro gordo y amarillo, y acabará siendo diabético. Una gata carey lleva manchas naranjas y negras aunque todas las células de su piel llevan los mismos dos cromosomas X. Un niño hereda la misma pérdida de un trozo del cromosoma 15 que otro niño, y uno tiene el síndrome de Prader–Willi y el otro el de Angelman — la única diferencia es de qué progenitor venía la deleción. Nada de esto está escrito en la secuencia del ADN. Está escrito sobre ella: en la manera en que dos metros de ADN se empaquetan en un núcleo de diez micrómetros, en los pequeños grupos químicos unidos a las proteínas de empaquetamiento y a las propias citosinas, y en la maquinaria que copia esas marcas de una célula a sus hijas. Este capítulo trata de esa segunda capa de información, de sus portadores moleculares y de los límites honrados de lo que puede recordar.

1.1 La cromatina: el ADN sobre un carrete

Definición 1.1 (Nucleosoma y cromatina)

La cromatina es el complejo del ADN con proteínas en el que existe el genoma dentro de un núcleo eucariota. Su unidad repetida es el nucleosoma: $147\,\mathrm{bp}$ de ADN enrollados en $1.65$ vueltas levógiras alrededor de un octámero de histonas — dos copias de cada una de las proteínas pequeñas y muy básicas H2A, H2B, H3 y H4 —, seguidos de un enlazador de $20\text{ a }60\,\mathrm{bp}$ hasta el nucleosoma siguiente. Una quinta histona, H1, se une al enlazador donde entra y sale del núcleo de la partícula y ayuda a que las cuentas se apilen unas contra otras. Cada histona del núcleo lleva una cola amino-terminal desestructurada de unos $20\text{ a }40$ residuos que sobresale de la partícula. La cromatina que se tiñe débilmente, está poco condensada y se transcribe es la eucromatina; la cromatina densa, de replicación tardía y en gran parte silenciosa, en los centrómeros, los telómeros y las secuencias repetidas, es la heterocromatina.

Evidencia. Hewish y Burgoyne (1973) digirieron núcleos de hígado de rata con una nucleasa endógena y encontraron que el ADN no salía como una mancha continua sino como una escalera de fragmentos cuyas longitudes eran múltiplos de unos $200\,\mathrm{bp}$ : el ADN estaba protegido a intervalos regulares y solo se cortaba entre ellos. Kornberg (1974) demostró que la unidad protegida era una partícula de ocho histonas con unos $200\,\mathrm{bp}$ , y las micrografías electrónicas de cromatina extendida con suavidad mostraron las “cuentas de un collar”. Luger y colaboradores (1997) resolvieron la estructura cristalina de la partícula nuclear a $2.8\,\text{Å}$ : $147\,\mathrm{bp}$ y un octámero con las colas saliendo entre las vueltas del ADN. ∎

La fibra de 10\, nm: núcleos de nucleosoma (azul) sobre un ADN continuo (rojo), cada cuenta un octámero de histonas con sus colas (naranja) hacia fuera, y la histona enlazadora H1 (verde) en el punto de entrada y salida. Unos seis nucleosomas ocupan la longitud que tendrían 1200\, bp de ADN desnudo. — La fibra de $10\,\mathrm{nm}$ : núcleos de nucleosoma (azul) sobre un ADN continuo (rojo), cada cuenta un octámero de histonas con sus colas (naranja) hacia fuera, y la histona enlazadora H1 (verde) en el punto de entrada y salida. Unos seis nucleosomas ocupan la longitud que tendrían $1200\,\mathrm{bp}$ de ADN desnudo.

La cromatina a escala molecular: la doble hélice enrollada sobre núcleos de histonas sucesivos, las “cuentas de un collar” que reveló la escalera de la nucleasa.

Proposición 1.2 (Niveles de condensación)

La razón de empaquetamiento de una estructura de cromatina es la longitud del ADN que contiene dividida por la longitud de la estructura. El enrollamiento en la fibra de $10\,\mathrm{nm}$ da una razón de unos $6$ : los $68\,\mathrm{nm}$ de una repetición de $200\,\mathrm{bp}$ se comprimen en una sola cuenta de $11\,\mathrm{nm}$ . En el núcleo en interfase la fibra no se enrolla en otra fibra regular más gruesa, como la dibujaron los libros de texto durante mucho tiempo, sino que se pliega en bucles de decenas a centenares de kilobases sujetos por su base por complejos de cohesina en forma de anillo y por la proteína CTCF, que se une al ADN; los bucles se agrupan en dominios de asociación topológica (TAD) de aproximadamente una megabase, dentro de los cuales un gen se encuentra con sus reguladores mucho más a menudo que con nada de fuera. Un cromosoma mitótico, el estado más condensado, tiene una razón de empaquetamiento cercana a $10\,000$ : los $4\,\mathrm{cm}$ de ADN de un cromosoma humano medio se pliegan en un bastón de $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Ejemplo 1.3 (Dos metros en diez micrómetros)

Un núcleo humano diploide contiene $6.4\times 10^{9}$ pares de bases. A $0.34\,\mathrm{nm}$ por par de bases eso son $2.2\,\mathrm{m}$ de doble hélice, en un núcleo de unos $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ de diámetro. Se empaquetan en $6.4\times 10^{9}/200 \approx 3.2\times 10^{7}$ nucleosomas, cada uno con unos $108\,\mathrm{kDa}$ de histona frente a $96\,\mathrm{kDa}$ de ADN ( $147\,\mathrm{bp}$ a $650\,\mathrm{Da}$ por par): el núcleo contiene aproximadamente tanta histona como ADN en masa. El propio ADN, tratado como un cilindro de $2\,\mathrm{nm}$ de diámetro, ocupa un volumen de solo unos $7\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , un $1\,\%$ de un núcleo esférico de radio $5\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; el problema del empaquetamiento es de enredo y de acceso, no de espacio.

1.2 El código de histonas

Definición 1.4 (Modificaciones de las histonas)

Los residuos de las colas de las histonas se modifican covalentemente: acetilación de las lisinas (que neutraliza su carga positiva y afloja la sujeción del ADN), metilación de lisinas y argininas (uno, dos o tres grupos metilo, sin cambio de carga), fosforilación de serinas, ubiquitinación de lisinas. Una modificación se nombra por histona, residuo y grupo: H3K4me3 es la histona H3, lisina 4, trimetilada; H3K27ac es la H3 con la lisina 27 acetilada. El código de histonas es la correlación entre las combinaciones de marcas y el estado del gen subyacente: H3K4me3 y H3K27ac en los promotores y los potenciadores activos, H3K36me3 a lo largo de los cuerpos de los genes transcritos, H3K9me3 en la heterocromatina constitutiva, H3K27me3 en los genes silenciados durante el desarrollo. Las enzimas que añaden una marca son escritores (histona-acetiltransferasas, HAT; metiltransferasas), las que la quitan son borradores (histona-desacetilasas, HDAC; desmetilasas), y las proteínas que se unen a una marca y actúan a partir de ella son lectores: un bromodominio une acetil-lisina, y un cromodominio, metil-lisina.

Proposición 1.5 (Las marcas se leen, no solo se sienten)

La acetilación actúa en parte por electrostática — una cola acetilada sujeta su ADN con menos fuerza y la fibra se abre —, pero la mayoría de las marcas actúan reclutando lectores. La H3K9me3 la une el cromodominio de la proteína de heterocromatina HP1, que dimeriza, tiende un puente entre nucleosomas vecinos y recluta a la mismísima metiltransferasa (SUV39H) que escribe H3K9me3 en el nucleosoma siguiente: la marca se propaga a lo largo de la fibra hasta encontrar un límite y condensa lo que cubre. La H3K27me3 la escribe el complejo represivo Polycomb 2 (PRC2, subunidad catalítica EZH2), la lee PRC1, que ubiquitina la H2A y condensa la fibra, y el complejo es a su vez estimulado por la marca que produce; el grupo de proteínas Trithorax escribe la marca opuesta, H3K4me3, y mantiene activos los genes del desarrollo propios de un tipo celular dado. Cada uno de estos bucles — un lector que recluta a un escritor — es una retroalimentación positiva que permite a un estado mantenerse una vez establecido, que es lo que necesita una marca heredable.

La lógica escritor–lector–borrador. Un lector unido a una marca en un nucleosoma recluta al escritor que pone la misma marca en el siguiente, de modo que el estado se propaga y se copia a sí mismo; los borradores se oponen. Los grupos acetilo (verde) abren la fibra; la H3K9me3 (rojo) la cierra.

Método 1.6 (Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP))

Para cartografiar dónde se sitúa una marca o una proteína en el genoma: (1) se entrecruzan las proteínas con el ADN en células vivas con formaldehído; (2) se fragmenta la cromatina en trozos de unos pocos centenares de pares de bases; (3) se precipitan los fragmentos con un anticuerpo contra la marca (por ejemplo H3K27me3) unido a bolas; (4) se revierten los entrecruzamientos y se purifica el ADN; (5) se secuencia (ChIP-seq) y se cuentan las lecturas a lo largo del genoma: los picos son los lugares donde estaba la marca. Un control de ADN de partida sin anticuerpo fija el fondo. La resolución es la de los fragmentos, de aproximadamente un nucleosoma.

Observación 1.7 (Código o correlación)

La palabra “código” exagera. Muchas marcas son consecuencia de la transcripción más que causa suya (la H3K36me3 la deposita una metiltransferasa que viaja con la polimerasa), y quitar un escritor cambia la expresión mucho menos de lo que sugiere la distribución de la marca. Lo que sí está bien establecido es que unas pocas marcas — H3K9me3, H3K27me3 y la metilación del ADN que sigue — llevan un silenciamiento que se propaga solo y sobrevive a la señal que lo inició.

1.3 La metilación del ADN y la copia de una marca

Definición 1.8 (Metilación del ADN)

En los vertebrados se añade un grupo metilo al carbono 5 de la citosina casi solo en el dinucleótido CpG (una C seguida de una G en la misma hebra), una secuencia que es su propio complemento, de modo que un CpG metilado suele estarlo en ambas hebras. Entre el $70\text{ a }80\,\%$ de los CpG de una célula humana están metilados, y los promotores metilados están silenciosos: los grupos metilo los leen proteínas de unión a CpG metilado (MeCP2, MBD1–4) que reclutan HDAC y metilasas de H3K9, y además bloquean directamente a varios factores de transcripción. La excepción son las islas CpG, tramos de alrededor de una kilobase, ricos en G y C y en CpG, que se sitúan en los promotores de la mayoría de los genes constitutivos y permanecen sin metilar en las células normales. El grupo metilo lo escriben las ADN-metiltransferasas: DNMT3A y DNMT3B llevan a cabo la metilación de novo de los sitios no metilados, y DNMT1, que prefiere un CpG hemimetilado — una hebra metilada y la otra no —, realiza la metilación de mantenimiento detrás de la horquilla de replicación. La eliminación es pasiva, por replicación sin mantenimiento, o activa, por las enzimas TET, que oxidan la 5-metilcitosina a 5-hidroximetilcitosina y más allá hasta que la reparación por escisión de bases la sustituye por una citosina normal.

Ejemplo 1.9 (Por qué el genoma es pobre en CpG)

El genoma humano tiene un $42\,\%$ de G $+$ C, de modo que si las bases fueran independientes un CpG aparecería con una frecuencia de $0.21\times 0.21 \approx 0.044$ , unas $2.8\times 10^{8}$ veces en el genoma diploide. El número observado es de unos $5.6\times 10^{7}$ , la quinta parte. La razón es la propia marca: una citosina metilada que pierde su grupo amino se convierte en timina, una base normal que la reparación no puede reconocer como errónea, mientras que una citosina sin metilar se desamina a uracilo, que sí se escinde. A lo largo del tiempo evolutivo los CpG metilados han mutado a TpG y CpA, y solo las islas sin metilar han conservado sus CpG. La marca ha dejado su firma en la secuencia.

Teorema 1.10 (Mantenimiento de un estado de metilación a lo largo de las divisiones)

Considérese un solo sitio CpG, seguido a lo largo de un linaje de células. En cada división la citosina de la hebra nueva se metila con probabilidad $\mu$ si la citosina de la hebra molde está metilada (eficiencia de mantenimiento) y con probabilidad $\delta$ si no lo está (tasa de novo). Sea $p_{n}$ la probabilidad de que el sitio esté metilado después de $n$ divisiones. Entonces

p_{n+1} = \mu\, p_{n} + \delta\,(1 - p_{n}), \qquad p_{n} = p^{*} + (p_{0} - p^{*})\,(\mu - \delta)^{n}, \qquad p^{*} = \frac{\delta}{1 - \mu + \delta}.

Todo sitio deriva hacia el mismo equilibrio $p^{*}$ , sea cual sea su estado de partida, y la memoria del estado inicial decae geométricamente con razón $\mu - \delta$ . Una marca se recuerda durante unas $1/(1 - \mu + \delta)$ divisiones; la memoria fiel de una diferencia entre sitios exige por tanto un $\mu$ muy próximo a $1$ y un $\delta$ muy próximo a $0$ , o bien una retroalimentación que haga depender $\mu$ y $\delta$ del estado del vecindario.

Demostración. La recurrencia es la ley de la probabilidad total sobre los dos estados de la hebra molde. Su punto fijo resuelve $p^{*} = \mu p^{*} + \delta(1 - p^{*})$ , lo que da $p^{*}(1 - \mu + \delta) = \delta$ . Restando la ecuación del punto fijo de la recurrencia, $p_{n+1} - p^{*} = (\mu - \delta)(p_{n} - p^{*})$ , que iterado da la forma cerrada. Como $0 \le \delta \le \mu \le 1$ , la razón $\mu - \delta$ está en $[0,1]$ y la desviación se encoge; se reduce a la mitad cada $\ln 2 / (-\ln(\mu - \delta)) \approx \ln 2/(1 - \mu + \delta)$ divisiones cuando $\mu - \delta$ está cerca de $1$ . ∎

Ejemplo 1.11 (Números)

Los valores medidos en células de mamífero son $\mu \approx 0.99$ y $\delta \approx 0.02$ por división en un CpG típico. Entonces $p^{*} = 0.02/0.03 \approx 0.67$ , próximo a la fracción metilada de todo el genoma, y $\mu - \delta = 0.97$ : un sitio completamente metilado dejado a solas con la maquinaria estaría a medio camino de la media tras $\ln 2 / 0.03 \approx 23$ divisiones. Un promotor silenciado que siga silencioso durante los centenares de divisiones de una vida necesita por tanto algo más que la DNMT1: los lectores de CpG metilado reclutan metilación de H3K9 y los lectores de H3K9 reclutan a DNMT3, de manera que una isla densa de marcas eleva su propio $\mu$ hacia $1$ y baja el $\delta$ de al lado hacia $0$ . A la inversa, una célula que pierde la DNMT1 pierde la marca de forma pasiva: con $\mu = \delta = 0$ la fracción de hebras metiladas se reduce a la mitad en cada división.

Izquierda: la metilación de mantenimiento. Tras la replicación todo CpG queda hemimetilado; la DNMT1 copia la marca en la hebra nueva con probabilidad por sitio. Derecha: el destino de un sitio a lo largo de las divisiones para = 0.99, = 0.02 (en azul desde metilado, en rojo desde sin metilar) — ambos convergen en p* = 0.67 — y para un sitio cuya retroalimentación vecinal eleva a 0.999 (verde). — Izquierda: la metilación de mantenimiento. Tras la replicación todo CpG queda hemimetilado; la DNMT1 copia la marca en la hebra nueva con probabilidad $\mu$ por sitio. Derecha: el destino de un sitio a lo largo de las divisiones para $\mu = 0.99$ , $\delta = 0.02$ (en azul desde metilado, en rojo desde sin metilar) — ambos convergen en $p^{*} = 0.67$ — y para un sitio cuya retroalimentación vecinal eleva $\mu$ a $0.999$ (verde).

Método 1.12 (Leer la metilación: la secuenciación con bisulfito)

La secuenciación por sí sola no ve un grupo metilo. Trátese el ADN desnaturalizado con bisulfito de sodio: la citosina sin metilar se desamina a uracilo, que se lee como T después de la PCR, mientras que la 5-metilcitosina queda protegida y sigue leyéndose como C. Secúnciese el ADN convertido y compárese con la referencia: toda C que siga siendo C estaba metilada, y toda C que se haya vuelto T no lo estaba. Hecho a escala de todo el genoma (secuenciación con bisulfito del genoma completo), esto da el estado de metilación de cada uno de los $2.8\times 10^{7}$ CpG de un genoma haploide con resolución de una sola base, como fracción de las células de la muestra.

1.4 Inactivación del X e impronta genómica

Definición 1.13 (Inactivación del cromosoma X)

En las hembras de mamífero uno de los dos cromosomas X de cada célula somática se silencia transcripcionalmente al principio del desarrollo, una forma de compensación de dosis que iguala la expresión de los genes ligados al X entre las hembras XX y los machos XY. El cromosoma silenciado se condensa en un cuerpo denso pegado a la envoltura nuclear, el corpúsculo de Barr. La elección de qué X se silencia es aleatoria en el embrión propiamente dicho y, una vez hecha, la heredan clonalmente todas las descendientes de la célula. La inactivación la inicia Xist, un ARN no codificante de $17\,\mathrm{kb}$ transcrito desde el centro de inactivación del X del cromosoma que va a ser silenciado: recubre ese cromosoma en cis, recluta a Polycomb (H3K27me3), la variante de histona macroH2A y finalmente la metilación del ADN de los promotores, y a partir de ahí el silencio se mantiene sin que haga falta Xist en cada división. Alrededor del $15\,\%$ de los genes humanos ligados al X escapan a la inactivación, en parte o del todo.

Evidencia. Barr y Bertram (1949) advirtieron un cuerpo denso en los núcleos de las neuronas de gata pero no en las de gato. Ohno (1959) demostró que era un cromosoma X entero, condensado. Lyon (1961) juntó las piezas: las ratonas heterocigóticas para genes de color del pelaje ligados al X tienen un pelaje en mosaico, con manchas que expresan un alelo o el otro, de modo que cada mancha es un clon en el que un X, siempre el mismo, está silencioso; lo mismo vale para las manchas naranjas y negras de una gata carey, cuyo gen naranja está ligado al X, y para las glándulas sudoríparas en mosaico de las mujeres portadoras de un alelo mutante de un gen ligado al X. Un gato carey macho es casi siempre XXY. ∎

Izquierda: un núcleo femenino teñido para el ADN, con el X inactivo compacto — el corpúsculo de Barr — apretado contra el borde nuclear. Derecha: una gata carey. Cada mancha naranja o negra es un clon de células de la piel que silenciaron el mismo cromosoma X; el blanco se debe a otro gen distinto, autosómico, de moteado.

Definición 1.14 (Impronta genómica)

Un gen está improntado cuando solo se expresa uno de sus dos alelos, y cuál de ellos depende del progenitor del que venga: algunos genes se expresan solo desde la copia paterna y otros solo desde la materna. Los mamíferos tienen entre $100\text{ a }200$ genes improntados, agrupados, y cada agrupamiento lo gobierna una región de control de la impronta (ICR) que está metilada en uno de los alelos parentales y no en el otro. La metilación se establece en la línea germinal — un patrón en el espermatozoide y otro en el óvulo —, se borra en las células germinales de la generación siguiente y se vuelve a poner según el sexo de ese individuo. Un niño que recibe las dos copias de un cromosoma del mismo progenitor (disomía uniparental) tiene por tanto una dosis equivocada de los genes improntados que lleva, aunque su secuencia sea del todo normal.

Evidencia. McGrath y Solter, e independientemente Surani, Barton y Norris (1984), hicieron cigotos de ratón con dos pronúcleos maternos, o con dos paternos, transfiriendo pronúcleos entre huevos fecundados. Ninguno de los dos tipos llegó a término, aunque cada uno tenía dos juegos completos de cromosomas: los embriones ginogenéticos formaban un embrión razonable con una placenta pobre, y los androgenéticos una placenta grande y casi ningún embrión. Los dos genomas parentales no son equivalentes y ambos son necesarios. Cattanach y Kirk (1985) demostraron, con disomías uniparentales de cromosomas concretos, que la no equivalencia se limita a regiones concretas de cromosomas concretos, que son donde más tarde se encontraron los agrupamientos improntados. ∎

Ejemplo 1.15 (El agrupamiento Igf2–H19)

Igf2, un factor de crecimiento fetal, se expresa desde el alelo paterno; su vecino H19, un ARN no codificante, desde el materno. Entre ambos está la ICR y, más allá de H19, un conjunto compartido de potenciadores. En el cromosoma materno la ICR no está metilada y une CTCF, que actúa como aislante: los potenciadores pueden alcanzar a H19 pero no a Igf2. En el cromosoma paterno la ICR está metilada (se fijó en el espermatozoide), CTCF no puede unirse y los potenciadores alcanzan a Igf2; la metilación se extiende además hasta silenciar el promotor de H19. Una sola marca, puesta en una sola línea germinal, decide los dos genes.

La impronta en Igf2–H19. Alelo materno: la ICR sin metilar une CTCF, un aislante, de modo que los potenciadores de aguas abajo solo activan H19. Alelo paterno: la ICR se metiló en el espermatozoide, CTCF no puede unirse, los potenciadores alcanzan a Igf2 y la metilación silencia H19. — La impronta en *Igf2*–*H19*. Alelo materno: la ICR sin metilar une CTCF, un aislante, de modo que los potenciadores de aguas abajo solo activan *H19*. Alelo paterno: la ICR se metiló en el espermatozoide, CTCF no puede unirse, los potenciadores alcanzan a *Igf2* y la metilación silencia *H19*.

Ejemplo 1.16 (Prader–Willi y Angelman)

La misma deleción de unos $5\,\mathrm{Mb}$ en el cromosoma 15 (región 15q11–q13) causa el síndrome de Prader–Willi — hipotonía muscular al nacer y después apetito insaciable y obesidad — cuando está en el cromosoma paterno, y el síndrome de Angelman — discapacidad intelectual grave, ausencia de habla, un porte risueño y convulsiones — cuando está en el materno. La región lleva genes de expresión paterna (SNRPN y un agrupamiento de ARN pequeños) cuya única copia activa se pierde en el primer caso, y el gen de expresión materna UBE3A, que se pierde en el segundo. La disomía uniparental materna del 15, sin deleción ninguna, da también un Prader–Willi: dos copias maternas, silenciosas para los genes paternos.

Observación 1.17 (Por qué improntar)

Los genes improntados están enriquecidos en el control del crecimiento fetal y del transporte de nutrientes por la placenta, y los de expresión paterna (Igf2, Peg3) tienden a favorecer el crecimiento mientras que los de expresión materna (H19, Igf2r, Cdkn1c) tienden a frenarlo. La teoría del parentesco lee esto como un conflicto: los genes de un padre ganan extrayendo más de una madre que quizá lleve más tarde crías de otros machos, mientras que los de la madre ganan racionando entre todas sus camadas. La impronta se da en los mamíferos placentarios y en las plantas con flor, cuyo endospermo también lo alimenta la madre, y no en las aves ni en los reptiles, que es lo que predice la teoría.

1.5 La herencia epigenética y sus límites

Definición 1.18 (Epigenética)

La epigenética es el estudio de los cambios heredables de la actividad génica que no son cambios de la secuencia del ADN: estados llevados por la metilación del ADN, por las marcas de histonas o por circuitos autosostenidos de factores de transcripción, y copiados a través de la división celular. Dos alelos de secuencia idéntica pero de estado epigenético estable distinto son epialelos. La herencia a través de la mitosis es la regla y es lo que hace que una célula diferenciada siga diferenciada. La herencia a través de la meiosis, de padres a hijos, es la excepción en los mamíferos, porque las marcas se borran en dos oleadas de reprogramación: en las células germinales primordiales, donde se barren las improntas y casi toda la metilación para volver a fijarlas según el sexo, y otra vez en el cigoto y el embrión temprano, donde el genoma paterno se desmetila activamente por TET3 y el materno de forma pasiva, antes de que DNMT3 establezca los patrones propios del embrión.

Ejemplo 1.19 (El ratón agutí viable amarillo)

En el alelo $A^{vy}$ un retrotransposón se ha insertado aguas arriba del gen de color del pelaje agouti. Donde el promotor del transposón no está metilado, dirige la expresión constante de agouti en todas las células; el ratón es amarillo, obeso y propenso a la diabetes. Donde está metilado, el gen sigue su control normal y el ratón es pardo (“seudoagutí”). Hermanos de camada genéticamente idénticos se reparten por todo el espectro, y una madre amarilla tiene más crías amarillas que una parda: el epialelo se borra de forma incompleta a través de la línea germinal materna. Waterland y Jirtle (2003) alimentaron a madres $A^{vy}$ preñadas con una dieta rica en donadores de metilo (folato, vitamina B₁₂, colina, betaína) y desplazaron el pelaje de las crías hacia el pardo. El ambiente de una generación había fijado una marca que llevó la siguiente.

Dos hermanos de camada Avy de genotipo idéntico: un ratón amarillo y obeso en el que el transposón situado aguas arriba de agouti no está metilado y un seudoagutí pardo en el que sí lo está. — Dos hermanos de camada $A^{vy}$ de genotipo idéntico: un ratón amarillo y obeso en el que el transposón situado aguas arriba de *agouti* no está metilado y un seudoagutí pardo en el que sí lo está.

Proposición 1.20 (Dónde se encuentran estados epigenéticos heredables)

Tres sistemas bien analizados ilustran los mecanismos anteriores. La variegación por efecto de posición en Drosophila: un gen que una reorganización cromosómica traslada junto a heterocromatina queda silenciado en unas células y no en otras, lo que da un ojo moteado; cada mancha es un clon, el silenciamiento se propaga desde la heterocromatina por el bucle de HP1, y los genes cuya mutación suprime la variegación (los genes Su(var)) son HP1 y la metiltransferasa de H3K9. La vernalización en Arabidopsis: semanas de frío invernal silencian el represor de la floración FLC mediante la H3K27me3 depositada por Polycomb, el silencio aguanta meses de crecimiento primaveral y miles de divisiones celulares, y se restablece en cada generación, de modo que cada planta ha de pasar su propio invierno. La paramutación en el maíz: un alelo del gen de pigmentación b1, cuando se encuentra con otro alelo determinado en un heterocigoto, lo convierte a su propio estado silencioso, y el alelo convertido transmite el estado a sus descendientes durante generaciones, mediante una metilación dirigida por ARN pequeños que se retoma en Capítulo 2. En cada caso la herencia es mitótica y robusta; la transmisión entre generaciones o bien se restablece activamente (plantas) o bien es parcial y con fugas (ratones).

Observación 1.21 (Los límites de las afirmaciones transgeneracionales)

Las afirmaciones de que los nietos humanos heredan “epigenéticamente” la hambruna o el estrés de un abuelo son frecuentes y en su mayor parte no están demostradas. Entre una marca somática y un nieto median dos oleadas de borrado; los genes improntados y unos pocos transposones son los únicos supervivientes documentados del borrado en los mamíferos; y en las cohortes humanas los efectos de un ambiente compartido, del ambiente uterino y de las diferencias genéticas son difíciles de separar de una marca llevada en la línea germinal. Los casos demostrados — el $A^{vy}$ , algunos epialelos ligados a transposones, los estados mediados por ARN en gusanos y plantas — son reales, están entendidos molecularmente y son estrechos. El teorema del capítulo dice por qué: sin una retroalimentación que empuje $\mu$ hacia $1$ , una marca se olvida a sí misma en unas pocas docenas de divisiones, y la línea germinal añade encima un borrado activo.

1.6 Ejercicios

Ejercicio 1.1 ★

Dese la composición de una partícula nuclear de nucleosoma, la longitud de ADN que une y la longitud típica del enlazador. ¿Por qué la digestión de la cromatina con nucleasa dio una escalera de fragmentos y no una mancha continua?

Solución

Solución de Ejercicio 1.1.

Dos copias de cada una de H2A, H2B, H3 y H4 (un octámero) con $147\,\mathrm{bp}$ de ADN en $1.65$ vueltas; enlazadores de $20\text{ a }60\,\mathrm{bp}$ , lo que da una repetición cercana a $200\,\mathrm{bp}$ . La nucleasa corta solo el ADN enlazador expuesto, nunca dentro de un núcleo, así que todo fragmento es un número entero de repeticiones: una escalera de $200$ , $400$ y $600\,\mathrm{bp}$ , no una mancha continua.

Ejercicio 1.2 ★

Un genoma de rana tiene $3.0\times 10^{9}$ pares de bases por juego haploide. ¿Cuántos nucleosomas contiene un núcleo diploide, tomando una repetición de $190\,\mathrm{bp}$ , y qué longitud tiene su ADN?

Solución

Solución de Ejercicio 1.2.

Diploide: $6.0\times 10^{9}$ bp; $6.0\times 10^{9}/190 \approx 3.2\times 10^{7}$ nucleosomas; longitud $6.0\times 10^{9}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 2.0\,\mathrm{m}$ .

Ejercicio 1.3 ★

Descífrense H3K27me3, H4K16ac y H3S10ph. Dígase para cada una si se asocia a cromatina activa o silenciosa, y nómbrese un lector de la primera.

Solución

Solución de Ejercicio 1.3.

H3K27me3: histona H3, lisina 27, trimetilada — cromatina silenciosa de genes reprimidos durante el desarrollo, escrita por PRC2 y leída por las proteínas con cromodominio de PRC1. H4K16ac: H4, lisina 16, acetilada — cromatina activa y abierta (rompe un contacto entre nucleosomas). H3S10ph: H3, serina 10, fosforilada — una marca mitótica asociada a la condensación de los cromosomas (y, de forma transitoria, a la activación génica por algunas señales); no es una marca estable de silenciamiento ni de activación.

Ejercicio 1.4 ★

Explíquese por qué una gata carey es casi siempre hembra, y qué tiene que ser un carey macho.

Solución

Solución de Ejercicio 1.4.

El gen naranja está ligado al X y tiene un alelo naranja y otro negro; un pelaje con manchas necesita uno de cada, en dos cromosomas X distintos, de los cuales se silencia uno por célula. Un macho tiene un solo X y es naranja o negro por entero. Un carey macho lleva dos cromosomas X y un Y (XXY), y es estéril.

Ejercicio 1.5 ★★

Calcúlese la razón de empaquetamiento de la fibra de $10\,\mathrm{nm}$ a partir de los números de Definición 1.1 (repetición $200\,\mathrm{bp}$ , cuenta $11\,\mathrm{nm}$ ), y la razón necesaria para meter los $4\,\mathrm{cm}$ de ADN de un cromosoma humano medio en una cromátida mitótica de $4\,\text{µ}\mathrm{m}$ . ¿Por qué factor adicional debe plegarse la fibra?

Solución

Solución de Ejercicio 1.5.

$200\,\mathrm{bp}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 68\,\mathrm{nm}$ por cuenta de $11\,\mathrm{nm}$ : razón $6.2$ . Necesaria: $4\,\mathrm{cm}/4\,\text{µ}\mathrm{m} = 10^{4}$ . Plegamiento adicional por $10^{4}/6.2 \approx 1600$ .

Ejercicio 1.6 ★★

En el modelo de Teorema 1.10 con $\mu = 0.98$ y $\delta = 0.01$ , hállense $p^{*}$ y el número de divisiones tras las cuales un sitio que empezó metilado ha perdido la mitad de su exceso sobre $p^{*}$ . Repítase para $\mu = 0.999$ , $\delta = 0.001$ .

Solución

Solución de Ejercicio 1.6.

$\mu = 0.98$ , $\delta = 0.01$ : $p^{*} = 0.01/0.03 = 0.33$ ; razón $\mu - \delta = 0.97$ ; semivida $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ divisiones. $\mu = 0.999$ , $\delta = 0.001$ : $p^{*} = 0.5$ ; razón $0.998$ ; semivida $\ln 2 / 0.002 \approx 350$ divisiones.

Ejercicio 1.7 ★★

Un experimento de ChIP-seq en células de hígado da un pico de H3K4me3 y un pico de H3K27ac en el promotor del gen $A$ , un dominio ancho de H3K27me3 sobre el gen $B$ y H3K9me3 sobre el gen $C$ . Predígase el estado transcripcional de cada uno, y dígase cuál de $B$ y $C$ tiene más probabilidades de encenderse en otro tipo celular, y por qué.

Solución

Solución de Ejercicio 1.7.

$A$ : activo (promotor con H3K4me3 y acetilación). $B$ : silencioso, reprimido por Polycomb — heterocromatina facultativa, el estado de un gen del desarrollo apagado en este linaje pero usado en otros, de modo que $B$ es el que probablemente esté activo en otro tipo celular. $C$ : silencioso, heterocromatina constitutiva (vía de HP1), típicamente repeticiones o genes silenciados en todos los tipos celulares.

Ejercicio 1.8 ★★

Una mujer lleva una deleción de la región de UBE3A en uno de sus cromosomas 15 pero está sana. Su padre llevaba la misma deleción y también estaba sano. ¿Qué síndrome, si alguno, corre el riesgo de tener cada uno de sus hijos, y con qué probabilidad? ¿Y si la deleción le hubiera venido de su madre?

Solución

Solución de Ejercicio 1.8.

UBE3A solo se expresa desde el alelo materno en las neuronas. Su deleción le vino de su padre, en el alelo que de todos modos está silencioso, así que ella está sana; cuando la transmita, pasará a ser una deleción materna: cada hijo tiene probabilidad $1/2$ de heredarla y entonces tiene el síndrome de Angelman. Si la deleción le hubiera venido de su madre, ella misma tendría el síndrome de Angelman; una portadora sana solo puede haberla heredado por vía paterna. (Una deleción paterna de toda la región daría un Prader–Willi; UBE3A sola no basta.)

Ejercicio 1.9 ★★

Predígase la consecuencia, en un embrión de ratón hembra, de suprimir el gen Xist de uno de los cromosomas X; y de los dos. Predígase qué le hace a un autosoma un transgén de Xist insertado en él.

Solución

Solución de Ejercicio 1.9.

Un X sin Xist no puede inactivarse, así que el otro X se silencia en todas las células: la inactivación es completa pero ya no aleatoria (sesgada), y el embrión es viable. Los dos X sin Xist: no hay inactivación, dos X activos, expresión doble de los genes ligados al X, y el embrión hembra muere pronto. Un transgén de Xist en un autosoma recubre ese autosoma en cis y silencia sus genes, lo que provoca la pérdida de función de una copia autosómica — el experimento que mostró que Xist basta para silenciar en cis.

Ejercicio 1.10 ★★★

Explíquese, con Ejemplo 1.9, por qué las islas CpG han conservado sus CpG mientras que el resto del genoma ha perdido cuatro quintas partes de los suyos, y qué implica esto sobre el estado de metilación de las islas en la línea germinal a lo largo del tiempo evolutivo. ¿Por qué falla el argumento para un gen metilado solo en el hígado?

Solución

Solución de Ejercicio 1.10.

Las citosinas metiladas se desaminan a timina, que la reparación no reconoce, de modo que un CpG metilado muta a TpG o CpA a alta velocidad. Solo las secuencias que están sin metilar en la línea germinal, generación tras generación, conservan sus CpG; las islas han conservado los suyos, luego han estado sin metilar en la línea germinal durante casi toda la historia de los vertebrados. Un gen metilado solo en el hígado está sin metilar en el espermatozoide y el óvulo; las mutaciones que surgen en las células hepáticas no se heredan, así que la metilación somática no deja huella en la secuencia.

Ejercicio 1.11 ★★★

Muéstrese, con el bucle escritor–lector de Proposición 1.5, cómo un dominio de H3K9me3 puede ser estable a través de la replicación aunque cada división diluya al doble las histonas marcadas con otras nuevas sin marcar. ¿Qué determina dónde deja de propagarse el dominio? Propóngase un experimento que ponga a prueba la explicación.

Solución

Solución de Ejercicio 1.11.

En la replicación las histonas viejas, marcadas, se reparten entre los dos dúplex hijos y se intercalan con otras nuevas sin marcar, de modo que cada dominio hijo está marcado a medias. HP1 unido a un nucleosoma marcado retenido recluta a SUV39H, que metila a los vecinos sin marcar; mientras los nucleosomas marcados sean lo bastante densos como para llevar un escritor a cada hueco, el dominio se rellena antes de la división siguiente — la misma retroalimentación que el $\mu$ alto del teorema. La propagación se detiene en los límites: proteínas aislantes (CTCF), genes muy transcritos y genes de ARNt, nucleosomas con marcas activas incompatibles (H3K4me3, acetilación) que el escritor no puede usar, y el punto en que los borradores (desmetilasas, recambio por HDAC) adelantan al escritor. Prueba: recluir HP1 de forma transitoria a un gen indicador (una fusión con un dominio de unión al ADN cuya unión se controla con un fármaco), soltarlo y seguir el silencio del indicador y la H3K9me3 a lo largo de las divisiones; se predice una persistencia que depende del escritor, y su pérdida si se mutan el escritor o la dimerización del lector, o si se coloca un aislante dentro del dominio.

Ejercicio 1.12 ★★★

Un estudio informa de que los nietos de personas que pasaron una hambruna tienen alterada la metilación de un gen del crecimiento y una masa corporal mayor. Enumérense las explicaciones alternativas que hay que excluir antes de concluir que se transmitió una marca de metilación por la línea germinal, y dígase qué experimento en ratones zanjaría la cuestión.

Solución

Solución de Ejercicio 1.12.

Hay que excluir: un ambiente compartido (la dieta y la pobreza de los propios nietos); un efecto uterino — la hija de la madre expuesta a la hambruna era un feto, con sus células germinales ya presentes, de modo que la línea germinal del nieto quedó expuesta directamente y el efecto no es transgeneracional —; las diferencias genéticas entre las familias que sobrevivieron y las que no; la causalidad inversa (la propia masa corporal altera la metilación en la sangre); las diferencias de composición celular de la sangre; y las pruebas múltiples sobre muchos CpG. Experimento en ratones: expónganse machos F $_0$ consanguíneos (sin vía uterina), críense con hembras no expuestas o mediante fecundación in vitro y transferencia de embriones, y sígase a F $_2$ y F $_3$ por vía paterna, midiendo la metilación en el esperma de cada generación; una marca que persiste en el esperma y el fenotipo de F $_3$ , en una cepa sin variación genética, es transmisión por la línea germinal.

1.7 Problema: la memoria de un gen silenciado

Problema 1.1

Problema de fin de semana — un genoma humano empaquetado en su núcleo, una marca de metilación seguida a lo largo de las divisiones, una gata carey leída como un mapa clonal y las enfermedades de una región improntada contadas, hasta llegar al número de divisiones que sobrevive una marca sin retroalimentación y al tamaño de la población celular que eligió su X

Datos: un núcleo humano diploide contiene $6.4\times 10^{9}$ pares de bases, a $0.34\,\mathrm{nm}$ y $650\,\mathrm{Da}$ por par; la repetición del nucleosoma es de $200\,\mathrm{bp}$ , un octámero de histonas pesa $108\,\mathrm{kDa}$ y una partícula nuclear es un disco de $11\,\mathrm{nm}$ de diámetro y $5.5\,\mathrm{nm}$ de espesor. El núcleo es una esfera de $10\,\text{µ}\mathrm{m}$ de diámetro. El genoma tiene un $42\,\%$ de G $+$ C. Metilación en un CpG corriente: $\mu = 0.99$ , $\delta = 0.02$ por división.

Parte I — Empaquetamiento.

Calcúlense la longitud total del ADN del núcleo y el número de nucleosomas.
Calcúlense la masa total de histona (solo octámeros) y la de ADN, en picogramos ( $1\,\mathrm{Da} = 1.66 \times 10^{-24}\,\mathrm{g}$ ).
Calcúlense el volumen del núcleo y el volumen total de las partículas nucleares, tratadas como cilindros. ¿Qué fracción del núcleo llenan?
Si los nucleosomas se pusieran uno tras otro como una fibra de $10\,\mathrm{nm}$ , ¿qué longitud tendría la fibra y cuál es la razón de empaquetamiento respecto al ADN desnudo?
La fibra se pliega en bucles de $200\,\mathrm{kb}$ anclados por cohesina. ¿Cuántos bucles, y cuántos nucleosomas por bucle?
Bajo la hipótesis de independencia, ¿cuántos dinucleótidos CpG contendría el genoma diploide? El número observado es $5.6\times 10^{7}$ . ¿Qué fracción se ha perdido, y por qué mecanismo mutacional?

Parte II — Una marca a lo largo de las divisiones.

Escríbase la recurrencia de $p_{n}$ y calcúlese $p^{*}$ .
Un CpG de promotor está completamente metilado en $n = 0$ . Calcúlese $p_{n}$ tras $10$ , $50$ y $200$ divisiones.
¿Al cabo de cuántas divisiones se ha reducido a la mitad el exceso $p_{n} - p^{*}$ ? Una célula madre de un tejido se divide una vez por semana: ¿cuántos años son?
Un fármaco inhibe por completo la DNMT1 ( $\mu = 0$ ) y también la DNMT3 ( $\delta = 0$ ). Muéstrese que la fracción de hebras metiladas de la población se reduce a la mitad en cada división, y hállese el número de divisiones para bajar de un $80\,\%$ de metilación a menos de un $5\,\%$ .
En una isla silenciada los lectores de CpG metilado reclutan metilación de H3K9, que recluta a DNMT3, de modo que dentro de la isla $\mu = 0.9995$ y $\delta = 0.0005$ . Recalcúlese la semivida del exceso, en divisiones y en años a una división por semana.
Explíquese en una frase por qué lo que necesita un gen silenciado de por vida es el resultado de la pregunta 11 y no el de la 9, y qué clase de disposición molecular lo produce.

Parte III — El mapa de la gata carey.

Una gata es heterocigótica para el gen naranja ligado al X. Explíquese por qué su pelaje tiene manchas naranjas y negras y qué representa una mancha.
La inactivación del X ocurrió cuando las células destinadas a formar la piel eran $N$ . Cada una eligió un X al azar. ¿Cuál es la probabilidad de que las $N$ eligieran el mismo, dando una gata de un solo color?
No se ha documentado ninguna heterocigótica de un solo color entre quizá mil millones de gatos; tómese la probabilidad como $10^{-9}$ y estímese $N$ .
La superficie de la piel de la gata es de unos $0.3\,\mathrm{m}^{2}$ y sus manchas miden en promedio $15\,\mathrm{cm}^{2}$ . Estímese el número de manchas y explíquese por qué es mayor que $N$ .
Un gato XXY es también carey. ¿Cuántos corpúsculos de Barr muestran sus células? ¿Cuántos en una hembra XXX y en un macho XY?
Un gen que escapa a la inactivación está presente en dos copias activas en las hembras y en una en los machos. Dese una razón por la que ese escape puede tolerarse y una situación en la que importe.

Parte IV — El cromosoma 15.

El síndrome de Prader–Willi afecta a uno de cada $15\,000$ nacimientos; el $70\,\%$ de los casos son una deleción de novo del 15q11–q13 paterno y el $25\,\%$ una disomía uniparental materna. Calcúlese la frecuencia de nacimiento de cada causa.
El síndrome de Angelman tiene aproximadamente la misma frecuencia; el $70\,\%$ son deleciones maternas, el $5\,\%$ disomías paternas y el $10\,\%$ mutaciones puntuales de UBE3A. ¿Por qué las mutaciones puntuales son causa de Angelman y casi nunca de Prader–Willi?
Un padre lleva una translocación equilibrada que da al $20\,\%$ de sus espermatozoides una deleción de 15q11–q13. ¿Qué fracción de sus hijos tiene Prader–Willi y qué fracción Angelman?
La disomía uniparental surge cuando un cigoto trisómico pierde un cromosoma. Si un cigoto con trisomía 15 pierde al azar uno de sus tres cromosomas, y la trisomía venía de la madre (dos copias maternas), ¿cuál es la probabilidad de que el superviviente tenga disomía materna? ¿Qué síndrome?
Los genes de Prader–Willi son de expresión paterna y el de Angelman, de expresión materna. Usando la teoría del parentesco, dígase cuáles de los síntomas de los dos síndromes (dificultad para mamar al nacer frente a apetito voraz) encajan en la teoría y cuáles son más difíciles de encajar.
Se propone un método para tratar el Angelman reactivando el UBE3A paterno silencioso. Su silencio se debe a un ARN antisentido de expresión paterna. Propóngase la diana molecular y dígase por qué la terapia no perturbaría a los demás genes improntados.
Resúmase: la semivida de una marca sin retroalimentación (pregunta 9) y con ella (pregunta 11), en divisiones; y la población fundadora $N$ del pelaje de la gata carey (pregunta 15).

Solución

Solución de Problema 1.1.

1. $6.4\times 10^{9}\times 0.34\,\mathrm{nm} = 2.2\,\mathrm{m}$ ; $6.4\times 10^{9}/200 = 3.2\times 10^{7}$ nucleosomas. 2. Histona: $3.2\times 10^{7}\times 1.08\times 10^{5} = 3.5\times 10^{12}$ Da $= 5.7\,\mathrm{pg}$ . ADN: $6.4\times 10^{9}\times 650 = 4.2\times 10^{12}$ Da $= 6.9\,\mathrm{pg}$ . Masas comparables. 3. Núcleo: $\tfrac{4}{3}\pi\,(5\,\text{µ}\mathrm{m})^{3} = 520\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ . Partícula: $\pi\,(5.5)^{2}\times 5.5 = 520\,\mathrm{nm}^{3} = 5.2\times 10^{-7}\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ ; total $3.2\times 10^{7}\times 5.2\times 10^{-7} = 17\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ : alrededor del $3\,\%$ del núcleo. 4. $3.2\times 10^{7}\times 11\,\mathrm{nm} = 0.35\,\mathrm{m}$ ; razón de empaquetamiento $2.2/0.35 \approx 6$ . 5. $6.4\times 10^{9}/2\times 10^{5} = 32\,000$ bucles de $1000$ nucleosomas cada uno. 6. $0.21^{2}\times 6.4\times 10^{9} = 2.8\times 10^{8}$ ; observados $5.6\times 10^{7}$ , luego se ha perdido el $80\,\%$ , por desaminación de la 5-metilcitosina a timina (transiciones C $\to$ T sin reparar en los CpG metilados). 7. $p_{n+1} = 0.99\,p_{n} + 0.02\,(1 - p_{n}) = 0.97\,p_{n} + 0.02$ ; $p^{*} = 0.02/0.03 = 0.67$ . 8. $p_{n} = 0.67 + 0.33\times 0.97^{n}$ : $n = 10$ : $0.91$ ; $n = 50$ : $0.74$ ; $n = 200$ : $0.67$ (el exceso es $7\times 10^{-4}$ ). 9. $\ln 2/(-\ln 0.97) = 22.8 \approx 23$ divisiones; a una por semana, unas $23$ semanas — cinco meses. 10. Cada replicación empareja una hebra vieja, aún metilada, con una hebra nueva que ninguna enzima metila; las hebras viejas ni se ganan ni se pierden, el número de hebras se duplica, y por tanto la fracción metilada se reduce a la mitad. $0.80/2^{n} < 0.05$ exige $2^{n} > 16$ : cinco divisiones ( $0.025$ ; con cuatro se llega exactamente al $5\,\%$ ). 11. Razón $0.9995 - 0.0005 = 0.999$ ; semivida $\ln 2/(-\ln 0.999) \approx 690$ divisiones, unos $13$ años a una por semana. 12. Un gen silencioso durante toda una vida de unas $4000$ divisiones semanales necesita una semivida de centenares de divisiones, que solo da la retroalimentación de la pregunta 11: los lectores de la marca (MeCP2, HP1) reclutan a sus escritores (metilasa de H3K9, DNMT3), de modo que un dominio denso de marcas se copia con una eficiencia que ninguna enzima aislada tiene. 13. Un X lleva el alelo naranja y el otro el negro; toda célula de la piel ha silenciado un X y expresa solo el otro; las descendientes de una célula conservan su elección, de modo que una mancha es un clon (o un grupo de clones contiguos) que hizo la misma elección. 14. Las $N$ eligen el X que lleva el naranja, o todas eligen el otro: $2\times (1/2)^{N} = 2^{1-N}$ . 15. $2^{1-N} = 10^{-9}$ : $N - 1 = \log_{2} 10^{9} = 29.9$ , $N \approx 30$ células. 16. $3000\,\mathrm{cm}^{2}/15\,\mathrm{cm}^{2} = 200$ manchas, muchas más que $30$ fundadoras: durante el crecimiento las descendientes de una fundadora se dispersan por mezcla y migración celular, de modo que un clon forma varias islas (y las vecinas con la misma elección se funden, lo que actúa en sentido contrario pero menos). 17. Un corpúsculo de Barr por cada X más allá del primero: XXY uno, XXX dos, XY ninguno. 18. Se tolera cuando el gen tiene un homólogo funcional en el Y, de modo que los machos también tienen dos copias (los genes seudoautosómicos y parejas como KDM5C/KDM5D); importa en las aneuploidías del X — en el síndrome de Turner (XO) los genes que escapan están en una sola copia, que es por lo que un individuo XO no es simplemente una hembra normal (haploinsuficiencia de SHOX y talla baja), y en XXY los que escapan están sobredosificados. 19. $1/15\,000 = 6.7\times 10^{-5}$ ; deleciones $0.70\times 6.7\times 10^{-5} = 4.7\times 10^{-5}$ (uno de cada $21\,000$ ); disomía materna $1.7\times 10^{-5}$ (uno de cada $60\,000$ ). 20. El Angelman es la pérdida de un solo gen, UBE3A, así que basta una mutación puntual en el alelo materno. El Prader–Willi es la pérdida simultánea de varios genes de expresión paterna (SNRPN, el agrupamiento de ARN pequeños); una mutación puntual inactiva uno de ellos y da como mucho un fenotipo parcial, nunca el síndrome entero. 21. El $20\,\%$ de los hijos recibe una deleción paterna y tiene Prader–Willi; ninguno tiene Angelman, que exige una deleción materna. 22. Tres cromosomas, dos maternos y uno paterno, y se pierde uno al azar: el paterno se pierde con probabilidad $1/3$ , lo que deja una disomía materna y un Prader–Willi; con probabilidad $2/3$ se pierde una copia materna y el niño es normal. 23. Los genes paternos deberían aumentar la demanda sobre la madre; su pérdida (Prader–Willi) debería reducirla — lo que encaja con la succión débil y el retraso del crecimiento del recién nacido —, mientras que el apetito insaciable posterior es lo contrario y es más difícil de encajar (una lectura propuesta es que los genes paternos empujan normalmente al niño hacia el destete). El Angelman, la pérdida de un gen materno, debería aumentar la demanda; la succión prolongada y los despertares nocturnos frecuentes de los niños con Angelman encajan, pero las convulsiones y la pérdida del habla no tienen nada que ver con los recursos. 24. La diana es el transcrito antisentido paterno (UBE3A-ATS), con un oligonucleótido antisentido que lo degrade o bloquee su elongación: el UBE3A paterno está intacto y solo se silencia en cis por ese ARN, de modo que quitar el ARN restaura su expresión. La metilación de la región de control de la impronta queda intacta, así que SNRPN y los demás genes improntados conservan su patrón parental normal. 25. Semivida de una marca: unas $23$ divisiones sin retroalimentación y unas $690$ con ella; el pelaje de la gata carey lo decidió una población fundadora de unas $30$ células.

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