Biología universitaria — tercer año · Bachelor Year 3

6Ingeniería genética y biotecnología

Hasta 1982 todos los diabéticos del mundo seguían vivos gracias a insulina extraída del páncreas de cerdos y de vacas — unos ocho mil kilogramos de glándulas por cada kilogramo de hormona — y una parte de los pacientes reaccionaba contra la proteína ajena. Ese año llegó al mercado el primer fármaco fabricado por un organismo modificado genéticamente: la insulina humana, sintetizada por Escherichia coli con el gen humano en un plásmido. Las herramientas que lo hicieron posible se habían reunido a lo largo de la década anterior — enzimas que cortan el ADN en secuencias elegidas, enzimas que unen los trozos, plásmidos que los llevan a una célula y los copian allí — y se les sumaron en las siguientes la reacción en cadena de la polimerasa, la inyección de genes en embriones y, desde 2012, un sistema inmunitario bacteriano convertido en unas tijeras programables capaces de reescribir una letra de un genoma en una célula viva. Este capítulo trata de esas herramientas, de la aritmética que gobierna su uso y de lo que se ha construido con ellas, desde un ratón luminoso hasta una cura para la anemia falciforme.

6.1 Cortar, unir y copiar ADN

Definición 6.1 (Enzimas de restricción, ligasa y vectores)

Una enzima de restricción de tipo II es una endonucleasa bacteriana que corta el ADN de doble hebra en una secuencia concreta de $4\text{ a }8$ pares de bases, casi siempre un palíndromo: EcoRI corta G $^{\downarrow}$ AATTC y deja salientes de hebra sencilla de cuatro bases (extremos cohesivos) complementarios de cualquier otro extremo EcoRI; otras enzimas dejan extremos romos. La ADN-ligasa sella dos fragmentos cuyos extremos encajan. Un vector es una molécula de ADN que se replica en un hospedador y puede llevar un fragmento insertado: un plásmido de unas pocas kilobases con un origen de replicación, un marcador de selección (un gen de resistencia a un antibiótico, de modo que solo crecen en el antibiótico las células que tomaron el plásmido) y un grupo de sitios de restricción únicos para el inserto; el bacteriófago $\lambda$ , los cósmidos y los cromosomas artificiales bacterianos o de levadura para insertos de $20\text{ a }1000\,\mathrm{kb}$ . El ADN entra en una bacteria por transformación, tras un choque químico o eléctrico que hace la membrana transitoriamente permeable, con una eficiencia de $10^{6}$ a $10^{9}$ transformantes por microgramo de plásmido. Una molécula recombinante es la que une ADN de dos procedencias.

Evidencia. Cohen, Chang, Boyer y Helling (1973) cortaron con EcoRI el plásmido pSC101 y un segundo plásmido con otro gen de resistencia, mezclaron y ligaron los fragmentos, transformaron E. coli y recuperaron colonias resistentes a ambos antibióticos que llevaban un solo plásmido hecho de los dos — el primer ADN recombinante que se replicó en una célula. Al año siguiente insertaron en pSC101 genes de ARN ribosómico de un sapo y mostraron que el ADN del anfibio se replicaba, y se transcribía, en la bacteria: los genes cruzan sin cambios la frontera entre reinos, y una bacteria copiará el ADN que se le dé. ∎

Un vector de clonación y su química. El plásmido lleva un origen, un marcador de selección y un sitio de restricción único en el que se liga un fragmento cortado con la misma enzima; los extremos cohesivos hacen compatibles dos fragmentos cualesquiera cortados por la misma enzima.

Método 6.2 (Clonar un gen)

(1) Obténgase el inserto: córtese ADN genómico con una enzima de restricción, o cópiese el ARN mensajero en ADN complementario (ADNc, que carece de intrones y por tanto puede expresarse en bacterias), o amplifíquese el gen por PCR con cebadores que lleven sitios de restricción. (2) Córtense el vector y el inserto con la misma enzima o enzimas — dos enzimas distintas fuerzan la orientación del inserto — y líguense. (3) Transfórmense bacterias y siémbrense en el antibiótico: solo crecen las células con plásmido. (4) Distínganse los plásmidos con inserto de los que se cerraron sobre sí mismos: con un gen marcador interrumpido por el sitio de clonación (lacZ: las colonias blancas tienen inserto y las azules no). (5) Críbense las colonias buscando el inserto deseado: por hibridación con una sonda marcada, por PCR o por digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel. (6) Secúnciese el inserto. Una genoteca es el conjunto de clones de todo un genoma o transcriptoma, del que puede pescarse cualquier gen con el mismo cribado.

Un gel de agarosa bajo luz ultravioleta: los fragmentos de ADN migran hacia el ánodo a una velocidad que cae con su longitud, de modo que cada banda es una población de moléculas de un solo tamaño, comparada con la escalera de tamaños conocidos de las calles exteriores.

Definición 6.3 (La reacción en cadena de la polimerasa)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica un tramo elegido de ADN situado entre dos cebadores — oligonucleótidos sintéticos de unas veinte bases complementarios de las dos hebras en los extremos de la diana — mediante ciclos de tres temperaturas: $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para separar las hebras, $50\text{ a }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para que los cebadores hibriden y $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ para que una polimerasa termoestable (la Taq, de la bacteria de aguas termales Thermus aquaticus) los alargue. Cada ciclo duplica el número de copias del segmento situado entre los cebadores, de modo que treinta ciclos convierten una sola molécula en mil millones. La PCR con transcripción inversa copia primero el ARN en ADN y mide así transcritos o virus de ARN; la PCR cuantitativa (qPCR) sigue la amplificación en tiempo real con un colorante fluorescente y lee la cantidad inicial a partir del ciclo en que la señal cruza un umbral.

Teorema 6.4 (La aritmética de la amplificación)

Con una eficiencia $E$ por ciclo ( $E = 1$ para una duplicación perfecta), $N_{0}$ copias iniciales pasan a ser

N_{n} = N_{0}\,(1 + E)^{n}

tras $n$ ciclos. Si la fluorescencia cruza un umbral fijo cuando el número de copias llega a $N_{T}$ , el ciclo umbral es

C_{T} = \frac{\log N_{T} - \log N_{0}}{\log(1 + E)},

una recta en $\log N_{0}$ de pendiente $-1/\log(1+E)$ : para $E = 1$ , cada aumento de diez veces de la cantidad inicial baja $C_{T}$ en $\log_{2} 10 = 3.32$ ciclos, y dos muestras cuyos ciclos umbral difieren en $\Delta C_{T}$ difieren en copias iniciales por el factor $(1 + E)^{\Delta C_{T}}$ .

Demostración. Cada ciclo multiplica el número de copias por $1 + E$ , de modo que $N_{n}$ es una sucesión geométrica. Igualando $N_{n} = N_{T}$ y despejando $n$ se obtiene $C_{T}$ ; la pendiente es el coeficiente de $\log N_{0}$ . Para dos muestras, $C_{T,1} - C_{T,2} = (\log N_{0,2} - \log N_{0,1})/\log(1+E)$ , de donde $N_{0,2}/N_{0,1} = (1+E)^{\Delta C_{T}}$ . ∎

Ejemplo 6.5 (Leer una placa de qPCR)

Una prueba de ARN vírico cruza el umbral en el ciclo $22$ en un paciente y en el $32$ en otro; con $E \approx 1$ el primero lleva $2^{10} \approx 1000$ veces más virus. Una muestra de diez copias cruza hacia el ciclo $37$ cuando el umbral está en $10^{12}$ copias ( $\log_{2} 10^{11} = 36.5$ ); una carrera de $40$ ciclos detecta por tanto unas pocas moléculas, y también lo hace una sola molécula contaminante de un amplicón anterior, que es por lo que los laboratorios separan las salas donde se monta la PCR de aquellas donde se manipulan los productos.

Curvas de amplificación para N_0 = 107 (azul), 104 (rojo) y 10 copias (verde), con E = 1 y la meseta que imponen los reactivos. Una diferencia de mil veces en N_0 desplaza el ciclo umbral en 10; las mesetas son todas iguales, y por eso el producto final no dice nada sobre el punto de partida. — Curvas de amplificación para $N_{0} = 10^{7}$ (azul), $10^{4}$ (rojo) y $10$ copias (verde), con $E = 1$ y la meseta que imponen los reactivos. Una diferencia de mil veces en $N_{0}$ desplaza el ciclo umbral en $10$ ; las mesetas son todas iguales, y por eso el producto final no dice nada sobre el punto de partida.

6.2 Fabricar proteínas

Definición 6.6 (Sistemas de expresión)

Un vector de expresión sitúa la secuencia codificante clonada bajo un promotor fuerte y controlable del hospedador (el promotor lac o el T7 en E. coli, inducidos por un análogo de azúcar), con un sitio de unión al ribosoma, un terminador y a menudo una etiqueta — seis histidinas, una proteína pequeña — fusionada al producto para purificarlo en una columna. Las bacterias fabrican gramos por litro de una proteína sencilla (insulina, hormona del crecimiento, enzimas) pero no pueden glicosilar ni plegar proteínas complejas de mamífero; la levadura añade azúcares a su manera; y las células de insecto y de mamífero (las de ovario de hámster chino son el estándar de la industria) fabrican anticuerpos y factores de coagulación plegados y glicosilados como en el ser humano. Un anticuerpo monoclonal lo fabrica un hibridoma — un linfocito B productor de anticuerpos fusionado con una célula de mieloma inmortal (Köhler y Milstein, 1975) — o, hoy, clonando los genes del anticuerpo en una línea de expresión de mamífero, donde el armazón de ratón puede sustituirse por secuencia humana para evitar el rechazo inmunitario (Capítulo 16).

Ejemplo 6.7 (La insulina)

La insulina humana consta de dos cadenas, la A (21 residuos) y la B (30), unidas por puentes disulfuro y cortadas en la célula $\beta$ a partir de un único precursor, la proinsulina. El primer proceso expresó las dos cadenas por separado en E. coli, cada una fusionada a la $\beta$ -galactosidasa, las separó químicamente y las unió in vitro; los procesos posteriores expresan proinsulina y la cortan con las enzimas que usa el páncreas. Desde 1996 se ha alterado la propia secuencia: cambiar o añadir un residuo o dos da análogos que se disocian más deprisa (para una comida) o que precipitan en el punto de inyección y se liberan a lo largo de un día. Una proteína que costaba ocho toneladas de glándulas por kilogramo se fabrica hoy en un fermentador, idéntica a la humana o mejor que ella.

6.3 Organismos transgénicos

Definición 6.8 (Transgénesis y direccionamiento génico)

Un organismo transgénico lleva un gen introducido en su línea germinal, de modo que todas sus células lo tienen y se hereda. En los ratones la vía clásica es la microinyección del ADN en uno de los pronúcleos de un huevo fecundado (Gordon y Ruddle, 1980), que se integra en un sitio al azar en una fracción de los embriones; Palmiter y Brinster (1982) hicieron ratones del doble del tamaño normal inyectando el gen de la hormona del crecimiento de rata detrás de un promotor de metalotioneína. El direccionamiento génico sustituye o interrumpe en cambio un gen elegido: se introduce en células madre embrionarias una construcción con brazos largos homólogos de la diana, se seleccionan las raras células en las que la recombinación homóloga la ha colocado en el lugar correcto y se inyectan en un blastocisto, y el ratón quimérico resultante transmite el gen alterado (Capecchi, Smithies y Evans, en los años ochenta). Una supresión génica carece del gen; una inserción dirigida lleva una versión modificada; y un alelo condicional, flanqueado por sitios loxP, solo se suprime donde y cuando se expresa la Cre (Capítulo 3). Se han suprimido unos diez mil genes de ratón, y para la mayoría el fenotipo fue la primera indicación de lo que hace el gen.

Izquierda: un huevo de ratón fecundado sujeto por succión mientras una aguja de vidrio inyecta ADN en uno de los pronúcleos. Derecha: un ratón transgénico que expresa en todas sus células la proteína verde fluorescente de una medusa, junto a un hermano de camada corriente, bajo luz ultravioleta.

Definición 6.9 (Plantas transgénicas)

Las plantas se transforman con Agrobacterium tumefaciens, una bacteria del suelo que inserta de forma natural un segmento de su plásmido inductor de tumores, el ADN-T, en el genoma de una planta herida para que forme una agalla y alimente a la bacteria. Sustituir los genes propios del ADN-T por cualquier gen elegido, entre las secuencias de borde que la bacteria reconoce, convierte al patógeno en un vector; las células transformadas se seleccionan y se regeneran en plantas enteras, cosa que toda célula vegetal puede hacer. Las especies a las que la bacteria no infecta (los cereales, durante mucho tiempo) se transforman disparando partículas de oro recubiertas de ADN contra el tejido. Los cultivos modificados genéticamente que se siembran a gran escala llevan un gen de toxina bacteriana (Bt) contra las larvas de insecto, o una enzima bacteriana que confiere tolerancia a un herbicida, o ambos; el arroz dorado lleva dos genes de la ruta de los carotenoides (una fitoeno-sintasa vegetal y una desaturasa bacteriana) para que su endospermo fabrique $\beta$ -caroteno, el precursor de la vitamina A, cuya carencia ciega y mata a varios centenares de miles de niños al año.

Arroz corriente y arroz dorado. El grano amarillo fabrica -caroteno en su endospermo a partir de dos genes añadidos de la ruta de los carotenoides. Derecha: los dos arroces comparados en el Instituto Internacional de Investigación del Arroz (IRRI, CC BY 2.0). — Arroz corriente y arroz dorado. El grano amarillo fabrica $\beta$ -caroteno en su endospermo a partir de dos genes añadidos de la ruta de los carotenoides. Derecha: los dos arroces comparados en el Instituto Internacional de Investigación del Arroz (IRRI, CC BY 2.0).

Observación 6.10 (El debate)

Treinta años de cultivo en centenares de millones de hectáreas, y todas las revisiones sistemáticas de las academias científicas, no han hallado ningún efecto sobre la salud de los cultivos transgénicos aprobados que difiera del de sus equivalentes convencionales; el transgén es un gen más entre cuarenta mil, y la proteína que fabrica se somete a las mismas pruebas que cualquier aditivo alimentario. Las cuestiones de verdad son ecológicas y económicas: la propagación de la resistencia en plagas y malas hierbas bajo una selección uniforme, el flujo de genes hacia parientes silvestres, la concentración del mercado de semillas y quién sale ganando. Son las cuestiones que plantea cualquier tecnología agrícola potente, y las respuestas dependen del carácter y del contexto, no del método con el que se movió el gen.

6.4 Editar genomas

Definición 6.11 (CRISPR–Cas9)

Las bacterias guardan fragmentos de los genomas de los fagos que infectaron a sus antepasados en una serie de repeticiones (CRISPR), los transcriben en ARN guía cortos y los usan para dirigir una nucleasa que corte todo ADN correspondiente que entre en la célula: un sistema inmunitario adaptativo con memoria genética. En Streptococcus pyogenes la nucleasa es una sola proteína, Cas9, que se une a un ARN guía y a un segundo ARN pequeño, rastrea el ADN en busca de un motivo adyacente al protoespaciador de tres bases (PAM, 5 $'$ -NGG), desenrolla el ADN contiguo y, si las veinte bases vecinas al PAM se aparean con la guía, corta las dos hebras a tres bases del PAM. Jinek, Charpentier, Doudna y colaboradores (2012) fusionaron los dos ARN en un solo ARN guía único y mostraron que Cas9 con una guía de cualquier secuencia elegida corta el ADN en esa secuencia en un tubo de ensayo; en menos de un año se había demostrado que la pareja funciona en células humanas, de ratón, de pez cebra, de planta y de levadura. La edición del genoma es lo que la célula hace con el corte: la unión de extremos deja una inserción o deleción pequeña que estropea el gen (una supresión génica en un paso, en cualquier organismo, en semanas), y la recombinación homóloga con un molde aportado escribe una secuencia elegida.

Cas9 y su guía. La proteína se une a un PAM, desenrolla el ADN contiguo y corta si las veinte bases se aparean con el ARN guía. La rotura se repara o bien por unión de extremos, que estropea el gen, o bien por recombinación con un molde, que lo reescribe.

Proposición 6.12 (Editar sin rotura)

Cortar las dos hebras es la edición más tosca: el resultado de la unión de extremos es aleatorio, y una rotura en otro sitio — un lugar fuera de diana que difiere de la guía en unas pocas posiciones y que Cas9 tolera — es una mutación que nadie ha pedido. Una Cas9 con un dominio nucleasa inactivado muerde una sola hebra; con los dos inactivados se limita a unirse, y puede llevar otras enzimas hasta una secuencia. Los editores de bases fusionan una Cas9 mordedora con una desaminasa que convierte C en U (leída como T) o A en I (leída como G) en la hebra desenrollada, y cambian una base sin rotura y sin molde; los editores cebados llevan una transcriptasa inversa y una guía alargada con la secuencia deseada, y copian esa secuencia en la hebra mordida, lo que permite cualquier sustitución y pequeñas inserciones o deleciones. La actividad fuera de diana se reduce con variantes de Cas9 de alta fidelidad diseñadas a tal efecto, entregando la enzima brevemente como proteína en lugar de como gen, y eligiendo guías cuyos parientes genómicos más próximos difieran en varias posiciones; se mide secuenciando los sitios predichos y con métodos sin sesgo que captan toda rotura del genoma.

Ejemplo 6.13 (Una cura)

La anemia falciforme es un cambio de una sola base en la $\beta$ -globina. La hemoglobina fetal, hecha de $\gamma$ -globina, serviría de sustituta, pero los genes $\gamma$ los apaga tras el nacimiento el represor BCL11A. La primera terapia CRISPR aprobada (2023) toma las propias células madre sanguíneas del paciente, corta con Cas9 el potenciador eritroide de BCL11A de modo que la unión de extremos lo inutilice en la mayoría de las células, y devuelve las células después de vaciar la médula del paciente: los glóbulos rojos que fabrican son ricos en hemoglobina fetal, no se falciforman y las crisis cesan. La edición es somática — la línea germinal queda intacta y el cambio no se hereda — y usa el resultado “tosco”, la interrupción, allí donde lo que se quiere es interrumpir.

Teorema 6.14 (Propagación supramendeliana de un impulsor génico)

Un impulsor génico es una construcción que codifica una Cas9 y una guía que corta el alelo silvestre en su propio locus en un heterocigoto; la reparación por recombinación copia el impulsor en el cromosoma cortado, de modo que una fracción $c$ de los gametos del heterocigoto lleva el impulsor en lugar de la mitad mendeliana. Si el impulsor tiene frecuencia $p$ en una población grande con apareamiento al azar y no tiene coste de eficacia biológica, su frecuencia en la generación siguiente es

p' = p + c\,p\,(1 - p),

de modo que se propaga desde la rareza a un ritmo proporcional a $c$ y alcanza la mitad de la población en unas $\ln(1/p_{0})/\ln(1 + c)$ generaciones desde una frecuencia inicial $p_{0}$ .

Demostración. El apareamiento al azar da homocigotos del impulsor con frecuencia $p^{2}$ , heterocigotos con $2p(1-p)$ y homocigotos silvestres con $(1-p)^{2}$ . Los homocigotos transmiten el impulsor a todos sus gametos, los heterocigotos a una fracción $(1 + c)/2$ (la mitad por Mendel, más $c$ veces la mitad silvestre convertida) y los silvestres a ninguno. De ahí que $p' = p^{2} + 2p(1-p)(1+c)/2 = p^{2} + p(1-p) + c\,p(1-p) = p + c\,p(1-p)$ . Para $p$ pequeño esto es $p' \approx (1+c)p$ , un crecimiento geométrico de razón $1 + c$ , que alcanza $1/2$ desde $p_{0}$ tras unas $\ln(1/2p_{0})/\ln(1+c)$ generaciones; el término logístico solo lo frena cerca del final. ∎

Un impulsor génico liberado al uno por ciento, con eficiencia de conversión 0.9 o 0.5 y sin coste de eficacia biológica. Un alelo mendeliano sin ventaja se quedaría en el uno por ciento; el impulsor se adueña de la población en diez o veinte generaciones. — Un impulsor génico liberado al uno por ciento, con eficiencia de conversión $0.9$ o $0.5$ y sin coste de eficacia biológica. Un alelo mendeliano sin ventaja se quedaría en el uno por ciento; el impulsor se adueña de la población en diez o veinte generaciones.

Observación 6.15 (Qué puede editarse)

Editar las células somáticas de un paciente que da su consentimiento es medicina, y se juzga como cualquier tratamiento por sus riesgos y sus beneficios. Editar la línea germinal — un embrión, cuya descendencia entera llevaría el cambio — es distinto en su naturaleza: la persona afectada no puede consentir, el cambio se hereda y los resultados fuera de diana y en mosaico de la técnica aún no están controlados; después de que un científico chino anunciara en 2018 que lo había hecho en unas gemelas, las academias científicas de la mayoría de los países pidieron una moratoria y varios Estados lo tipificaron como delito. Un impulsor génico liberado en una población silvestre es una decisión tomada en nombre de todos los que vengan después, y por eso las propias propuestas del campo para eliminar los mosquitos del paludismo acompañan los impulsores de salvaguardas — impulsores de reversión, diseños autolimitados — y del consentimiento público de los países afectados.

6.5 Ejercicios

Ejercicio 6.1 ★

Enumérense los tres componentes que debe tener un plásmido de clonación y explíquese la finalidad de cada uno.

Solución

Solución de Ejercicio 6.1.

Un origen de replicación, para que el hospedador copie el plásmido y lo pase a las células hijas; un marcador de selección, por lo común una resistencia a un antibiótico, para que solo crezcan las células con plásmido; y un sitio de restricción único (o un grupo de sitios) en el que se liga el inserto sin cortar el plásmido por otro lado.

Ejercicio 6.2 ★

EcoRI reconoce GAATTC. ¿Con qué frecuencia aparece el sitio, en promedio, en ADN aleatorio, y cuántos fragmentos produce del genoma de E. coli de $4.6\,\mathrm{Mb}$ ? ¿Por qué el número real es algo distinto?

Solución

Solución de Ejercicio 6.2.

Una secuencia dada de seis bases aparece una vez cada $4^{6} = 4096$ bp en ADN aleatorio: unos $4.6\times 10^{6}/4096 \approx 1100$ fragmentos de $4.1\,\mathrm{kb}$ de media. Los genomas reales no son aleatorios — la composición de bases, el uso de codones y la evitación de algunas secuencias desplazan el recuento (el número real de sitios EcoRI de E. coli es de varios centenares).

Ejercicio 6.3 ★

Enúnciense los tres pasos de temperatura de un ciclo de PCR y qué ocurre en cada uno. ¿Por qué ha de ser termoestable la polimerasa?

Solución

Solución de Ejercicio 6.3.

La desnaturalización a $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ separa las hebras; la hibridación a $50\text{ a }65\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ deja que los cebadores se apareen con sus sitios; y la extensión a $72\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ deja que la polimerasa copie desde cada cebador. Una polimerasa corriente se destruiría a $95\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ en el primer ciclo y habría que añadirla de nuevo treinta veces; la Taq sobrevive a todos los ciclos.

Ejercicio 6.4 ★

¿Qué necesita Cas9 para cortar una secuencia dada, y qué dos resultados pueden seguir al corte?

Solución

Solución de Ejercicio 6.4.

Un ARN guía cuyas veinte bases correspondan a la diana, y un PAM (NGG) inmediatamente en 3 $'$ de la diana en la hebra no diana. Tras la rotura de doble hebra: la unión de extremos, que deja una inserción o deleción pequeña y suele destruir el marco de lectura del gen; o la recombinación homóloga con un molde que lleve la secuencia deseada, que la escribe.

Ejercicio 6.5 ★★

Una PCR corre $35$ ciclos con eficiencia $E = 0.9$ a partir de $50$ copias. ¿Cuántas copias resultan? Una qPCR de dos muestras da $C_{T} = 18.2$ y $25.5$ ; con $E = 0.95$ , ¿cuál es la razón de sus cantidades iniciales?

Solución

Solución de Ejercicio 6.5.

$50\times 1.9^{35} = 50\times 5.7\times 10^{9} \approx 3\times 10^{11}$ copias. $\Delta C_{T} = 7.3$ ; razón $1.95^{7.3} = e^{7.3\ln 1.95} \approx 130$ : la primera muestra tenía unas $130$ veces más molde.

Ejercicio 6.6 ★★

¿Por qué se usa una genoteca de ADNc, y no una genómica, para expresar una proteína humana en bacterias? Nómbrense otros dos obstáculos para fabricar una proteína humana en E. coli y dígase cómo se salva cada uno.

Solución

Solución de Ejercicio 6.6.

Las bacterias no pueden cortar y empalmar: una copia genómica con intrones se transcribiría en un mensaje inservible, de modo que se usa el ADNc sin intrones, copiado del ARNm maduro. Otros obstáculos: la polimerasa bacteriana no reconoce el promotor humano (aportar un promotor bacteriano y un sitio de unión al ribosoma); el uso de codones humano difiere (sintetizar el gen con los codones preferidos del hospedador); la proteína puede no plegarse o agregarse (bajar la temperatura, fusionarla a un compañero soluble o replegarla desde los cuerpos de inclusión); falta la glicosilación (usar levadura o células de mamífero si importa); y los puentes disulfuro necesitan el periplasma oxidante.

Ejercicio 6.7 ★★

Se fabrica un ratón con supresión génica por direccionamiento en células madre embrionarias. Explíquese por qué el primer ratón que nace es una quimera, por qué hay que cruzarlo y qué fracción de los nietos de una quimera cuya línea germinal está dirigida a medias son homocigotos para la supresión si se intercruzan abuelos heterocigóticos.

Solución

Solución de Ejercicio 6.7.

Las células madre dirigidas se inyectan en un blastocisto hospedador y se mezclan con sus propias células, de modo que el ratón está construido a partir de dos genotipos — una quimera — y solo transmite el alelo si algunas de sus células germinales derivan de las células dirigidas. Cruzar la quimera con un ratón silvestre da heterocigotos (a partir de la mitad de sus gametos si la línea germinal está dirigida a medias); intercruzar heterocigotos da una cuarta parte de homocigotos para la supresión.

Ejercicio 6.8 ★★

Se elige un ARN guía de 20 bases con un PAM NGG. ¿Cuántos sitios de un genoma de $3.2\times 10^{9}$ bp (ambas hebras) coinciden por azar exactamente con la guía? ¿Cuántos coinciden con hasta dos discrepancias, si Cas9 las tolera? (Cuéntense las secuencias a dos discrepancias como $1 + 3\binom{20}{1} + 9\binom{20}{2}$ .)

Solución

Solución de Ejercicio 6.8.

Exactas: $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}\times (1/16) \approx 4\times 10^{-4}$ sitios (el GG del PAM cuesta un factor $16$ ) — ninguno, en la práctica. A dos discrepancias hay $1 + 60 + 1710 = 1771$ secuencias: $1771\times 4\times 10^{-4} \approx 0.7$ sitios por azar. El genoma real no es aleatorio, y una guía se contrasta directamente con él.

Ejercicio 6.9 ★★

Con el Teorema 6.14, calcúlese la frecuencia de un impulsor con $c = 0.8$ tras tres generaciones desde $p_{0} = 0.05$ , y estímese el número de generaciones para llegar a $0.5$ .

Solución

Solución de Ejercicio 6.9.

$p_{1} = 0.05 + 0.8\times 0.05\times 0.95 = 0.088$ ; $p_{2} = 0.152$ ; $p_{3} = 0.255$ ; luego $0.41$ y $0.60$ : unas cinco generaciones para pasar de $0.5$ , frente a la estimación $\ln(1/(2\times 0.05))/\ln 1.8 \approx 4$ .

Ejercicio 6.10 ★★★

La terapia de la anemia falciforme interrumpe un potenciador en lugar de corregir la mutación de la $\beta$ -globina. Dense dos razones por las que se eligió la interrupción por unión de extremos frente a la corrección por recombinación homóloga en células madre sanguíneas, y un inconveniente.

Solución

Solución de Ejercicio 6.10.

La unión de extremos actúa en toda célula, incluidas las células madre quiescentes, en las que la recombinación homóloga, un proceso de S y G2, es poco eficiente; no exige entregar ningún molde y su producto — cualquier interrupción del potenciador — hace el trabajo, mientras que la corrección exige la secuencia exacta y rinde una minoría de células. Además, la misma edición sirve para toda mutación de la $\beta$ -globina, falciforme o talasémica. Inconveniente: elimina un elemento regulador (con todas las demás funciones que tenga), deja el alelo falciforme donde estaba y la mezcla de inserciones y deleciones no está controlada.

Ejercicio 6.11 ★★★

Un impulsor génico contra un mosquito lleva un coste de eficacia biológica $s$ en los homocigotos. Modifíquese la recurrencia para incluir la selección contra los homocigotos del impulsor y hállese la condición sobre $c$ y $s$ para que el impulsor se propague desde la rareza. Explíquese después por qué los alelos de resistencia — productos de la unión de extremos en la diana que la guía ya no reconoce — son el principal obstáculo en la práctica.

Solución

Solución de Ejercicio 6.11.

Con una eficacia biológica de los homocigotos $1 - s$ , $p' = \bigl[p^{2}(1-s) + p(1-p)(1+c) \bigr]/(1 - sp^{2})$ . Desde la rareza los homocigotos son despreciables y el impulsor crece como $(1+c)p$ sea cual sea $s$ ; que llegue a la fijación se decide cerca de $p = 1$ , donde un alelo silvestre raro de frecuencia $q$ vuelve como $q' \approx q(1-c)/(1-s)$ : hay fijación si $c > s$ , y un equilibrio intermedio en caso contrario. Resistencia: cada conversión fallida (unión de extremos en lugar de recombinación) deja un alelo que la guía ya no reconoce; si esos alelos son biológicamente eficaces — una inserción o deleción en fase en una región no esencial —, no tienen coste mientras que el impulsor sí lo tiene, de modo que la selección los favorece y sustituyen al impulsor. Los remedios son dirigir el corte a secuencias esenciales donde las inserciones y deleciones sean letales, y usar varias guías a la vez.

Ejercicio 6.12 ★★★

Arguméntese, con los mecanismos de este capítulo y del Capítulo 3, por qué la edición de la línea germinal de un embrión humano no puede garantizar hoy el resultado pretendido en todas las células, y qué pruebas harían falta antes de que una persona racional pudiera considerarla segura.

Solución

Solución de Ejercicio 6.12.

La Cas9 inyectada en un cigoto puede actuar después de las primeras divisiones, de modo que células distintas reciben reparaciones distintas — el mosaicismo —; la reparación de cada rotura la elige la célula, y la unión de extremos da inserciones y deleciones impredecibles, grandes deleciones o pérdida de heterocigosidad en el corte; el resultado por recombinación homóloga es minoritario; hay roturas fuera de diana en sitios que no pueden predecirse todos; y el embrión solo puede comprobarse secuenciando unas pocas células de biopsia, que no pueden hablar por las demás. Pruebas necesarias: métodos que editen todas las células por igual (antes de la primera fase S) con eficiencias cercanas al $100\,\%$ , la secuenciación del genoma completo de cada célula de embriones animales editados que no muestre ningún cambio no pretendido, y el seguimiento a largo plazo de animales editados a lo largo de generaciones — nada de lo cual existe.

6.6 Problema: de un gen a un fármaco y a un cultivo

Problema 6.1

Problema de fin de semana — un gen clonado con la aritmética de los sitios de restricción y de la transformación, un virus contado por qPCR, una hormona producida por toneladas en un fermentador, un genoma editado con sus dianas erróneas contadas y un impulsor génico cronometrado, hasta llegar a las copias de un virus en una muestra, al volumen anual de fermentador para la insulina del mundo y al número de generaciones que necesita un impulsor

Datos: un gen de $1.5\,\mathrm{kb}$ ; un sitio de restricción de seis bases; un plásmido de $4\,\mathrm{kb}$ ; eficiencia de transformación, $2\times 10^{7}$ colonias por microgramo de plásmido; la ligación da inserto al $10\,\%$ de los plásmidos. Eficiencia de la qPCR $E = 1$ , umbral $N_{T} = 10^{12}$ . Insulina: $5.8\,\mathrm{kDa}$ ; un paciente usa $40$ unidades al día, y una unidad son $35\,\text{µ}\mathrm{g}$ ; $10^{7}$ pacientes; un fermentador rinde $2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de producto por tanda, con diez tandas al año. Genoma, $3.2\times 10^{9}$ bp. Conversión del impulsor $c = 0.9$ , liberado a $p_{0} = 0.001$ .

Parte I — Clonación.

¿Con qué frecuencia aparece un sitio dado de seis bases en ADN aleatorio? ¿Cuál es la probabilidad de que el gen de $1.5\,\mathrm{kb}$ no contenga ningún sitio de esos, de modo que la enzima pueda usarse para clonarlo entero?
Si sí contiene un sitio, ¿cómo se clonaría de todos modos? (Dos métodos.)
Se transforman $100\,\mathrm{ng}$ de plásmido ligado. ¿Cuántas colonias, y cuántas llevan el inserto?
Se usa el cribado azul–blanco. ¿Qué fracción de las colonias es blanca, y cuántas colonias blancas hay que tomar para tener un $99\,\%$ de probabilidad de que al menos una lleve el gen en la orientación correcta (la mitad de los insertos)?
El plásmido recombinante mide $5.5\,\mathrm{kb}$ . Una célula contiene $50$ copias y se divide cada $30\,\mathrm{min}$ . Tras un crecimiento nocturno ( $16\,\mathrm{h}$ ) desde una sola célula, ¿cuántas moléculas de plásmido, y qué masa de ADN plasmídico ( $650\,\mathrm{Da}$ por par de bases)?
¿Por qué el plásmido necesita un origen bacteriano mientras que el gen humano insertado no necesita promotor bacteriano para clonarse, pero sí para expresarse?

Parte II — Contar un virus.

La muestra de un paciente cruza el umbral en $C_{T} = 28$ . ¿Cuántas copias había en la reacción? ¿Y en otra con $C_{T} = 35$ ?
Sensibilidad: ¿cuántos ciclos hacen falta para llevar una sola copia hasta el umbral?
El punto de corte de la prueba se fija en $C_{T} = 38$ . ¿A qué número de copias corresponde, y por qué no usar $45$ ciclos?
Una molécula contaminante del producto de una carrera anterior entra en una muestra negativa. ¿En qué ciclo cruza el umbral? ¿Qué práctica de laboratorio lo evita?
La transcripción inversa convierte en ADN el $40\,\%$ del ARN vírico. Corríjase el recuento de la pregunta 7 para la primera muestra.
Dos muestras difieren en $\Delta C_{T} = 3.3$ con $E = 1$ , pero la eficiencia es en realidad $0.9$ . ¿Qué diferencia de veces informa el analista, y cuál es la verdadera?

Parte III — Insulina por toneladas.

Calcúlense la masa diaria de insulina por paciente y la necesidad mundial anual para $10^{7}$ pacientes, en kilogramos.
¿Cuántos moles de insulina son, y cuántas moléculas?
¿Qué volumen de fermentador, con diez tandas al año, la produce? Compárese con una piscina de $2500\,\mathrm{m}^{3}$ .
La extracción de glándulas daba $1\,\mathrm{kg}$ de insulina por cada $8000\,\mathrm{kg}$ de páncreas; un páncreas de cerdo pesa $100\,\mathrm{g}$ . ¿Cuántos cerdos al año necesitaría el mundo?
¿Por qué se prefiere la hormona recombinante incluso donde la insulina animal es barata? Dense dos razones.
Los análogos de la insulina difieren de la secuencia humana en uno o dos residuos. Explíquese por qué un análogo sigue siendo un fármaco que actúa sobre el receptor humano, y por qué el cambio de un solo residuo puede alterar su tiempo de disociación.

Parte IV — Editar e impulsar.

¿Cuántas coincidencias exactas de una guía de 20 bases más NGG contiene el genoma por azar (ambas hebras: $6.4\times 10^{9}$ posiciones)?
Si Cas9 tolera hasta tres discrepancias, ¿cuántas secuencias están a tres discrepancias de la guía, y cuántos sitios fuera de diana por azar resultan?
Las células madre sanguíneas editadas son $10^{7}$ ; el $80\,\%$ lleva la interrupción pretendida. ¿Cuántas células llevan una rotura fuera de diana en un sitio dado si se corta en una célula de cada $10^{4}$ , y por qué preocupa una rotura en un gen supresor de tumores en una sola célula madre?
Calcúlese la frecuencia del impulsor tras $1, 2, 3$ generaciones desde $p_{0} = 0.001$ , y estímense las generaciones hasta $0.5$ .
Un mosquito tiene diez generaciones al año. ¿Cuántos años tarda en adueñarse de la población? ¿Cómo cambia cualitativamente el panorama un coste de eficacia biológica del $20\,\%$ en los homocigotos?
Un alelo de resistencia surge cuando el corte lo repara la unión de extremos y no la recombinación, con probabilidad $1 - c = 0.1$ por intento de conversión. Estímese el número de alelos de resistencia creados en una población de $10^{6}$ heterocigotos en una generación, y explíquese qué le ocurre al impulsor si son biológicamente eficaces.
Resúmase: las copias de la primera muestra (pregunta 7), el volumen anual de fermentador para la insulina del mundo (pregunta 15) y las generaciones que tarda el impulsor en llegar a la mitad de la población (pregunta 22).

Solución

Solución de Problema 6.1.

1. Una vez cada $4096$ bp. $P(\text{sin sitio}) = (1 - 1/4096)^{1500} = e^{-0.37} = 0.69$ . 2. Elíjase una enzima sin sitio en el gen; o amplifíquese el gen por PCR con cebadores que lleven sitios de restricción nuevos en sus extremos 5 $'$ (o úsese clonación de extremos romos o independiente de ligación). 3. $0.1\,\text{µ}\mathrm{g}$ $\times 2\times 10^{7} = 2\times 10^{6}$ colonias; el $10\,\%$ , $2\times 10^{5}$ , llevan el inserto. 4. Blancas: el $10\,\%$ . La mitad de los insertos están en la orientación correcta, de modo que $P(\text{ninguna en } n \text{ blancas}) = 0.5^{n} \le 0.01$ da $n \ge 6.6$ : tómense siete. 5. $32$ duplicaciones, $2^{32} = 4.3\times 10^{9}$ células, $2.1\times 10^{11}$ plásmidos; cada uno $5500\times 650 = 3.6\times 10^{6}$ Da $= 5.9\times 10^{-18}$ g: $1.3\,\text{µ}\mathrm{g}$ de plásmido. 6. La clonación solo necesita replicación, que aporta el origen del plásmido; la ARN-polimerasa bacteriana no lee el promotor humano, de modo que para la expresión hay que poner delante de la secuencia codificante (sin intrones) un promotor bacteriano y un sitio de unión al ribosoma. 7. $N_{0} = N_{T}/2^{C_{T}}$ : $10^{12}/2^{28} \approx 3700$ copias; con $C_{T} = 35$ , $10^{12}/2^{35} \approx 29$ copias. 8. $2^{n} = 10^{12}$ : $n = 39.9$ , cuarenta ciclos. 9. $10^{12}/2^{38} \approx 3.6$ copias. Más allá de unos $40$ ciclos, una sola molécula contaminante, o los artefactos de los cebadores, llegan al umbral, y una muestra de menos de una copia no significa nada. 10. Una molécula cruza en el ciclo $40$ : un positivo. Se evita con salas y material separados para montar la reacción y para manipular los productos, un flujo de trabajo en un solo sentido, controles negativos en cada carrera y la destrucción enzimática de los amplicones arrastrados. 11. $3700/0.4 \approx 9000$ copias de ARN. 12. Informa $2^{3.3} \approx 10$ veces; la verdadera es $1.9^{3.3} = e^{3.3\ln 1.9} \approx 8.3$ veces. 13. $40\times 35\,\text{µ}\mathrm{g} = 1.4\,\mathrm{mg}$ al día, $0.51\,\mathrm{g}$ al año; $\times 10^{7}$ : $5100\,\mathrm{kg}$ al año. 14. $5.1\times 10^{6}/5800 \approx 880$ mol; $5.3\times 10^{26}$ moléculas. 15. $5.1\times 10^{6}$ g $/ (20$ g/L $) = 2.6\times 10^{5}$ L $= 260\,\mathrm{m}^{3}$ — una décima parte de la piscina. 16. $5100\times 8000 = 4.1\times 10^{7}$ kg de páncreas, a $0.1\,\mathrm{kg}$ cada uno: $4\times 10^{8}$ cerdos al año. 17. La hormona recombinante es idéntica a la humana, de modo que no provoca anticuerpos ni reacciones alérgicas; no lleva patógenos animales (virus, priones); el suministro no depende del sacrificio; y la secuencia puede mejorarse. 18. Los residuos que tocan el receptor no cambian, de modo que la unión y la señalización son las de la insulina; los residuos alterados están en la superficie por la que las moléculas de insulina se asocian en dímeros y hexámeros, y cambiarlos cambia la velocidad con la que el depósito inyectado se deshace en monómeros absorbibles. 19. $6.4\times 10^{9}\times 4^{-20}/16 \approx 3.6\times 10^{-4}$ : ninguna coincidencia exacta por azar. 20. $1 + 60 + 1710 + 27\times 1140 = 32\,551$ secuencias; $32\,551\times 3.6\times 10^{-4} \approx 12$ sitios fuera de diana por azar. 21. $10^{7}\times 10^{-4} = 1000$ células. Una célula madre vive y se divide durante toda la vida del paciente; una que haya perdido un supresor de tumores, o adquirido una translocación, puede fundar un clon que acabe en leucemia. 22. $p_{1} = 0.0019$ , $p_{2} = 0.0036$ , $p_{3} = 0.0069$ ; el crecimiento geométrico por $1.9$ por generación da $\ln 500/\ln 1.9 \approx 10$ ; iterando la recurrencia, la frecuencia pasa de $0.5$ en la generación $11$ ( $0.45 \to 0.68$ ). 23. Alrededor de un año. Un coste del $20\,\%$ en los homocigotos es menor que $c = 0.9$ , de modo que el impulsor llega igual a la fijación, más despacio, mientras la eficacia biológica media de la población cae — que es la finalidad de un impulsor de supresión; un coste superior a $c$ lo detendría en una frecuencia intermedia. 24. $10^{6}\times 0.1 = 10^{5}$ alelos de resistencia en una generación. Al no poder cortarse y ser, si son eficaces, gratuitos mientras el impulsor es costoso, quedan favorecidos y se propagan, y el impulsor se elimina — de ahí que los impulsores se dirijan a sitios donde los productos de la unión de extremos sean letales, y con varias guías a la vez. 25. Unas $3700$ copias en la primera muestra; unos $260\,\mathrm{m}^{3}$ de fermentador al año para la insulina del mundo; y unas $11$ generaciones, un año de mosquito, para el impulsor.

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