Biología universitaria — tercer año · Bachelor Year 3

12Bacteriología: crecimiento, fisiología y genética

Una sola célula de Escherichia coli en caldo templado se divide cada veinte minutos. Sin freno, sus descendientes pesarían más que la Tierra en dos días; de hecho se detienen en cuestión de horas, cuando se acaba el azúcar, y aguantan semanas en un estado que sobrevive al ayuno. Una bacteria emparentada, dada una herida y unas horas, se convierte en cien millones de células y en una fiebre; hace cien años mataba a un tercio de los pacientes a los que infectaba, y desde 1941 el veneno de un moho contra ella ha salvado más vidas que ningún otro fármaco — mientras que las bacterias, a lo largo de esos mismos ochenta años, han desarrollado maneras de sortear todos los antibióticos fabricados. Las bacterias fueron los organismos en los que se demostró por primera vez que los genes son ADN, en los que se entendió por primera vez la regulación génica y de los que se tomaron las herramientas del Capítulo 6. Este capítulo las trata como organismos: su envoltura, la aritmética de su crecimiento en un matraz y en un cultivo continuo, la manera en que una población detecta su propia densidad, el tráfico de genes entre células y la química y la evolución de los antibióticos y la resistencia.

12.1 La célula bacteriana

Definición 12.1 (La envoltura)

Todas las bacterias salvo unas pocas están encerradas en una pared de peptidoglicano: cadenas alternas de N-acetilglucosamina y de ácido N-acetilmurámico, entrecruzadas por péptidos cortos en una sola molécula que rodea la célula y resiste la presión de turgencia — varias atmósferas — del citoplasma. Las bacterias grampositivas tienen una pared gruesa de $20\text{ a }80\,\mathrm{nm}$ , de muchas capas, atravesada por ácidos teicoicos; las gramnegativas tienen una pared fina de una o dos capas y, por fuera, una segunda bicapa lipídica, la membrana externa, cuya monocapa exterior es lipopolisacárido (LPS, endotoxina — la molécula que reconoce el sistema inmunitario innato del Capítulo 15 y que causa el choque séptico), y que encierra un periplasma. Las porinas de la membrana externa dejan pasar moléculas pequeñas y excluyen muchos antibióticos. Por fuera puede haber una cápsula de polisacárido contra los fagocitos, flagelos para nadar (Capítulo 9) y pili para la adhesión y la conjugación. Dentro, el cromosoma — una sola molécula circular de $1\text{ a }10\,\mathrm{Mb}$ en la mayoría de las especies — se pliega en un nucleoide sin membrana, junto a los plásmidos. Algunos géneros (Bacillus, Clostridium) pueden encerrar una copia del cromosoma en una cubierta gruesa como endospora, deshidratada e inerte metabólicamente, que sobrevive a la ebullición, a la radiación y a siglos de sequía y germina cuando vuelven los nutrientes.

Método 12.2 (La tinción de Gram)

La prueba más antigua del laboratorio bacteriológico (Gram, 1884) sigue decidiendo la primera elección de antibiótico. (1) Extiéndase la muestra y fíjese con calor; (2) tíñase con cristal violeta y después con yodo, que forma dentro de las células un complejo grande e insoluble con el colorante; (3) lávese con alcohol: el peptidoglicano grueso de las grampositivas, deshidratado por el alcohol, atrapa el complejo y las células siguen moradas, mientras que la pared fina de las gramnegativas lo deja salir; (4) contratíñase con safranina, que da color rosa a las gramnegativas, ya incoloras. La forma y la disposición — cocos en racimos (estafilococos) o en cadenas (estreptococos), bacilos, espirales — estrechan aún más la identificación, y un coco morado en racimos procedente de un absceso es un estafilococo antes de que haya crecido ningún cultivo.

Izquierda: una tinción de Gram — cocos grampositivos morados en racimos y bacilos gramnegativos rosas. Derecha: células de Bacillus teñidas para las endosporas, los óvalos verdes brillantes dentro de células rosas y esporas libres al lado. — Izquierda: una tinción de Gram — cocos grampositivos morados en racimos y bacilos gramnegativos rosas. Derecha: células de *Bacillus* teñidas para las endosporas, los óvalos verdes brillantes dentro de células rosas y esporas libres al lado.

Las dos envolturas. Las grampositivas envuelven la membrana en muchas capas de peptidoglicano; las gramnegativas tienen una capa fina y una membrana externa de lipopolisacárido perforada por porinas, que mantiene fuera muchos antibióticos y fabrica la endotoxina que causa el choque séptico.

12.2 Crecimiento

Teorema 12.3 (Crecimiento exponencial, ley de Monod y quimiostato)

Una población de $N$ células que se divide con tiempo de generación $T$ crece como $N(t) = N_{0}\,2^{t/T} = N_{0}e^{\mu t}$ , con tasa específica de crecimiento $\mu = \ln 2/T$ . La tasa depende del nutriente limitante $S$ según la ley de Monod

\mu(S) = \mu_{\max}\,\frac{S}{K_{S} + S},

que satura en $\mu_{\max}$ y vale la mitad del máximo en $S = K_{S}$ . En un quimiostato — un recipiente de volumen $V$ al que entra medio fresco de concentración de nutriente $S_{0}$ a caudal $F$ y del que sale cultivo al mismo caudal, con tasa de dilución $D = F/V$ — el estado estacionario cumple

\mu(S^{*}) = D,\qquad S^{*} = \frac{K_{S}D}{\mu_{\max} - D},\qquad X^{*} = Y\,(S_{0} - S^{*}),

donde $X$ es la densidad celular e $Y$ el rendimiento (células producidas por unidad de nutriente). El experimentador fija la tasa de crecimiento girando una bomba; el cultivo responde ajustando el nutriente que deja atrás. Si $D$ supera a $\mu(S_{0})$ , las células no pueden seguir el ritmo y son arrastradas fuera.

Demostración. Células: $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t = \mu(S)X - DX$ , crecimiento menos salida; en el estado estacionario con $X^{*} > 0$ , $\mu(S^{*}) = D$ , y al invertir la ley de Monod se obtiene $S^{*}$ . Nutriente: $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = D(S_{0} - S) - \mu(S)X/Y$ , entrada menos salida menos consumo; en el estado estacionario, con $\mu = D$ , $D(S_{0} - S^{*}) = DX^{*}/Y$ , de donde $X^{*}$ . El estado estacionario existe solo si $S^{*} < S_{0}$ , es decir, $D < \mu(S_{0})$ ; más allá, el único estado estacionario es $X = 0$ , el arrastre. Estabilidad: si $X$ sube por encima de $X^{*}$ consume más, $S$ cae por debajo de $S^{*}$ , $\mu$ cae por debajo de $D$ y $X$ disminuye — una retroalimentación negativa a través del nutriente. ∎

Ejemplo 12.4 (Un cultivo en números)

E. coli en medio rico a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ : $T = 20\,\mathrm{min}$ , $\mu = 2.1\,\mathrm{h}^{-1}$ . A partir de una célula, $2^{36}$ al cabo de doce horas — $7\times 10^{10}$ células, unos $70\,\mathrm{mg}$ , que es donde se detiene un matraz de $100\,\mathrm{mL}$ por falta de oxígeno y de azúcar; “la masa de la Tierra en dos días” son $2^{144}\approx 10^{43}$ células, y la aritmética solo muestra que el crecimiento exponencial nunca dura. En un quimiostato con glucosa y $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ e $Y = 0.5\,\mathrm{g}$ de células por gramo de glucosa, una tasa de dilución de $0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ deja $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de glucosa y sostiene $X^{*} = 0.495\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de células, que se dividen cada $83\,\mathrm{min}$ , indefinidamente. El quimiostato es como se estudia la fisiología a una tasa de crecimiento fija, y como se corren miles de generaciones de evolución en una botella.

Izquierda: un cultivo por lotes — una latencia mientras se inducen las enzimas, el crecimiento exponencial, una fase estacionaria cuando se agota el nutriente y una muerte lenta. Derecha: la ley de Monod, la tasa de crecimiento frente al nutriente limitante, con K_S la concentración a la que el crecimiento es la mitad del máximo. — Izquierda: un cultivo por lotes — una latencia mientras se inducen las enzimas, el crecimiento exponencial, una fase estacionaria cuando se agota el nutriente y una muerte lenta. Derecha: la ley de Monod, la tasa de crecimiento frente al nutriente limitante, con $K_{S}$ la concentración a la que el crecimiento es la mitad del máximo.

Definición 12.5 (Fases y estados)

En un matraz nuevo (un cultivo por lotes) las células primero se detienen — la fase de latencia, mientras inducen las enzimas que el medio nuevo exige —, luego crecen exponencialmente y después paran cuando se agota un nutriente o se acumula un desecho: la fase estacionaria, en la que las células se encogen, engrosan su envoltura, condensan su nucleoide en torno a proteínas protectoras, encienden los genes de estrés a través del factor sigma alternativo RpoS y pueden sobrevivir meses; sigue una fase de muerte en la que la mayoría se lisa y unas pocas viven de los restos. Algunas especies responden al ayuno con un programa de desarrollo: Bacillus subtilis se divide de forma asimétrica y la célula mayor engulle a la menor y construye la espora a su alrededor, una secuencia de ocho horas controlada por una cascada de factores sigma — las subunidades que dirigen la ARN-polimerasa hacia un conjunto de promotores — que se alterna entre los dos compartimentos, el primer ejemplo bacteriano de diferenciación y de señalización de célula a célula a través de una pared.

12.3 Detectarse unas a otras

Definición 12.6 (Percepción de quórum)

Las bacterias detectan su propia densidad mediante la percepción de quórum: cada célula secreta a velocidad constante una pequeña molécula señal, un autoinductor — lactonas de homoserina aciladas en las gramnegativas, péptidos cortos en las grampositivas —; la concentración en el medio sube con el número de células y, al cruzar un umbral, se une a un receptor que enciende un conjunto de genes, entre ellos la sintasa del propio autoinductor (de ahí el nombre). Los genes así controlados son los que solo compensan en compañía: la luz en Vibrio fischeri, los factores de virulencia en Staphylococcus aureus y en Pseudomonas aeruginosa, la matriz de las biopelículas, la competencia para captar ADN y la eliminación de las vecinas. Casi toda la detección bacteriana pasa por sistemas de dos componentes: una histidina-quinasa de membrana que detecta un estímulo y fosforila a un regulador de respuesta citoplasmático, que se une al ADN — una célula tiene docenas, para el fosfato, la osmolaridad, el oxígeno y los autoinductores de otras especies.

Evidencia. Nealson, Platt y Hastings (1970) cultivaron la bacteria marina luminosa Vibrio fischeri a partir de un inóculo diluido y encontraron que las células no producían luz hasta alcanzar una densidad de unos $10^{7}$ por mililitro, y entonces se encendían todas a la vez; el medio en el que había crecido un cultivo denso, esterilizado y añadido a un cultivo diluido, encendía la luz al instante. Las células estaban contando una sustancia secretada, no el tiempo ni el nutriente. La sustancia se identificó como una acil-homoserina-lactona (Eberhard, 1981), y los genes — luxI para la sintasa, luxR para el receptor y el operón de la luciferasa que controlan — se clonaron en E. coli, que entonces brillaba al amontonarse. En el calamar que aloja a la bacteria a $10^{10}$ por mililitro, el órgano luminoso brilla; en el mar, donde las bacterias están diluidas, están oscuras y se ahorran el coste. ∎

Proposición 12.7 (Un umbral de densidad)

Supóngase que cada una de $N$ células de un volumen $V$ secreta autoinductor a razón de $p$ moléculas por segundo, y que la molécula se pierde (degradada o diluida) con velocidad de primer orden $k$ . La concentración se aproxima a $A^{*} = pN/(kV)$ , proporcional a la densidad celular $N/V$ , con constante de tiempo $1/k$ ; el receptor se enciende cuando $A^{*}$ alcanza su umbral $A_{\text{umbr}}$ , es decir, a la densidad

\left(\frac{N}{V}\right)_{\text{umbr}} = \frac{k\,A_{\text{umbr}}}{p}.

En un espacio cerrado — el órgano luminoso de un calamar, un absceso, el moco de un pulmón — $k$ es pequeña porque la señal no se la llevan, de modo que la densidad umbral se alcanza con menos células; en mar abierto no se alcanza nunca. La célula no mide por tanto su número, sino su número por unidad del volumen que comparte, que es lo que importa para cualquier acto cooperativo, y la retroalimentación positiva del autoinductor sobre su propia sintasa hace brusco el cambio: en cuanto unas pocas células cruzan el umbral, su producción adicional empuja al resto a cruzarlo.

Demostración. $\mathrm{d}A/\mathrm{d}t = pN/V - kA$ tiene el estado estacionario $A^{*} = pN/(kV)$ y relaja hacia él como $e^{-kt}$ . Igualando $A^{*} = A_{\text{umbr}}$ y despejando $N/V$ se obtiene la densidad umbral. ∎

Izquierda: un cultivo denso de Vibrio fischeri brillando, junto a otro diluido que está oscuro — las mismas células, por encima y por debajo de su quórum. Derecha: una prueba de difusión en disco; el diámetro de cada halo claro mide la sensibilidad de la bacteria al antibiótico de ese disco, y el disco sin halo marca una resistencia. — Izquierda: un cultivo denso de *Vibrio fischeri* brillando, junto a otro diluido que está oscuro — las mismas células, por encima y por debajo de su quórum. Derecha: una prueba de difusión en disco; el diámetro de cada halo claro mide la sensibilidad de la bacteria al antibiótico de ese disco, y el disco sin halo marca una resistencia.

12.4 El tráfico de genes

Definición 12.8 (Transferencia horizontal de genes)

Las bacterias se reproducen de forma clonal pero intercambian genes por tres rutas. La transformación: la captación de ADN desnudo del ambiente por una célula competente — la ruta por la que los neumococos de Griffith adquirieron su cápsula y con la que Avery demostró que el principio transformante era ADN (1944). La transducción: un fago que empaqueta un trozo de ADN del hospedador y lo inyecta en el siguiente (Capítulo 13). La conjugación: la transferencia de un plásmido a través de un pilus y de un puente de apareamiento desde una donadora que lo lleva hasta una receptora, demostrada por Lederberg y Tatum (1946) con cepas auxótrofas de E. coli que producían recombinantes prototrofas solo al mezclarse. Los plásmidos conjugativos llevan sus propios genes de transferencia; muchos llevan además genes de resistencia, a menudo agrupados en integrones y flanqueados por transposones, de modo que un solo apareamiento puede transferir la resistencia a cinco antibióticos de una vez, entre especies distintas. La consecuencia es que una especie bacteriana tiene un genoma central compartido por todas las cepas y un genoma accesorio que varía — un pangenoma: dos cepas de E. coli pueden diferir en una quinta parte de sus genes, y las cepas patógenas se distinguen de las inocuas sobre todo por islas adquiridas de genes de virulencia. Los genes del capítulo de mutación del volumen de segundo año surgen por mutación; los de este capítulo, en su mayoría, llegan.

Las tres rutas de la transferencia horizontal. Los genes de resistencia, de virulencia y de metabolismo se mueven entre células — y entre especies — más deprisa de lo que la mutación podría fabricarlos.

Evidencia. Robert Koch (1876–1884) estableció que una bacteria concreta causa una enfermedad concreta: aisló Bacillus anthracis de animales enfermos, lo cultivó en cultivo puro sobre medio sólido (la placa de agar y la colonia aislada son inventos de su laboratorio), mostró que el cultivo reproducía el carbunco en animales sanos y podía volver a aislarse de ellos — los postulados que aún definen a un patógeno — y pasó luego al bacilo de la tuberculosis y al vibrión del cólera. Alexander Fleming (1928) advirtió que un moho que contaminaba una placa de estafilococos había despejado una zona a su alrededor; la sustancia, la penicilina, la purificaron y demostraron que curaba infecciones Florey y Chain (1940–1941), y en menos de una década los estafilococos resistentes con una enzima que destruye la penicilina eran frecuentes en los hospitales — una advertencia que el propio Fleming dio en su discurso del Nobel. ∎

Robert Koch, que demostró que bacterias concretas causan enfermedades concretas e inventó los métodos para cultivarlas (Wellcome Collection, CC BY 4.0). Derecha: Alexander Fleming en su laboratorio con placas del moho cuyo producto llegó a ser la penicilina (archivo de la Armada de los EE. UU., dominio público).

12.5 Antibióticos y resistencia

Definición 12.9 (Antibióticos)

Un antibiótico es una molécula que mata bacterias o detiene su crecimiento a concentraciones inocuas para el hospedador, actuando sobre una diana que el hospedador no tiene o tiene en otra forma — la toxicidad selectiva. Las dianas son pocas. La pared celular: los $\beta$ -lactámicos (penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos) imitan el D-Ala-D-Ala terminal del péptido del peptidoglicano y acilan a las enzimas que lo entrecruzan, de modo que la pared en crecimiento es débil y la célula estalla por su propia turgencia; la vancomicina une el propio D-Ala-D-Ala. El ribosoma, cuya forma bacteriana difiere de la eucariota: los aminoglicósidos (la subunidad pequeña, con lecturas erróneas), las tetraciclinas (que bloquean la entrada del ARNt), los macrólidos y el cloranfenicol (el túnel de salida y la peptidil-transferasa de la subunidad grande). La ADN-girasa y la topoisomerasa IV: las quinolonas. La ARN-polimerasa: la rifampicina. La síntesis de folato, que los animales no hacen: las sulfamidas y el trimetoprim. La membrana: las polimixinas, último recurso. La concentración mínima inhibitoria (CMI) es la concentración más baja de un fármaco que impide el crecimiento visible de una cepa; una cepa se llama resistente cuando su CMI supera la concentración que el fármaco alcanza en el paciente.

Método 12.10 (Medir la sensibilidad)

Dos pruebas. La dilución en caldo: inocúlese un número fijo de células (unas $5\times 10^{5}$ por mililitro) en una fila de tubos o pocillos con el antibiótico en pasos dobles, incúbese toda la noche y léase el primer pocillo transparente: esa concentración es la CMI. La difusión en disco: extiéndase la cepa en una placa de agar, colóquense discos de papel cargados con cantidades conocidas de varios antibióticos e incúbese; el fármaco difunde hacia fuera y su concentración cae con la distancia, y el crecimiento queda inhibido hasta el radio en el que la concentración iguala a la CMI, de modo que el diámetro del halo claro — leído en tablas calibradas — da la sensibilidad a cada disco en una sola placa. Ambas pruebas duran un día; secuenciar el genoma en busca de genes y mutaciones de resistencia conocidos cuesta lo mismo y empieza a sustituirlas.

Definición 12.11 (Resistencia)

Una bacteria resiste a un antibiótico por uno de cinco medios. Destruye el fármaco: las $\beta$ -lactamasas hidrolizan el anillo $\beta$ -lactámico, y las variantes de espectro extendido y las carbapenemasas destruyen hoy las más nuevas. Altera la diana: una mutación de la proteína ribosómica o de la girasa que el fármaco une o, en el SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina), un gen adquirido de una enzima de entrecruzamiento a la que los $\beta$ -lactámicos no se unen; la resistencia a la vancomicina sustituye el D-Ala terminal por D-lactato, que el fármaco no reconoce. Expulsa el fármaco con bombas de expulsión, a menudo de amplia especificidad. Impide que el fármaco entre, perdiendo una porina. O sortea el paso bloqueado con una enzima alternativa. Las mutaciones de la diana surgen por azar en el paciente a velocidades de $10^{-8}$ a $10^{-6}$ por división y se seleccionan durante el tratamiento; las enzimas y las bombas se adquieren en su mayoría en plásmidos del inmenso reservorio de bacterias del suelo y del intestino, en el que evolucionaron durante eras frente a los antibióticos que fabrican los hongos y otras bacterias. Las persistentes — células latentes que sobreviven a un fármaco sin ser genéticamente resistentes — explican las recaídas tras tratamientos que deberían haber funcionado.

Proposición 12.12 (Por qué la resistencia es inevitable y la combinación es la respuesta)

Una infección de $10^{9}$ células tratada con un fármaco frente al que las mutaciones de resistencia surgen a $10^{-8}$ por división ya contiene unas diez células resistentes; el fármaco mata a las demás y las diez se adueñan del terreno — la aritmética del Capítulo 11 sin más, ya que una población bacteriana y un tumor son ambos clones que evolucionan bajo selección. Dos fármacos de dianas independientes se enfrentan a una célula doblemente resistente a $10^{-16}$ por división, que mil millones de células no contienen. Es por esto por lo que la tuberculosis, cuyas lesiones albergan de $10^{8}$ a $10^{9}$ bacilos, se trata con tres o cuatro fármacos a la vez desde los años cincuenta y por lo que su monoterapia producía resistencia en cuestión de meses; y es también por lo que todo uso de un antibiótico, en un paciente o en un cebadero, selecciona resistencia en algún sitio, y por lo que el ritmo de aparición de antibióticos nuevos — ninguno de clase nueva contra las gramnegativas desde los años sesenta — es la medida frente a la que se cuentan las pérdidas. Los remedios son los de cualquier contienda evolutiva: usar menos, combinar, terminar el tratamiento para que las células parcialmente resistentes no sobrevivan para reproducirse, y buscar dianas nuevas.

Ejemplo 12.13 (La ventana de selección de mutantes)

Una cepa tiene una CMI de $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; sus mutantes resistentes de primer paso, presentes a razón de uno de cada $10^{7}$ , tienen una CMI de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ . Una dosis que mantenga el fármaco en $4\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ mata al tipo silvestre y deja a los mutantes crecer sin competencia: el intervalo de concentraciones entre la CMI del tipo silvestre y la de los mutantes es la ventana de selección de mutantes, y un tratamiento que se quede dentro de ella cría resistencia. Una dosis por encima de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ mata a los dos; una dosis demasiado baja, o un tratamiento interrumpido cuando el paciente se encuentra mejor y el nivel del fármaco está bajando por la ventana, es como se fabrica una población resistente. La misma lógica fija las pautas del tratamiento de la tuberculosis: seis meses, cuatro fármacos y dosis por encima de la CMI de todo mutante de un solo paso.

La ventana de selección de mutantes. Un nivel de fármaco por encima de la CMI de los mutantes lo mata todo; entre las dos CMI (zona sombreada) mata al tipo silvestre y selecciona a los mutantes. Una dosis cuyo nivel cae por la ventana durante horas, o un tratamiento interrumpido antes de tiempo, cría resistencia.

Observación 12.14 (La mayoría de las bacterias no son patógenas)

Las bacterias de la clínica de este capítulo son una minoría minúscula. Del millón de especies estimadas, unos pocos centenares causan enfermedad humana; el resto llevan los ciclos del nitrógeno, del azufre y del carbono (el volumen de segundo año), fijan el nitrógeno de todas las leguminosas, digieren la celulosa de todos los rumiantes y componen los microbiomas del Capítulo 14, cuya pérdida bajo un tratamiento antibiótico es un coste de cada tanda. Los propios antibióticos son moléculas suyas — armas y señales que evolucionaron entre bacterias del suelo y hongos mucho antes de que hubiera hospitales — y también lo son casi todos los genes de resistencia.

12.6 Ejercicios

Ejercicio 12.1 ★

Descríbanse las envolturas grampositiva y gramnegativa y explíquese por qué la tinción de Gram las distingue.

Solución

Solución de Ejercicio 12.1.

Grampositiva: membrana citoplasmática envuelta en una pared gruesa de peptidoglicano de muchas capas, atravesada por ácidos teicoicos. Gramnegativa: una capa fina de peptidoglicano en un periplasma y después una membrana externa cuya monocapa exterior es lipopolisacárido, con porinas. El complejo de cristal violeta y yodo queda atrapado en la pared gruesa y deshidratada por el alcohol de la grampositiva (morada), pero se lava fuera de la gramnegativa a través de su pared fina y su membrana externa alterada, que toma entonces la contratinción rosa.

Ejercicio 12.2 ★

Un cultivo de $10^{3}$ células por mililitro llega a $10^{9}$ en $8\,\mathrm{h}$ de crecimiento exponencial. Hállense el número de generaciones, el tiempo de generación y $\mu$ .

Solución

Solución de Ejercicio 12.2.

$10^{6}$ veces $= 2^{19.9}$ : unas $20$ generaciones; $T = 8\,\mathrm{h}/20 = 24\,\mathrm{min}$ ; $\mu = \ln 2/0.4\,\mathrm{h} = 1.7\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Ejercicio 12.3 ★

Nómbrense las tres rutas de la transferencia horizontal de genes y dese el experimento clásico que demostró cada una.

Solución

Solución de Ejercicio 12.3.

Transformación — Griffith (1928) y Avery, MacLeod y McCarty (1944): los neumococos virulentos muertos por calor transforman a los avirulentos vivos, y el agente es ADN. Transducción — Zinder y Lederberg (1952): el fago P22 lleva genes de Salmonella de una cepa a otra a través de un filtro que detiene a las células. Conjugación — Lederberg y Tatum (1946): dos cepas auxótrofas de E. coli dan recombinantes prototrofas solo al mezclarse, y hace falta contacto celular (el tubo en U de Davis).

Ejercicio 12.4 ★

Dense la diana de la penicilina, de la estreptomicina, del ciprofloxacino y de la rifampicina, y dígase por qué cada una es selectivamente tóxica.

Solución

Solución de Ejercicio 12.4.

Penicilina: las transpeptidasas que entrecruzan el peptidoglicano, que las células animales no tienen. Estreptomicina: la subunidad ribosómica pequeña, cuya forma bacteriana difiere de la eucariota. Ciprofloxacino: la ADN-girasa, una topoisomerasa bacteriana ausente en el ser humano. Rifampicina: la subunidad $\beta$ de la ARN-polimerasa bacteriana, que la enzima eucariota no comparte.

Ejercicio 12.5 ★★

Un quimiostato tiene $\mu_{\max} = 0.8\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.02\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $Y = 0.4$ . Calcúlense $S^{*}$ y $X^{*}$ en $D = 0.2$ , $0.6$ y $0.79$ h $^{-1}$ , y la tasa de dilución a la que empieza el arrastre.

Solución

Solución de Ejercicio 12.5.

$S^{*} = K_{S}D/(\mu_{\max} - D)$ , $X^{*} = Y(S_{0} - S^{*})$ . $D = 0.2$ : $S^{*} = 0.0067\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.80\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . $D = 0.6$ : $S^{*} = 0.06$ , $X^{*} = 0.78$ . $D = 0.79$ : $S^{*} = 1.58$ , $X^{*} = 0.17$ . Arrastre cuando $D = \mu(S_{0}) = 0.8\times 2/2.02 = 0.79\,\mathrm{h}^{-1}$ .

Ejercicio 12.6 ★★

Con la Proposición 12.7, compárese la densidad umbral de la percepción de quórum en un órgano luminoso de calamar ( $k = 0.01\,\mathrm{h}^{-1}$ ) y en agua de mar en movimiento ( $k = 10\,\mathrm{h}^{-1}$ ), con $p = 100$ moléculas por célula y hora y $A_{\text{umbr}} = 10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ( $6\times 10^{12}$ moléculas por litro).

Solución

Solución de Ejercicio 12.6.

$(N/V)_{\text{umbr}} = kA_{\text{umbr}}/p$ . Órgano luminoso: $0.01\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{8}$ por litro $= 6\times 10^{5}$ por mL. Agua de mar: $10\times 6\times 10^{12}/100 = 6\times 10^{11}$ por litro $= 6\times 10^{8}$ por mL — mil veces más, y nunca se alcanza en el mar.

Ejercicio 12.7 ★★

Una placa de difusión en disco muestra halos de $25$ , $12$ y $0\,\mathrm{mm}$ para tres fármacos. Interprétese cada uno y explíquese por qué un diámetro de halo puede convertirse en una CMI.

Solución

Solución de Ejercicio 12.7.

$25\,\mathrm{mm}$ : sensible, CMI baja. $12\,\mathrm{mm}$ : sensibilidad reducida, intermedia — puede fracasar a dosis corrientes. $0\,\mathrm{mm}$ : resistente, con crecimiento hasta el disco. El fármaco difunde desde el disco de modo que su concentración cae con la distancia de forma reproducible; el crecimiento se detiene donde la concentración iguala a la CMI, así que el radio del halo y la CMI se relacionan por una curva de calibración establecida con cepas de CMI conocida.

Ejercicio 12.8 ★★

Explíquese cómo un solo suceso de conjugación puede hacer resistente a cinco antibióticos a una Klebsiella sensible, y por qué los genes de resistencia se encuentran tan a menudo juntos en plásmidos.

Solución

Solución de Ejercicio 12.8.

El plásmido conjugativo lleva un integrón cuya serie de casetes contiene varios genes de resistencia, más transposones que llevan más; el plásmido cruza en un solo apareamiento y los expresa todos. Se agrupan porque la selección por cualquiera de los fármacos mantiene todo el plásmido, de modo que los genes que viajan de gorra en él persisten (la coselección); los integrones capturan casetes; los transposones saltan a los plásmidos; y la unidad de transferencia es el plásmido, no el gen.

Ejercicio 12.9 ★★

Un paciente tiene $10^{9}$ bacterias y toma un fármaco frente al que la resistencia surge a $10^{-7}$ por división. Calcúlense las células resistentes esperadas al inicio; después, con dos fármacos independientes. ¿Por qué las persistentes son otro problema?

Solución

Solución de Ejercicio 12.9.

Un solo fármaco: $10^{-7}\times 10^{9} = 100$ células resistentes esperadas. Dos fármacos independientes: $10^{-14}\times 10^{9} = 10^{-5}$ . Las persistentes no son mutantes: una pequeña fracción de células latentes sobrevive a cualquier fármaco y vuelve a crecer como una población sensible cuando el fármaco se retira, de modo que un segundo fármaco no ayuda; solo un tratamiento lo bastante largo como para atraparlas al despertar, o un fármaco activo sobre células latentes.

Ejercicio 12.10 ★★★

Muéstrese que el estado estacionario del quimiostato es estable: pertúrbese $X$ ligeramente por encima de $X^{*}$ y sígase el signo de $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t$ y de $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t$ . Explíquese después por qué dos especies que compiten por un nutriente en un quimiostato no pueden coexistir en el estado estacionario, y cuál gana a un $D$ dado.

Solución

Solución de Ejercicio 12.10.

$X > X^{*}$ : el consumo $\mu X/Y$ supera al suministro, de modo que $S$ cae por debajo de $S^{*}$ ; entonces $\mu(S) < D$ y $\mathrm{d}X/\mathrm{d}t < 0$ , y $X$ vuelve a bajar; al bajar $X$ , $S$ sube de nuevo. Las dos desviaciones se corrigen: el estado estacionario es estable. Dos especies: cada una necesita $\mu_{i}(S) = D$ para persistir, lo que fija su propio $S_{i}^{*}$ ; el nutriente solo puede tomar un valor, de modo que persiste a lo sumo una especie. La que tiene el $S^{*}(D)$ más bajo lleva $S$ por debajo de lo que la otra necesita, y la otra es arrastrada fuera; cuál sea esa especie puede cambiar con $D$ si sus curvas de Monod se cruzan.

Ejercicio 12.11 ★★★

El autoinductor induce su propia sintasa. Modifíquese el modelo de la Proposición 12.7 de modo que $p$ salte de $p_{0}$ a $p_{1} \gg p_{0}$ cuando $A > A_{\text{umbr}}$ , y muéstrese que el sistema puede tener dos estados estables en un intervalo de densidades (la histéresis): una población que se ha encendido sigue encendida a una densidad en la que una población ingenua estaría apagada. ¿Cuál es la utilidad biológica de eso?

Solución

Solución de Ejercicio 12.11.

Con la densidad $\rho = N/V$ , el estado apagado $A = p_{0}\rho/k$ existe mientras se mantenga por debajo de $A_{\text{umbr}}$ , es decir, $\rho < kA_{\text{umbr}}/p_{0}$ ; el estado encendido $A = p_{1}\rho/k$ existe mientras se mantenga por encima, es decir, $\rho > kA_{\text{umbr}}/p_{1}$ . Para $kA_{\text{umbr}}/p_{1} < \rho < kA_{\text{umbr}}/p_{0}$ los dos son coherentes consigo mismos: una población que se ha encendido se mantiene encendida con su producción mayor, y una que no lo ha hecho sigue apagada. Utilidad: el compromiso — una vez que una colonia ha decidido construir una biopelícula o liberar toxina, una bajada de densidad no deshace la decisión, y el cambio es brusco y sincrónico en lugar de gradual.

Ejercicio 12.12 ★★★

Explíquese la ventana de selección de mutantes y úsese para argumentar a favor o en contra de cada cosa: (a) dosis altas en tandas cortas; (b) dosis bajas en tandas largas; (c) interrumpir cuando ceden los síntomas; (d) la terapia combinada.

Solución

Solución de Ejercicio 12.12.

(a) Dosis altas en tandas cortas: el nivel se mantiene por encima de la CMI de los mutantes y mata por igual al tipo silvestre y a los mutantes de primer paso — a favor, con el límite de la toxicidad. (b) Dosis bajas en tandas largas: el nivel se queda en la ventana durante días y cría resistencia — en contra. (c) Interrumpir cuando ceden los síntomas: los supervivientes son las células menos sensibles y el nivel que baja atraviesa la ventana — en contra. (d) Combinación: una célula ha de ser resistente a los dos, cosa que mil millones de células no contienen — a favor.

12.7 Problema: un quimiostato y una clínica

Problema 12.1

Problema de fin de semana — un cultivo crecido en un matraz y mantenido en un quimiostato, una bacteria luminosa contada hasta su quórum y una infección tratada frente a la aritmética de la resistencia, hasta llegar a las células del quimiostato, a la densidad a la que se enciende la luz y a las probabilidades de que una tanda de dos fármacos encuentre una célula resistente

Datos: E. coli a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , $T = 20\,\mathrm{min}$ ; una célula pesa $1\,\mathrm{pg}$ . Quimiostato: $V = 1\,\mathrm{L}$ , $F = 0.5\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $\mu_{\max} = 1.0\,\mathrm{h}^{-1}$ , $K_{S} = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $S_{0} = 2\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ de glucosa, $Y = 0.5$ . Vibrio: $p = 500$ moléculas de autoinductor por célula y hora, $A_{\text{umbr}} = 6\times 10^{12}$ moléculas por litro ( $10\,\mathrm{nmol}/\mathrm{L}$ ), $k = 0.05\,\mathrm{h}^{-1}$ en el órgano luminoso. Infección: $10^{9}$ células; resistencia al fármaco A a $10^{-8}$ por división y al fármaco B a $10^{-7}$ ; CMI del tipo silvestre para A, $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , y del mutante de primer paso, $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ; una dosis da $16\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ que cae con semivida $4\,\mathrm{h}$ .

Parte I — El matraz.

Una célula en $100\,\mathrm{mL}$ de caldo. ¿Cuántas células al cabo de $6\,\mathrm{h}$ de crecimiento exponencial, y qué densidad por mL?
El caldo sostiene como mucho $2\times 10^{9}$ células por mL. ¿Cuándo se detiene el crecimiento, y cuál es la masa de células del cultivo?
¿Cuánto tardarían los descendientes de una célula en alcanzar la masa de la Tierra ( $6\times 10^{27}$ g)? Coméntese.
La fase de latencia dura $1\,\mathrm{h}$ cuando se inoculan en medio fresco células de la fase estacionaria, y casi nada cuando se usan células en fase exponencial. Explíquese.
Calcúlese $\mu$ a partir de $T$ . Si se cambia el medio a un azúcar en el que $T = 60\,\mathrm{min}$ , ¿cuál es $\mu$ , y por qué factor cae el número de células al cabo de $6\,\mathrm{h}$ ?
Una muestra del cultivo estacionario se extiende en una placa y da $200$ colonias a partir de $0.1\,\mathrm{mL}$ de una dilución $10^{-6}$ . ¿Cuál es el recuento de viables, y por qué podría diferir de un recuento al microscopio?

Parte II — El quimiostato.

Calcúlense la tasa de dilución $D$ y el tiempo de generación que el cultivo se ve obligado a adoptar.
Calcúlense $S^{*}$ y $X^{*}$ (en g/L y en células por mL).
¿Cuántas células salen del recipiente por hora? ¿Cuántas generaciones recorre el cultivo en un mes?
La bomba se sube a $F = 0.95\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ . ¿Nuevos $S^{*}$ y $X^{*}$ ? ¿Qué ocurre con $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ ?
Aparece un mutante con $\mu_{\max} = 1.2\,\mathrm{h}^{-1}$ y el mismo $K_{S}$ . Con $D = 0.5$ , ¿qué $S^{*}$ necesita, y qué le ocurre a la cepa original? (Úsese el Ejercicio 12.10.)
Un mes de funcionamiento son $700$ generaciones. Si una mutación beneficiosa surge a $10^{-9}$ por división y el recipiente contiene $10^{12}$ células, ¿cuántas mutaciones beneficiosas surgen por generación? ¿Qué dice esto sobre la evolución en un quimiostato?

Parte III — El quórum.

Calcúlese la densidad celular umbral para la luz en el órgano luminoso, en células por mL.
El órgano luminoso contiene $1\,\text{µ}\mathrm{L}$ de bacterias a $10^{10}$ por mL. ¿Por qué factor supera el autoinductor al umbral?
En el agua de mar la señal se la lleva la corriente con $k = 20\,\mathrm{h}^{-1}$ . ¿Densidad umbral? Compárese con las $10^{2}$ células por mL de mar abierto.
Después de que el calamar expulse el $90\,\%$ de las bacterias al amanecer, ¿cuánto tardan las $10^{9}$ por mL restantes, que se dividen cada $2\,\mathrm{h}$ , en restaurar $10^{10}$ por mL? ¿Se apaga la luz entretanto?
Cada célula que brilla gasta alrededor del $20\,\%$ de su energía en la luz. ¿Por qué se ve favorecida una célula oscura en el mar, y por qué no en el órgano?
Un patógeno usa el mismo sistema para retrasar sus toxinas hasta ser numeroso. Propóngase una estrategia farmacológica que aproveche esto y dígase por qué podría seleccionar resistencia más despacio que un antibiótico.

Parte IV — La clínica.

Número esperado de células resistentes a A al empezar el tratamiento; a B; a ambos.
Probabilidad de que no exista ninguna célula resistente a A; y a ambos.
Tras la dosis, ¿cuándo baja el nivel del fármaco a $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ , y a $1\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ ? ¿Cuánto tiempo pasa por dosis dentro de la ventana de selección de mutantes?
Si el fármaco se administra cada $12\,\mathrm{h}$ , ¿qué fracción del tiempo está el nivel dentro de la ventana, y qué predice eso a lo largo de una tanda de diez días solo con A?
Propóngase un cambio de pauta que mantenga el nivel por encima de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ en todo momento (calcúlese el intervalo o la dosis necesarios), y enúnciese su coste.
Una célula de cada $10^{4}$ es persistente, latente e intocable por cualquier concentración de ninguno de los dos fármacos. ¿Cuántas sobreviven a la tanda, qué ocurre cuando se retira el fármaco y qué implica esto para la duración del tratamiento?
Resúmase: las células por mL del quimiostato (pregunta 8), la densidad umbral de la luz (pregunta 13) y la probabilidad de que la tanda de dos fármacos no encuentre ninguna célula resistente (pregunta 20).

Solución

Solución de Problema 12.1.

1. $18$ generaciones: $2^{18} = 2.6\times 10^{5}$ células, $2.6\times 10^{3}$ por mL. 2. $2\times 10^{9}\times 100 = 2\times 10^{11}$ células $= 2^{37.5}$ : al cabo de $12.5\,\mathrm{h}$ ; masa $0.2\,\mathrm{g}$ . 3. $6\times 10^{27}/10^{-12} = 6\times 10^{39} = 2^{132}$ células: $132$ generaciones, $44\,\mathrm{h}$ . Los nutrientes, el oxígeno y los desechos lo detienen en un día; el crecimiento exponencial siempre es breve. 4. Las células estacionarias han desmontado sus ribosomas y reprimido sus enzimas metabólicas; han de reconstruirlos antes de dividirse. Las células exponenciales llegan del todo equipadas. 5. $\mu = \ln 2/0.333\,\mathrm{h} = 2.08\,\mathrm{h}^{-1}$ ; con $T = 60\,\mathrm{min}$ , $0.69\,\mathrm{h}^{-1}$ ; tras $6\,\mathrm{h}$ , $2^{6} = 64$ en lugar de $2^{18}$ : un factor $2^{12} \approx 4000$ menos. 6. $200/(0.1\times 10^{-6}) = 2\times 10^{9}$ células viables por mL. El microscopio cuenta además las células muertas y las que no crecerán en la placa, y un grumo da una sola colonia. 7. $D = 0.5/1 = 0.5\,\mathrm{h}^{-1}$ ; $T = \ln 2/0.5 = 1.39\,\mathrm{h} = 83\,\mathrm{min}$ . 8. $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.5 = 0.01\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; $X^{*} = 0.5\times 1.99 \approx 1\,\mathrm{g}/\mathrm{L} = 10^{12}$ células por litro, $10^{9}$ por mL. 9. $0.5\times 10^{12} = 5\times 10^{11}$ células por hora; $720/1.39 \approx 520$ generaciones al mes. 10. $D = 0.95$ : $S^{*} = 0.01\times 0.95/0.05 = 0.19\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ , $X^{*} = 0.5\times 1.81 = 0.9\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ . Con $F = 1.1\,\mathrm{L}/\mathrm{h}$ , $D > \mu_{\max}$ : arrastre. 11. El mutante mantiene $S^{*} = 0.01\times 0.5/0.7 = 0.0071\,\mathrm{g}/\mathrm{L}$ ; a esa glucosa la cepa original crece a $1.0\times 0.0071/0.0171 = 0.42\,\mathrm{h}^{-1} < D$ y decae como $e^{-0.08t}$ : queda arrastrada fuera en unas pocas semanas. El mutante se adueña del recipiente. 12. $10^{-9}\times 10^{12} = 1000$ mutaciones beneficiosas por generación: la adaptación es continua, con un clon ventajoso nuevo barriendo la población cada pocos centenares de generaciones — el quimiostato es una máquina de evolución. 13. $kA_{\text{umbr}}/p = 0.05\times 6\times 10^{12}/500 = 6\times 10^{8}$ por litro $= 6\times 10^{5}$ células por mL. 14. $10^{10}/6\times 10^{5} \approx 1.7\times 10^{4}$ veces. 15. $20\times 6\times 10^{12}/500 = 2.4\times 10^{11}$ por litro, $2.4\times 10^{8}$ por mL — seis órdenes de magnitud por encima de las $10^{2}$ por mL del mar: oscuras. 16. Diez veces son $3.3$ duplicaciones, $6.6\,\mathrm{h}$ . A $10^{9}$ por mL la población sigue $1700$ veces por encima del umbral: la luz sigue encendida. 17. En el mar nadie ve la luz y no alimenta a ningún hospedador: un mutante oscuro se ahorra el $20\,\%$ y supera a los que brillan. En el órgano el calamar selecciona a favor de la luz — expulsa o no alimenta a las tramposas oscuras —, de modo que el coste compra un hogar. 18. Bloquéese el receptor o destrúyase el autoinductor (el apagado del quórum): las bacterias viven pero nunca despliegan sus toxinas, y el sistema inmunitario las elimina. Como las bacterias sensibles y las “resistentes” crecen igual — no se mata a nadie —, la ventaja selectiva de escapar al fármaco es pequeña, y la resistencia debería propagarse más despacio que frente a un fármaco que mata. 19. A: $10^{-8}\times 10^{9} = 10$ ; B: $100$ ; ambos: $10^{-15}\times 10^{9} = 10^{-6}$ . 20. $P_{0}(\text{A}) = e^{-10} = 5\times 10^{-5}$ ; $P_{0}(\text{ambos}) = e^{-10^{-6}} = 0.999999$ . 21. $16 \to 8$ : una semivida, $4\,\mathrm{h}$ ; $16 \to 1$ : cuatro, $16\,\mathrm{h}$ ; dentro de la ventana de las $4\,\mathrm{h}$ a las $16\,\mathrm{h}$ , $12\,\mathrm{h}$ por dosis. 22. Con una dosis cada $12\,\mathrm{h}$ : dentro de la ventana de la hora $4$ a la $12$ , dos tercios del tiempo; a lo largo de diez días los mutantes de primer paso de A — diez de ellos al principio — quedan seleccionados y A por sí solo fracasa. 23. Por encima de $8\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ en todo momento: dósese cada semivida ( $4\,\mathrm{h}$ ), o bien una dosis que alcance un máximo de $64\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ cada $12\,\mathrm{h}$ ( $64 \to 8$ en tres semividas), o bien una perfusión continua. Costes: la toxicidad de los máximos altos, o seis dosis al día que los pacientes no cumplirán. 24. $10^{-4}\times 10^{9} = 10^{5}$ persistentes sobreviven pase lo que pase con los fármacos; cuando cesa el tratamiento despiertan y vuelven a crecer como una población del todo sensible — una recaída. El tratamiento ha de durar lo bastante como para atraparlas al salir de la latencia, que es por lo que la tuberculosis dura seis meses. 25. $10^{9}$ células por mL en el quimiostato; la luz se enciende a $6\times 10^{5}$ células por mL; y $P_{0} = 0.999999$ de que la tanda de dos fármacos no encuentre ninguna célula resistente.

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