31Chromatografie

Een druppel energiedrank, verdund en gefiltreerd, wordt geïnjecteerd in een stalen buisje dat niet langer is dan een pen en gevuld is met silicakorrels van enkele micrometer. Een paar minuten later heeft een detector een lijn getekend met een handvol pieken, en uit de oppervlakte van een ervan meldt het laboratorium hoeveel cafeïne het blikje bevat, op enkele procenten na. Chromatografie scheidt de componenten van een mengsel door ze met verschillende snelheden door een kolom te laten racen; dit hoofdstuk legt uit waarom ze verschillend snel gaan, waarom hun pieken de breedte hebben die ze hebben, hoe je twee buren scheidt, en hoe je van een piek een hoeveelheid maakt.

Wat je al weet

Het schoolboek: papier- en dunnelaagchromatografie, chromatogram, loopvloeistof. Het deel van jaar 1: de verdelingscoëfficiënt, vloeistof-vloeistofextractie, de retentiefactor $R_f$ van een dunnelaagplaat. Hoofdstuk 7: de theoretische schotel van een destillatiekolom.

31.1 Principe

Definitie 31.1 (Chromatografie)

Chromatografie scheidt de componenten van een mengsel door ze te verdelen tussen een stationaire fase, vastgezet in een kolom of op een plaat, en een mobiele fase, een gas of een vloeistof die erlangs stroomt. Het meevoeren van de componenten door en uit de kolom met de mobiele fase is elutie.

Een molecuul beweegt alleen zolang het in de mobiele fase is; zolang de stationaire fase het vasthoudt, wacht het. Het wisselt onderweg miljoenen keren tussen de twee fasen, dus zijn gemiddelde snelheid wordt bepaald door de fractie van de tijd die het in elk ervan doorbrengt, dat wil zeggen door zijn verdelingsevenwicht.

Definitie 31.2 (Retentie)

De retentietijd $t_R$ van een verbinding is de tijd van de injectie tot het maximum van haar piek; de dode tijd $t_M$ is de retentietijd van een niet-weerhouden verbinding, die nooit in de stationaire fase komt. De retentiefactor $k$ van een verbinding op een kolom is

$$k = \frac{t_R - t_M}{t_M}.$$

Het is niet de $R_f$ van een dunnelaagplaat, die een afgelegde afstand meet, al beschrijven beide dezelfde verdeling.

Propositie 31.3 (Retentietijd)

Als de hoeveelheden van een verbinding in de stationaire en de mobiele fase van een plakje kolom bij evenwicht $n_s$ en $n_m$ zijn, beweegt de verbinding met $u/(1 + n_s/n_m)$, waarin $u$ de snelheid van de mobiele fase is, en is $t_R = t_M(1 + n_s/n_m)$.

Propositie 31.4 (Retentie en verdeling)

De retentiefactor is de verhouding van de hoeveelheden in de twee fasen, $k = n_s/n_m = KV_s/V_m$, waarin $K$ de verdelingscoëfficiënt is (concentratie in de stationaire fase gedeeld door concentratie in de mobiele fase) en $V_s$, $V_m$ de volumes van de fasen in de kolom.

Twee verbindingen scheiden als hun verdelingscoëfficiënten verschillen; de kolomgeometrie ($V_s/V_m$) vermenigvuldigt alle retenties op dezelfde manier. De mobiele fase veranderen, wat $K$ verandert, is de belangrijkste hefboom van de chemicus op de retentie.

31.2 Piekbreedte en schotelgetal

Een band blijft niet dun. Moleculen van dezelfde verbinding volgen verschillende wegen tussen de korrels, diffunderen langs de kolom en blijven willekeurig lang achter in de stationaire fase. De piek die aan de uitgang geregistreerd wordt, is zeer nauwkeurig een gaussfunctie met standaardafwijking $\sigma_t$ (in tijd), en hoe smaller hij is bij een gegeven $t_R$, hoe beter de kolom.

Definitie 31.5 (Schotelgetal)

Het schotelgetal van een kolom voor een verbinding is $N = (t_R/\sigma_t)^2$, waarin $\sigma_t$ de standaardafwijking van haar piek in tijd is. De schotelhoogte is $H = L/N$, voor een kolom met lengte $L$.

De namen komen van de destillatiekolom van Hoofdstuk 7: een chromatografische kolom gedraagt zich alsof ze een stapel van $N$ evenwichtstrappen was, elk $H$ hoog. De analogie is een manier van tellen, geen beeld van de kolom.

Propositie 31.6 (Schotelgetal uit een piek)

Met $w$ de basisbreedte tussen de raaklijnen in de buigpunten en $w_{1/2}$ de breedte op halve hoogte geldt

$$N = 16\left(\frac{t_R}{w}\right)^2 = 5.54\left(\frac{t_R}{w_{1/2}}\right)^2.$$

Propositie 31.7 (Vergelijking van Van Deemter)

De schotelhoogte hangt als volgt af van de lineaire snelheid $u$ van de mobiele fase:

$$H = A + \frac{B}{u} + Cu,$$

waarin $A$ staat voor de verschillende wegen door de pakking, $B/u$ voor diffusie langs de kolom (erger wanneer de moleculen langer blijven) en $Cu$ voor de trage uitwisseling met de stationaire fase (erger wanneer de mobiele fase voorbijjaagt). $H$ is het kleinst bij $u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{B/C}$, waar $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$.

De vorm van de vergelijking wordt aangenomen; haar minimum niet. $\mathrm dH/\mathrm du = -B/u^2 + C$ wordt nul bij $u = \sqrt{B/C}$, en daar is $B/u = Cu = \sqrt{BC}$, dus $H_{\min} = A + 2\sqrt{BC}$; de tweede afgeleide $2B/u^3$ is positief, dus dit is een minimum. Kleine korrels verkleinen $A$ en $C$: daarom gebruikt moderne vloeistofchromatografie deeltjes van enkele micrometer en hoge drukken om de mobiele fase erdoor te duwen.

31.3 Twee verbindingen scheiden

Definitie 31.8 (Selectiviteit en resolutie)

Voor twee naburige pieken met $k_2 > k_1$ is de selectiviteitsfactor $\alpha = k_2/k_1$, en de resolutie

$$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_1 + w_2},$$

de afstand tussen de pieken gedeeld door hun gemiddelde basisbreedte.

Bij $R_s = 1$ overlappen de pieken nog zichtbaar; bij $R_s = 1.5$ keert het signaal tussen hen terug naar de basislijn (basislijnscheiding), wat het gebruikelijke doel is voor kwantitatief werk.

Stelling 31.9 (Resolutievergelijking)

Voor twee naburige pieken met hetzelfde schotelgetal $N$ geldt

$$R_s = \frac{\sqrt N}{4}\,\frac{\alpha - 1}{\alpha}\,\frac{k_2}{1 + k_2}.$$

Methode 31.10 (Een resolutie verbeteren)

1. Efficiëntie: $R_s \propto \sqrt N$. De kolomlengte verdubbelen verdubbelt $N$ en de analysetijd, maar vermenigvuldigt $R_s$ maar met $\sqrt2 \approx 1.41$; kleinere deeltjes of het optimale debiet verhogen $N$ bij constante lengte.
2. Selectiviteit: de factor $(\alpha - 1)/\alpha$ is het gevoeligst. Verander de mobiele fase (oplosmiddel, pH), de stationaire fase of, bij gaschromatografie, de temperatuur.
3. Retentie: $k_2/(1+k_2)$ stijgt steil tot $k \approx 2$ en daarna langzaam, terwijl de tijd blijft toenemen als $1 + k$; mik op een $k$ tussen ongeveer 2 en 10.

31.4 Technieken

Definitie 31.11 (Chromatografische technieken)

Bij gaschromatografie (GC) is de mobiele fase een gas (helium, waterstof of stikstof) en de stationaire fase een vloeistoffilm op de binnenwand van een lange capillaire kolom, die in een oven staat. Bij hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) duwt een pomp een vloeibare mobiele fase door een korte kolom die gepakt is met kleine deeltjes. Bij HPLC met omgekeerde fase is de stationaire fase apolair (silica met lange alkylketens) en de mobiele fase een polair mengsel van water met methanol of acetonitril. Bij gradiëntelutie wordt de samenstelling van de mobiele fase tijdens de run veranderd, bij vloeistofchromatografie, om sterk weerhouden verbindingen sneller te elueren.

De keuze tussen beide volgt uit de vluchtigheid. GC vraagt verbindingen die verdampen zonder te ontleden, ruwweg onder $400{}^{\circ}\mathrm{C}$: oplosmiddelen, brandstoffen, geurstoffen, kleine organische moleculen. De oventemperatuur tijdens de run verhogen (een temperatuurprogramma) elueert zwaardere verbindingen sneller, zoals een gradiënt dat doet bij HPLC. HPLC kan alles aan wat oplost, ook zouten, suikers, geneesmiddelen en eiwitten. Bij omgekeerde fase komen de meest polaire verbindingen eerst en de meest apolaire laatst; meer organisch oplosmiddel aan de mobiele fase toevoegen verlaagt elke retentie. Preparatieve kolomchromatografie, en haar snellere variant, flashchromatografie, passen hetzelfde principe op grote schaal toe om grammen product te zuiveren, meestal op polaire silica met mengsels van hexaan en ethylacetaat.

31.5 Kwantitatieve analyse

De oppervlakte van een piek is evenredig met de hoeveelheid verbinding die de detector bereikte, maar de evenredigheidsconstante hangt af van de verbinding en van de detector. Geïnjecteerde volumes, in de orde van een microliter, zijn niet perfect reproduceerbaar. Een interne standaard neemt beide moeilijkheden weg.

Definitie 31.12 (Responsfactor en interne standaard)

Een interne standaard is een verbinding die afwezig is in het monster en die in een bekende hoeveelheid aan elke geanalyseerde oplossing toegevoegd wordt; ze moet gescheiden zijn van alle andere pieken en zich gedragen zoals de analyt. De responsfactor $F$ van een analyt ten opzichte van de interne standaard wordt gedefinieerd door

$$\frac{A_X}{A_{IS}} = F\,\frac{c_X}{c_{IS}},$$

waarin $A$ piekoppervlakten zijn en $c$ concentraties in de geïnjecteerde oplossing.

Propositie 31.13 (Kwantificering met een interne standaard)

Een $F$ die gemeten is op een ijkoplossing met bekende $c_X$ en $c_{IS}$ geeft, voor een monster waaraan de interne standaard is toegevoegd met concentratie $c_{IS}$, $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$, ongeacht het geïnjecteerde volume.

Methode 31.14 (Kwantificeren met een interne standaard)

1. Kies een standaard die qua structuur dicht bij de analyt staat, afwezig is in het monster, dicht bij de analyt elueert maar ervan gescheiden is ($R_s \ge 1.5$).
2. Injecteer een ijkoplossing met bekende $c_X$ en $c_{IS}$; bereken $F$ uit de verhouding van de oppervlakten.
3. Voeg de standaard met dezelfde $c_{IS}$ toe aan de monsteroplossing; injecteer; lees $A_X/A_{IS}$ af.
4. Bereken $c_X = (A_X/A_{IS})\,c_{IS}/F$, en reken dan via elke verdunning terug naar het oorspronkelijke monster.

Een externe ijking (een reeks standaarden van alleen de analyt, daarna het monster, allemaal op dezelfde manier geïnjecteerd) is eenvoudiger, maar steunt erop dat het geïnjecteerde volume en de detector tussen de runs constant blijven.

Geschiedenis — Kleurschrift, 1906

De botanicus Michail Tsvet goot een extract van groene bladeren op een glazen buis gevuld met gepoederd krijt en spoelde het door met een oplosmiddel: de pigmenten scheidden zich in gekleurde banden, groene chlorofyllen en gele carotenoïden. In 1906 noemde hij de methode chromatografie, “kleurschrift”. Ze werd een kwarteeuw lang grotendeels genegeerd, tot ze in de jaren 1930 opnieuw opgepakt werd voor natuurstoffen. (Portret: onbekende auteur, publiek domein; Wikimedia Commons.)

Veiligheid

Acetonitril en methanol, de gebruikelijke organische componenten van mobiele fasen voor HPLC, zijn ontvlambaar en giftig; hexaan, gebruikt bij kolomchromatografie, is ontvlambaar, schadelijk voor de gezondheid en giftig voor waterorganismen. Oplosmiddelafval wordt ingezameld, nooit in de gootsteen gegoten.

31.6 Oefeningen

Oefening 31.1 ★

Een verbinding heeft $t_R = 5.0\,\mathrm{min}$ op een kolom met een dode tijd van $1.0\,\mathrm{min}$. Bereken haar retentiefactor en de fractie van haar tijd die ze in de mobiele fase doorbrengt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.1.

$k = (5.0 - 1.0)/1.0 = 4.0$; fractie van de tijd in de mobiele fase $1/(1 + k) = 0.20$.

Oefening 31.2 ★

Een piek bij $t_R = 6.0\,\mathrm{min}$ heeft een basisbreedte van $0.30\,\mathrm{min}$. Bereken het schotelgetal.

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.2.

$N = 16(6.0/0.30)^2 = 16 \times 400 = 6400$.

Oefening 31.3 ★

Een kolom van $250\,\mathrm{mm}$ geeft $N = 10\,000$ voor een verbinding. Bereken de schotelhoogte.

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.3.

$H = 250\,\mathrm{mm}/10\,000 = 0.025\,\mathrm{mm} = 25\,\text{µ}\mathrm{m}$.

Oefening 31.4 ★

GC of HPLC? Ethanol in bloed; een eiwit; cafeïne in een drank; benzeen in benzine; suikers in vruchtensap.

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.4.

Ethanol in bloed: GC (vluchtig). Eiwit: HPLC. Cafeïne in een drank: HPLC (in water, zonder voorbehandeling niet vluchtig genoeg). Benzeen in benzine: GC. Suikers: HPLC (ze ontleden voor ze koken).

Oefening 31.5 ★★

Twee pieken: $t_{R1} = 4.0\,\mathrm{min}$, $w_1 = 0.40\,\mathrm{min}$; $t_{R2} = 4.6\,\mathrm{min}$, $w_2 = 0.50\,\mathrm{min}$. Bereken de resolutie. Zijn ze tot op de basislijn gescheiden?

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.5.

$R_s = 2(4.6 - 4.0)/(0.40 + 0.50) = 1.2/0.90 \approx 1.3$: niet helemaal tot op de basislijn gescheiden (onder 1.5).

Oefening 31.6 ★★

Hoeveel schotels zijn er nodig om twee verbindingen met $\alpha = 1.10$ en $k_2 = 4.0$ te scheiden bij $R_s = 1.5$?

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.6.

$\sqrt N = 4R_s\,\dfrac{\alpha}{\alpha - 1}\,\dfrac{1 + k_2}{k_2} = 4 \times 1.5 \times 11 \times 1.25 = 82.5$, dus $N \approx 6.8 \times 10^3$.

Oefening 31.7 ★★

Een kolom heeft $A = 5\,\text{µ}\mathrm{m}$, $B = 8\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$, $C = 2\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}/\mathrm{mm}$ (gegevens voor de oefening). Zoek de optimale snelheid en de kleinste schotelhoogte.

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.7.

$u_{\mathrm{opt}} = \sqrt{8/2} = 2\,\mathrm{mm}/\mathrm{s}$; $H_{\min} = 5 + 2\sqrt{16} = 13\,\text{µ}\mathrm{m}$.

Oefening 31.8 ★★

Voorspel de elutievolgorde van benzeen, fenol en tolueen bij HPLC met omgekeerde fase en een mobiele fase water–methanol, en wat er gebeurt wanneer de methanolfractie verhoogd wordt.

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.8.

Fenol (polaire $\ce{OH}$, waterstofbruggen met water) eerst, dan benzeen, dan tolueen (één $\ce{CH3}$ meer, apolairder). Meer methanol maakt de mobiele fase minder polair: alle drie elueren vroeger, in dezelfde volgorde.

Oefening 31.9 ★★

Een ijkoplossing van een analyt bij $20.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ met de interne standaard bij $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ geeft oppervlakten 860 en 400. Een monster waaraan de standaard is toegevoegd bij $10.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$, geeft oppervlakten 645 en 410. Bereken de responsfactor en de concentratie van de analyt (gegevens voor de oefening).

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.9.

$F = (860/400)/(20.0/10.0) = 2.15/2.00 = 1.075$. Monster: $c_X = (645/410) \times 10.0/1.075 \approx 14.6\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$.

Oefening 31.10 ★★★

Een scheiding geeft $R_s = 1.06$. Welke kolomlengte, ten opzichte van de huidige, geeft $R_s = 1.5$, en wat kost dat aan tijd? Welke andere hefbomen zijn er?

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.10.

$R_s \propto \sqrt N \propto \sqrt L$: $L$ moet vermenigvuldigd worden met $(1.5/1.06)^2 \approx 2.0$, wat de analysetijd en de druk verdubbelt. Andere hefbomen: de selectiviteit (mobiele fase, stationaire fase, temperatuur), kleinere deeltjes, het optimale debiet.

Oefening 31.11 ★★★

Bereken voor twee gaussische pieken van gelijke hoogte en breedte met basisbreedte $w = 4\sigma$ het signaal halverwege ertussen, ten opzichte van de piekhoogte, bij $R_s = 1$ en bij $R_s = 1.5$ (verwaarloos de bijdrage van de verre piek op elk maximum).

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.11.

De pieken liggen $4\sigma R_s$ uit elkaar, dus het midden ligt op $2\sigma R_s$ van elk. $R_s = 1$: elke piek draagt $\mathrm e^{-(2)^2/2} = \mathrm e^{-2} = 0.135$ bij; het dal ligt op $0.27$ van de piekhoogte. $R_s = 1.5$: $2\mathrm e^{-(3)^2/2} = 2\mathrm e^{-4.5} \approx 0.022$, ongeveer 2 %: in de praktijk terug op de basislijn.

Oefening 31.12 ★★★

Vergelijk bij constante $N$ en $\alpha$ de resolutiefactor $k_2/(1+k_2)$ en de relatieve analysetijd $1 + k_2$ voor $k_2 = 2$, 5 en 10. Welk bereik van $k$ zou je kiezen?

Oplossing

Oplossing van Oefening 31.12.

$k_2/(1+k_2)$: 0.67, 0.83, 0.91; tijd in eenheden $t_M$: 3, 6, 11. Van 2 naar 5 gaan wint 25 % aan resolutie voor twee keer de tijd; van 5 naar 10 9 % voor opnieuw bijna twee keer de tijd. Een $k$ van ongeveer 2 tot 5 is het gebruikelijke compromis.

31.7 Probleem: cafeïne in een energiedrank

Probleem 31.1

Weekendprobleem — de elutievolgorde bij omgekeerde fase, de prestaties van een kolom uit een chromatogram, de scheiding verbeteren, en kwantificering met een interne standaard

Gegevens voor de oefening (verzonnen, geen echte methode). Een energiedrank wordt tienmaal verdund ($5.00\,\mathrm{mL}$ tot $50.0\,\mathrm{mL}$) en theofylline wordt als interne standaard toegevoegd tot $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ in de verdunde oplossing. Kolom: $150\,\mathrm{mm}$, omgekeerde fase; mobiele fase water–methanol; uv-detectie. De niet-weerhouden matrix (suikers en zouten) elueert bij $t_M = 1.0\,\mathrm{min}$; theofylline bij $3.0\,\mathrm{min}$ (basisbreedte $0.18\,\mathrm{min}$); cafeïne bij $3.4\,\mathrm{min}$ (basisbreedte $0.20\,\mathrm{min}$). IJking: cafeïne $50.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ en theofylline $40.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$ geven oppervlakten 1500 en 1000. Monster: oppervlakten 970 (cafeïne) en 1010 (theofylline). Een blikje bevat $250\,\mathrm{mL}$.

Deel I — Omgekeerde fase.

1. Beschrijf de stationaire en de mobiele fase van een kolom met omgekeerde fase.
2. Waarom elueren de suikers bij de dode tijd?
3. Cafeïne is 1,3,7-trimethylxanthine, theofylline 1,3-dimethylxanthine. Verklaar hun elutievolgorde.
4. Waarom is theofylline hier een goede interne standaard?
5. Wat zou er met beide retentietijden gebeuren als de methanolfractie verhoogd werd?
6. Wat meet de dode tijd?

Deel II — Prestaties van de kolom.

7. Bereken de retentiefactoren van theofylline en cafeïne.
8. Bereken de selectiviteitsfactor.
9. Bereken het schotelgetal voor cafeïne en voor theofylline.
10. Bereken de schotelhoogte voor cafeïne.
11. Bereken de resolutie tussen de twee pieken.
12. Controleer ze met de resolutievergelijking.
13. Zijn de pieken tot op de basislijn gescheiden?

Deel III — Sneller of beter.

14. Om tijd te winnen, wordt de kolom ingekort tot $75\,\mathrm{mm}$ (zelfde pakking en debiet). Wat wordt de resolutie?
15. En de analysetijd?
16. Wat zou een kolom van $300\,\mathrm{mm}$ in plaats daarvan geven, en tegen welke kost?
17. Welke hefboom werkt in op $\alpha$?
18. Zou een grotere $k$ hier veel helpen?

Deel IV — Kwantificering.

19. Bereken de responsfactor van cafeïne ten opzichte van theofylline.
20. Waarom doet het geïnjecteerde volume er niet toe?
21. Bereken de concentratie cafeïne in de verdunde oplossing.
22. Bereken de concentratie cafeïne in de drank.
23. Wat zou er misgaan als een verbinding uit de matrix samen met theofylline elueerde?
24. Wat zou een externe ijking in plaats daarvan vragen?
25. Geef de massa cafeïne in een blikje van $250\,\mathrm{mL}$.

Oplossing

Oplossing van Probleem 31.1.

1. Stationair: silicakorrels met lange alkylketens, apolair. Mobiel: water met methanol, polair. 2. Ze zijn zeer polair en blijven in de mobiele fase: $k \approx 0$. 3. Cafeïne heeft één methylgroep meer dan theofylline, en theofylline een $\ce{N-H}$ die waterstofbruggen vormt met water: theofylline is polairder en elueert eerst. 4. Ze lijkt qua structuur op cafeïne (vergelijkbare respons en vergelijkbaar gedrag), is afwezig in de drank, en elueert dicht bij cafeïne terwijl ze ervan gescheiden blijft. 5. Beide zouden dalen: een minder polaire mobiele fase concurreert beter met de stationaire fase. 6. De tijd die de mobiele fase nodig heeft om de kolom te doorlopen, de tijd die een verbinding in beweging doorbrengt. 7. $k_{\mathrm{theo}} = (3.0 - 1.0)/1.0 = 2.0$; $k_{\mathrm{caf}} = 2.4$. 8. $\alpha = 2.4/2.0 = 1.2$. 9. Cafeïne $N = 16(3.4/0.20)^2 = 4624 \approx 4.6 \times 10^3$; theofylline $16(3.0/0.18)^2 \approx 4.4 \times 10^3$. 10. $H = 150\,\mathrm{mm}/4624 \approx 0.032\,\mathrm{mm} = 32\,\text{µ}\mathrm{m}$. 11. $R_s = 2(3.4 - 3.0)/(0.18 + 0.20) = 0.80/0.38 \approx 2.1$. 12. $\frac{\sqrt{4624}}{4} \times \frac{0.2}{1.2} \times \frac{2.4}{3.4} = 17 \times 0.167 \times 0.706 \approx 2.0$; het kleine verschil komt van de aanname van gelijke breedten in de vergelijking. 13. Ja: $R_s > 1.5$. 14. $N$ wordt gehalveerd: $R_s \approx 2.1/\sqrt2 \approx 1.5$, net basislijnscheiding. 15. Gehalveerd: cafeïne bij $1.7\,\mathrm{min}$. 16. $R_s \approx 2.1\sqrt2 \approx 3.0$, voor twee keer de tijd en twee keer de druk: hier verspilling. 17. De samenstelling van de mobiele fase (methanolfractie, pH, een ander organisch oplosmiddel) of de stationaire fase. 18. Weinig: $k_2/(1 + k_2) = 0.71$ al; bij $k_2 = 5$ zou het 0.83 zijn (+18 %) voor een analysetijd die vermenigvuldigd wordt met $6/3.4 \approx 1.8$. 19. $F = (1500/1000)/(50.0/40.0) = 1.50/1.25 = 1.20$. 20. Beide pieken komen uit dezelfde injectie: het volume valt weg in de verhouding van de oppervlakten. 21. $c = (970/1010) \times 40.0/1.20 \approx 32.0\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 22. Tienvoudige verdunning: $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L}$. 23. $A_{IS}$ zou te groot zijn, en het resultaat voor cafeïne te laag. 24. Een reeks cafeïnestandaarden, geïnjecteerd onder exact dezelfde omstandigheden als het monster, een ijklijn van oppervlakte tegen concentratie, en reproduceerbare injectievolumes. 25. $320\,\mathrm{mg}/\mathrm{L} \times 0.250\,\mathrm{L}$: $\boldsymbol{\approx 80\,\mathrm{mg}}$ cafeïne per blikje (gegevens voor de oefening).