Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

24Células-Tronco, Regeneração e Envelhecimento

Corte a perna de um axolote e em dois meses ele terá feito crescer uma nova, com osso, músculo, nervo e pele nos lugares certos, e voltará a fazê-lo tantas vezes quantas você cortar. Corte uma planária em vinte pedaços e cada um vira um verme inteiro em quinze dias, com o pedaço que era cauda fazendo crescer uma cabeça com olhos e cérebro. Corte um dedo humano acima da última articulação e ele fecha em cicatriz. E, no entanto, o corpo humano não é sem renovação: a cada segundo ele faz dois milhões de hemácias, o revestimento do intestino é substituído a cada cinco dias, a pele a cada mês, e tudo isso descende de pequenas populações de células que se dividem a vida toda sem se esgotar. Este capítulo trata dessas células — o que faz uma célula-tronco, como seu nicho a mantém, como toda a hierarquia do sangue ou do intestino é construída a partir dela —, dos animais que conseguem refazer o que nós não conseguimos e por quê, da descoberta de que qualquer célula pode ser empurrada de volta ao estado embrionário por quatro genes, e do que a aritmética da divisão celular tem a dizer sobre por que envelhecemos.

24.1 O que é uma célula-tronco

Definição 24.1 (Células-tronco e sua hierarquia)

Uma célula-tronco tem duas propriedades definidoras: ela pode se autorrenovar, produzindo filhas que são células-tronco, e pode produzir filhas que se diferenciam. Pode fazer as duas coisas de uma vez, por divisão assimétrica, uma filha de cada tipo, com o destino decidido pela herança desigual de determinantes ou por qual filha permanece em contato com o nicho — o microambiente de células vizinhas, matriz e sinais que mantém uma célula como célula-tronco; ou pode se dividir simetricamente, com algumas divisões dando duas células-tronco e outras duas células em diferenciação, mantendo a população constante em média. As filhas em diferenciação costumam passar por estágios de progenitor ou de amplificação de trânsito, dividindo-se mais algumas vezes com potência cada vez mais estreita antes de amadurecer: a hierarquia amplifica algumas poucas divisões lentas de células-tronco numa produção grande e limita o número de divisões que qualquer célula-tronco precisa fazer. As células-tronco adultas são raras e lentas — uma célula-tronco hematopoética se divide talvez uma vez por ano, uma célula-tronco intestinal uma vez por dia — e multipotentes, restritas às linhagens de seu tecido; as células-tronco embrionárias, da massa celular interna do blastocisto, são pluripotentes, capazes de fazer todos os tecidos do corpo, mas não a placenta.

A hierarquia hematopoética. Alguns milhares de células-tronco lentas na medula alimentam progenitores que se dividem depressa e se comprometem progressivamente, de modo que a produção de um trilhão de células por dia quase nada custa às células-tronco.

Evidência. Till e McCulloch (1961) injetaram células de medula em camundongos irradiados de modo letal e contaram os nódulos que apareciam no baço dez dias depois: cada um era uma colônia de células sanguíneas de várias linhagens, com número proporcional às células injetadas, e marcar os cromossomos das células doadoras mostrou que cada colônia era um clone — uma única célula tinha feito hemácias, granulócitos e plaquetas, e algumas colônias continham células capazes de semear novas colônias num segundo camundongo: autorrenovação e multipotência numa só célula, a definição operacional de uma célula-tronco e a base do transplante de medula óssea. Barker e Clevers (2007) marcaram com uma cor hereditária as células que expressam o gene Lgr5 na base das criptas intestinais e observaram, ao longo de semanas, a cor subir a cripta e preencher vilosidades inteiras: as células marcadas eram as células-tronco do intestino e uma delas, cultivada num gel com os três fatores de crescimento certos, cresceu num intestino em miniatura, um organoide, com criptas e vilosidades próprias (Sato, 2009). ∎

Proposição 24.2 (O nicho e a cripta)

A cripta intestinal é o nicho mais bem compreendido. Em sua base, cerca de catorze células-tronco Lgr5 ficam encaixadas entre células de Paneth, que secretam os sinais Wnt e Notch e os fatores de crescimento que as mantêm células-tronco; uma célula-tronco empurrada para cima, fora de contato com as células de Paneth, perde o sinal em poucos diâmetros celulares e se torna uma célula amplificadora de trânsito, que se divide quatro ou cinco vezes na cripta e então se diferencia nas células absortivas e secretoras que migram pela vilosidade acima e são descamadas de sua ponta cinco dias depois. As células-tronco se dividem simetricamente, cerca de uma vez por dia, e competem pelo espaço limitado do nicho: por acaso um clone se expande e os outros são perdidos, de modo que, em poucos meses, toda cripta descende de uma única célula-tronco — deriva neutra na escala de uma cripta, um passeio aleatório com fronteiras absorventes. O nicho, e não a célula, guarda o caráter de tronco: ponha uma célula diferenciada de volta em contato com os sinais de Paneth depois de uma lesão e ela pode reverter; tire a célula-tronco de lá e lhe dê os sinais numa placa e ela faz um organoide. A medula óssea, os folículos pilosos, o testículo e as zonas de células-tronco neurais do encéfalo seguem a mesma lógica com sinais diferentes.

Evidência. Snippert e colaboradores (2010) marcaram células-tronco de cripta com um “confete” de quatro cores aleatórias; as criptas eram multicoloridas a princípio e já eram de cor única em alguns meses, a uma taxa compatível com divisão simétrica e competição neutra entre cerca de catorze células — e não com divisão assimétrica, que teria mantido toda cor indefinidamente. Remover as células de Paneth encolhe o conjunto de células-tronco; remover o sinal Wnt esvazia a cripta em dias. ∎

A cripta como nicho. Ser tronco é um lugar: as células em contato com os sinais das células de Paneth continuam células-tronco; as empurradas para fora do contato começam a viagem de cinco dias até a ponta da vilosidade. Marcadas com cores aleatórias, as células-tronco de uma cripta derivam para um único clone em poucos meses.

24.2 Pluripotência e reprogramação

Definição 24.3 (Embrionárias, induzidas e cultivadas)

As células-tronco embrionárias (Evans, Kaufman, Martin, 1981, em camundongo; Thomson, 1998, em humanos) são células da massa celular interna mantidas em divisão em cultura sem se diferenciar, por sinais (LIF, ou FGF e activina) que mantêm um núcleo de fatores de transcrição — Oct4, Sox2, Nanog — que se ativam mutuamente e reprimem os genes de toda linhagem. Injetadas num blastocisto, elas se juntam ao embrião e contribuem para todos os seus tecidos, inclusive a linhagem germinativa, que é como se faz o camundongo nocaute: altere um gene nas células e faça um camundongo a partir delas. A transferência nuclear do volume do Ano 2 mostrou que um núcleo diferenciado pode ser reiniciado pelo citoplasma do ovo; Takahashi e Yamanaka (2006) descobriram o que faz esse reinício. De vinte e quatro genes candidatos, quatro — Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc —, introduzidos juntos por vírus em fibroblastos de pele, converteram cerca de uma célula em mil, ao longo de três semanas, numa célula-tronco pluripotente induzida indistinguível de uma embrionária, capaz de formar todos os tecidos e um camundongo inteiro. A reprogramação é lenta e ineficiente porque os fatores precisam abrir a cromatina fechada por anos de diferenciação, e as células passam por uma fase estocástica em que a maioria empaca; ela é também, em princípio, uma rota das próprias células de um paciente até qualquer tecido. Acrescente os sinais certos na ordem certa e células pluripotentes numa placa recapitulam o desenvolvimento: músculo cardíaco que bate, neurônios dopaminérgicos para transplante num encéfalo parkinsoniano, células retinianas, e organoides — tecidos tridimensionais auto-organizados de alguns milímetros, de intestino, rim, fígado e cérebro, com a arquitetura e os tipos celulares do órgão, nos quais o desenvolvimento e as doenças humanas podem ser observados e fármacos testados.

À esquerda: um organoide cerebral cultivado a partir de células pluripotentes humanas — alguns milímetros de tecido auto-organizado semelhante ao córtex, com cavidades semelhantes a ventrículos e neurônios em camadas. À direita: um esfregaço de medula óssea, a hierarquia da primeira figura vista de uma só vez: blastos, granulócitos em maturação, precursores de hemácias e um megacariócito.

Método 24.4 (Rastreamento de linhagem)

Para descobrir quais células são as células-tronco de um tecido: (1) escolha um gene expresso pelas células candidatas e ponha sob seu promotor uma recombinase indutível (Cre-ER, ativa apenas quando se dá tamoxifeno); (2) no mesmo animal, um gene repórter que fica permanentemente ativo quando a recombinase corta dele um cassete de parada — uma cor herdada por todos os descendentes; (3) dê uma dose única de tamoxifeno para marcar as células candidatas num momento; (4) colha tecido em intervalos e avalie os clones marcados: um clone que cresce, persiste por meses e contém todos os tipos celulares do tecido veio de uma célula-tronco; um clone descamado em uma semana veio de uma célula de trânsito. (5) Com um repórter multicolorido, acompanhe a competição entre clones. (6) Teste a função diretamente matando as células marcadas com um receptor de toxina expresso sob o mesmo promotor, e veja se o tecido deixa de se renovar.

24.3 Regeneração

Definição 24.5 (Como os animais refazem)

A regeneração toma três rotas. A Hydra e a planária dependem de células-tronco pluripotentes adultas: os neoblastos de uma planária, um quinto de suas células, são as únicas células em divisão que ela tem, migram para uma ferida e reconstroem qualquer parte faltante, guiados por sinais posicionais (um gradiente de Wnt diz ao pedaço que extremidade é a cauda; bloqueie-o e um pedaço de cauda faz crescer uma segunda cabeça). As salamandras reconstroem um membro a partir de um blastema, uma tampa de células em divisão no coto, formada em boa parte por desdiferenciação: as fibras musculares se fragmentam em células mononucleadas, as células cartilaginosas e conjuntivas voltam a um estado de progenitor, cada uma lembrando seu tecido de origem e sua posição ao longo do membro, e o blastema roda de novo o programa embrionário do membro sob a epiderme da ferida e os nervos, cuja presença é exigida (desnerve o coto e nada cresce). Os peixes-zebra refazem nadadeiras e coração do mesmo modo, com as células musculares cardíacas sobreviventes se dividindo para repor um quinto do ventrículo em um mês. Os mamíferos fazem pouco disso: o fígado refaz sua massa depois de removidos dois terços, mas pela divisão das células remanescentes no lugar (crescimento compensatório), e não reconstruindo os lobos perdidos; uma ponta de dedo se regenera em crianças; os chifres do veado crescem de novo a cada ano a partir de um periósteo de células-tronco. Por que não mais que isso é uma questão de compromissos: a resposta mamífera à ferida — coagulação rápida, inflamação, cicatriz fibroblástica — fecha depressa uma ferida contra a infecção e a perda de sangue, e a cicatriz inviabiliza o blastema; e células capazes de se desdiferenciar e se dividir à vontade são células capazes de virar cânceres, um risco que um animal longevo e de sangue quente pode não bancar.

À esquerda: um axolote, que refaz um membro em dois meses a partir de um blastema de células desdiferenciadas e pode fazê-lo a vida toda. À direita: uma planária cortada em pedaços, cada pedaço refazendo um verme completo a partir de seus neoblastos em duas semanas.

Evidência. Morgan (1898) cortou planárias em 279 pedaços e descobriu que cada um refazia um verme inteiro, até um limite de cerca de um centésimo do corpo; Reddien e colaboradores (2011) transplantaram um único neoblasto para um verme irradiado de modo letal e o restauraram por inteiro — uma célula, todos os tecidos. Kragl e colaboradores (2009) fizeram axolotes com um tecido marcado em verde de cada vez e os enxertaram em hospedeiros não marcados: após a amputação, o músculo verde deu origem apenas a músculo, e a cartilagem verde apenas a cartilagem — o blastema não é um reservatório de células pluripotentes, mas um conjunto de progenitores restritos a linhagens, cada um desdiferenciado apenas até o progenitor de seu próprio tecido. Singer (1952) mostrou que um membro de salamandra só se regenera se um número limiar de fibras nervosas alcança o coto, e que desviar um nervo para uma ferida no flanco fazia um membro crescer ali. ∎

24.4 A aritmética do envelhecimento

Teorema 24.6 (Telômeros e o limite de Hayflick)

Cada cromossomo termina num telômero, vários quilobases da repetição TTAGGG. Como a DNA polimerase não consegue completar o último trecho da fita retardada (o problema da replicação das extremidades), cada divisão encurta cada telômero em $\Delta \approx$ $50\text{ a }100\,\mathrm{bp}$ . Partindo de $L_{0} \approx 10\,\mathrm{kb}$ e disparando a senescência replicativa — uma parada permanente imposta pela p53 — quando o telômero mais curto chega a $L_{\text{crit}} \approx 4\,\mathrm{kb}$ , uma linhagem celular pode se dividir no máximo

n_{\max} = \frac{L_{0} - L_{\text{crit}}}{\Delta} \approx \frac{6000}{50\text{--}100} \approx 60\text{--}120

vezes: o limite de Hayflick, as cinquenta e tantas duplicações populacionais que os fibroblastos humanos completam em cultura antes de parar. A enzima telomerase, uma transcriptase reversa com molde de RNA, reestende as extremidades; ela é ativa na linhagem germinativa, em células-tronco embrionárias e em muitas adultas, e em $90\,\%$ dos cânceres, que escaparam do limite ao religá-la. Uma célula-tronco que se divide $d$ vezes por ano com a telomerase compensando uma fração $f$ da perda tem $n_{\max} = (L_{0} - L_{\text{crit}})/[(1 - f)\Delta]$ divisões, e uma vida de $n_{\max}/d$ anos: com $f = 0.7$ , $\Delta = 60$ , $d = 1$ , uns 330 anos para uma célula-tronco hematopoética — mas seus progenitores, com a telomerase desligada e vinte divisões até uma hemácia, gastam um quinto de sua reserva a cada linhagem, e é por isso que as células sanguíneas dos idosos têm telômeros mais curtos que as dos jovens, em cerca de $30\,\mathrm{bp}$ por ano.

Demonstração. A perda por divisão é um comprimento fixo, de modo que o comprimento do telômero cai linearmente com o número de divisões, $L_{n} = L_{0} - n\Delta$ , e chega a $L_{\text{crit}}$ em $n = (L_{0} - L_{\text{crit}})/\Delta$ ; com compensação parcial a perda líquida por divisão é $(1 - f)\Delta$ . Hayflick e Moorhead (1961) mostraram que fibroblastos humanos normais param depois de cerca de cinquenta duplicações, quaisquer que sejam as condições de cultura, que células congeladas após vinte duplicações e descongeladas completam apenas as trinta restantes — elas contam divisões, e não tempo — e que o limite é menor para células de doadores idosos. Harley, Futcher e Greider (1990) mediram os telômeros encurtando com as duplicações em cultura e com a idade do doador; Bodnar e colaboradores (1998) puseram telomerase em células normais e elas se dividiram além do limite indefinidamente sem se tornar cancerosas, o que estabeleceu o telômero como o relógio. ∎

Os telômeros como contador de divisões. Uma perda fixa por divisão dá uma reta; onde ela cruza o comprimento crítico a linhagem para. A telomerase achata a inclinação e, plenamente ativa, abole o limite — na linhagem germinativa e nos cânceres.

Proposição 24.7 (A lei de Gompertz)

Acima de cerca de trinta anos a taxa de mortalidade humana $\mu(t)$ — a probabilidade de morrer no ano seguinte — dobra a cada oito anos: $\mu(t) = \mu_{0}\,\mathrm{e}^{\gamma(t - t_{0})}$ com $\gamma = \ln 2/8 \approx 0.087\,\mathrm{yr}^{-1}$ (Gompertz, 1825). A sobrevivência até a idade $t$ é então

S(t) = \exp\!\Bigl[-\frac{\mu_{0}}{\gamma}\bigl(\mathrm{e}^{\gamma(t - t_{0})} - 1\bigr)\Bigr],

uma curva plana por décadas e depois em queda íngreme, com uma expectativa mediana de vida $t_{1/2} = t_{0} + \gamma^{-1}\ln(1 + \gamma\ln 2/\mu_{0})$ : para $\mu_{0} = 10^{-3}$ por ano aos trinta, cerca de $30 + 47 = 77$ anos. A mesma lei, com constantes diferentes, vale para camundongos (tempo de duplicação de três meses), cães, moscas e vermes: envelhecer é uma elevação exponencial da vulnerabilidade, e não um relógio que para. A biologia por trás do expoente é um conjunto de marcas que interagem: dano acumulado ao DNA e deriva epigenética, desgaste dos telômeros, perda da proteostase, declínio mitocondrial, esgotamento dos reservatórios de células-tronco, o acúmulo de células senescentes que já não se dividem mas secretam sinais inflamatórios, e a inflamação crônica; em camundongos, eliminar células senescentes ou restringir calorias prolonga a vida, e em vermes uma única mutação na via semelhante à da insulina a dobra. Se o expoente pode ser reduzido em humanos, em vez da constante $\mu_{0}$ , que a medicina já reduziu dez vezes em um século, é a questão em aberto.

Demonstração. Se $\mu$ é o risco instantâneo, $\mathrm{d}S/\mathrm{d}t = -\mu(t)S$ , de modo que $\ln S = -\int_{t_{0}}^{t}\mu = -(\mu_{0}/\gamma)(\mathrm{e}^{\gamma(t-t_{0})} - 1)$ . Fazendo $S = 1/2$ : $\mathrm{e}^{\gamma(t-t_{0})} = 1 + \gamma\ln 2/ \mu_{0}$ , donde a mediana; com $\gamma = 0.087$ e $\mu_{0} = 10^{-3}$ , $\ln(1 + 60) = 4.1$ e $t - t_{0} = 47$ . A lei empírica é o ajuste de Gompertz às tábuas de vida inglesas; que ela descreva tantas espécies com uma forma comum e constantes específicas de cada uma é admitido aqui como o resumo de um século de demografia. ∎

A lei de Gompertz. À esquerda: num eixo logarítmico a taxa de mortalidade é uma reta dos trinta em diante. À direita: a curva de sobrevivência que daí decorre — um platô e depois um despenhadeiro, com a mediana onde a integral do risco alcança 2. — A lei de Gompertz. À esquerda: num eixo logarítmico a taxa de mortalidade é uma reta dos trinta em diante. À direita: a curva de sobrevivência que daí decorre — um platô e depois um despenhadeiro, com a mediana onde a integral do risco alcança $\ln 2$ .

Observação 24.8 (A renovação e seu preço)

Um corpo que se renova precisa manter células capazes de se dividir indefinidamente, e células capazes de se dividir indefinidamente são a matéria-prima do câncer; um corpo que se protege do câncer contando divisões e impondo senescência precisa, com o tempo, ficar sem células capazes de se dividir. A hierarquia de células-tronco é uma solução — poucas células lentas protegidas em nichos, muitas células rápidas que logo morrem — e o limite de Hayflick é outra, e a exponencial de Gompertz é a soma de seus custos. A salamandra paga de outro jeito: ela tolera células que se desdiferenciam e refaz uma perna, e é de sangue frio, lenta e raramente vive o bastante para pagar a conta do câncer. As células com que você nasceu não são, em sua maior parte, as células que você tem; as que fizeram as substitutas são as que você precisa manter.

24.5 Exercícios

Exercício 24.1 ★

Defina autorrenovação, potência, nicho e célula amplificadora de trânsito, e dê um exemplo de cada um no intestino.

Solução

Solução de Exercício 24.1.

Autorrenovação: uma divisão que produz ao menos uma filha que ainda é célula-tronco — as células Lgr5 da base da cripta. Potência: a gama de destinos que uma célula ainda pode adotar — a célula-tronco da cripta é multipotente, fazendo células absortivas, caliciformes, enteroendócrinas, de Paneth e em tufo. Nicho: as células de Paneth e seus sinais Wnt, Notch e EGF, que mantêm o caráter de tronco no lugar. Célula amplificadora de trânsito: uma filha comprometida que se divide mais quatro ou cinco vezes na cripta antes de se diferenciar a caminho do topo da vilosidade.

Exercício 24.2 ★

O que o ensaio de colônias esplênicas mostrou, e que propriedade de uma célula-tronco exigiu um segundo camundongo para ser demonstrada?

Solução

Solução de Exercício 24.2.

Células isoladas de medula produziram colônias esplênicas contendo hemácias, granulócitos e plaquetas: uma célula, várias linhagens — a multipotência, e a resposta linear à dose mostrou que cada colônia vinha de uma célula. A autorrenovação exigiu um segundo camundongo: células de uma colônia, injetadas em outro receptor irradiado, fizeram colônias novas, de modo que a célula fundadora tinha produzido filhas com sua própria capacidade.

Exercício 24.3 ★

Nomeie os quatro fatores de Yamanaka e explique por que a reprogramação leva semanas e dá certo num milésimo das células.

Solução

Solução de Exercício 24.3.

Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc. A cromatina do fibroblasto fechou os genes da pluripotência atrás de heterocromatina e metilação do DNA, de modo que os fatores encontram poucos sítios acessíveis a princípio e precisam recrutar enzimas de remodelamento ao longo de muitos ciclos celulares; a célula precisa ainda desligar seu próprio programa, escapar da senescência e passar por um estado intermediário estocástico em que a maioria das células empaca ou morre. Só a célula rara em que cada passo dá certo emerge pluripotente, semanas depois.

Exercício 24.4 ★

Contraste as rotas da planária e da salamandra para a regeneração, e diga o que os experimentos de enxertia de Kragl mostraram sobre o blastema.

Solução

Solução de Exercício 24.4.

A planária mantém células-tronco adultas pluripotentes, os neoblastos, que migram para a ferida e constroem o que estiver faltando. A salamandra não tem esse reservatório: células diferenciadas do coto se desdiferenciam em progenitores que, com células-tronco residentes do tecido, formam um blastema que roda de novo o programa do membro. Os enxertos de tecidos isolados marcados feitos por Kragl mostraram que as células do blastema permanecem fiéis à sua origem — músculo faz músculo, cartilagem faz cartilagem —, de modo que o blastema é uma mistura de progenitores restritos a linhagens, e não uma massa pluripotente.

Exercício 24.5 ★★

Os telômeros começam em $11\,\mathrm{kb}$ , a senescência ocorre em $5\,\mathrm{kb}$ , e a perda é de $75\,\mathrm{bp}$ por divisão. Limite de Hayflick? Células de um doador de 70 anos têm $8\,\mathrm{kb}$ : duplicações restantes? Se a telomerase compensar $60\,\%$ da perda, qual é o limite?

Solução

Solução de Exercício 24.5.

$(11 - 5)/0.075 = 80$ duplicações. A partir de $8\,\mathrm{kb}$ : $(8 - 5)/0.075 = 40$ . Com $60\,\%$ de compensação a perda líquida é de $30\,\mathrm{bp}$ : $6000/30 = 200$ .

Exercício 24.6 ★★

Uma cripta abriga 14 células-tronco que se dividem uma vez por dia, alimentando células de trânsito que se dividem mais 4 vezes, e a cripta fornece $300$ células por dia à sua vilosidade. Confira a aritmética: quantas divisões de células-tronco por dia produzem filhas em diferenciação, e a quantas células-tronco isso equivale em divisões?

Solução

Solução de Exercício 24.6.

Catorze divisões de células-tronco por dia rendem 28 filhas; 14 precisam continuar células-tronco, de modo que 14 se comprometem — uma filha comprometida por célula-tronco por dia. Cada uma se compromete a $2^{4} = 16$ células: $14\times 16 = 224$ células de vilosidade por dia, a ordem das $300$ observadas (uma quinta divisão de trânsito dá $448$ ). O nível das células-tronco contribui com divisões equivalentes a catorze células; o nível de trânsito, com as outras $200$ .

Exercício 24.7 ★★

O corpo faz $2\times 10^{11}$ hemácias por dia, cada uma o produto de cerca de 20 divisões a partir de uma célula-tronco. Quantas divisões de células-tronco por dia isso exige e, com $10\,000$ células-tronco, com que frequência cada uma se divide? Compare com o “cerca de uma vez por ano” observado e explique a discrepância.

Solução

Solução de Exercício 24.7.

$2\times 10^{11}/2^{20} = 1.9\times 10^{5}$ filhas comprometidas por dia; com $10\,000$ células-tronco, 19 por célula-tronco por dia — contra uma divisão por ano. A contagem de vinte divisões é por linhagem, da célula-tronco à hemácia, mas os progenitores intermediários não são de uso único: os reservatórios de progenitores multipotentes e comprometidos se sustentam por semanas com suas próprias divisões, de modo que quase toda a divisão acontece nos níveis de progenitor e a célula-tronco é acionada raramente.

Exercício 24.8 ★★

Com $\gamma = 0.087\,\mathrm{yr}^{-1}$ e $\mu_{0} = 10^{-3}$ aos trinta, calcule a taxa de mortalidade aos 50, 70 e 90, a sobrevivência até 70 e 90, e a expectativa mediana de vida. O que reduzir $\mu_{0}$ à metade faz com a mediana? E o que faz reduzir $\gamma$ à metade?

Solução

Solução de Exercício 24.8.

$\mu(50) = 10^{-3}\mathrm{e}^{1.74} = 5.7\times 10^{-3}$ ; $\mu(70) = 10^{-3}\mathrm{e}^{3.48} = 0.032$ ; $\mu(90) = 10^{-3}\mathrm{e}^{5.22} = 0.19$ por ano. Com $\mu_{0}/\gamma = 0.0115$ : $S(70) = \exp[-0.0115 \times 31.5] = 0.70$ e $S(90) = \exp[-0.0115\times 184] = 0.12$ . Mediana: $30 + \ln(61)/0.087 = 77$ . Reduzindo $\mu_{0}$ à metade: $\ln(121)/0.087 = 55$ , mediana 85 — um tempo de duplicação, oito anos, ganho. Reduzindo $\gamma$ à metade, a $0.0435$ : $\ln(31)/0.0435 = 79$ , mediana 109: retardar o expoente ganha quatro vezes mais que reduzir a constante à metade.

Exercício 24.9 ★★

Dois terços do fígado de um rato são removidos. Os hepatócitos remanescentes, todos eles se dividindo, restauram a massa em dez dias. De quantas divisões cada um precisa? Por que isso se chama crescimento compensatório e não regeneração, e o que o fígado não reconstrói?

Solução

Solução de Exercício 24.9.

O terço restante precisa triplicar: $\log_{2}3 = 1.6$ divisão por célula. Crescimento compensatório, porque os lobos existentes aumentam pela divisão de células no lugar; os lobos removidos, com seus ductos, vasos e arquitetura, não são reconstruídos — o fígado recupera sua massa e sua função, mas não sua forma.

Exercício 24.10 ★★★

Deriva neutra: $N$ células-tronco num nicho se dividem simetricamente; a cada evento uma célula se divide e uma é perdida ao acaso, de modo que o número de um dado clone faz um passeio aleatório entre $0$ e $N$ . Argumente que a probabilidade de um clone de $k$ células acabar tomando o nicho é $k/N$ e que, com $N = 14$ , um clone de uma célula tem uma chance de $1/14$ . O que isso prevê para o destino de uma célula-tronco que carrega uma mutação neutra nova?

Solução

Solução de Exercício 24.10.

A cada evento o tamanho $k$ do clone vai a $k + 1$ ou a $k - 1$ com igual probabilidade, de modo que seu tamanho esperado nunca muda; quando o passeio termina, ele é $N$ (tomada) ou $0$ (perda), e a esperança $N\,P + 0 = k$ dá $P = k/N$ . Uma célula única: $1/14$ . Uma mutação neutra numa célula-tronco se fixa em sua cripta com probabilidade $1/14$ e, de outro modo, é perdida em meses — a deriva expurga treze de cada catorze mutações.

Exercício 24.11 ★★★

Uma mutação dá a um clone de células-tronco uma vantagem de $10\,\%$ na competição do Exercício 24.10. Explique qualitativamente por que sua probabilidade de tomada sobe bem acima de $k/N$ , por que as criptas e a medula dos idosos são cada vez mais dominadas por poucos clones (hematopoese clonal), e por que isso é um primeiro passo rumo ao câncer sem ser câncer.

Solução

Solução de Exercício 24.11.

O passeio agora é enviesado: o clone ganha um lugar com mais frequência do que perde um, de modo que seu tamanho esperado cresce e a probabilidade de tomada sobe rumo à certeza conforme $k$ cresce — para uma vantagem de $10\,\%$ num nicho de catorze, cerca do triplo de $1/14$ para uma única célula, e mais ainda quando o clone já ocupa alguns lugares. Ao longo de décadas, as células-tronco com tais mutações (DNMT3A, TET2 na medula) tomam seus nichos e, aos setenta, um quinto das pessoas tem boa parte de seu sangue vindo de um clone. Não é câncer: as células ainda se diferenciam e obedecem à sua hierarquia. Mas a mutação seguinte tem agora um clone de bilhões em que surgir, e o risco de leucemia fica dez vezes maior.

Exercício 24.12 ★★★

Suponha que o expoente de Gompertz $\gamma$ reflita uma taxa de acúmulo de dano e a constante $\mu_{0}$ , o ambiente. A medicina cortou $\mu_{0}$ dez vezes desde 1900 sem mudar $\gamma$ . Calcule o ganho de expectativa mediana de vida que essa redução de dez vezes dá, e o ganho adicional de mais um corte de dez vezes; explique por que os retornos diminuem, e o que um corte de $20\,\%$ em $\gamma$ faria em vez disso.

Solução

Solução de Exercício 24.12.

Mediana $= 30 + \gamma^{-1}\ln(1 + \gamma\ln 2/\mu_{0})$ : para $\mu_{0} = 10^{-2}$ , $30 + \ln 7/0.087 = 52$ ; para $10^{-3}$ , 77; para $10^{-4}$ , $30 + \ln 604/0.087 = 104$ . Na forma de Gompertz pura, cada corte de dez vezes acrescenta os mesmos $\ln 10/\gamma = 26$ anos. Na prática os retornos diminuem porque os ganhos históricos vieram de remover um termo independente da idade — infecção, parto, acidente, a constante $A$ de Makeham em $\mu = A + \mu_{0}\mathrm{e}^{\gamma t}$ — e, uma vez que $A$ é pequeno em comparação com a exponencial nas idades que importam, cortá-lo mais quase nada muda; o $\mu_{0}$ intrínseco mudou muito menos. Um corte de $20\,\%$ em $\gamma$ (para $0.070$ ) dá $30 + \ln 49/0.070 = 86$ : nove anos, ganhos em toda idade, e não por adiar algumas causas de morte.

24.6 Problema: As Células Com Que Você Nasceu

Problema 24.1

Problema de fim de semana — a renovação de um corpo em números: a hierarquia do sangue e o que ela pede de suas células-tronco, a deriva da cripta, o relógio dos telômeros e como a telomerase e os progenitores o gastam, a curva de Gompertz da população e os compromissos que um animal que se regenera aceita, terminando na contagem de Hayflick, na reserva vitalícia da célula-tronco e na expectativa mediana de vida

Dados: hemácias $2.5\times 10^{11}$ por dia, granulócitos $10^{11}$ por dia; $20$ divisões da célula-tronco à célula madura; $10\,000$ células-tronco hematopoéticas. Telômeros: $L_{0} = 10\,\mathrm{kb}$ , $L_{\text{crit}} = 4\,\mathrm{kb}$ , $\Delta = 60\,\mathrm{bp}$ por divisão; a telomerase nas células-tronco compensa $f = 0.7$ ; nenhuma nos progenitores. Cripta: $N = 14$ células-tronco, uma divisão por dia. Gompertz: $\mu_{0} = 10^{-3}$ por ano aos 30 anos, $\gamma = 0.087\,\mathrm{yr}^{-1}$ . Membro do axolote: $40\,\mathrm{mm}$ refeitos em $60\,\mathrm{d}$ ; blastema de $10^{5}$ células crescendo até $10^{8}$ .

Parte I — O sangue.

Células produzidas por dia no total, e por segundo.
Cada célula madura é o fim de $20$ divisões: quantas células resultam de uma filha comprometida de uma célula-tronco? Quantas filhas comprometidas por dia são necessárias?
Com $10\,000$ células-tronco, quantas divisões em diferenciação por célula-tronco por dia isso implica? E por ano?
A divisão medida das células-tronco é de cerca de uma vez por ano. Concilie: o que os progenitores precisam fazer, que o cálculo da questão 3 supôs que as células-tronco faziam?
Os progenitores não têm telomerase. A partir de $10\,\mathrm{kb}$ , que comprimento de telômero um precursor de hemácia alcança após suas $20$ divisões? Importa que ele esteja acima de $L_{\text{crit}}$ ?
Uma célula-tronco que se divide uma vez por ano com $f = 0.7$ : perda líquida por divisão, divisões até a senescência e anos. Comente.

Parte II — A cripta.

Divisões por cripta por dia no nível das células-tronco; se metade dos eventos repõe uma célula-tronco perdida e metade alimenta a zona de trânsito, quantas células comprometidas por dia, e quantas células de vilosidade após $4$ divisões de trânsito?
A probabilidade de tomada de um clone de uma célula é $1/N$ . O tempo esperado até a monoclonalidade é da ordem de $N^{2}$ eventos de divisão por célula; estime-o em dias e compare com as observações do confete (meses).
Uma célula-tronco adquire uma mutação. Probabilidade de ela acabar fixada em sua cripta? Em quantas das $10^{7}$ criptas de um cólon uma mutação que surgisse uma vez por cripta se fixaria?
Por que a deriva de uma cripta protege mais contra o câncer que um tecido em que toda célula-tronco se divide assimetricamente a vida toda?
Depois que a irradiação mata as células-tronco, as células de trânsito revertem e reenchem o nicho. O que isso diz sobre onde mora o caráter de tronco?
Esboce o experimento de rastreamento de linhagem que distingue a deriva simétrica da divisão assimétrica, e os dois desfechos.

Parte III — O relógio.

Limite de Hayflick para uma linhagem somática sem telomerase.
Uma cultura de fibroblastos é congelada após $25$ duplicações e descongelada uma década depois: duplicações restantes? O que isso mostra sobre o que a célula conta?
Os telômeros dos leucócitos encurtam $30\,\mathrm{bp}$ por ano nos adultos. Partindo de $8\,\mathrm{kb}$ aos vinte, quando chegariam a $L_{\text{crit}}$ ? Compare com a duração da vida e comente.
A telomerase acrescentada a fibroblastos normais os deixa passar do limite sem se tornarem cancerosos. A telomerase está ativa em $90\,\%$ dos cânceres. Concilie as duas afirmações.
Calcule a taxa de mortalidade de Gompertz aos 40, 60, 80 e 100, e a sobrevivência até cada idade.
Expectativa mediana de vida; e a idade em que $10\,\%$ sobrevivem.

Parte IV — Refazer.

Axolote: taxa média de recrescimento em mm/dia; duplicações para o blastema crescer de $10^{5}$ a $10^{8}$ células, e o tempo médio de duplicação ao longo de 60 dias.
Se as células desdiferenciadas se dividissem como as do blastema a vida toda e uma divisão carregasse uma chance de $10^{-9}$ por célula de uma mutação oncogênica, quantas mutações dessas surgem numa regeneração? Por que, ainda assim, o axolote quase nunca tem câncer, e por que um mamífero poderia não se safar disso?
Desnervar o coto interrompe a regeneração. Proponha um experimento para mostrar que o nervo fornece um fator difusível, e uma identidade possível para esse fator.
Um pedaço de cauda de planária faz crescer uma segunda cauda em vez de uma cabeça quando um inibidor de Wnt é silenciado. Explique com um gradiente e a memória posicional do pedaço.
Fígado humano após uma ressecção de dois terços: fração dos hepatócitos que precisa se dividir uma vez, duas vezes, para restaurar a massa. Por que o resultado é um fígado que funciona, mas com a forma errada?
Por que um corpo que se regenerasse como um axolote teria uma curva de Gompertz diferente, e em que direção?
Resuma: a contagem de Hayflick (questão 13), as divisões e os anos de uma célula-tronco auxiliada pela telomerase (questão 6) e a expectativa mediana de vida (questão 18).

Solução

Solução de Problema 24.1.

1. $3.5\times 10^{11}$ por dia, $4\times 10^{6}$ por segundo. 2. $2^{20} \approx 10^{6}$ células por filha comprometida; $3.5\times 10^{11}/10^{6} = 3.3\times 10^{5}$ filhas comprometidas por dia. 3. $33$ por célula-tronco por dia, $12\,000$ por ano. 4. Os reservatórios de progenitores precisam se sustentar: os progenitores multipotentes e comprometidos se dividem por semanas e mantêm seus próprios números, de modo que quase toda divisão das vinte acontece em níveis que se renovam, e a célula-tronco contribui com uma filha comprometida raramente — da ordem de uma vez por ano. 5. $10 - 20\times 0.06 = 8.8\,\mathrm{kb}$ : bem acima de $L_{\text{crit}}$ , e a hemácia nunca mais se divide; a reserva só importa para progenitores que são reutilizados. 6. Perda líquida $0.3\times 60 = 18\,\mathrm{bp}$ ; $6000/18 = 333$ divisões; a uma por ano, $333$ anos — muito além de uma vida, de modo que os telômeros não limitam a própria célula-tronco; outros danos limitam. 7. $14$ divisões por dia; $7$ repõem células-tronco perdidas e $7$ se comprometem; $7\times 2^{4} = 112$ células de vilosidade por dia. 8. $N^{2} = 196$ eventos por célula a um por dia: cerca de $200\,\mathrm{d}$ , seis a sete meses — o tempo em que as criptas do confete ficaram de cor única. 9. $1/14 \approx 7\,\%$ ; $10^{7}/14 \approx 7\times 10^{5}$ criptas. 10. A deriva descarta treze de cada catorze mutações em poucos meses. A divisão assimétrica ao longo da vida manteria toda célula-tronco mutante para sempre, de modo que as mutações se acumulariam em toda linhagem sem nunca serem expurgadas. 11. Ser tronco é uma posição no nicho e um conjunto de sinais, e não uma propriedade permanente de uma célula: qualquer célula que alcance os sinais de Paneth pode assumir o papel. 12. Induza uma marcação multicolorida nas células-tronco num dado momento e acompanhe as criptas. Deriva simétrica: as criptas ficam de cor única em poucos meses. Divisão assimétrica: cada cripta mantém todas as suas cores indefinidamente, cada uma como uma fita fina subindo a vilosidade. 13. $6000/60 = 100$ duplicações. 14. Cerca de $75$ restantes: a célula conta divisões, e não tempo de calendário, já que a década no congelador nada custou. 15. $(8000 - 4000)/30 = 133$ anos depois dos vinte — aos 153 anos. O comprimento médio dos telômeros dos leucócitos não limita, por si só, a vida; os telômeros mais curtos, e as demais marcas, importam mais. 16. A telomerase remove uma barreira, a senescência replicativa, e por isso é encontrada em quase todo câncer, que precisa de divisão ilimitada; mas os fibroblastos que receberam telomerase mantiveram seus pontos de checagem, a inibição por contato e a p53 intacta, de modo que a divisão ilimitada sozinha não os tornou cânceres. Necessária, não suficiente. 17. $\mu(40) = 2.4\times 10^{-3}$ , $\mu(60) = 0.014$ , $\mu(80) = 0.077$ , $\mu(100) = 0.44$ por ano. $S = \exp[-0.0115(\mathrm{e}^{\gamma (t-30)} - 1)]$ : $0.98$ aos 40, $0.87$ aos 60, $0.42$ aos 80 e $0.006$ aos 100. 18. Mediana $30 + \ln 61/0.087 = 77$ . Dez por cento sobrevivem em $\mathrm{e}^{\gamma(t-30)} = 1 + \gamma\ln 10/\mu_{0} = 201$ : $t = 30 + 5.3/0.087 = 91$ . 19. $0.67\,\mathrm{mm}/\mathrm{d}$ ; $\log_{2}1000 = 10$ duplicações em 60 dias, uma a cada seis dias. 20. Cerca de $10^{8}$ divisões, portanto $0.1$ mutação oncogênica por regeneração — uma em cada dez membros. Os axolotes quase nunca desenvolvem tumores: são de sangue frio e lentos, com supressão tumoral robusta, e as células do blastema permanecem restritas a linhagens e se rediferenciam em vez de continuar se dividindo; o tecido em regeneração chega a suprimir tumores induzidos. Um mamífero tem mais células, temperatura e taxa metabólica mais altas e uma vida mais longa ao longo da qual um clone escapado poderia crescer. 21. Desnerve o coto e implante uma esfera que libere a proteína candidata, ou enxerte tecido condicionado por nervo: a regeneração restaurada significa um fator difusível. Candidatos identificados em tritões e axolotes: a proteína de gradiente anterior nAG, a neuregulina-1 e os FGFs. 22. A sinalização Wnt é alta na cauda e baixa na cabeça, e a ferida na extremidade anterior de um pedaço normalmente faz uma cabeça porque o Wnt ali é baixo; silenciar um inibidor de Wnt eleva o Wnt em toda parte, as duas feridas leem “posterior” e crescem duas caudas. O pedaço conhece seu próprio eixo pelo gradiente residual de seu músculo, e a ferida restabelece o gradiente em relação a ele. 23. O terço restante precisa triplicar: todo hepatócito se divide uma vez (chegando a dois terços) e metade se divide de novo — uma média de $1.6$ divisão. Os lobos sobreviventes incham até a massa original; os lobos faltantes e seus ductos e vasos não são reconstruídos. 24. Uma regeneração que substituísse tecido gasto e danificado retardaria o acúmulo que o expoente mede, baixando $\gamma$ e achatando a curva — os axolotes mostram pouca senescência. O preço seria um termo constante mais alto, vindo dos cânceres num corpo quente, grande e longevo. 25. Contagem de Hayflick de cerca de $100$ duplicações; uma célula-tronco auxiliada pela telomerase tem umas $330$ divisões, mais de três séculos a uma por ano; expectativa mediana de vida de $77$ anos.

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