Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

2RNAs não codificantes e regulação pós-transcricional

Em 1990 dois botânicos tentaram deixar petúnias de um roxo mais intenso dando-lhes cópias extras do gene da enzima do pigmento. Quase metade das plantas transgênicas saiu branca, ou roxa com setores brancos: o gene acrescentado desligara a cópia própria da planta além de si mesmo. Oito anos depois, dois geneticistas que injetavam RNA em Caenorhabditis elegans descobriram que um RNA de fita dupla correspondente a um gene muscular silenciava esse gene, no verme injetado e em sua prole, com muito mais potência do que qualquer das fitas isoladas. Os dois enigmas tinham uma só resposta: as células possuem uma maquinaria que usa RNAs curtos para encontrar e silenciar RNAs de sequência correspondente. Essa maquinaria, e o mundo mais amplo da regulação que acontece a um RNA mensageiro depois de transcrito — como ele é processado, para onde é enviado, quanto tempo vive, se é traduzido — é o assunto deste capítulo. O volume do 1.º ano tratou o gene como uma unidade ligada ou desligada em seu promotor; aqui o próprio transcrito passa a ser o objeto do controle.

2.1 O censo de RNAs de uma célula

Definição 2.1 (RNA não codificante)

Um RNA não codificante (ncRNA) é um transcrito que funciona como RNA, e não como molde para uma proteína. Além dos RNAs ribossômicos e transportadores da tradução e dos RNAs nucleares pequenos (snRNAs) do spliceossomo, uma célula eucarionte contém: microRNAs (miRNAs), de $21\text{ a }23$ nucleotídeos, recortados de grampos nos próprios transcritos da célula e guiando a repressão de mensageiros parcialmente complementares; RNAs pequenos de interferência (siRNAs), do mesmo comprimento, recortados de RNA longo de fita dupla e guiando a clivagem de alvos perfeitamente correspondentes; RNAs que interagem com Piwi (piRNAs), de $26\text{ a }31$ nucleotídeos, ativos na linhagem germinativa contra transpósons; RNAs nucleolares pequenos que guiam a modificação do rRNA; e RNAs longos não codificantes (lncRNAs), transcritos com mais de $200\,\mathrm{nt}$ sem nenhuma fase de leitura aberta de consequência, dos quais o Xist do Capítulo 1 é o mais bem compreendido. Os éxons codificadores de proteína são cerca de $1.5\,\%$ do genoma humano; uma grande fração do resto é transcrita em algum momento em alguma célula, mas quanto dessa transcrição é funcional continua em aberto.

Observação 2.2 (Abundância não é função)

Um transcrito pode ser detectado porque a polimerase vaza, e não porque o RNA faça alguma coisa; a maioria dos lncRNAs está presente em menos de uma cópia por célula, é pouco conservada e é dispensável quando deletada. O teste de função é genético: um fenótipo quando o RNA, e não apenas seu DNA, é removido. O Xist, os miRNAs e os piRNAs passam nele com folga; das dezenas de milhares de lncRNAs anotados, algumas centenas passaram até agora.

2.2 A interferência por RNA e os microRNAs

Definição 2.3 (Interferência por RNA)

A interferência por RNA (RNAi) é o silenciamento sequência-específico de um gene por um RNA pequeno derivado de RNA de fita dupla. A enzima Dicer, uma RNase III, corta o RNA longo de fita dupla em dúplexes de $21\text{ a }23$ nucleotídeos com extremidades 3 $'$ salientes de dois nucleotídeos; uma das fitas de cada dúplex, a fita-guia, é carregada numa proteína Argonauta para formar o complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). A guia pareia com um RNA-alvo complementar, e o domínio endonuclease da Argonauta corta o alvo em frente aos nucleotídeos 10 e 11 da guia; o RNA cortado é então degradado e o RISC é liberado para procurar outro. Em plantas, vermes e fungos uma RNA-polimerase dependente de RNA copia o alvo em novo RNA de fita dupla, de modo que o sinal é amplificado e se propaga; os mamíferos não têm essa etapa.

Evidência. Napoli, Lemieux e Jorgensen (1990) introduziram um gene extra da chalcona-sintase na petúnia para intensificar a cor da flor; $42\,\%$ dos transformantes eram brancos ou variegados, com o transgene e o gene endógeno silenciados — a “cossupressão”. Guo e Kemphues (1995) constataram que um RNA antissenso contra um gene de C. elegans o silenciava, mas o controle senso também. Fire, Mello e colaboradores (1998) resolveram o paradoxo: suas preparações de fitas simples estavam contaminadas com fitas duplas, e o RNA de fita dupla purificado de unc-22 injetado num verme dava o fenótipo de contração do unc-22 em concentrações de algumas moléculas por célula, ao passo que o RNA senso ou antissenso puro quase não dava nada; o silenciamento passava para tecidos distantes do local da injeção e para a prole. Hamilton e Baulcombe (1999) detectaram os RNAs de $25\,\mathrm{nt}$ em plantas silenciadas, e Zamore e colaboradores (2000) mostraram, num extrato de mosca, que o RNA de fita dupla é cortado neles e que o alvo é clivado em intervalos de $21\,\mathrm{nt}$ . ∎

À esquerda: petúnias que carregam um gene extra de pigmento, com os setores brancos da cossupressão. À direita: o nematódeo Caenorhabditis elegans, de cerca de um milímetro e transparente, no qual o RNA de fita dupla injetado silenciou o gene correspondente no animal inteiro e em sua prole. — À esquerda: petúnias que carregam um gene extra de pigmento, com os setores brancos da cossupressão. À direita: o nematódeo *Caenorhabditis elegans*, de cerca de um milímetro e transparente, no qual o RNA de fita dupla injetado silenciou o gene correspondente no animal inteiro e em sua prole.

Definição 2.4 (MicroRNAs)

Um microRNA é codificado no genoma — num gene próprio ou num íntron de um gene codificador de proteína — e transcrito pela RNA-polimerase II como um longo transcrito primário (pri-miRNA) que contém um grampo de cerca de $70\,\mathrm{nt}$ . No núcleo a RNase III Drosha, com sua parceira DGCR8, recorta o grampo (o pré-miRNA); a exportina-5 o leva ao citoplasma, onde a Dicer remove a alça, deixando um dúplex de $22\,\mathrm{nt}$ . Uma das fitas é carregada na Argonauta. O miRNA maduro reconhece seus alvos sobretudo por sua semente, os nucleotídeos 2 a 8, que pareia com sítios em geral na região 3 $'$ não traduzida de um mensageiro; o resto do miRNA pareia de modo imperfeito, e por isso o alvo não é clivado, mas reprimido: o RISC recruta proteínas que encurtam a cauda poli(A), removem o capuz e inibem a tradução, e o mensageiro é degradado mais depressa. Como uma semente tem apenas sete nucleotídeos, um miRNA tem centenas de alvos, e mais da metade dos genes humanos codificadores de proteína carrega sítios conservados para ao menos um das várias centenas de miRNAs humanos identificados com confiança.

Evidência. O lin-4, um gene necessário para o verme passar de seu primeiro estágio larval ao segundo, foi mostrado por Lee, Feinbaum e Ambros (1993) codificar não uma proteína, mas um RNA de $22\,\mathrm{nt}$ , complementar a sete sítios na região 3 $'$ não traduzida do mensageiro do lin-14, o gene que ele reprimia. Quando a larva entra no segundo estágio a proteína LIN-14 desaparece enquanto seu mRNA permanece: a repressão é pós-transcricional. Reinhart e colaboradores (2000) encontraram um segundo RNA desses, o let-7, controlando as transições larvais posteriores; Pasquinelli (2000) encontrou o let-7 em moscas e em humanos, com a mesma sequência, o que fez de uma curiosidade de verme um mecanismo geral. ∎

Biogênese de um microRNA. O grampo é recortado do transcrito primário pela Drosha no núcleo, exportado, aparado pela Dicer até um dúplex de 22\, nt, e uma das fitas é carregada na Argonauta. A semente pareia com um sítio na região 3' não traduzida de um mensageiro, e o mensageiro é desadenilado, degradado e menos traduzido. — Biogênese de um microRNA. O grampo é recortado do transcrito primário pela Drosha no núcleo, exportado, aparado pela Dicer até um dúplex de $22\,\mathrm{nt}$ , e uma das fitas é carregada na Argonauta. A semente pareia com um sítio na região 3 $'$ não traduzida de um mensageiro, e o mensageiro é desadenilado, degradado e menos traduzido.

Teorema 2.5 (O que um microRNA faz ao nível e à velocidade de um mensageiro)

Um mensageiro é sintetizado a uma taxa constante $k$ e degradado com taxa de primeira ordem $\gamma$ ; um microRNA presente no nível $R$ acrescenta um termo de decaimento $\gamma' R\, m$ . Então o nível de mRNA $m(t)$ obedece a

\frac{\mathrm{d}m}{\mathrm{d}t} = k - (\gamma + \gamma' R)\, m, \qquad m^{*} = \frac{k}{\gamma + \gamma' R}, \qquad m(t) = m^{*} + (m_{0} - m^{*})\,e^{-(\gamma + \gamma' R)t}.

O microRNA baixa o estado estacionário pelo fator $1 + \gamma' R/ \gamma$ e encurta a constante de tempo de toda mudança em $m$ de $1/\gamma$ para $1/(\gamma + \gamma' R)$ pelo mesmo fator. Um gene regulado por microRNA é, portanto, ao mesmo tempo mais silencioso e mais rápido: alcança antes um novo estado estacionário depois que seu promotor muda, e as flutuações de sua transcrição são amortecidas.

Demonstração. A equação é linear com coeficientes constantes; seu ponto fixo é $m^{*}$ , onde o lado direito se anula, e escrever $u = m - m^{*}$ dá $\mathrm{d}u/\mathrm{d}t = -(\gamma + \gamma' R)\,u$ , de onde vem a exponencial. O tempo de meia-resposta da aproximação é $\ln 2/(\gamma + \gamma' R)$ , e $\gamma = \ln 2 / t_{1/2}$ , em que $t_{1/2}$ é a meia-vida natural do mensageiro. ∎

Exemplo 2.6 (Uma repressão de quatro vezes)

Um mensageiro com meia-vida natural de $30\,\mathrm{min}$ ( $\gamma = 0.023\,\mathrm{min}^{-1}$ ), transcrito a $k = 2$ moléculas por minuto, assenta-se em $m^{*} = 2/0.023 \approx 87$ cópias por célula e leva $30\,\mathrm{min}$ para percorrer metade do caminho até um novo nível depois que seu promotor muda. Um microRNA que triplica sua taxa de decaimento ( $\gamma' R = 3\gamma$ ) o leva a $22$ cópias e reduz o tempo de meia-resposta a $7.5\,\mathrm{min}$ . Os mesmos números, lidos ao contrário, mostram por que os nocautes de miRNA muitas vezes têm fenótipos brandos: uma mudança de quatro vezes num mensageiro que já é tamponado adiante pode deixar o organismo quase normal, e o efeito aparece sob estresse ou no cronograma.

Subida de um mensageiro depois que seu promotor é ligado, com os números do . O microRNA baixa o patamar quatro vezes e o alcança quatro vezes mais cedo. — Subida de um mensageiro depois que seu promotor é ligado, com os números do Exemplo 2.6. O microRNA baixa o patamar quatro vezes e o alcança quatro vezes mais cedo.

Método 2.7 (Silenciar um gene por RNAi)

Para silenciar um gene sem tocar em seu DNA: (1) escolha uma sequência de $21\,\mathrm{nt}$ exclusiva de seu mensageiro, evitando correspondências de semente com outros genes; (2) entregue-a como um dúplex sintético de siRNA (transitório, alguns dias) ou como um RNA em grampo curto (shRNA) expresso a partir de um vetor, que a Dicer processa continuamente; em vermes, alimente os animais com bactérias que expressam o RNA de fita dupla; (3) meça o mensageiro por PCR quantitativa e a proteína por imunotransferência, esperando uma perda de $70\text{ a }95\,\%$ em vez da ausência completa de um nocaute; (4) controle os efeitos fora do alvo com um segundo siRNA que não se sobreponha ao primeiro e com um resgate por uma versão do gene resistente ao RNAi. Um knockdown é uma perda de função parcial e reversível; as terapias gênicas hoje aprovadas com esse princípio entregam siRNAs contra mensageiros hepáticos (transtirretina, PCSK9) acoplados a um açúcar que o hepatócito capta.

2.3 RNAs pequenos que guardam o genoma

Definição 2.8 (piRNAs e silenciamento de transpósons)

Os piRNAs são RNAs de $26\text{ a }31$ nucleotídeos, feitos sem a Dicer a partir de longos transcritos de fita simples de agrupamentos de piRNA genômicos — cemitérios de cópias defeituosas de transpósons — e carregados na subfamília PIWI das proteínas Argonauta na linhagem germinativa. Um piRNA antissenso a um transpóson guia a clivagem dos transcritos desse transpóson; o fragmento clivado se torna um novo piRNA senso, que por sua vez corta transcritos do agrupamento para fazer mais piRNAs antissenso — o ciclo pingue-pongue, uma amplificação que mira justamente o transpóson que estiver ativo. Proteínas PIWI nucleares também dirigem a metilação da H3K9 e a metilação do DNA às cópias genômicas do transpóson, ligando o RNA às marcas de cromatina do Capítulo 1. A mãe deposita seus piRNAs no óvulo; uma fêmea cuja linhagem nunca encontrou um transpóson não tem piRNAs contra ele, e sua prole com um macho que o carrega é estéril — a disgenesia híbrida, vista primeiro em cruzamentos de Drosophila entre linhagens de laboratório e selvagens.

Proposição 2.9 (Silenciamento da cromatina dirigido por RNA)

Nas plantas, uma via dedicada — a RNA-polimerase IV transcreve um loco, uma RNA-polimerase dependente de RNA o torna de fita dupla, uma Dicer corta siRNAs de $24\,\mathrm{nt}$ , a Argonauta 4 os leva de volta aos transcritos nascentes da polimerase V no mesmo loco e recruta a metiltransferase DRM2 — metila o DNA de transpósons e de sequências repetidas; é o mecanismo da paramutação. Na levedura de fissão, siRNAs das repetições centroméricas recrutam a metiltransferase da H3K9 e constroem a heterocromatina de que o centrômero precisa. Nos dois casos um RNA encontra um lugar no genoma por complementaridade e ali se escreve uma marca de cromatina: sequência-específica, autorreforçadora e hereditária ao longo das divisões.

2.4 A vida de um mensageiro

Definição 2.10 (Splicing regulado)

O splicing alternativo produz mensageiros diferentes a partir de um só gene pelo salto de éxon, pela escolha entre éxons mutuamente exclusivos, pela retenção de um íntron ou pelo uso de sítios de splicing 5 $'$ ou 3 $'$ alternativos. Ele é regulado por proteínas ligadoras de RNA que se ligam a elementos de sequência nos éxons e íntrons próximos de um sítio de splicing: as proteínas SR ligadas a intensificadores exônicos recrutam o spliceossomo e promovem a inclusão do éxon, as proteínas hnRNP ligadas a silenciadores a bloqueiam, e o desfecho numa dada célula é fixado pelas quantidades relativas dos dois tipos. Mais de $90\,\%$ dos genes humanos com vários éxons sofrem splicing alternativo; o gene Dscam de Drosophila, com quatro blocos de éxons mutuamente exclusivos (12, 48, 33 e 2 alternativas), pode produzir $38\,016$ proteínas distintas, cada neurônio expressando um conjunto diferente que permite a seus ramos reconhecer-se e evitar-se mutuamente.

Evidência. O sexo de uma mosca-das-frutas é decidido por uma cascata de splicing. Nas fêmeas o gene Sex-lethal (Sxl) produz uma proteína funcional; a SXL é uma proteína ligadora de RNA que bloqueia um sítio de splicing em seu próprio transcrito (de modo que um éxon com códon de parada é saltado e a proteína continua sendo feita) e no transcrito do transformer, forçando o splicing feminino; a TRA, junto com a TRA-2, liga-se então a um intensificador exônico no transcrito do doublesex e dirige a forma feminina do fator de transcrição DSX. Nos machos, sem SXL, cada um desses transcritos toma o splicing padrão, o transformer contém um códon de parada, e a DSX sai na forma masculina. Toda característica sexualmente dimórfica da mosca decorre de qual DSX é feita; uma fêmea com tra mutado desenvolve-se como macho. ∎

Definição 2.11 (Estabilidade e localização do mRNA)

A meia-vida de um mensageiro vai de minutos a dias e é fixada por elementos de sua região 3 $'$ não traduzida. Os elementos ricos em AU (repetições AUUUA) nos mensageiros de citocinas, fatores de crescimento e proto-oncogenes são ligados por proteínas que recrutam desadenilases e dão meias-vidas de $10\text{ a }30\,\mathrm{min}$ , de modo que uma rajada de transcrição produz uma rajada de proteína e nada mais; mutações que os removem causam superexpressão e, para alguns proto-oncogenes, câncer. Os elementos de localização, muitas vezes estruturados, são ligados por adaptadores que ligam o mensageiro a um motor: os mensageiros de bicoid e de oskar são levados aos dois polos do óvulo da mosca pela dineína e pela cinesina sobre microtúbulos, o mensageiro da $\beta$ -actina à borda de avanço de um fibroblasto, e os mensageiros de proteínas sinápticas para dentro dos dendritos, onde são traduzidos sob demanda. O elemento responsivo ao ferro (IRE), uma haste–alça ligada pelas proteínas reguladoras de ferro IRP1 e IRP2 quando o ferro é escasso, faz dois trabalhos opostos a partir de duas posições: na região 5 $'$ não traduzida do mensageiro da ferritina, a IRP ligada bloqueia o ribossomo; na região 3 $'$ não traduzida do mensageiro do receptor de transferrina, a IRP ligada protege o transcrito de uma nuclease.

Exemplo 2.12 (O ferro, lido por um grampo)

Quando o ferro está baixo, a IRP liga os dois mensageiros: a ferritina, a proteína de armazenamento, não é traduzida, e o receptor de transferrina, que importa ferro, é estabilizado e abundante — a célula armazena menos e importa mais. Quando o ferro está alto, ele converte a IRP1 numa aconitase (ela adquire um agrupamento ferro–enxofre e perde sua afinidade por RNA) e dispara a degradação da IRP2: a ferritina é traduzida, o mensageiro do receptor decai em minutos, e a célula armazena mais e importa menos. Nenhuma mudança de transcrição é necessária. Uma mutação pontual no IRE da ferritina que impede a ligação da IRP causa síntese constitutiva de ferritina e a síndrome hereditária hiperferritinemia–catarata.

O elemento responsivo ao ferro. Com pouco ferro a proteína reguladora de ferro liga os grampos IRE: na extremidade 5' do mensageiro da ferritina ela bloqueia a tradução, na extremidade 3' do mensageiro do receptor de transferrina ela bloqueia uma nuclease. Com muito ferro a proteína solta os dois: a ferritina é feita, o mensageiro do receptor decai. — O elemento responsivo ao ferro. Com pouco ferro a proteína reguladora de ferro liga os grampos IRE: na extremidade 5 $'$ do mensageiro da ferritina ela bloqueia a tradução, na extremidade 3 $'$ do mensageiro do receptor de transferrina ela bloqueia uma nuclease. Com muito ferro a proteína solta os dois: a ferritina é feita, o mensageiro do receptor decai.

Proposição 2.13 (Controle traducional)

A etapa de iniciação é o ponto usual de controle da tradução. A fosforilação do fator de iniciação eIF2 por cinases que percebem a privação de aminoácidos, proteínas mal enoveladas, RNA viral de fita dupla ou deficiência de heme desliga a iniciação geral em minutos, poupando alguns poucos mensageiros com características especiais — em particular os que têm fases de leitura aberta a montante, fases curtas na região 5 $'$ não traduzida que normalmente prendem ribossomos e que, sob estresse, são contornadas, de modo que os fatores de resposta ao estresse (GCN4 na levedura, ATF4 nos mamíferos) são feitos exatamente quando todo o resto não é. O fator de ligação ao capuz eIF4E é mantido inativo por proteínas ligadoras de 4E até que a cinase de sinalização de crescimento mTOR as fosforile: uma célula traduz a pleno regime só quando os nutrientes e os fatores de crescimento o autorizam. Nas bactérias, os ribosswitches fazem isso sem proteína alguma: uma região 5 $'$ estruturada liga um metabólito (pirofosfato de tiamina, S-adenosilmetionina, uma purina) e, ao ligá-lo, redobra-se para enterrar o sítio de ligação do ribossomo ou para formar um terminador de transcrição, de modo que um óperon biossintético se desliga quando seu produto é abundante.

Um RNA longo não codificante em ação: o transcrito Xist (vermelho), detectado por hibridação fluorescente, recobre o território de um cromossomo X num núcleo feminino (DNA em azul). — Um RNA longo não codificante em ação: o transcrito *Xist* (vermelho), detectado por hibridação fluorescente, recobre o território de um cromossomo X num núcleo feminino (DNA em azul).

Observação 2.14 (O que o controle pós-transcricional compra)

O controle transcricional age através do núcleo, com um atraso de minutos a horas até que um novo mensageiro seja feito, exportado e traduzido. O controle do próprio mensageiro age onde a proteína é necessária, em segundos a minutos, e pode ser local: um único dendrito traduzindo um mensageiro numa sinapse, a borda de avanço de um fibroblasto produzindo actina onde ele rasteja. Ele também faz de um gene muitas proteínas, e deixa um só sinal — o ferro, um aminoácido, um microRNA — coordenar centenas de mensageiros ao mesmo tempo sem tocar num único promotor.

2.5 Exercícios

Exercício 2.1 ★

Distinga miRNA, siRNA e piRNA quanto à origem, ao comprimento, à dependência da Dicer e ao que fazem a seus alvos.

Solução

Solução de Exercício 2.1.

miRNA: codificado no genoma como um grampo, $22\,\mathrm{nt}$ , cortado pela Drosha e depois pela Dicer, pareia de modo imperfeito por sua semente e reprime a tradução e a estabilidade de muitos mensageiros. siRNA: vem de RNA longo de fita dupla (viral, transgênico, experimental), $21\,\mathrm{nt}$ , dependente da Dicer, pareia perfeitamente e dirige a Argonauta para clivar o alvo. piRNA: vem de transcritos de fita simples de agrupamentos de piRNA, $26\text{ a }31\,\mathrm{nt}$ , independente da Dicer, carregado em proteínas PIWI na linhagem germinativa, cliva transcritos de transpósons (pingue-pongue) e dirige o silenciamento da cromatina do DNA dos transpósons.

Exercício 2.2 ★

Trace a biogênese de um microRNA desde seu gene até um mensageiro reprimido, nomeando a enzima de cada corte.

Solução

Solução de Exercício 2.2.

A Pol II transcreve o pri-miRNA; a Drosha (com a DGCR8) recorta o grampo no núcleo; a exportina-5 exporta o pré-miRNA; a Dicer corta a alça, deixando um dúplex de $22\,\mathrm{nt}$ ; uma das fitas é carregada na Argonauta; a semente (nucleotídeos 2–8) pareia com um sítio na 3 $'$ UTR; a Argonauta recruta a maquinaria de desadenilação e de remoção do capuz e bloqueia a iniciação — o mensageiro é menos traduzido e decai mais depressa.

Exercício 2.3 ★

Por que injetar RNA senso de unc-22 em vermes silenciava o gene nos primeiros experimentos, e o que Fire e Mello mudaram?

Solução

Solução de Exercício 2.3.

O RNA feito in vitro por uma polimerase de fago continha contaminantes de fita dupla (a polimerase também copia a outra fita do molde e ultrapassa as extremidades), de modo que as preparações “senso” carregavam o verdadeiro gatilho. Fire e Mello purificaram cada fita, mostraram que cada uma isolada fazia pouco e depois as anelaram de propósito: o RNA de fita dupla era ao menos cem vezes mais potente, e algumas moléculas por célula bastavam.

Exercício 2.4 ★

O que acontece com a ferritina e com o receptor de transferrina quando uma célula é privada de ferro? Qual etapa da expressão é controlada em cada caso?

Solução

Solução de Exercício 2.4.

Privada de ferro: a IRP liga os IREs. Ferritina: a iniciação da tradução é bloqueada e nenhuma proteína de armazenamento é feita (controle da tradução). Receptor de transferrina: o mensageiro é protegido de sua nuclease e se acumula, de modo que mais receptor é feito e mais ferro é importado (controle da estabilidade do mensageiro).

Exercício 2.5 ★★

Um mensageiro tem meia-vida de $2\,\mathrm{h}$ e é feito a $5$ moléculas por minuto. Calcule seu nível estacionário e, em seguida, o nível e o tempo de meia-resposta quando um microRNA dobra sua taxa de decaimento.

Solução

Solução de Exercício 2.5.

$\gamma = \ln 2/120\,\mathrm{min} = 0.0058\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $m^{*} = 5/0.0058 \approx 870$ moléculas. Com o decaimento dobrado: $m^{*} \approx 430$ , meia-resposta $120\,\mathrm{min}/2 = 60\,\mathrm{min}$ .

Exercício 2.6 ★★

Uma semente de sete nucleotídeos corresponde a uma sequência aleatória com probabilidade $4^{-7}$ . Num conjunto de $20\,000$ mensageiros com regiões 3 $'$ não traduzidas de $1000\,\mathrm{nt}$ em média, quantos sítios uma semente de microRNA corresponde por acaso? O que, então, distingue um alvo real?

Solução

Solução de Exercício 2.6.

Sequência total de 3 $'$ UTR $2\times 10^{7}$ nt; correspondências ao acaso $2\times 10^{7}/4^{7} = 2\times 10^{7}/16\,384 \approx 1200$ sítios. Um alvo real se distingue pela conservação do sítio entre espécies, por um contexto favorável (uma vizinhança rica em AU, um sítio afastado do códon de parada, pareamento adicional na extremidade 3 $'$ do miRNA), pela coexpressão de miRNA e alvo na mesma célula, e pelo experimento: o mensageiro cai quando o miRNA está presente e deixa de cair quando o sítio é mutado.

Exercício 2.7 ★★

Preveja o sexo de uma mosca (a) com uma mutação de perda de função de tra e dois cromossomos X; (b) que expressa TRA a partir de um transgene constitutivo, com um X; (c) desprovida de dsx.

Solução

Solução de Exercício 2.7.

(a) XX, tra nulo: a SXL é feita, mas a TRA não, e o dsx toma o splicing masculino padrão — um macho somático (estéril). (b) XY com TRA constitutiva: a TRA-2 está presente nos dois sexos, de modo que a DSX é feita na forma feminina — desenvolvimento somático feminino (uma “pseudofêmea” estéril, com a linhagem germinativa seguindo outros sinais). (c) Sem dsx: nenhuma das formas de DSX, de modo que nenhum dos programas de diferenciação terminal é imposto — um intersexo de caracteres mistos ou incompletos.

Exercício 2.8 ★★

O mensageiro de um proto-oncogene tem normalmente meia-vida de $15\,\mathrm{min}$ por causa de um elemento rico em AU. Uma translocação cromossômica remove o elemento e a meia-vida passa a $3\,\mathrm{h}$ . Por qual fator sobe o nível da proteína, se a tradução e a degradação proteica não mudam? Por que isso é oncogênico embora a proteína seja normal?

Solução

Solução de Exercício 2.8.

No estado estacionário o mensageiro, e portanto a proteína, é proporcional à meia-vida do mensageiro: $180\,\mathrm{min}/15\,\mathrm{min} = 12$ vezes mais proteína. A proteína é um sinal de crescimento normal que deveria ser transitório, um pulso após cada estímulo; feita doze vezes mais e de forma contínua, ela impulsiona a proliferação sem estímulo. A dose e o tempo, e não a sequência, é que a tornam oncogênica.

Exercício 2.9 ★★

Uma linhagem de laboratório de Drosophila não tem elementos P; uma linhagem selvagem os carrega. Preveja a fertilidade da prole de (a) fêmeas de laboratório $\times$ machos selvagens, (b) fêmeas selvagens $\times$ machos de laboratório, e explique a assimetria com os piRNAs.

Solução

Solução de Exercício 2.9.

(a) Mãe de laboratório, pai selvagem: os óvulos não carregam piRNAs contra elementos P (a linhagem da mãe nunca os encontrou), e os elementos P paternos transpõem livremente na linhagem germinativa da prole — estéril (disgênica). (b) Mãe selvagem: seus óvulos contêm piRNAs de elemento P, que silenciam os elementos na prole — fértil. A assimetria é a deposição materna de piRNAs, uma herança de RNA, e não de genes.

Exercício 2.10 ★★★

Usando o Teorema 2.5, argumente que a proteína feita a partir de um mensageiro flutua menos, em termos relativos, quando o mensageiro está sob controle de microRNA, para um mesmo nível médio de mensageiro. (A proteína faz a média do mensageiro ao longo de sua própria vida, e o mensageiro se renova mais depressa.) Por que uma célula pagaria por um microRNA e por uma taxa de transcrição maior para obter a mesma média?

Solução

Solução de Exercício 2.10.

A proteína integra seu mensageiro ao longo de sua própria vida $\tau_{p}$ . Os mensageiros vivem $\tau_{m} = 1/(\gamma + \gamma' R)$ ; durante $\tau_{p}$ a proteína vê, portanto, cerca de $\tau_{p}/\tau_{m}$ tempos de vida independentes de mensageiro, cada um um evento aleatório de nascimento e morte. A flutuação relativa de uma média sobre $N$ eventos independentes cai com $1/\sqrt{N}$ , de modo que o $\tau_{m}$ mais curto sob controle de microRNA — com o mesmo mensageiro médio, o que exige um $k$ proporcionalmente maior — dá uma proteína mais lisa. A célula paga pelo microRNA e pela transcrição extra para comprar precisão e velocidade: um nível fixado por um equilíbrio de síntese rápida e decaimento rápido é ao mesmo tempo menos ruidoso e mais pronto a se reajustar do que o mesmo nível fixado por síntese lenta e decaimento lento.

Exercício 2.11 ★★★

Nos vermes, uma RNA-polimerase dependente de RNA faz siRNAs secundários a partir do mensageiro-alvo; nos mamíferos não há nenhuma. Preveja, para cada um, se o silenciamento por uma única injeção de RNA de fita dupla dura por muitas divisões celulares e se ele se espalha a outros tecidos, e explique a consequência médica para os fármacos de siRNA.

Solução

Solução de Exercício 2.11.

Verme: a RNA-polimerase dependente de RNA faz novos siRNAs a partir do próprio mensageiro-alvo, de modo que o sinal é renovado enquanto o alvo for transcrito, sobrevive à diluição pelas divisões e, com um canal de RNA de fita dupla entre as células, espalha-se a outros tecidos e à linhagem germinativa por algumas gerações. Mamífero: sem amplificação, os siRNAs são consumidos e diluídos a cada divisão, agem apenas nas células que os receberam e se desvanecem em dias nas células em divisão. Consequência: um fármaco de siRNA precisa ser entregue a cada célula-alvo, funciona melhor em células que não se dividem (hepatócitos, daí os fármacos hepáticos) e exige doses repetidas.

Exercício 2.12 ★★★

Um lncRNA recém-anotado é expresso no coração. Planeje os experimentos que distinguiriam (a) um RNA funcional, (b) um ato de transcrição funcional cujo RNA é irrelevante e (c) ruído, e diga que resultado cada um prevê.

Solução

Solução de Exercício 2.12.

(a) RNA funcional: destruir o transcrito depois de feito (siRNA, oligonucleotídeo antissenso) dá um fenótipo, e expressar o RNA a partir de um transgene em outro lugar do genoma o resgata. (b) Transcrição funcional: inserir um sinal precoce de poliadenilação que interrompa a transcrição (ou deletar o promotor) dá o fenótipo, ao passo que destruir o RNA pós-transcricionalmente não dá, e um transgene ectópico não resgata — o ato de transcrever (ou o elemento de DNA) é que importa, como em muitos RNAs associados a intensificadores. (c) Ruído: nenhuma das manipulações muda coisa alguma, o RNA está a menos de uma cópia por célula, e sua sequência e sua expressão não são conservadas.

2.6 Problema: o cronômetro de um verme

Problema 2.1

Problema de fim de semana — o interruptor lin-4/lin-14 do verme cronometrado com a cinética do mensageiro, um RNA injetado diluído pelas divisões de um embrião e resgatado por amplificação, o regulão do ferro quantificado e uma contagem de splicing, terminando no fator de repressão, no tempo de meia-resposta do interruptor e no número de divisões que um sinal não amplificado sobrevive

Dados: o mensageiro lin-14 é feito a $k = 3$ moléculas por minuto por célula e tem meia-vida de $40\,\mathrm{min}$ . A proteína LIN-14 é feita a $\beta = 2$ por mensageiro por minuto e tem meia-vida de $3\,\mathrm{h}$ . A partir do início do segundo estágio larval, o RNA lin-4 se acumula e acrescenta um termo de decaimento $\gamma' R = 3\gamma$ ao mensageiro e, ao bloquear a iniciação, reduz $\beta$ à metade. Um embrião de verme desenvolve-se de uma célula a cerca de $550$ células ao eclodir; um adulto tem $959$ células somáticas.

Parte I — O mensageiro.

Calcule $\gamma$ e o nível estacionário do mensageiro lin-14 antes de o lin-4 aparecer.
Calcule a taxa de degradação da proteína e o nível estacionário da proteína LIN-14.
Uma vez presente o lin-4, calcule o novo nível do mensageiro e a nova constante de tempo do mensageiro.
Calcule o novo estado estacionário da proteína e o fator de repressão total sobre a proteína.
Quanto tempo depois de o lin-4 aparecer o mensageiro chega à metade do caminho até seu novo nível? E a proteína — que etapa limita a velocidade do interruptor?
Os experimentos originais encontraram a proteína desaparecida enquanto o mRNA ainda era detectável. Isso é coerente com seus números? Que fração do mensageiro permanece?

Parte II — Diluição e amplificação.

A gônada de um verme recebe a injeção de $10^{6}$ moléculas de RNA de fita dupla, repartidas igualmente entre $250$ óvulos. Quantas moléculas por óvulo?
Se as moléculas fossem simplesmente repartidas a cada divisão, quantas teria cada célula da larva de $550$ células ao eclodir? Após quantas divisões a mais a média cairia abaixo de uma por célula?
Fire e Mello viram silenciamento no animal inteiro e em sua prole, com algumas moléculas por célula. Explique o que uma RNA-polimerase dependente de RNA acrescenta à explicação, e por que o efeito mesmo assim se desvanece após algumas gerações.
Numa célula de mamífero sem essa polimerase, uma transfecção de siRNA põe $5000$ dúplexes numa célula que se divide diariamente; o RISC é estável, mas é diluído pela divisão. Após quantos dias a contagem cai abaixo de $100$ , mais ou menos o número necessário para um silenciamento eficaz?
Um siRNA terapêutico contra um mensageiro hepático é dado uma única vez e funciona por seis meses. Os hepatócitos raramente se dividem. Explique por que o mecanismo da questão 10 não o limita, e o que o limita.
Uma semente de sete nucleotídeos corresponde ao acaso uma vez a cada $4^{7}$ nucleotídeos. O transcriptoma do verme tem cerca de $20\,\mathrm{Mb}$ de sequência 3 $'$ não traduzida. Quantas correspondências de semente ao acaso tem o lin-4, e como os geneticistas souberam qual alvo importava?

Parte III — O regulão do ferro.

Em células ricas em ferro o mensageiro do receptor de transferrina tem meia-vida de $10\,\mathrm{min}$ ; com a IRP ligada, $50\,\mathrm{min}$ . Sem mudança na transcrição, por qual fator sobe o mensageiro quando o ferro se torna escasso?
O mensageiro da ferritina não muda de nível, mas sua tradução cai de $1$ para $0.05$ proteínas por mensageiro por minuto quando a IRP se liga. Por qual fator cai a síntese de ferritina?
Combine os dois: por qual fator muda a razão entre capacidade de importação e capacidade de armazenamento entre os estados rico e pobre em ferro?
A proteína IRP1 é ou uma proteína ligadora de RNA ou uma aconitase, conforme tenha ou não um agrupamento ferro–enxofre. Explique por que isso faz dela um sensor do próprio ferro, e não de um hormônio.
Um paciente tem uma mutação no IRE da ferritina que abole a ligação da IRP. Preveja o nível de ferritina, o ferro sérico e por que o cristalino do olho é afetado.
Explique numa frase por que o mesmo grampo pode ativar numa posição e reprimir em outra.
A IRP2 não tem agrupamento ferro–enxofre; quando o ferro está alto ela é destruída por uma ubiquitina-ligase cuja própria estabilidade exige ferro e oxigênio. Por que uma célula manteria dois sensores de química tão diferente?

Parte IV — Contando isoformas.

O Dscam tem blocos de éxons com 12, 48, 33 e 2 alternativas mutuamente exclusivas. Quantas isoformas? Se cada neurônio expressa cerca de $50$ ao acaso, qual é a probabilidade de dois neurônios dados compartilharem ao menos uma? (Use $1 - (1 - 50/N)^{50}$ .)
Por que um neurônio se beneficia de ter isoformas que seus vizinhos quase certamente não têm?
Um gene com $n$ éxons-cassete, cada um incluído ou saltado de modo independente, dá quantos mensageiros? Quantos para $n = 10$ ? Por que o número real num dado tipo celular é em geral muito menor?
Na mosca, por que uma fêmea com dois cromossomos X mas um alelo Sxl nulo morre em vez de simplesmente se desenvolver como macho? (Considere o que mais o sistema de contagem do X controla: a compensação de dose dos genes ligados ao X.)
A SXL promove o splicing produtivo de seu próprio transcrito. Explique por que isso faz da decisão sexual uma memória que persiste depois que o sinal de contagem do X, presente apenas no embrião inicial, desapareceu, e relacione isso com os interruptores autossustentados do Capítulo 1.
Resuma o cronômetro: o fator de repressão sobre a proteína LIN-14 (questão 4), o tempo de meia-resposta do interruptor do mensageiro (questão 5) e o número de divisões que um sinal não amplificado sobrevive antes de cair abaixo de uma molécula por célula (questão 8).

Solução

Solução de Problema 2.1.

1. $\gamma = \ln 2/40 = 0.0173\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $m^{*} = 3/0.0173 \approx 170$ mensageiros. 2. $\delta_{p} = \ln 2/180 = 0.003\,85\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $P^{*} = \beta m^{*}/\delta_{p} = 2\times 173/0.00385 \approx 9.0\times 10^{4}$ proteínas. 3. Decaimento $4\gamma = 0.069\,\mathrm{min}^{-1}$ ; $m^{*} = 3/0.069 \approx 43$ ; constante de tempo $1/0.069 = 14\,\mathrm{min}$ . 4. $\beta = 1$ : $P^{*} = 43/0.00385 \approx 1.1\times 10^{4}$ ; repressão de $8$ vezes ( $4$ pelo decaimento, $2$ pela tradução). 5. Meia-resposta do mensageiro $\ln 2/(4\gamma) = 10\,\mathrm{min}$ . A proteína decai então com sua própria meia-vida, $3\,\mathrm{h}$ : é a degradação da proteína que limita o interruptor. 6. Sim: o mensageiro cai apenas a $1/4$ (ainda facilmente detectável), ao passo que a proteína cai a $1/8$ e continua caindo à medida que a proteína antiga se renova; a observação original de que a proteína sumia “enquanto o mRNA permanecia” refletia sobretudo a metade traducional da repressão. 7. $10^{6}/250 = 4000$ moléculas por óvulo. 8. $4000/550 \approx 7$ por célula ao eclodir. $4000/2^{n} < 1$ para $n \ge 12$ divisões desde o zigoto — cerca de três divisões depois da eclosão. 9. A polimerase copia o mensageiro-alvo em novo RNA de fita dupla, cortado em siRNAs secundários: o gatilho é regenerado a partir do próprio alvo, e por isso sobrevive à diluição e se espalha (um canal passa RNA de fita dupla entre as células e para a linhagem germinativa). Ele se desvanece porque a amplificação precisa ao mesmo tempo do alvo e de um gatilho primário; uma vez ido o RNA injetado, a reserva secundária é diluída geração após geração e a linhagem germinativa se reinicia. 10. $5000/2^{n} < 100$ : $2^{n} > 50$ , $n = 6$ dias (sobram $78$ cópias). 11. Células que não se dividem não diluem o RISC; o limite é o tempo de vida químico do siRNA (degradação por nucleases, retardada por modificação química das fitas) e o vazamento lento do depósito endossomal que abastece o citoplasma. 12. $2\times 10^{7}/16\,384 \approx 1200$ correspondências ao acaso. A genética decidiu: a perda de lin-14 dá o fenótipo oposto ao da perda de lin-4, os alelos de ganho de função de lin-14 eram deleções exatamente dos sítios da 3 $'$ UTR, e os sete sítios eram conservados. 13. Nível $\propto$ meia-vida: subida de $50/10 = 5$ vezes. 14. Queda de $1/0.05 = 20$ vezes na síntese de ferritina. 15. A razão importação/armazenamento sobe $5\times 20 = 100$ vezes do estado rico ao pobre em ferro. 16. O agrupamento só se monta quando há ferro citosólico disponível, de modo que a conformação da proteína é uma leitura direta da concentração de ferro, sem receptor, hormônio ou transcrição — como um ribosswitch, um metabólito percebido pela molécula que ele controla. 17. A ferritina é traduzida independentemente do ferro: ferritina sérica muito alta, ferro sérico e estoques normais (sem sobrecarga). No cristalino, que não se renova, a ferritina se acumula por anos e cristaliza — uma catarata precoce. 18. O grampo é apenas um sítio de pouso; o efeito é aquilo que a proteína ligada obstrui fisicamente — os ribossomos que varrem a extremidade 5 $'$ , uma nuclease na extremidade 3 $'$ . 19. Duas químicas cobrem duas condições: o agrupamento ferro–enxofre da IRP1 também é destruído por oxidantes e por baixo oxigênio, de modo que a IRP1 responde ao estado redox, ao passo que a degradação da IRP2 dependente de ferro responde ao próprio ferro em toda a faixa fisiológica de oxigênio; a redundância torna o regulão robusto, e as duas relatam coisas diferentes. 20. $12\times 48\times 33\times 2 = 38\,016$ . $1 - (1 - 50/38\,016)^{50} = 1 - 0.99868^{50} \approx 1 - e^{-0.066} = 0.064$ : cerca de $6\,\%$ . 21. Isoformas idênticas ligam-se homofilicamente e se repelem: os ramos de um mesmo neurônio se evitam e se espalham, ao passo que ramos de neurônios diferentes, que quase não compartilham isoformas, podem se cruzar — uma identidade privada por célula. 22. $2^{n}$ ; $1024$ para $n = 10$ . Menos na realidade: a inclusão é decidida por fatores específicos de tipo celular e coordenada entre os éxons, muitas combinações deslocam a fase de leitura e são destruídas pelo decaimento mediado por códon sem sentido, e os éxons não são independentes. 23. O Sxl também controla a compensação de dose: nas fêmeas a SXL bloqueia a tradução do msl-2, de modo que os dois cromossomos X não são hipertranscritos; sem SXL um embrião XX monta o complexo MSL nos dois cromossomos X e dobra sua produção — uma dose letal de cada gene ligado ao X, antes mesmo de o sexo estar em questão. 24. O promotor precoce dispara apenas enquanto o sinal X:A está presente; a SXL que ele produz força o splicing produtivo do transcrito do promotor de manutenção, que é ativo nos dois sexos, de modo que, uma vez existindo, a SXL continua produzindo a si mesma e o sinal deixa de ser necessário — a mesma lógica autossustentada de leitor-recruta-escritor das marcas de cromatina, aqui com uma proteína e um splicing. 25. Proteína LIN-14 reprimida $8$ vezes; meia-resposta do interruptor do mensageiro $10\,\mathrm{min}$ ; um RNA não amplificado cai abaixo de uma molécula por célula após $12$ divisões.

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