Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

23Genética do Desenvolvimento e Evolução da Forma

O ovo de uma mosca-das-frutas tem meio milímetro de comprimento e, nas três horas após a fecundação, antes que uma única membrana celular tenha se formado entre seus seis mil núcleos, ele decide que extremidade será a cabeça, qual a cauda, onde ficará cada um de catorze segmentos e quais deles terão pernas, asas ou antenas. Ele o faz com algumas dezenas de genes, ligados numa hierarquia de faixas cada vez mais finas, cada faixa lida a partir das concentrações dos produtos das faixas anteriores. Em 1980 dois jovens cientistas em Heidelberg rastrearam milhares de moscas mutantes em busca de larvas com partes faltando ou duplicadas, e encontraram toda a hierarquia: genes cuja perda apaga um bloco de segmentos, genes cuja perda apaga um segmento sim e outro não, genes cuja perda vira todo segmento de trás para a frente. O trabalho do mesmo ano sobre um gene que transforma o terceiro segmento de uma mosca numa cópia do segundo — dando-lhe quatro asas, como tinham seus ancestrais — abriu um conjunto de genes mestres que, veio a se descobrir, ficavam na mesma ordem ao longo dos cromossomos de um camundongo e de um humano, e faziam o mesmo trabalho. Este capítulo trata de como um embrião computa sua própria geometria, de como algumas centenas de genes regulatórios constroem todo corpo animal, e de como mudar quando e onde eles agem produziu a diversidade da forma animal.

23.1 As coordenadas da mosca

Definição 23.1 (A hierarquia da segmentação)

O embrião de Drosophila se desenvolve, em suas primeiras treze divisões nucleares, como um blastoderma sincicial, uma única célula cujos núcleos compartilham um citoplasma, de modo que as proteínas se difundem livremente a partir de onde são feitas. Quatro gradientes estabelecidos pelas células da mãe fixam os eixos: o mRNA de bicoid fica ancorado no polo anterior e sua proteína se difunde para trás formando um gradiente exponencial da cabeça à cauda; o mRNA de nanos, no polo posterior, faz o gradiente espelhado; os mRNAs de hunchback e caudal são uniformes, mas a proteína Bicoid reprime a tradução de caudal e a Nanos reprime a de hunchback, de modo que suas proteínas também formam gradientes. Esses produtos de efeito materno, cujo fenótipo mutante depende do genótipo da mãe e não do embrião, ligam os genes gap (hunchback, Krüppel, knirps, giant) em faixas largas, cada uma respondendo a uma faixa de concentração de Bicoid e reprimindo suas vizinhas; as proteínas gap, em combinação, ligam os genes pair-rule (even-skipped, fushi tarazu, hairy) em sete faixas cada, alternadas; e as proteínas pair-rule ligam os genes de polaridade segmentar (engrailed, wingless, hedgehog) em catorze faixas, uma por segmento, que fixam a frente e o fundo de cada segmento e são mantidas, depois que as células se formam, pela sinalização entre elas. Três horas, quatro níveis, de um único gradiente a catorze segmentos — e os nomes dos mutantes registram o rastreamento: hunchback não tem tórax, Krüppel (“aleijado”) não tem o meio, fushi tarazu (“segmentos insuficientes”) não tem um segmento sim e outro não, hedgehog tem um gramado de cerdas.

A hierarquia da segmentação. Um gradiente materno é lido em quatro faixas de genes gap; as proteínas gap, em combinação, em sete faixas pair-rule; e estas, em catorze faixas de polaridade segmentar. Cada faixa é um limite traçado onde uma concentração cruza um limiar.

Teorema 23.2 (Um gradiente de morfógeno a partir de síntese, difusão e degradação)

Uma proteína feita numa extremidade de um tecido à taxa $J$ (por unidade de área), que se difunde com coeficiente $D$ e é degradada com constante de taxa $k$ , alcança um regime estacionário em que sua concentração ao longo do eixo $x$ obedece a

D\,\frac{\mathrm{d}^{2}c}{\mathrm{d}x^{2}} - k\,c = 0, \qquad c(x) = c_{0}\,\mathrm{e}^{-x/\lambda}, \qquad \lambda = \sqrt{D/k}, \quad c_{0} = \frac{J}{\sqrt{Dk}} .

O comprimento de decaimento $\lambda$ fixa o alcance do gradiente; uma célula lê sua posição comparando $c$ com limiares — a bandeira francesa de Wolpert (1969): acima de $T_{1}$ , azul; entre $T_{1}$ e $T_{2}$ , branco; abaixo, vermelho — e o limite para o limiar $T$ fica em $x_{T} = \lambda\ln(c_{0}/T)$ . Duas consequências: dobrar a fonte desloca todo limite para trás pelo mesmo $\lambda\ln 2$ , e um erro fracionário $\delta c/c$ na leitura da concentração é um erro posicional $\delta x = \lambda\,\delta c/c$ , de modo que um gradiente só consegue colocar um limite com precisão de uma célula se as células o lerem com precisão de alguns por cento. A Bicoid tem $\lambda \approx 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ num ovo de $500\,\text{µ}\mathrm{m}$ : o gradiente abrange um fator $\mathrm{e}^{5} \approx 150$ , e o limite de hunchback fica no meio do ovo, onde a Bicoid caiu a cerca de um doze avos de seu pico.

Demonstração. Conservação numa fatia entre $x$ e $x + \mathrm{d}x$ : a entrada difusiva líquida $D\,\partial^{2}c/\partial x^{2}$ equilibra a degradação $kc$ em regime estacionário, dando a equação; a solução limitada quando $x \to \infty$ é a exponencial decrescente com $\lambda^{2} = D/k$ . A fonte: o fluxo difusivo em $x = 0$ , $-D\, c'(0) = Dc_{0}/\lambda$ , é igual a $J$ , de modo que $c_{0} = J\lambda/D = J/\sqrt{Dk}$ . Limiar: $c_{0}\mathrm{e}^{-x_{T}/\lambda} = T$ dá $x_{T}$ ; dobrar $c_{0}$ acrescenta $\lambda\ln 2$ a todo $x_{T}$ , seja qual for $T$ . Erro: derivando $x_{T} = \lambda\ln(c_{0}/c)$ , $\delta x = -\lambda\,\delta c/c$ . O regime estacionário é alcançado na escala de tempo $1/k$ , que para a Bicoid ( $50\,\mathrm{min}$ ) é comparável às duas horas disponíveis, de modo que o gradiente é lido enquanto ainda se acomoda. ∎

A bandeira francesa traçada por uma exponencial. Limiares sobre um único gradiente repartem o ovo em regiões; uma fonte mais forte move todos os limites para trás pela mesma distância, que é o que mostram os embriões de mães com cópias extras de bicoid. — A bandeira francesa traçada por uma exponencial. Limiares sobre um único gradiente repartem o ovo em regiões; uma fonte mais forte move todos os limites para trás pela mesma distância, que é o que mostram os embriões de mães com cópias extras de *bicoid*.

Evidência. Nüsslein-Volhard e Wieschaus (1980) alimentaram moscas com um mutagênico, cruzaram os descendentes até a homozigose e olharam ao microscópio as cutículas de umas $27\,000$ larvas mortas em busca de padrões faltando ou repetidos: cerca de cento e vinte genes, classificados por seus fenótipos nas classes gap, pair-rule e de polaridade segmentar — uma hierarquia visível antes que se conhecesse molécula alguma. Driever e Nüsslein-Volhard (1988) coraram embriões para a proteína Bicoid e viram o gradiente exponencial a partir do polo anterior; embriões de mães com uma, duas, quatro ou seis cópias do gene tinham gradientes de altura proporcional, e a prega cefálica e o limite de hunchback se moviam para trás com a dose, como o modelo de limiar prevê, e aproximadamente pelo $\lambda\ln 2$ por duplicação que ele exige. Injetar mRNA de bicoid no meio de um ovo produzia ali uma cabeça. ∎

À esquerda: um embrião sincicial corado para a proteína Bicoid, mais brilhante no polo anterior e desvanecendo exponencialmente rumo ao posterior. À direita: um embrião uma hora depois, corado para uma proteína pair-rule, sete faixas traçadas a partir das faixas dos genes gap.

23.2 Identidade: os genes Hox

Definição 23.3 (Genes homeóticos e colinearidade)

Uma mutação homeótica transforma uma parte do corpo em outra: a palavra é de Bateson (1894) para as anormalidades que “substituem um membro de uma série por outro”. Na mosca, os mutantes dominantes Antennapedia fazem crescer pernas onde deveria haver antenas; os mutantes bithorax (Lewis, 1978) transformam o terceiro segmento torácico numa cópia do segundo, de modo que os balancins (halteres) viram um segundo par de asas. Os oito genes responsáveis, os genes Hox, ficam em dois agrupamentos de um mesmo cromossomo, e Lewis notou que sua ordem ao longo do DNA corresponde à ordem, ao longo do corpo, dos segmentos que eles controlam — a colinearidade, ainda não totalmente explicada. Cada um codifica um fator de transcrição com o mesmo domínio homeobox de ligação ao DNA, de 60 aminoácidos (McGinnis, Gehring, 1984), que foi então encontrado em todo animal: camundongos e humanos carregam quatro agrupamentos de treze genes cada, colineares do mesmo modo, expressos em domínios aninhados ao longo do eixo do corpo, com os genes mais tardios do agrupamento mais posteriores. A identidade de uma célula ao longo do eixo é dada pela combinação de genes Hox que ela expressa, o código Hox; os genes posteriores dominam os anteriores (prevalência posterior), de modo que perder um gene posterior deixa o segmento adotar a identidade do que está à frente. Os genes Hox não constroem um segmento; eles dizem a um segmento já construído qual segmento ele é, ligando as baterias de genes a jusante apropriadas a uma perna, uma asa, uma costela ou uma vértebra lombar.

Agrupamentos Hox numa mosca e num camundongo. Os genes ficam ao longo do DNA na ordem das regiões do corpo que especificam, nos dois animais, e os genes homólogos podem ser reconhecidos pela sequência: um gene Hoxb6 de camundongo é reconhecivelmente o Antennapedia da mosca. — Agrupamentos Hox numa mosca e num camundongo. Os genes ficam ao longo do DNA na ordem das regiões do corpo que especificam, nos dois animais, e os genes homólogos podem ser reconhecidos pela sequência: um gene *Hoxb6* de camundongo é reconhecivelmente o *Antennapedia* da mosca.

Evidência. Lewis (1978) mapeou o complexo bithorax como uma série de mutações, cada uma transformando um segmento no que está à frente, dispostas no cromossomo na ordem do corpo, e propôs que os genes eram ativados sequencialmente ao longo do eixo. McGinnis e colaboradores (1984) encontraram o homeobox por hibridização cruzada entre Antennapedia e Ultrabithorax e depois em rãs e camundongos. A equivalência funcional foi mostrada diretamente: um gene Hoxb6 de camundongo expresso numa mosca produz o fenótipo Antennapedia, pernas no lugar de antenas (anos 1990); um camundongo sem Hoxc8 tem uma costela extra em sua primeira vértebra lombar, tendo o segmento assumido a identidade do que está à frente; e alterar os limites de expressão Hox em galinha e camundongo desloca a posição em que se formam os membros anteriores, sendo o comprimento do pescoço de um cisne acompanhado por um deslocamento posterior do mesmo limite. ∎

À esquerda: a cabeça de uma mosca mutante Antennapedia, um par de pernas onde deveria haver antenas — o segmento construído corretamente e informado da identidade errada. À direita: o esqueleto de um embrião de camundongo, cartilagem em azul e osso em vermelho, as vértebras ao longo das quais o código Hox é lido. — À esquerda: a cabeça de uma mosca mutante *Antennapedia*, um par de pernas onde deveria haver antenas — o segmento construído corretamente e informado da identidade errada. À direita: o esqueleto de um embrião de camundongo, cartilagem em azul e osso em vermelho, as vértebras ao longo das quais o código Hox é lido.

23.3 Construir um vertebrado

Definição 23.4 (Organizadores e centros de sinalização)

Os embriões de vertebrados são celulares desde o início, de modo que seus gradientes são feitos por proteínas secretadas, e não pela difusão de um sincício, e as mesmas poucas famílias fazem tudo: Wnt, Hedgehog, BMP e outros parentes do TGF- $\beta$ , FGF, Notch e ácido retinoico. Spemann e Mangold (1924) enxertaram um pedaço do lábio dorsal de uma gástrula de tritão no ventre de outra e obtiveram um segundo embrião, da cabeça à cauda, feito sobretudo de células do hospedeiro: o enxerto era um organizador, que induzia seus vizinhos a formar um sistema nervoso e um eixo, e suas moléculas se revelaram, setenta anos depois, antagonistas secretados (Chordin, Noggin) que bloqueiam a BMP, cuja ausência permite que o ectoderma se torne neural — o padrão. O tubo neural é então padronizado dorsoventralmente pelo sonic hedgehog da notocorda e da placa do assoalho (alto: neurônios motores; baixo: interneurônios) contra a BMP do teto; e o broto do membro, por dois centros, a zona de atividade polarizadora em sua margem posterior, que secreta Shh (cujo enxerto na margem anterior dá uma duplicação em espelho dos dedos, seis dedos se encontrando polegar com polegar), e a crista ectodérmica apical em sua ponta, que secreta FGFs que mantêm em divisão as células subjacentes e especificam a sequência proximal-distal de úmero, antebraço e mão. Enxerto, ablação e esferas embebidas em proteína continuam sendo as ferramentas; a lógica — uma fonte local, um gradiente, limiares, um código de fatores de transcrição — é a da mosca.

Os dois centros de sinalização do broto do membro. O sonic hedgehog da margem posterior diz às células que dedo se tornarem; o FGF da ponta lhes diz quão longe estão ao longo do membro. Enxertos que movem um centro movem o padrão com ele.

Proposição 23.5 (Padrão espontâneo: o mecanismo de Turing)

Nem todo padrão é lido de um gradiente preexistente. Turing (1952) mostrou que duas substâncias que se difundem e reagem — um ativador que estimula sua própria produção e a de um inibidor, e um inibidor que suprime o ativador e se difunde muito mais depressa — podem transformar espontaneamente um campo uniforme num arranjo regular de picos: um pequeno excesso local de ativador cresce por autorreforço enquanto o inibidor que ele produz se espalha e impede que novos picos se formem por perto, de modo que os picos surgem num espaçamento fixado pelo alcance do inibidor, $\lambda \sim \sqrt{D_{\text{inib}}/k_{\text{inib}}}$ , e não por coordenada externa alguma. O mecanismo, aqui admitido em sua matemática, é a melhor explicação para as manchas e listras dos pelames, para o espaçamento dos folículos pilosos e dos brotos de pena, para as cristas do palato, para os dedos da mão (cujo número sobe quando o comprimento de onda do padrão é encurtado pela redução da atividade Hox) e para as listras do peixe-zebra, em que as células que interagem — células pigmentares que repelem vizinhas de um tipo e atraem as de outro a distância — foram identificadas e suas listras, levadas a se refazer após ablação a laser exatamente como a teoria prevê.

Demonstração. Admitido neste nível. ∎

23.4 Evolução da forma

Definição 23.6 (Evo-devo)

Os genes que constroem os animais são um kit de ferramentas antigo e compartilhado: algumas centenas de fatores de transcrição e vias de sinalização já presentes no ancestral comum de todos os animais, e a diversidade animal vem sobretudo de mudanças em quando, onde e quanto eles são expressos, e não no que codificam. Homologia profunda: o gene Pax6 dirige a formação do olho em moscas, lulas e camundongos, cujos olhos não são homólogos como órgãos — um Pax6 de camundongo expresso na perna de uma mosca faz ali um olho de mosca ectópico (Halder, Gehring, 1995). Evolução cis-regulatória: a perda dos espinhos pélvicos nos esgana-gatas de água doce é a deleção de um único intensificador do gene Pitx1, com a proteína intacta e ainda servindo em outros lugares; a perda das manchas das asas em algumas moscas-das-frutas, uma mudança num intensificador de yellow; a perda das pernas nas cobras, um intensificador quebrado de sonic hedgehog no membro. Deslocamentos Hox: o limite de expressão de Hoxc6 marca a primeira vértebra torácica igualmente em camundongo, galinha, ganso e cobra, nas vértebras 7, 14, 23 e 3; a perda das pernas abdominais nos insetos foi a proteína Hox Ubx adquirindo um domínio repressor que desliga o gene da perna Distal-less, onde nos crustáceos ela não o faz. A heterocronia, uma mudança no tempo de um programa de desenvolvimento, fez do axolote uma larva permanente e do rosto humano o de um macaco juvenil. A velha pergunta de como surgem formas novas vira uma pergunta sobre DNA regulatório: a maior parte do genoma que importa para a forma não é gene, é interruptor.

Exemplo 23.7 (Quatro asas)

Os ancestrais das moscas tinham quatro asas, como libélulas e abelhas ainda têm; as moscas têm duas, com o par posterior reduzido aos balancins. Nas moscas, Ultrabithorax é expresso no terceiro segmento torácico e ali reprime o programa da asa — uns cem genes-alvo, sendo um halter uma asa com esses genes desligados. A mosca mutante tripla de Lewis, sem função de Ubx no terceiro segmento, faz crescer um segundo par de asas: não uma estrutura nova, mas a liberação de uma antiga. Nas borboletas o Ubx é expresso também na asa posterior e, ali, não suprime a asa, mas muda seu padrão: a mesma proteína, um conjunto diferente de alvos. Quatrocentos milhões de anos de evolução dos dípteros dependeram da decisão de um gene num segmento, e uma única mutação a desfaz numa geração — e é por isso que a história da forma é legível nos genes que a constroem.

Observação 23.8 (Geometria a partir da química)

Um embrião não tem planta nem agrimensor. Ele tem alguns gradientes feitos por difusão e degradação, células que os leem contra limiares e ligam fatores de transcrição, e um código desses fatores que diz a cada região o que se tornar; tem organizadores locais que induzem seus vizinhos, e reações que se padronizam sozinhas. A matemática é a da cinética de primeira ordem e da difusão — uma exponencial, uma raiz quadrada, um limiar — e ela explica não só como a cabeça de uma mosca é posicionada, mas por que dobrar um gene desloca um limite por uma distância fixa, por que aparecem seis dedos quando um sinal é duplicado, e por que uma cobra tem trezentas costelas. A evolução edita os interruptores, e não a máquina: o kit de ferramentas de uma esponja e o de um humano são quase o mesmo, e o que difere é a fiação.

23.5 Exercícios

Exercício 23.1 ★

Nomeie os quatro níveis da hierarquia de segmentação da mosca, um gene de cada e o fenótipo mutante que o colocou em sua classe.

Solução

Solução de Exercício 23.1.

Efeito materno: bicoid, embriões de mães mutantes não têm cabeça nem tórax. Gap: Krüppel, um bloco contíguo de segmentos faltando. Pair-rule: fushi tarazu (ou even-skipped), um segmento sim e outro não faltando. Polaridade segmentar: hedgehog (ou engrailed), com parte de cada segmento substituída por uma imagem espelhada do resto.

Exercício 23.2 ★

O que é um gene de efeito materno? Uma fêmea homozigota para uma mutação nula de bicoid é cruzada com um macho selvagem: descreva seus embriões e explique por que o genótipo deles não os salva.

Solução

Solução de Exercício 23.2.

Um gene cujo produto é depositado no ovo pela mãe, de modo que o fenótipo do embrião segue o genótipo dela. Seus embriões não têm cabeça nem tórax e carregam estruturas posteriores nas duas extremidades; eles morrem. O alelo selvagem paterno está no zigoto, mas o mRNA de bicoid é feito durante a oogênese pelas células nutridoras da mãe e ancorado no polo antes da fecundação; a cópia do próprio zigoto só seria transcrita horas depois, passado o tempo do gradiente.

Exercício 23.3 ★

Enuncie a colinearidade e a prevalência posterior. Preveja o fenótipo de um camundongo sem Hoxc8 e o de uma mosca que expressa Antennapedia na cabeça.

Solução

Solução de Exercício 23.3.

Colinearidade: a ordem dos genes Hox ao longo do cromossomo corresponde à ordem de seus domínios de expressão ao longo do corpo. Prevalência posterior: onde vários são expressos, o mais posterior fixa a identidade. Um camundongo sem Hoxc8 mostra uma transformação anterior — sua primeira vértebra lombar assume a identidade de uma torácica e carrega uma costela. Antennapedia na cabeça converte antenas em pernas, a identidade do segundo segmento torácico.

Exercício 23.4 ★

O que o enxerto de Spemann–Mangold mostrou, e que moléculas se descobriu serem as do organizador? Por que o destino neural é chamado de “padrão”?

Solução

Solução de Exercício 23.4.

Um lábio dorsal enxertado induziu um segundo eixo completo, feito sobretudo de células do hospedeiro: o enxerto instruiu seus vizinhos — um organizador. Suas moléculas são antagonistas secretados da BMP (Chordin, Noggin, Folistatina). O ectoderma se torna neural quando a sinalização de BMP está ausente e epiderme quando a BMP está presente, de modo que neural é o que o ectoderma faz quando nada lhe é dito: o organizador funciona silenciando uma instrução.

Exercício 23.5 ★★

Bicoid: $D = 4\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , meia-vida de $35\,\mathrm{min}$ . Calcule $k$ , $\lambda$ e a razão entre as concentrações no polo anterior e no meio do ovo ( $250\,\text{µ}\mathrm{m}$ ).

Solução

Solução de Exercício 23.5.

$k = \ln 2/(35\times 60) = 3.3 \times 10^{-4}\,\mathrm{s}^{-1}$ ; $\lambda = \sqrt{4/ 3.3\times 10^{-4}} = 110\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; razão $\mathrm{e}^{250/110} = \mathrm{e}^{2.27} = 9.7$ .

Exercício 23.6 ★★

Com $\lambda = 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ , um limite fica em $240\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Onde ele fica se a mãe carregar quatro cópias de bicoid em vez de duas? E uma cópia? Expresse os deslocamentos como fração de um ovo de $500\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Solução

Solução de Exercício 23.6.

Quatro cópias dobram $c_{0}$ : o limite recua $\lambda\ln 2 = 69\,\text{µ}\mathrm{m}$ , para $309\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; uma cópia o reduz à metade: avança $69\,\text{µ}\mathrm{m}$ , para $171\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Cada deslocamento é $14\,\%$ do comprimento do ovo — maior que o observado, o que é, em si, evidência de mecanismos que amortecem a dependência da dose.

Exercício 23.7 ★★

Os núcleos do blastoderma estão a $8\,\text{µ}\mathrm{m}$ um do outro. Para colocar um limite com precisão de um núcleo, com $\lambda = 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ , com que precisão um núcleo precisa ler a concentração de Bicoid? Se o núcleo contar moléculas ao longo de um tempo $\tau$ e a contagem for de Poisson, quantas ele precisa contar?

Solução

Solução de Exercício 23.7.

$\delta x = \lambda\,\delta c/c$ : para $8\,\text{µ}\mathrm{m}$ , $\delta c/c = 8/100 = 8\,\%$ . Uma contagem de Poisson $N$ tem erro relativo $1/\sqrt{N}$ , de modo que $N = 1/0.08^{2} \approx 160$ moléculas precisam ser contadas — alguns por cento das moléculas presentes num núcleo, ou uma única contagem integrada no tempo.

Exercício 23.8 ★★

O gradiente se aproxima do regime estacionário na escala de tempo $1/k$ . Com uma meia-vida de $35\,\mathrm{min}$ , que fração da concentração estacionária é alcançada em $60\,\mathrm{min}$ , $90\,\mathrm{min}$ e $120\,\mathrm{min}$ ? O que isso implica para um embrião que precisa ler o gradiente até $150\,\mathrm{min}$ ?

Solução

Solução de Exercício 23.8.

$k = \ln 2/35 = 0.0198\,\mathrm{min}^{-1}$ : $1 - \mathrm{e}^{-kt}$ dá $0.70$ em $60\,\mathrm{min}$ , $0.83$ em $90\,\mathrm{min}$ , $0.91$ em $120\,\mathrm{min}$ e $0.95$ em $150\,\mathrm{min}$ . O gradiente ainda sobe alguns por cento enquanto é lido, o que deslocaria um limite em $\lambda\ln(1/0.9) \approx 10\,\text{µ}\mathrm{m}$ , cerca de um núcleo, ao longo da janela de leitura: o embrião precisa ou ler num tempo fixo ou usar uma leitura insensível ao nível global.

Exercício 23.9 ★★

Uma ZPA é enxertada na margem anterior de um broto de membro de galinha. Preveja o padrão dos dedos, e o padrão se, em vez disso, for implantada ali uma esfera que libera uma dose baixa de Shh.

Solução

Solução de Exercício 23.9.

Uma segunda ZPA dá uma duplicação em espelho, 4-3-2-2-3-4: as células anteriores agora veem Shh alto e se tornam dedos posteriores. Uma esfera que libera pouco Shh dá uma duplicação parcial — um dedo 2 anterior extra, digamos 2-2-3-4 — porque as células anteriores só veem a concentração baixa que especifica o dedo 2.

Exercício 23.10 ★★★

Um morfógeno é feito por todo um tecido de comprimento $L$ à taxa $s$ por unidade de volume, degradado à taxa $k$ e destruído no limite $x = L$ (um sorvedouro absorvente), sem fluxo em $x = 0$ . Resolva $Dc'' - kc + s = 0$ para $c(x)$ e esboce-o. Em que a forma desse gradiente difere do caso da fonte numa extremidade, e o que acontece quando $L \ll \lambda$ ?

Solução

Solução de Exercício 23.10.

Solução particular $s/k$ ; soluções homogêneas $\cosh(x/\lambda)$ e $\sinh(x/\lambda)$ ; a ausência de fluxo em $0$ elimina o $\sinh$ ; $c(L) = 0$ fixa a amplitude: $c(x) = (s/k)\bigl[1 - \cosh(x/\lambda)/\cosh(L/\lambda)\bigr]$ . O perfil é um platô perto de $x = 0$ que cai a zero numa camada-limite de largura $\lambda$ no sorvedouro — não uma exponencial a partir de um ponto, mas um campo nivelado com uma borda; a concentração mais alta é a mais distante do sorvedouro. Para $L \ll \lambda$ , $\cosh u \approx 1 + u^{2}/2$ e $c \approx s(L^{2} - x^{2})/(2D)$ : uma parábola independente de $k$ , já que as moléculas chegam ao sorvedouro antes de poderem decair.

Exercício 23.11 ★★★

Dois limiares em $T_{1} = 0.3c_{0}$ e $T_{2} = 0.08c_{0}$ dividem um gradiente em três regiões. Mostre que as larguras das duas primeiras regiões não dependem de $c_{0}$ , e explique por que um embrião cujo comprimento varia entre indivíduos (de $450\,$ a $550\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) precisa de algo mais que uma simples exponencial para escalonar seu padrão. Proponha um mecanismo.

Solução

Solução de Exercício 23.11.

$x_{1} = \lambda\ln(1/0.3) = 1.20\lambda$ e $x_{2} = \lambda\ln(1/0.08) = 2.53\lambda$ : a primeira região tem $1.20\lambda$ de largura e a segunda, $1.32\lambda$ , ambas independentes de $c_{0}$ , que as desloca juntas. A terceira região, $L - 2.53\lambda$ , absorve toda a variação de comprimento do ovo: num ovo de $450\,\text{µ}\mathrm{m}$ com $\lambda = 100\,\text{µ}\mathrm{m}$ o abdome tem $197\,\text{µ}\mathrm{m}$ , e num de $550\,\text{µ}\mathrm{m}$ , $297\,\text{µ}\mathrm{m}$ — o padrão não está escalonado. Mecanismos: um segundo gradiente a partir do polo posterior (Nanos, Caudal ou o sistema terminal) lido junto com a Bicoid, de modo que as posições sejam fixadas pela razão; ou uma molécula “expansora” feita onde o morfógeno é baixo, que alonga $\lambda$ até o gradiente preencher o ovo.

Exercício 23.12 ★★★

Os esgana-gatas perderam os espinhos pélvicos deletando um intensificador de Pitx1; as cobras perderam os membros quebrando um intensificador de sonic hedgehog. Explique por que mudanças regulatórias, e não mudanças codificantes, são a rota usual para uma estrutura perdida ou alterada, em termos de pleiotropia e do que a mesma proteína faz em outros lugares.

Solução

Solução de Exercício 23.12.

Uma mudança codificante altera a proteína onde quer que ela aja: o Pitx1 também constrói a hipófise e a mandíbula, o sonic hedgehog também padroniza o tubo neural, o intestino e os dentes, de modo que uma proteína quebrada é letal ou pleiotropicamente incapacitante. Um intensificador dirige a expressão num tecido e num tempo; deletá-lo remove a estrutura que aquele tecido teria construído e deixa intacto todo outro uso da proteína. Os intensificadores são modulares e muitas vezes em parte redundantes, de modo que passos intermediários são viáveis, e a mesma rota — um interruptor perdido — foi tomada independentemente em muitos lagos de esgana-gatas.

23.6 Problema: A Bandeira Francesa

Problema 23.1

Problema de fim de semana — o sistema de coordenadas de um ovo calculado a partir da cinética de primeira ordem: o comprimento, a fonte e o tempo de formação do gradiente de Bicoid, os limites que ele traça e sua precisão, o que a dosagem gênica e o tamanho do ovo fazem com eles, e o código Hox lido a jusante, terminando no comprimento de decaimento, no deslocamento por duplicação e na precisão posicional

Dados: comprimento do ovo $500\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; Bicoid $D = 4\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}/\mathrm{s}$ , meia-vida de $35\,\mathrm{min}$ ; fluxo da fonte tal que $c_{0} = 50\,\mathrm{nM}$ com duas cópias maternas; espaçamento nuclear $8.5\,\text{µ}\mathrm{m}$ no ciclo 14; limiares $T_{1} = 0.3\,c_{0}$ (cabeça/tórax) e $T_{2} = 0.08\,c_{0}$ (limite de hunchback) para o caso de duas cópias. Ruído de leitura $\delta c/c = 0.1$ para um único núcleo. Número de Avogadro $6 \times 10^{23}\,$ ; um núcleo é uma esfera de raio $3\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Parte I — O gradiente.

Calcule $k$ a partir da meia-vida, em $\mathrm{s}^{-1}$ , e o tempo de vida $1/k$ em minutos.
Calcule $\lambda = \sqrt{D/k}$ em micrômetros. Quantos comprimentos de decaimento tem o ovo?
A concentração cai por que fator de um polo ao outro? E por que fator ao longo de um espaçamento nuclear no meio do ovo?
Calcule o fluxo da fonte $J = c_{0}\sqrt{Dk}$ em $\mathrm{nM}\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}^{-1}$ , e o número de moléculas que entram por segundo num trecho de $1\,\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ do polo anterior.
Número de moléculas de Bicoid num núcleo do polo ( $c_{0}$ ) e no meio do ovo.
Fração do regime estacionário alcançada em $60\,\mathrm{min}$ e $120\,\mathrm{min}$ ( $1 - \mathrm{e}^{-kt}$ ). O gradiente está estacionário quando os limites são traçados, por volta de $120\,\mathrm{min}$ ?

Parte II — Limites.

Posições dos dois limites, em $\text{µ}\mathrm{m}$ e como frações do comprimento do ovo.
A mãe tem quatro cópias: novo $c_{0}$ e as duas posições dos limites. De quanto cada um se moveu? E com seis cópias?
Uma cópia: posições. Que regiões cresceram e quais encolheram?
Erro posicional a partir de um ruído de leitura de $10\,\%$ , em micrômetros e em espaçamentos nucleares.
Se o erro precisa ser de um núcleo, que precisão de leitura é necessária? Se o núcleo tira a média de $n$ leituras independentes e o ruído cai como $1/\sqrt{n}$ , quantas leituras?
Um núcleo no limite de hunchback contém o número calculado na questão 5. Qual é o ruído de Poisson $1/\sqrt{N}$ de uma única contagem instantânea? Compare com $10\,\%$ e comente.

Parte III — Escalonamento e robustez.

Os ovos variam de $450\,$ a $550\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Se $\lambda$ e $c_{0}$ forem fixos, onde cai o limite de hunchback como fração do comprimento do ovo em cada caso? O padrão está escalonado?
Suponha, em vez disso, que $D$ escale como $L^{2}$ (o mesmo tempo de vida, mas uma fonte cujo espalhamento cresce com o ovo). Mostre que $\lambda/L$ é então constante e o padrão escalona. Isso é plausível?
O gene hunchback responde à Bicoid com um coeficiente de Hill de $5$ : sua expressão é $c^{5}/(c^{5} + T^{5})$ . Ao longo de quantos micrômetros a expressão vai de $10\,\%$ a $90\,\%$ em torno do limite? Compare com um espaçamento nuclear.
Explique por que uma resposta íngreme afia um limite mas não reduz, por si só, o erro posicional devido ao ruído de concentração.
A repressão mútua entre genes gap afia e estabiliza seus limites. Argumente numa frase por que dois genes que se reprimem mutuamente não podem estar ambos ligados no mesmo núcleo em regime estacionário.
A temperatura eleva $D$ em $2\,\%$ e $k$ em $6\,\%$ por grau. Variação de $\lambda$ por grau, e o deslocamento do limite numa sala $5\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ mais quente. Por que os embriões podem precisar de um mecanismo compensatório?

Parte IV — Identidade.

O código Hox: com oito genes Hox de mosca, cada um ligado ou desligado, quantos códigos são possíveis? Quantos são usados (catorze segmentos)? Por que a prevalência posterior reduz o número efetivo?
Uma mosca não tem Ubx em seu terceiro segmento torácico. O que o segmento se torna, e por que o resultado são quatro asas e não uma estrutura nova?
O limite de Hoxc6 de um camundongo fica na vértebra 7, e o de um ganso na 23. O que isso prevê sobre seus pescoços, e o que mudou na evolução: o gene ou sua expressão?
Um enxerto de ZPA dá dedos 4-3-2-2-3-4. Explique o padrão a partir de dois gradientes de Shh que se encontram no meio.
Halder e Gehring expressaram Pax6 de camundongo na perna de uma mosca e obtiveram ali um olho de mosca. O que isso mostra sobre o gene, e o que isso não mostra sobre os olhos de moscas e de camundongos?
O sexto dedo: encurtar o comprimento de onda de Turing acrescenta um dedo. Com cinco dedos numa placa de mão de $2\,\mathrm{mm}$ , que mudança de comprimento de onda dá seis? Que parâmetro do sistema de reação–difusão a produziria?
Resuma: $\lambda$ (questão 2), o deslocamento do limite por duplicação da fonte (questão 8) e o erro posicional a partir de um ruído de $10\,\%$ (questão 10).

Solução

Solução de Problema 23.1.

1. $k = \ln 2/(35\times 60) = 3.3 \times 10^{-4}\,\mathrm{s}^{-1}$ ; $1/k = 3030\,\mathrm{s} = 50\,\mathrm{min}$ . 2. $\lambda = \sqrt{4/3.3\times 10^{-4}} = 110\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; o ovo tem $4.5\lambda$ . 3. $\mathrm{e}^{4.5} \approx 90$ de um polo ao outro; $\mathrm{e}^{8.5/110} = 1.08$ , uma variação de $8\,\%$ por núcleo. 4. $J = 50\times\sqrt{4\times 3.3\times 10^{-4}} = 50\times 0.036 = 1.8\,\mathrm{nM}\,\text{µ}\mathrm{m}\,\mathrm{s}^{-1}$ . Um nM são $0.6$ moléculas por $\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ , de modo que são cerca de $1.1$ moléculas por $\text{µ}\mathrm{m}^{2}$ por segundo. 5. Volume nuclear $\tfrac{4}{3}\pi\times 27 = 113\,\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ . A $50\,\mathrm{nM}$ , $30$ moléculas por $\text{µ}\mathrm{m}^{3}$ : $3400$ moléculas. No meio do ovo, $c = 50\,\mathrm{e}^{-2.27} = 5.2\,\mathrm{nM}$ : cerca de $350$ moléculas. 6. $kt = 1.19$ em $60\,\mathrm{min}$ : $0.70$ ; $kt = 2.38$ em $120\,\mathrm{min}$ : $0.91$ . O gradiente está a menos de $10\,\%$ do estacionário quando é lido — ainda subindo por um tanto que moveria um limite em $\lambda\ln(1/0.91) \approx 10\,\text{µ}\mathrm{m}$ , um núcleo. 7. $x_{1} = 110\ln(1/0.3) = 132\,\text{µ}\mathrm{m}$ ( $26\,\%$ ); $x_{2} = 110\ln(1/0.08) = 278\,\text{µ}\mathrm{m}$ ( $56\,\%$ ). 8. Quatro cópias: $c_{0} = 100\,\mathrm{nM}$ ; os dois limites recuam $\lambda\ln 2 = 76\,\text{µ}\mathrm{m}$ , para $208$ e $354\,\text{µ}\mathrm{m}$ . Seis cópias: $\lambda\ln 3 = 121\,\text{µ}\mathrm{m}$ , para $253$ e $399\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 9. Uma cópia: avanço de $76\,\text{µ}\mathrm{m}$ , para $56$ e $202\,\text{µ}\mathrm{m}$ . A região da cabeça encolheu de $132$ para $56\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; o tórax manteve sua largura ( $146\,\text{µ}\mathrm{m}$ ) e avançou; o abdome cresceu de $222$ para $298\,\text{µ}\mathrm{m}$ . 10. $\delta x = 110\times 0.1 = 11\,\text{µ}\mathrm{m}$ , $1.3$ espaçamentos nucleares. 11. Um núcleo: $\delta c/c = 8.5/110 = 7.7\,\%$ . A partir de $10\,\%$ , $n = (10/7.7)^{2} \approx 1.7$ : duas leituras independentes (ou a média de dois núcleos vizinhos) bastam. 12. $1/\sqrt{350} = 5.3\,\%$ : uma única contagem instantânea já é mais precisa que os $10\,\%$ supostos, de modo que o ruído observado não é só ruído de contagem, mas vem da cinética de ligação e da maquinaria de leitura — e a média no tempo o melhora. 13. $278/450 = 62\,\%$ e $278/550 = 51\,\%$ do comprimento do ovo: uma discrepância de $11\,\%$ , seis núcleos. O padrão não escalona com um $\lambda$ fixo. 14. Se $D \propto L^{2}$ com $k$ fixo, $\lambda \propto L$ e $x_{T}/L = (\lambda/L)\ln(c_{0}/T)$ é o mesmo em todo ovo: escalonamento perfeito. Mas $D$ é uma propriedade da molécula e do citoplasma, e não do tamanho do ovo, de modo que isso é implausível como enunciado; o escalonamento em embriões reais é parcial e vem de outras leituras. 15. $c^{5}/(c^{5} + T^{5}) = 0.1$ em $c/T = 9^{-1/5} = 0.64$ e $0.9$ em $c/T = 9^{1/5} = 1.55$ : um fator $2.4$ em concentração, $\Delta x = 110\ln 2.4 = 97\,\text{µ}\mathrm{m}$ — onze núcleos, muito mais largo que o limite observado, de dois ou três; a leitura do gradiente, sozinha, não é nítida o bastante. 16. A inclinação mapeia uma dada concentração para ligado ou desligado de modo mais decisivo, de modo que a região de transição é mais estreita; mas um erro de $10\,\%$ na concentração continua movendo o ponto em que o limiar é cruzado em $\lambda\,\delta c/c$ : a resposta pode ser um degrau perfeito e o degrau ainda assim cair no lugar errado. 17. Se os dois estivessem ligados, cada um estaria reprimindo o outro, de modo que ao menos um seria desligado; com repressão cooperativa os únicos estados estáveis são um ligado e o outro desligado, e um limite entre eles é uma chave, e não uma rampa. 18. $\mathrm{d}\ln\lambda = \tfrac{1}{2}(0.02 - 0.06) = -0.02$ por grau: $\lambda$ cai $2\,\%$ por grau, $10\,\%$ para $5\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ , indo a $99\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; o limite de hunchback vai de $278$ para $250\,\text{µ}\mathrm{m}$ , três núcleos adiante. As moscas se desenvolvem entre $18\,$ e $29\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ com proporções normais, de modo que algo compensa — uma fonte ou uma leitura que se desloca com a temperatura no sentido contrário. 19. $2^{8} = 256$ códigos; catorze usados. Com a prevalência posterior, só o gene ligado mais posterior importa, de modo que há no máximo nove identidades distintas (oito genes, ou nenhum): o código é uma ordenação, e não uma palavra binária. 20. O terceiro segmento torácico vira um segundo: o Ubx reprimia o programa da asa que um segmento torácico roda por padrão, e retirar o repressor libera o estado ancestral — quatro asas, como nos ancestrais de quatro asas da mosca. 21. A região cervical do ganso vai até a vértebra 22: um pescoço longo, de muitas vértebras, contra as sete do camundongo. O gene é o mesmo; o limite anterior de sua expressão se moveu para trás — uma mudança regulatória em onde um gene Hox é ligado. 22. Cada margem é agora uma fonte; o Shh é mais alto nas duas bordas (dedo 4), cai rumo ao centro (3, depois 2) e nunca alcança o nível baixo que especifica o dedo 1, de modo que o meio abriga dois dedos 2 costas com costas: 4-3-2-2-3-4. 23. O Pax6 é um regulador mestre conservado que consegue disparar qualquer programa de olho que o hospedeiro carregue: a mosca construiu um olho de mosca, de modo que o gene de camundongo não carrega informação de olho de camundongo, apenas a ordem “construa um olho aqui”. Isso mostra homologia profunda da rede gênica, e não homologia dos órgãos: o olho composto e o olho em câmara evoluíram separadamente a partir de um ancestral que tinha um retalho de fotorreceptores com Pax6. 24. Cinco dedos ao longo de $2\,\mathrm{mm}$ são um comprimento de onda de $0.4\,\mathrm{mm}$ ; seis exigem $0.33\,\mathrm{mm}$ , um encurtamento de um sexto. Como $\lambda \propto \sqrt{D_{\text{inib}}/k_{\text{inib}}}$ , eleve a degradação do inibidor em $44\,\%$ ou baixe sua difusão em $31\,\%$ ; na placa da mão, reduzir a dose dos genes Hox posteriores faz isso, e os camundongos mutantes têm seis, sete ou mais dedos finos. 25. $\lambda \approx 110\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; uma duplicação da fonte desloca todo limite em $76\,\text{µ}\mathrm{m}$ ; um ruído de $10\,\%$ na concentração são $11\,\text{µ}\mathrm{m}$ , cerca de um núcleo, de erro posicional.

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