Biologia universitária — 3.º ano · Bachelor Year 3

7Biologia estrutural das proteínas

Max Perutz começou a trabalhar na estrutura da hemoglobina em 1937 e a publicou em 1960: vinte e dois anos para ver, a uma resolução de meio nanômetro, como quatro cadeias de cento e cinquenta aminoácidos se dobram em torno de quatro hemes. Uma molécula de hemoglobina se dobra sozinha em alguns milissegundos. Entre esses dois fatos está o assunto deste capítulo: o que é a forma de uma proteína, por que uma cadeia de aminoácidos tem uma forma e não outra, como ela encontra essa forma tão depressa entre um número astronômico de alternativas, o que dá errado quando não a encontra, como as formas são vistas — por raios X, por ressonância magnética, por elétrons e, hoje, por computação — e como uma proteína se move entre formas para fazer seu trabalho, com a troca da hemoglobina entre uma forma tensa e uma relaxada como modelo de toda proteína alostérica desde então.

7.1 O que é a estrutura de uma proteína

Definição 7.1 (Níveis de estrutura)

A estrutura primária é a sequência de resíduos. A estrutura secundária é a conformação regular local do esqueleto, estabilizada por pontes de hidrogênio entre as carbonilas e as amidas do esqueleto: a $\alpha$ -hélice, uma espiral dextrógira de $3.6$ resíduos por volta, que sobe $0.15\,\mathrm{nm}$ por resíduo ( $0.54\,\mathrm{nm}$ por volta), cada carbonila ligada à amida quatro resíduos adiante; e a folha $\beta$ , em que fitas estendidas se dispõem lado a lado, paralelas ou antiparalelas, ligadas às vizinhas, com as cadeias laterais alternando acima e abaixo da folha. A estrutura terciária é o enovelamento de uma cadeia inteira em três dimensões; uma unidade compacta que se dobra de modo independente, de $50\text{ a }250$ resíduos dentro dela, é um domínio, e o arranjo dos elementos secundários de um domínio é seu enovelamento. A estrutura quaternária é a montagem de várias cadeias: o $\alpha_{2}\beta_{2}$ da hemoglobina. Cerca de $1300$ enovelamentos dão conta de todos os domínios conhecidos, e algumas dezenas deles — o enovelamento de Rossmann, o barril TIM, o enovelamento de imunoglobulina — de uma grande fração de todas as proteínas: a natureza reaproveita enovelamentos e varia suas sequências.

O diagrama de Ramachandran. As regiões sombreadas são as combinações estericamente permitidas dos ângulos e do esqueleto; a -hélice dextrógira e a fita correspondem cada uma a uma região pequena, e a maioria dos resíduos de uma proteína enovelada cai numa delas. — O diagrama de Ramachandran. As regiões sombreadas são as combinações estericamente permitidas dos ângulos $\phi$ e $\psi$ do esqueleto; a $\alpha$ -hélice dextrógira e a fita $\beta$ correspondem cada uma a uma região pequena, e a maioria dos resíduos de uma proteína enovelada cai numa delas.

Proposição 7.2 (O que mantém um enovelamento)

Uma proteína enovelada é estabilizada pelo efeito hidrofóbico — enterrar cadeias laterais apolares num cerne longe da água, o que libera as moléculas de água que de outro modo ficariam ordenadas em torno delas —, pelas pontes de hidrogênio da estrutura secundária e de grupos polares enterrados, pelo empacotamento de van der Waals de um cerne tão denso quanto um cristal, por pontes salinas ocasionais e, nas proteínas secretadas, por pontes dissulfeto. O efeito hidrofóbico fornece a maior parte do impulso; as pontes de hidrogênio em geral se pagam a si mesmas (um esqueleto ligado à água no estado desenovelado está ligado a si mesmo no enovelado) e, em vez disso, ditam qual enovelamento. A energia livre líquida do enovelamento é pequena, $\Delta G \approx -20$ a $-60\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ — a força de um punhado de pontes de hidrogênio numa molécula que tem centenas — porque a perda de entropia conformacional no enovelamento quase anula o ganho em entalpia. As proteínas são marginalmente estáveis: uns poucos graus, uma mudança de pH ou uma única mutação no cerne podem desenovelá-las, e essa marginalidade é o que lhes permite mover-se.

Evidência. Anfinsen (1961) desenovelou a ribonuclease A com ureia e um agente redutor, rompendo suas quatro pontes dissulfeto e destruindo sua atividade; ao retirar os dois, a enzima se reenovelou, reformou as quatro pontes corretas entre os $105$ pareamentos possíveis e recuperou toda a atividade. Nenhum molde, nenhuma enzima, nenhuma informação além da sequência estava presente: a estrutura nativa é o estado termodinamicamente mais estável acessível à cadeia, e a sequência a codifica. Reoxidar as pontes dissulfeto com a cadeia ainda em ureia deu uma mistura embaralhada com $1\,\%$ de atividade, que então se desembaralhou até a forma nativa quando lhe permitiram enovelar-se: a cadeia encontra o mínimo por si só. ∎

7.2 Como uma cadeia encontra seu enovelamento

Teorema 7.3 (O paradoxo de Levinthal)

Se cada um dos $n$ resíduos de uma proteína pudesse adotar $k$ conformações de esqueleto de modo independente, a cadeia teria $k^{n}$ conformações. Com $k = 3$ e $n = 100$ isso dá $3^{100} \approx 5\times 10^{47}$ ; amostrá-las a uma por picossegundo ( $10^{12}$ por segundo) levaria $5\times 10^{35}$ segundos, cerca de $10^{28}$ anos. Proteínas desse tamanho se enovelam em milissegundos a segundos. Logo, o enovelamento não é uma busca ao acaso entre conformações: a superfície de energia é um funil, no qual quase toda conformação parcial é enviesada rumo ao estado nativo, e a cadeia desce por movimentos locais que são, em média, cada um ladeira abaixo.

Demonstração. A contagem é o princípio multiplicativo; o tempo é a contagem dividida pela taxa de amostragem, $5\times 10^{47}/10^{12} = 5\times 10^{35}$ s, e um ano tem $3\times 10^{7}$ s. A conclusão é a contrapositiva: uma busca ao acaso desse tamanho é impossível no tempo observado, logo a busca não é ao acaso. O que a torna não aleatória é que uma interação formada numa parte da cadeia persiste enquanto outras se formam (o colapso hidrofóbico e a formação de hélices acontecem em microssegundos e reduzem o espaço a percorrer) e que as estruturas parcialmente corretas têm, em média, energia mais baixa que as erradas, de modo que a descida é guiada — um funil, e não um campo de golfe com um único buraco. ∎

O funil de enovelamento. A energia livre cai e o número de conformações disponíveis encolhe à medida que a cadeia se aproxima do estado nativo; as paredes são acidentadas, de modo que uma cadeia pode ficar presa num intermediário parcialmente mal enovelado, mas a inclinação geral a leva até o fundo em milissegundos.

Definição 7.4 (Chaperonas)

Uma chaperona molecular é uma proteína que auxilia o enovelamento de outras sem se tornar parte delas nem fornecer informação sobre o enovelamento: ela impede a agregação que compete com o enovelamento no citoplasma abarrotado. A Hsp70 liga segmentos hidrofóbicos expostos de cadeias nascentes ou desenoveladas e as libera com a hidrólise de ATP para nova tentativa; a chaperonina GroEL (Hsp60 nas mitocôndrias, TRiC no citosol eucarionte) é um barril duplo de catorze subunidades cuja cavidade central, tampada pela GroES, encerra uma única cadeia de até $60\,\mathrm{kDa}$ em isolamento por cerca de dez segundos — uma gaiola de Anfinsen — e a ejeta enovelada ou não, para tentar de novo. Cerca de um décimo das proteínas bacterianas recém-feitas passa pela GroEL, e uma célula cujas chaperonas são sobrecarregadas — pelo calor, razão pela qual a maioria delas são proteínas de choque térmico induzidas por uma elevação da temperatura — enche-se de agregados.

Definição 7.5 (Amiloide)

O amiloide é um agregado ordenado de proteína em que as cadeias se empilham em fibrilas não ramificadas de $5\text{ a }10\,\mathrm{nm}$ de largura, com as fitas de cada cadeia correndo perpendicularmente ao eixo da fibrila e ligadas por pontes de hidrogênio às fitas da cadeia seguinte — a estrutura cross- $\beta$ , a mesma seja qual for a proteína. Quase qualquer proteína pode formá-lo em condições desestabilizantes; nas doenças de mau enovelamento determinadas proteínas o fazem no corpo: a amiloide- $\beta$ e a tau na doença de Alzheimer, a $\alpha$ -sinucleína na de Parkinson, a huntingtina, a transtirretina, o amiloide das ilhotas no diabetes tipo 2. Um príon é um amiloide que se propaga: a forma mal enovelada da proteína priônica PrP converte a forma normal, por contato, em mais de si mesma, de modo que a “infecção” não carrega ácido nucleico algum, apenas uma forma — o mecanismo do scrapie, da encefalopatia espongiforme bovina e da doença de Creutzfeldt–Jakob, estabelecido por Prusiner a partir de 1982 contra longa resistência.

À esquerda: fibrilas amiloides no microscópio eletrônico — retas, não ramificadas, às vezes torcidas, e estruturalmente parecidas seja qual for a proteína de que são feitas. À direita: o tetrâmero da hemoglobina, duas cadeias e duas , cada uma abrigando um heme. — À esquerda: fibrilas amiloides no microscópio eletrônico — retas, não ramificadas, às vezes torcidas, e estruturalmente parecidas seja qual for a proteína de que são feitas. À direita: o tetrâmero da hemoglobina, duas cadeias $\alpha$ e duas $\beta$ , cada uma abrigando um heme.

7.3 Ver uma proteína

Definição 7.6 (Métodos estruturais)

A cristalografia de raios X cresce um cristal da proteína, expõe-no a um feixe de raios X e registra o padrão de difração; as posições dos pontos dão a rede e suas intensidades, uma vez recuperadas as fases das ondas, dão a densidade eletrônica da célula unitária, na qual a cadeia é construída. A ressonância magnética nuclear (RMN) mede, em solução, os acoplamentos entre os núcleos de átomos próximos no espaço, a partir dos quais se calculam distâncias e daí uma estrutura; ela funciona para proteínas abaixo de uns $40\,\mathrm{kDa}$ e informa sobre seus movimentos. A criomicroscopia eletrônica fotografa de milhares a milhões de moléculas isoladas congeladas num filme fino de gelo vítreo, cada uma em orientação aleatória, e reconstrói a densidade tridimensional combinando-as; desde os detectores diretos de elétrons (2013) ela alcança resolução atômica e não precisa de cristal, de modo que complexos grandes, proteínas de membrana e montagens flexíveis que nunca cristalizaram são hoje resolvidos de rotina. A resolução de uma estrutura é o menor espaçamento em que dois detalhes ficam separados: a $0.35\,\mathrm{nm}$ o esqueleto e as cadeias laterais grandes são posicionados, a $0.2\,\mathrm{nm}$ cada átomo, a $0.1\,\mathrm{nm}$ os hidrogênios.

Evidência. Kendrew (1958) obteve a primeira estrutura de uma proteína, a mioglobina de cachalote, a $0.6\,\mathrm{nm}$ — uma salsicha de irregularidade inesperada, “mais complicada e menos simétrica do que qualquer um previra” — e a $0.2\,\mathrm{nm}$ em 1960, quando as $\alpha$ -hélices que Pauling propusera a partir de modelos em 1951 foram vistas pela primeira vez. Perutz (1960) resolveu a hemoglobina a $0.55\,\mathrm{nm}$ usando o método de átomos pesados que idealizara para obter as fases: átomos de mercúrio presos à proteína mudam as intensidades de um modo que revela a informação que falta. Comparando as formas oxigenada e desoxigenada (1970), ele viu as subunidades girarem umas contra as outras em $15{}^{\circ}$ ao ligar o oxigênio, a primeira transição alostérica observada em escala atômica. ∎

Max Perutz em 1962, ano de seu prêmio Nobel pela estrutura da hemoglobina (Associated Press, domínio público). Ao centro: cristais de proteína numa gota suspensa, o ponto de partida da cristalografia. À direita: um criomicroscópio eletrônico, o instrumento que tornou os cristais desnecessários.

Método 7.7 (Resolver uma estrutura por cristalografia)

(1) Purifique miligramas da proteína e teste centenas de condições (precipitante, pH, sal) em busca de cristais; (2) congele rapidamente um cristal e colete imagens de difração num síncrotron enquanto ele gira no feixe; (3) indexe os pontos para obter a célula unitária e a simetria; o maior ângulo em que se veem pontos fixa a resolução pela lei de Bragg, $d = \lambda/(2\sin\theta)$ ; (4) resolva o problema das fases — o detector registra intensidades, mas não fases — com átomos pesados, com o espalhamento anômalo do selênio na selenometionina, ou, para uma proteína parecida com outra já conhecida, por substituição molecular, colocando o modelo conhecido na célula; (5) calcule a densidade eletrônica, construa a cadeia dentro dela e refine o modelo contra os dados até que a discordância (fator $R$ ) seja pequena; (6) valide: geometria, discrepâncias de Ramachandran e o ajuste a dados contra os quais o modelo não foi refinado.

Do cristal ao modelo. A rede regular espalha os raios X em pontos discretos; o ponto de maior ângulo fixa a resolução; recuperar as fases converte as intensidades num mapa de densidade eletrônica, no qual a cadeia é construída.

Observação 7.8 (A predição entrou para os métodos)

Desde 2020 a estrutura de uma proteína é prevista a partir de sua sequência com uma acurácia que muitas vezes rivaliza com a de uma estrutura experimental de $0.3\,\mathrm{nm}$ (Capítulo 5). A predição é uma hipótese sobre um estado nativo estático; os métodos experimentais continuam sendo o árbitro, e a única fonte de informação sobre ligantes, mudanças conformacionais, complexos e a dinâmica discutida adiante. Os papéis deles mudaram — um modelo previsto resolve o problema das fases por substituição molecular e orienta quais experimentos vale a pena fazer — em vez de um substituir o outro.

7.4 Alosteria: a hemoglobina como modelo

Definição 7.9 (Alosteria e cooperatividade)

Uma proteína é alostérica quando a ligação de um ligante num sítio muda a afinidade de outro sítio, por uma mudança de conformação transmitida através da molécula. Quando os dois sítios ligam o mesmo ligante e o efeito é positivo, a ligação é cooperativa: a saturação fracionária $Y$ sobe com a concentração do ligante como uma sigmoide, e não como uma hipérbole, descrita empiricamente pela equação de Hill $Y = [S]^{n_{H}}/(K^{n_{H}} + [S]^{n_{H}})$ com um coeficiente de Hill $n_{H} > 1$ (hemoglobina: $n_{H} \approx 2.8$ para seus quatro sítios; mioglobina, de um sítio: $n_{H} = 1$ ). A hemoglobina existe em duas conformações quaternárias, o estado T (tenso, de baixa afinidade, favorecido quando nenhum oxigênio está ligado) e o estado R (relaxado, de alta afinidade), e alterna entre elas como um todo; prótons, dióxido de carbono e 2,3-bisfosfoglicerato estabilizam o T e assim baixam a afinidade — o efeito Bohr, pelo qual o tecido em trabalho, ácido e quente, retira mais oxigênio do sangue.

Teorema 7.10 (O modelo de Monod–Wyman–Changeux)

Seja uma proteína de $n$ sítios idênticos que existe em duas conformações, $T$ e $R$ , em equilíbrio $L = [T_{0}]/[R_{0}]$ na ausência de ligante, com cada sítio de $R$ ligando o ligante com constante de dissociação $K_{R}$ e cada sítio de $T$ com $K_{T}$ , $c = K_{R}/K_{T} < 1$ . Todos os sítios de uma molécula alternam juntos (a transição é concertada). Então, com $\alpha = [S]/K_{R}$ , a saturação fracionária é

Y = \frac{\alpha(1+\alpha)^{n-1} + Lc\alpha(1+c\alpha)^{n-1}} {(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}},

e a fração de moléculas no estado $R$ é $\bar R = (1+\alpha)^{n}/\bigl[(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}\bigr]$ . Para $L \gg 1$ e $c \ll 1$ a curva é sigmoide: os primeiros ligantes se ligam às escassas moléculas $R$ , de alta afinidade, e inclinam o equilíbrio, de modo que a ligação recruta mais $R$ e a afinidade dos sítios restantes sobe — cooperatividade sem interação direta alguma entre os sítios.

Demonstração. A espécie com $i$ ligantes ligados na forma $R$ tem concentração $[R_{0}]\binom{n}{i}\alpha^{i}$ (cada uma das $\binom{n}{i}$ escolhas de sítios ocupados contribui com $([S]/K_{R})^{i}$ pela lei da ação das massas), e na forma $T$ , $[T_{0}]\binom{n}{i}(c\alpha)^{i}$ , já que $[S]/K_{T} = c\alpha$ . Somando sobre $i$ pelo teorema binomial, a proteína total é $[R_{0}]\bigl[(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}\bigr]$ e o ligante total ligado é $[R_{0}]\sum_{i} i\binom{n}{i}\bigl[ \alpha^{i} + L(c\alpha)^{i}\bigr] = [R_{0}]\,n\bigl[\alpha(1+\alpha)^{n-1} + Lc\alpha(1+c\alpha)^{n-1}\bigr]$ , usando $\sum_{i} i\binom{n}{i}x^{i} = nx(1+x)^{n-1}$ . Dividir o ligante ligado por $n$ vezes a proteína total dá $Y$ ; a fração $R$ são os termos em $R$ sobre o total. Quando $\alpha$ é pequeno, os termos em $T$ dominam o denominador (porque $L \gg 1$ ) e $Y \approx c\alpha$ , a baixa afinidade de $T$ ; quando $\alpha$ é grande o bastante para que $(1+\alpha)^{n} > L(1+c\alpha)^{n}$ , os termos em $R$ assumem e a afinidade é $K_{R}$ : a troca entre os dois regimes é a sigmoide. ∎

Exemplo 7.11 (A hemoglobina em números)

Tome $n = 4$ , $K_{R} = 1\,\mathrm{mmHg}$ , $c = 0.01$ (de modo que $K_{T} = 100\,\mathrm{mmHg}$ ) e $L = 3\times 10^{5}$ . À pressão parcial de oxigênio do sangue arterial, $100\,\mathrm{mmHg}$ , $\alpha = 100$ e $Y = 0.97$ ; a $40\,\mathrm{mmHg}$ , o valor venoso em repouso, $Y = 0.78$ ; a $26\,\mathrm{mmHg}$ , $Y = 0.52$ — o modelo reproduz a pressão de meia-saturação de $26\,\mathrm{mmHg}$ ; a $20\,\mathrm{mmHg}$ , num músculo em exercício, $Y = 0.35$ . Um transportador não cooperativo de mesma pressão de meia-saturação daria $100/126 = 0.79$ nos pulmões e $20/46 = 0.43$ no músculo, descarregando $0.36$ de sua capacidade onde a hemoglobina descarrega $0.62$ . A cooperatividade é o que faz um transportador que carrega por completo a uma pressão e descarrega quase tudo a uma pressão apenas cinco vezes menor.

Saturação de oxigênio da hemoglobina calculada pela equação de Monod–Wyman–Changeux com os parâmetros do exemplo (vermelho), contra um transportador de um só sítio de mesma pressão de meia-saturação (azul). Entre o pulmão e o músculo em trabalho, o transportador cooperativo descarrega quase o dobro.

Proposição 7.12 (Mecanismo da troca)

Na desoxi-hemoglobina o ferro fica ligeiramente fora do plano do heme, puxado em direção à histidina proximal, e o heme fica abaulado. A ligação do oxigênio achata o heme e atrai o ferro e, com ele, a histidina e a hélice a que ela pertence, em cerca de $0.06\,\mathrm{nm}$ na direção do heme; esse deslocamento é amplificado na interface entre os dímeros $\alpha_{1}\beta_{1}$ e $\alpha_{2}\beta_{2}$ , que giram $15{}^{\circ}$ e rompem as pontes salinas que sustentam o estado T. Os efetores agem sobre essas mesmas pontes: os prótons se ligam a histidinas cujas pontes só existem em T (o efeito Bohr), o dióxido de carbono forma carbamatos com as extremidades amino que estabilizam o T, e o 2,3-bisfosfoglicerato, uma pequena molécula fortemente negativa, aloja-se na cavidade central entre as cadeias $\beta$ , que só é larga o bastante em T. A hemoglobina fetal, com cadeias $\gamma$ que o ligam pior, tem afinidade maior que a da mãe e puxa o oxigênio através da placenta.

7.5 Proteínas em movimento

Definição 7.13 (Desordem e dinâmica)

Uma região intrinsecamente desordenada não tem enovelamento estável por si só e existe como um conjunto de conformações que se interconvertem rapidamente, muitas vezes enovelando-se apenas ao encontrar seu parceiro; cerca de um terço das proteínas humanas carrega uma região desordenada de mais de trinta resíduos, e elas são enriquecidas em sinalização e regulação, em que um segmento flexível pode ser fosforilado em muitos sítios, ligar vários parceiros em sequência e agir como conector. As proteínas enoveladas também se movem: as cadeias laterais giram em picossegundos, as alças se abrem em nanossegundos a microssegundos, os domínios articulam-se em microssegundos a milissegundos, e o ciclo catalítico de uma enzima é uma coreografia desses movimentos, e não uma chave-fechadura estática. Uma estrutura cristalográfica é um instantâneo de um conjunto conformacional; a RMN e a simulação molecular veem o resto. Proteínas e RNAs desordenados e multivalentes também podem separar-se do citoplasma em gotículas líquidas — os condensados biomoleculares, como os nucléolos, os grânulos de estresse e os corpos P —, que concentram reações sem membrana e cujo envelhecimento em agregados sólidos é uma das rotas para as doenças amiloides.

Observação 7.14 (Estrutura e função)

A lição de sessenta anos de estruturas é dupla. Um enovelamento é uma solução para um problema físico — ligar isto, catalisar aquilo, transmitir um sinal por quatro nanômetros — e conhecer a estrutura muitas vezes torna o mecanismo evidente, como tornou para o ferro do heme e para a rotação dos dímeros da hemoglobina movida pelo oxigênio. E um enovelamento é um objeto histórico: as mesmas poucas centenas de arquiteturas, remexidas, duplicadas e fundidas, servem a toda a diversidade de função proteica, de modo que a estrutura de uma proteína de uma bactéria muitas vezes dirá como funciona a prima humana.

7.6 Exercícios

Exercício 7.1 ★

Defina os quatro níveis de estrutura proteica e dê o exemplo de cada um na hemoglobina.

Solução

Solução de Exercício 7.1.

Primária: a sequência dos $141$ resíduos de uma cadeia $\alpha$ . Secundária: suas oito $\alpha$ -hélices. Terciária: o enovelamento de globina de uma cadeia envolvendo seu heme. Quaternária: o tetrâmero $\alpha_{2}\beta_{2}$ e o modo como seus dímeros giram um contra o outro.

Exercício 7.2 ★

Uma $\alpha$ -hélice contém $36$ resíduos. Qual é seu comprimento, quantas voltas ela dá e quantas pontes de hidrogênio do esqueleto a sustentam (a carbonila de cada resíduo liga-se à amida quatro resíduos adiante)?

Solução

Solução de Exercício 7.2.

$36\times 0.15\,\mathrm{nm} = 5.4\,\mathrm{nm}$ ; $36/3.6 = 10$ voltas; $36 - 4 = 32$ pontes de hidrogênio.

Exercício 7.3 ★

O que o reenovelamento da ribonuclease por Anfinsen mostrou, e por que era importante fazer o experimento sem nenhum componente celular presente?

Solução

Solução de Exercício 7.3.

Que a estrutura nativa, inclusive o pareamento correto de quatro pontes dissulfeto entre $105$ possibilidades, é recuperada espontaneamente a partir da cadeia desenovelada: a sequência contém toda a informação necessária, e o estado nativo é o mínimo termodinâmico. Fazê-lo num tubo de ensaio com proteína pura excluiu qualquer molde, enzima ou maquinaria celular como fonte da informação.

Exercício 7.4 ★

Ordene a cristalografia, a RMN e a criomicroscopia eletrônica pelo tamanho de proteína que cada uma trata melhor, e diga qual delas dá informação sobre movimento.

Solução

Solução de Exercício 7.4.

RMN: proteínas pequenas, abaixo de uns $40\,\mathrm{kDa}$ , em solução. Cristalografia: qualquer tamanho que cristalize, de peptídeos a ribossomos. Criomicroscopia eletrônica: complexos grandes, acima de uns $50\,\mathrm{kDa}$ , sem cristais. A RMN informa diretamente sobre o movimento (e a crio-ME consegue separar as moléculas em classes conformacionais); uma estrutura cristalográfica é uma média estática.

Exercício 7.5 ★★

Refaça a contagem de Levinthal para uma proteína de $150$ resíduos com $k = 2$ , e para um peptídeo de $20$ resíduos com $k = 3$ . Para qual das duas uma busca ao acaso é concebível dentro de um segundo a $10^{12}$ tentativas por segundo?

Solução

Solução de Exercício 7.5.

$2^{150} \approx 1.4\times 10^{45}$ conformações, $1.4\times 10^{33}$ s $\approx 5\times 10^{25}$ anos. $3^{20} \approx 3.5\times 10^{9}$ , $3.5$ ms: o peptídeo poderia fazer uma busca exaustiva dentro de um segundo; a proteína não conseguiria na idade do universo.

Exercício 7.6 ★★

Usando a equação MWC com $n = 2$ , $L = 100$ , $c = 0.01$ , calcule $Y$ em $\alpha = 1$ , $10$ e $100$ , e compare com um único sítio de constante de dissociação $K_{R}$ ( $Y = \alpha/(1+\alpha)$ ). Onde aparece a cooperatividade?

Solução

Solução de Exercício 7.6.

$Y = [\alpha(1+\alpha) + Lc\alpha(1+c\alpha)]/[(1+\alpha)^{2} + L(1+c\alpha)^{2}]$ . $\alpha = 1$ : $3.01/106 = 0.028$ (sítio único $0.50$ ). $\alpha = 10$ : $121/242 = 0.50$ ( $0.91$ ). $\alpha = 100$ : $10\,300/10\,601 = 0.97$ ( $0.99$ ). A curva MWC fica bem atrás do sítio único em ligante baixo e depois sobe abruptamente — de $0.03$ a $0.97$ ao longo de duas décadas em que o sítio único vai de $0.5$ a $0.99$ : essa inclinação é a cooperatividade.

Exercício 7.7 ★★

Explique, com o modelo MWC, por que o 2,3-bisfosfoglicerato baixa a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio, que parâmetro do modelo ele muda, e por que o sangue armazenado, que perde o composto, entrega oxigênio mal quando transfundido.

Solução

Solução de Exercício 7.7.

O bisfosfoglicerato liga apenas o estado T (na cavidade central), e por isso estabiliza o T: no modelo ele eleva $L$ , a razão $T/R$ da proteína sem ligante, e assim desloca a curva para a direita — afinidade menor, mais oxigênio liberado às pressões teciduais. As hemácias armazenadas perdem o composto, $L$ cai, a curva se desloca para a esquerda, e o sangue transfundido retém seu oxigênio em vez de cedê-lo aos tecidos, até que as células o ressintetizem ao longo de um dia.

Exercício 7.8 ★★

Um cristal difrata até um ângulo máximo $\theta = 15{}^{\circ}$ com raios X de comprimento de onda $0.1\,\mathrm{nm}$ . Qual é a resolução? Que detalhes da proteína ficarão visíveis? Que ângulo seria necessário para $0.12\,\mathrm{nm}$ ?

Solução

Solução de Exercício 7.8.

$d = \lambda/(2\sin\theta) = 0.1/(2\times 0.259) = 0.19\,\mathrm{nm}$ : o esqueleto e cada cadeia lateral são posicionados, com os átomos individuais resolvidos. Para $0.12\,\mathrm{nm}$ : $\sin\theta = 0.1/0.24 = 0.417$ , $\theta = 25{}^{\circ}$ .

Exercício 7.9 ★★

Uma mutação substitui uma leucina enterrada por uma lisina. Preveja seu efeito sobre a estabilidade, usando a Proposição 7.2, e explique por que a mesma substituição na superfície seria inofensiva. Depois explique por que uma proteína com $\Delta G_{\text{enov}} = -30\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ não é “muito estável”, embora o número pareça grande.

Solução

Solução de Exercício 7.9.

Uma lisina carregada enterrada entre cadeias laterais apolares custa dezenas de quilojoules por mol (sua carga sem solvatação, perdido o enterramento hidrofóbico da leucina), mais do que todo o $\Delta G$ do enovelamento: a proteína se desenovela ou o cerne se rearranja. Na superfície a lisina fica hidratada como ficaria no estado desenovelado e nada se perde. $-30\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol} \approx -12RT$ significa $K = e^{12} \approx 1.6\times 10^{5}$ : uma molécula em $160\,000$ está desenovelada a cada momento, e toda a margem equivale a duas ou três pontes de hidrogênio entre centenas — o valor de uma mutação.

Exercício 7.10 ★★★

Deduza a fração de moléculas no estado $R$ , $\bar R$ , a partir das espécies contadas na prova do Teorema 7.10, e mostre que, para $c \to 0$ , a concentração de ligante em que metade das moléculas está em $R$ satisfaz $(1+\alpha)^{n} = L$ . Calcule esse $\alpha$ para os parâmetros da hemoglobina e compare com o $P_{50}$ .

Solução

Solução de Exercício 7.10.

As espécies $R$ somam $[R_{0}](1+\alpha)^{n}$ e as espécies $T$ , $[R_{0}]L(1+c\alpha)^{n}$ , de modo que $\bar R = (1+\alpha)^{n}/[(1+\alpha)^{n} + L(1+c\alpha)^{n}]$ . Para $c \to 0$ o termo $T$ é $L$ , e $\bar R = 1/2$ quando $(1+\alpha)^{n} = L$ , isto é, $\alpha = L^{1/n} - 1$ . Para a hemoglobina $(3\times 10^{5})^{1/4} = 23.4$ , logo $\alpha \approx 22$ : $22\,\mathrm{mmHg}$ , perto do $P_{50}$ de $26\,\mathrm{mmHg}$ — a troca conformacional e a meia-saturação quase coincidem.

Exercício 7.11 ★★★

Os príons transmitem uma forma. Explique por que a hipótese “só proteína” foi resistida, que experimento a refutaria, e que evidências (resistência da infecciosidade a nucleases e à luz ultravioleta, sensibilidade a desnaturantes de proteína, príons sintéticos) a apoiam. Por que um príon precisa de uma semente?

Solução

Solução de Exercício 7.11.

Ela foi resistida porque todo agente infeccioso conhecido se replicava por ácido nucleico, e uma proteína não consegue copiar sua sequência. Encontrar um ácido nucleico necessário, ou mostrar que proteína purificada não transmite, a refutaria. Apoio: a infecciosidade sobrevive a nucleases e à radiação ultravioleta e ionizante em doses que destroem qualquer genoma, mas é destruída por desnaturantes de proteína e por proteases; a PrP recombinante enovelada in vitro em fibrilas transmite a doença a animais, com as mesmas propriedades de cepa ao longo das passagens. É preciso uma semente porque a conversão de um monômero normal é proibitivamente lenta sozinha — o núcleo da estrutura cross- $\beta$ precisa formar-se primeiro, e esse é o evento limitante —, ao passo que a ponta de uma fibrila já formada converte monômeros depressa: a forma é copiada por crescimento sobre molde.

Exercício 7.12 ★★★

Uma família de proteínas manteve seu enovelamento enquanto suas sequências divergiram até $15\,\%$ de identidade. Explique por que a estrutura é mais conservada que a sequência, que tipo de resíduos são os conservados, e como isso é explorado tanto pelos métodos de perfil (Capítulo 5) quanto pelo projeto de proteínas novas.

Solução

Solução de Exercício 7.12.

Muitas sequências se enovelam na mesma estrutura: o que um enovelamento exige é um padrão de posições hidrofóbicas e polares, algumas glicinas e prolinas nas curvas e os resíduos que fazem o trabalho; todo o resto na superfície pode mudar sem penalidade, de modo que as mutações se acumulam ali enquanto a seleção preserva o enovelamento e a função. Os resíduos conservados são, portanto, o cerne (mais como padrão do que como identidades), os resíduos catalíticos e de ligação, e as glicinas, prolinas e cisteínas estruturais. Os métodos de perfil ponderam exatamente essas colunas e por isso reconhecem membros da família a $15\,\%$ de identidade; o projeto de proteínas percorre a lógica ao contrário, escolhendo um padrão hidrofóbico para um enovelamento-alvo e deixando a superfície ser qualquer coisa.

7.7 Problema: o enovelamento de uma globina

Problema 7.1

Problema de fim de semana — as hélices de uma globina medidas, seu enovelamento cronometrado contra Levinthal, sua ligação de oxigênio calculada pelo modelo de dois estados e sua estrutura resolvida a partir de um cristal, terminando na diferença de saturação entre o pulmão e o músculo, no tempo de Levinthal e na resolução do mapa

Dados: uma cadeia de globina de $150$ resíduos, massa média por resíduo $110\,\mathrm{Da}$ , $75\,\%$ dos resíduos em oito $\alpha$ -hélices; elevação da hélice $0.15\,\mathrm{nm}$ por resíduo, $3.6$ resíduos por volta. Volume específico parcial da proteína $0.73\,\mathrm{cm}^{3}/\mathrm{g}$ . Parâmetros MWC da hemoglobina: $n = 4$ , $K_{R} = 1\,\mathrm{mmHg}$ , $c = 0.01$ , $L = 3\times 10^{5}$ . Comprimento de onda dos raios X $0.1\,\mathrm{nm}$ ; célula unitária um cubo de aresta $6\,\mathrm{nm}$ ; cristal um cubo de aresta $100\,\text{µ}\mathrm{m}$ .

Parte I — Anatomia de uma cadeia.

Quantos resíduos estão em hélices? Que comprimento total de hélice é esse, e quantas voltas?
Quantas pontes de hidrogênio do esqueleto as hélices contêm, contando uma por resíduo além dos quatro primeiros de cada hélice?
A massa da cadeia e seu volume a partir do volume específico parcial; o raio de uma esfera desse volume.
A cadeia estendida teria $0.36\,\mathrm{nm}$ por resíduo. Compare seu comprimento com o diâmetro da esfera: por qual fator o enovelamento compacta a cadeia?
As oito hélices têm em média $14$ resíduos. Se os resíduos fossem dispostos ponta a ponta, que fração do comprimento estendido é helicoidal, e em quanto a hélice o encurta?
Uma globina enterra cerca de $40$ cadeias laterais apolares em seu cerne. Tomando $4\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ de estabilização hidrofóbica por cadeia lateral enterrada e um custo de entropia conformacional de $0.9\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ por resíduo no enovelamento (todos os $150$ ), estime o $\Delta G$ líquido do enovelamento e compare com a faixa da Proposição 7.2.

Parte II — Encontrar o enovelamento.

Calcule a contagem de Levinthal para $150$ resíduos com $k = 3$ e o tempo para amostrá-la a $10^{12}$ por segundo.
A globina se enovela em $10\,\mathrm{ms}$ . Quantas conformações, no máximo, ela pode ter visitado? Que fração da contagem é essa?
Suponha, em vez disso, que cada hélice se forme de modo independente em $1\,\text{µ}\mathrm{s}$ e que as oito hélices formadas então encontrem seu empacotamento entre $8!$ ordenações amostradas a $10^{6}$ por segundo. Estime o tempo de enovelamento. Isso é um funil?
Uma chaperonina encerra uma cadeia por $10\,\mathrm{s}$ por ciclo e a libera enovelada com probabilidade $0.3$ por ciclo. Qual é o número esperado de ciclos, e o tempo esperado, para enovelar um substrato difícil? Que fração continua desenovelada após um minuto?
Uma mutação desestabilizante eleva a fração desenovelada a $37\,{}^{\circ}\mathrm{C}$ de $10^{-4}$ para $10^{-2}$ . Com $\Delta G = -RT\ln(K)$ e $K = [\text{enovelada}]/[\text{desenovelada}]$ , de quanto mudou o $\Delta G_{\text{enov}}$ ?
Explique por que cem vezes mais proteína desenovelada pode ser a diferença entre saúde e doença amiloide, usando a necessidade de uma semente.

Parte III — Ligar o oxigênio.

Calcule $Y$ pela equação MWC em $\alpha = 100$ (pulmão) e $\alpha = 20$ (músculo em trabalho).
Calcule a fração de moléculas no estado $R$ nessas duas pressões.
Quanto do oxigênio carregado é descarregado entre o pulmão e o músculo? Compare com um transportador de um só sítio, de pressão de meia-saturação $26\,\mathrm{mmHg}$ .
O sangue carrega $150\,\mathrm{g}$ de hemoglobina por litro, e cada grama liga $1.34\,\mathrm{mL}$ de oxigênio. Quantos mililitros de oxigênio por litro a hemoglobina entrega ao músculo, a partir da questão 15? Um corpo em repouso consome $250\,\mathrm{mL}/\mathrm{min}$ : que fluxo sanguíneo isso exige em repouso (descarregando de $0.97$ a $0.78$ )?
O bisfosfoglicerato eleva $L$ a $3\times 10^{6}$ . Recalcule $Y$ em $\alpha = 40$ e diga o que isso faz à entrega em repouso.
A hemoglobina fetal tem, na prática, $L = 3\times 10^{4}$ . Calcule seu $Y$ à pressão placentária de $30\,\mathrm{mmHg}$ , compare com o da mãe e explique a transferência.

Parte IV — Vê-la.

Quantas células unitárias o cristal contém? Se cada célula abriga quatro cadeias de globina, quantas moléculas difratam juntas?
Veem-se pontos até $\theta = 14.5{}^{\circ}$ . Qual é a resolução, e as cadeias laterais serão posicionadas?
Que ângulo daria $0.15\,\mathrm{nm}$ ? Por que um cristal mal ordenado só difrata a ângulos baixos?
Na criomicroscopia eletrônica o sinal da imagem média cresce com a raiz quadrada do número de partículas. Se $10\,000$ partículas dão $0.6\,\mathrm{nm}$ , e a resolução melhora com o inverso do sinal, quantas partículas dão $0.3\,\mathrm{nm}$ ?
A criomicroscopia eletrônica não precisa de cristal. Nomeie dois tipos de proteína ou de complexo para os quais isso decide se uma estrutura pode ser obtida, e explique por quê.
Um modelo previsto da globina difere da estrutura cristalográfica em $0.1\,\mathrm{nm}$ em média ao longo do esqueleto. Nomeie duas coisas que a predição não fornece e que o cristal forneceu.
Resuma: a descarga entre o pulmão e o músculo (questão 15), o tempo de Levinthal para $150$ resíduos (questão 7) e a resolução do mapa (questão 20).

Solução

Solução de Problema 7.1.

1. $0.75\times 150 \approx 112$ resíduos helicoidais; $112\times 0.15\,\mathrm{nm} = 17\,\mathrm{nm}$ ; $112/3.6 \approx 31$ voltas. 2. $112 - 8\times 4 = 80$ pontes de hidrogênio. 3. Massa $150\times 110 = 16\,500\,\mathrm{Da} = 2.7\times 10^{-20}$ g; volume $2.7\times 10^{-20}\times 0.73 = 2.0\times 10^{-20}$ cm $^{3}$ $= 20\,\mathrm{nm}^{3}$ ; raio $(3V/4\pi)^{1/3} = 1.7\,\mathrm{nm}$ . 4. Estendida, $150\times 0.36 = 54\,\mathrm{nm}$ contra um diâmetro de $3.4\,\mathrm{nm}$ : um fator de $16$ . 5. Os resíduos helicoidais são $75\,\%$ do comprimento estendido, $112\times 0.36 = 40\,\mathrm{nm}$ ; a hélice os comprime a $17\,\mathrm{nm}$ , um fator $0.36/0.15 = 2.4$ . 6. $40\times 4 = 160\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ ganhos, $150\times 0.9 = 135\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ perdidos: no total, $\Delta G \approx -25\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , dentro da faixa marginal. 7. $3^{150} \approx 4\times 10^{71}$ ; $4\times 10^{59}$ s $\approx 10^{52}$ anos. 8. $10^{-2}\times 10^{12} = 10^{10}$ conformações, uma fração $3\times 10^{-62}$ da contagem. 9. Hélices em $1\,\text{µ}\mathrm{s}$ (em paralelo); $8! = 40\,320$ empacotamentos a $10^{6}$ por segundo levam $40\,\mathrm{ms}$ : no total, cerca de $40\,\mathrm{ms}$ , a ordem de grandeza observada. Sim: resolver as partes de modo independente e depois o todo é um funil — o espaço de busca é fatorado, e não esgotado. 10. Ciclos esperados $1/0.3 = 3.3$ , cerca de $33\,\mathrm{s}$ ; após seis ciclos, $0.7^{6} = 0.12$ continua desenovelado. 11. $\Delta G = -RT\ln K$ com $K = 10^{4} \to 10^{2}$ : de $-23.7$ a $-11.9\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , uma perda de $12\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ de estabilidade ( $RT = 2.58\,\mathrm{kJ}/\mathrm{mol}$ , $\ln 100 = 4.6$ ). 12. A agregação começa por um núcleo, cuja taxa de formação sobe como uma potência alta da concentração da espécie desenovelada propensa à agregação; cem vezes mais dessa espécie eleva em ordens de grandeza a chance de um núcleo se formar dentro de uma vida, e, uma vez existindo o núcleo, o crescimento é rápido e se molda a si mesmo. 13. $\alpha = 100$ : $Y = 1.054\times 10^{8}/1.089\times 10^{8} = 0.97$ . $\alpha = 20$ : numerador $185\,220 + 103\,680 = 288\,900$ , denominador $194\,481 + 622\,080 = 816\,561$ : $Y = 0.35$ . 14. $\bar R = 1.041\times 10^{8}/1.089\times 10^{8} = 0.96$ no pulmão; $194\,481/816\,561 = 0.24$ no músculo. 15. $0.97 - 0.35 = 0.62$ da capacidade descarregada (dois terços da carga). Sítio único: $100/126 - 20/46 = 0.79 - 0.43 = 0.36$ . 16. Capacidade $150\times 1.34 = 200\,\mathrm{mL}/\mathrm{L}$ ; ao músculo, $0.62\times 200 \approx 125\,\mathrm{mL}/\mathrm{L}$ . Em repouso, $(0.97 - 0.78)\times 200 = 38\,\mathrm{mL}/\mathrm{L}$ ; $250/38 \approx 6.5\,\mathrm{L}/\mathrm{min}$ de fluxo sanguíneo — a ordem de um débito cardíaco de repouso. 17. $L = 3\times 10^{6}$ , $\alpha = 40$ : numerador $2.76\times 10^{6} + 3.29\times 10^{6} = 6.05\times 10^{6}$ , denominador $2.83\times 10^{6} + 11.5\times 10^{6} = 14.4\times 10^{6}$ : $Y = 0.42$ em vez de $0.78$ — bem mais oxigênio descarregado em repouso, a adaptação do sangue à altitude e do músculo ao trabalho. 18. Fetal, $L = 3\times 10^{4}$ , $\alpha = 30$ : numerador $893\,730 + 19\,770 = 913\,500$ , denominador $923\,520 + 85\,680 = 1\,009\,200$ : $Y = 0.91$ . Materna à mesma pressão: numerador $893\,730 + 197\,730 = 1\,091\,460$ , denominador $923\,520 + 856\,830 = 1\,780\,350$ : $Y = 0.61$ . À mesma pressão o sangue fetal retém mais oxigênio, e por isso o oxigênio flui da mãe para o feto através da placenta. 19. $(10^{5}\,\text{nm}/6\,\text{nm})^{3} = 4.6\times 10^{12}$ células; $1.9\times 10^{13}$ moléculas. 20. $d = 0.1/(2\sin 14.5^{\circ}) = 0.20\,\mathrm{nm}$ : sim, cada cadeia lateral e cada átomo ficam posicionados. 21. $\sin\theta = 0.1/0.3$ , $\theta = 19.5{}^{\circ}$ . Num cristal desordenado as moléculas não estão em registro exato, as ondas espalhadas a ângulos altos — que codificam os detalhes finos — deixam de somar-se em fase, e os pontos se apagam em ângulos altos; só sobrevivem os pontos de baixa resolução. 22. Reduzir $d$ à metade exige o dobro do sinal e, portanto, quatro vezes as partículas: cerca de $40\,000$ (mais, na prática, já que outros erros entram). 23. Proteínas de membrana, que raramente cristalizam a partir de soluções de detergente e podem ser fotografadas num nanodisco lipídico; complexos grandes e flexíveis — ribossomos, spliceossomos, canais iônicos com seus reguladores —, cuja heterogeneidade impede a cristalização, mas cujas partículas podem ser separadas em classes conformacionais. 24. O heme e o oxigênio ligados e sua geometria exata, as águas e os íons ordenados, a segunda conformação (T contra R) e a prova de que o enovelamento está certo — uma predição é um único modelo sem ligante e sem conferência experimental. 25. Descarga de $0.62$ da capacidade (sítio único $0.36$ ); o tempo de Levinthal, cerca de $10^{52}$ anos; um mapa a $0.20\,\mathrm{nm}$ .

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